La lactoferrine et 1 ' o{ - 1 ac ta I bumi ne sont les deux protéines majeures du lactosérum humain. Leurs concentrations varient respective¬ ment entre environ 1 et 2g/ 1 , et entre environ 3 et 4,8 g/1 dans le lait humain mature.

La lactoferrine est une glycoprotéine à simple chaîne, riche en acides aminés basiques ( pHi = 8,7). Son poids moléculaire est. de 76.400 daltons. El le présente la propriété de fixer deux atomes de fer par l ' intermédiaire d'un complexe mettant en oeuvre deux ions bicarbonate. Partiellement saturée dans le lait (8 à 25% de sa capacité théorique de fixation), cette protéine est capable d' inhiber in vitro, par ferr i r i at ion, la croissance de microorganismes tels que Bacillus stearothermoph i 1 us , Bacillus subtilis ou Escherichia coli. L' inhibition observée est de ty¬ pe bacter i os ta i que , la croissance des bactéries étant rétabl ie par addition de fer en excès dans le mi l ieu. Toutefois, un effet bactéricide direct a été observé, un tel effet pouvant découler d'une fixation de la lactoferrine à la surface des cel¬ lules, qui entraînerait un blocage, soit des sites de transport de certains nutriments, soit des é- canismes de biosynthèse de la paroi.

L ¹ os -lactalbumine humaine est une pro¬ téine à simple chaîne, ayant une masse moléculaire de 14.100 daltons. Représentant 25% en poids des protéines du lait humain, elle contribue considé- rablement à la haute valeur biologique de ce lait, de par sa composition en acides aminés essentiels, notamment en tryptophane.

De nombreuses méthodes ont été mises en oeuvre pour isoler et purifier ces deux protéines, mais toujours à des fins analytiques. Ainsi diffé¬ rentes techniques chromatographiques ont été utilisées; on peut citer notamment les séparations chromatograph ques basées sur l'échange d ^l ions, rapportées par BLACKBERG L., HERNELL O. 1980 "FEBS Lett.,

109 (2), 180-184", pour la lac o errine, et par LONNERDAL B., GLAZIER C. , 1985 "J. Nutr., 115, 1209-1216" pour l' ^θ (-lactal- bumine , la séparation chromatograph i que basée sur l'affinité par chélation avec des métaux, rapportée par LONNERDAL B. CARLSSON J. PORATH J. 1977 "FEBS Lett., 75 (1), 89-92"; et la séparation chroma ograph i que basée sur

1 ' immuno-affinité, rapportée par KAWAKAMI H., SHINIvDTO H., DOSAKO S., SOGO Y. 1987 "J. Dairy Se i . , 70, 752-759.

Si ces méthodes permettent d'obtenir des protéines avec un degré de pureté élevée, elles ne sont pas adaptées à l'obtention de quantités d' ^~ ~ - lactalbumine et de lactoferrine humaines requises pour une utilisation thérapeutique. Les quantités obtenues sont, en effet, inférieures au gramme. Par ailleurs, les autres composants protéiques ne

FEUILLE DE REMPLACEMENT

sont pas ou ^* sont mal récupérés.

En France, les lactariums recueillent actuellement près de 100.000 litres/an de lait humain. Outre la redistribution du lait, la sépa- ration des constituants protidiques, lipidiques et glucidiques permettrait de préparer des nutriments aptes à répondre à des besoins thérapeutiques de prématurés ou de nourrissons souffrant de patholo- gies graves de la digestion. La présente invention propose un procédé permettant de préparer, à l 'échel le industrielle, à titre principal , la lactoferrine humaine et 1 ' σ^ - 1 ac ta 1 bumi ne humaine util isables pour les be¬ soins précités, et à titre secondaire, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres composants du lait, tels que les caséines et les protéines de poids moléculaires élevés, et différents peptides, glycosylés ou non. Le procédé selon l ' invention met en jeu une combinaison de techniques de fil- tration sur membranes présentant différents pou¬ voirs de coupure .

La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé de fractionnement du lait humain, conduisant notamment à l 'obtention de fractions enrichies en lactoferrine et en { -lac¬ talbumine humaines, caractérisé par le fait que: (1) dans une première étape, on soumet du lait humain à une microfiltration, notamment une microfiltration tangent ie 11 e , sur une mem- brane présentant un diamètre de pores de l 'ordre de 0, 1 à 0,3 _À m ^~~ - pour obtenir: d'une part, un perméat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion pré¬ pondérante d' ^~ ~\ -lactalbumine; de la lactoferrine; de la sérum albumine; des

FEUILLE DE REMPLACEMENT

pept ides ; d'autre part, un rétentat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine; des caséines; et des protéines de poids moléculaires plus élevés; et

(2) dans une seconde étape, on soumet le perméat n° 1 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre en- viron 80.000 et 300.000 daltons, pour obten i r : d'une part, un perméat n° 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion majeu¬ re d' -*. - 1 ac tal bumine et une fraction mineure de protéines et peptides de plus faible poids moléculaire, et d'autre part, un rétentat n ^D 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine, une propor- tion mineure de sérum albumine.

Conformément à un mode de réal isation préféré du procédé selon l' invention,

(3) dans une troisième étape, on soumet le per¬ méat n° 2 à une ultrafil ration sur une mem- brane ayant un seuil de coupure compris entre environ 5000 et 50.000 daltons, pour obten i r : d'une part, un perméat n° 3, essentiellement constitué par des peptides éventuellemen gl cosylés; et d'autre part, un rétentat n° 3, essentielle¬ ment constitué par de 1 ' o{ - 1 ac ta 1 bumine .

Selon l' invention, on part généralement d'un lait écréme. Par ailleurs, pour des raisons évidentes, le lait util isé est un lait décongelé,

FEUILLE DE REMPLACEMENT

ayant été stocké à une température de l 'ordre de 20 ^Q C, un tel stockage pouvant durer plusieurs mo i s .

La microfiltration de l 'étape (1 ) est conduite en flux tangentiel , la vitesse de cir¬ culation du lait écrémé étant de l 'ordre de 4 m/s à 7 m/s , de préférence de 6 m/s . La membrane de microfiltration, qui présente, de préférence, un diamètre de pores de l 'ordre de 0,2 M~ , est choi- sie notamment parmi les membranes minérales, parmi lesquelles on peut citer les membranes en oxyde de zirconium, supporté par du carbone ou de l 'acier inoxydable fritte, en alumine ou en carbone.

Par ai l leurs, on conduit cette microfil- tration à une pression qui , en amont du dispositif de microfiltration, est comprise entre 3 et 1 bars relatifs, de préférence entre 1,5 et 1,0 bar rela¬ tif, et qui , en aval du dispositif de microfiltra¬ tion, est comprise entre 1,0 et 0.2 bar relatif, de préférence, entre 0,5 et 0,2 bar relatif.

La température à laquel le est conduite cette opération de microfiltration est inférieure à 48°C. Au-delà de cette température, l 'opération es techniquement réal isable, mais les composants seront obtenus sous une forme plus ou moins déna¬ turée, c'est-à-dire inactivée. Il en est de même pour les autres séparations sur membrane prévues conformément au procédé de l' invention.

Dans un mode de réal isation préféré, on fait suivre la microfiltration de l 'étape (1 ) par un diaf i 1 t rat ion du rétentat n° 1 pour éliminer la majeure partie de 1 ' ° -lactalbumine et des peptides. L'étape (1 ) et cette étape de diafiltra- tion peuvent du reste être réal isées de façon concomi tante .

QUILLE DE REMPLACEMENT

Pour réaliser 1 ' u 1 t raf i 1 trat ion de l 'étape (2), on utilise, de préférence, une mem¬ brane d' ul traf i 1 rat ion présentant un seuil de coupure de l'ordre de 100.000 daltons. Parmi les membranes qu' il est possible d'utiliser à cette étape, on peut citer les membranes à fibres creu¬ ses commercialisées par les firmes AMICON et RQMI - CON, les membranes de conception plane commerciali¬ sées par les firmes TECHSEP , ILLIPORE et PASILAC. Les autres paramètres de cette ultrafil¬ tration de l'étape (2) sont classiques: on tra¬ vaille à une pression qui, en amont du dispositif d'ultrafiltration, est comprise entre 6,0 et 1,0 bars relatifs selon la membrane utilisée, et qui, en aval du dispositif d'ul rafil ration, est com¬ prise entre 4,0 et 0,2 bars relatifs, et on fait circuler le rétentat n° 1 à une vitesse comprise entre 4,5 et 1,5 m/s.

Il est possible de faire suivre 1 'u 1 tra f i 1 tra ion de l'étape (2) par une diafil- tration du rétentat n° 2, jusqu'à élimination sen¬ siblement complète de 1 ' o^ -lactalbumine. Cette étape de diaf i l tration peut être réalisée de façon concomitante à l'étape (2) d'ultrafiltration. L 'u 1 traf i 1 trat ion de l 'étape (3) peut être menée avec utilisation d'une membrane présen¬ tant un seuil de coupure présentant de préférence une valeur de l'ordre de 10.000 daltons. Les autres paramètres de cette ultrafiltration, y compris la nature de la membrane, sont analogues à ceux indi¬ qués pour 1 ^l u 1 traf i 1 trat ion de l 'étape (2). De la même façon, on peut faire suivre 1 ' u 11raf i 11ra ion de l 'étape (3) par une diaf i 1 tra ion du rétentat n° 3 jusqu'à élimination sensiblement complète des peptides.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Par ai l leurs, on peut soumettre le ré¬ tentat n° 2 à une purification par chroma tograph ie d'échange d' ions, notamment par la technique dé¬ crite par FOLEY A.A. , BATES G.W. , 1987, "Anal . Biochem., 162, 296-300".

Chacune des fractions obtenues par le procédé de l ' invention et ses variantes peut être séchée pour donner une poudre, plus facile à met¬ tre en oeuvre pour les appl ications thérapeutiques et diététiques prévues pour ces substances.

La présente invention porte également sur les différentes fractions obtenues par ce pro¬ cédé, et notamment les fractions suivantes:

Fraction correspondant au perm at n° 1, qui renferme:

©(.-lactalbumine 76-78 lactoferrine 16-20 sérum albumine 2- 3, ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéi¬ nes vraies ( _t -N _{so l TCA 12 %} ) x 6,38 (TCA = acide tr i ch 1 oracét i que ) .

Fraction correspondant au rétentat n° 1, qui renferrne : de la lactoferrine à raison de 29-34 grammes pour 100 grammes de protéine vraies

( ^N t- ^N sol TCA 12%) ^{x 6} ' ³⁸ '

Fraction correspondant au perméat n° 2, qui renferme : de 1 ' ci, -lactalbumine à raison de 0,04-0,08 gramme pour 100 grammes de produit liquide.

Fraction correspondant au rétentat n° 2, qui renfe rme : lactoferrine 32-35 sérum albumine 9-12,

FEUILLE DE REMPLACEMENT

.ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéi¬ nes vraies (N _t -N _{sol TCA 12%} )x 6,38 Fraction correspondant au rétentat n° 3, qui renferme de 1 ' -~\ -lactalbumine à raison de 80-81g pour 100 grammes de poudre faisant 2,5% d'humidité.

L' invention porte également, d'une ma¬ nière générale, sur les produits suivants: un produit à haute teneur en o -lactalbumine

- au moins 80 g de la protéine pour 100 g de matière sèche - résultant de la concen ration par ultrafiltration du perméat n° 2 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 5000 et 50.000 daltons, de préférence, de l'ordre de 10.000 daltons, conformément à ce qui a été exposé ci-dessus; un produit à haute teneur en lactoferrine

- au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids par rapport à la matière sèche - ladite lactofer¬ rine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et 3ates (GRAHAM G., BATES G.W. , 1976. Approaches to the standard iza t ion of sérum unsaturated iron-binding capacity. J. Lab. Clin. Med., 88 (3), 477-486), au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1 ,2 A _J )L~~- ^~ 1 e de fer par micromole de protéi- nés; un produit à haute teneur en lactoferrine

- au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids de la matière sèche - résultant de la concentra- " tion par ultrafiltration du perméat n° 1 avec

FEUILLE DE REMPLACEMENT

une membrane ayant un pouvoir de coupure com¬ pris entre 80.000 et 300.000 daltons, de pré¬ férence de l 'ordre de 100.000 daltons, conformément à ce qui a été exposé ci-des- sus .

Enfin, l ' invention porte sur l 'util isation de ces fractions plus ou moins puri¬ fiées à des fins thérapeutiques et diététiques, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique. L' invention sera encore il lustrée par la description qui suit d'un mode de réal isation par¬ ticul ier, faite en référence au dessin annexé. Sur ce dessin: la Figure 1 montre sch ma i quement les étapes du procédé conforme à ce mode de réal isation; et les Figures 2 à 8 il lustrent les résultats des diverses analyses qui ont été effectuées.

Dans cet exemple, on a util isé un lait de m lange provenant du lac arium de Paris. Après décongélation par immersion dans un bain d'eau à 40°C, on a porté le lait à une température de 37°C et on l 'a écrémé sur une écrémeuse Wesfal ia, type DD 100 Z. Le volume du lait écrémé était de 60 li- très.

On a ensuite conduit un fractionnement des protéines du lait par des filtrations succes¬ sives, comme illusré par la Figure 1. Etape ( 1 ): On a soumis le lait écrémé à une micro¬ filtration dans une unité pilote SFEC comportant deux pompes vo 1 umé r i ques , à savoir une pompe d'al ime ta ion et une pompe de recirculation de 15 m .h , ainsi que deux modules équipés de mem- brane minérales CARBOSEP M14. La surface membra-

FEUILLE DE REMPLACEMENT

naire était de 1,6 m2. L'essai a été réal isé à une température de 48-50°C, avec une pression trans- membranaire moyenne de 1,45 bar. La vitesse de re¬ circulation du produit dans la membrane était de 4,0 . s ^-1 .

Ensuite, le rétentat obtenu (20 litres) a été diafiltré en continu avec 60 litres d'eau désionisée. Après diaf i I tra ion, le rétentat a été concentré deux fois. Etapes (2) et (3):

On a conduit deux étapes successives d'ultrafiltration sur une autre unité pilote équi¬ pée d'une pompe volumetri que avec une circulation de 4 m . h , et d'une membrame à fibres creuses ROMICON PM 100 pour l ' u 11raf i 1 trat ion de l 'étape (2) et ROMICON PM 10 pour 1 ' u 1 traf i 1 trat ion de l 'étape (3), la surface membranaire étant, dans les deux cas, de 1,5 m ² . La température était de 48-50°C, et la pression transmembrana i re moyenne, de 0,6 bar.

Le rétentat n° 2 (iO litres) a été dia¬ filtré en continu avec de l 'eau désionisée, jusqu'à élimination complète de 1 ' ≈ -lactalbu¬ mine. Une partie du perméat n° 2 a été concen¬ trée sur la membrane ROMICON PM10. Le rétentat n° 3 ainsi obtenu a été diafiltré en continu jusqu'à élimination complète des peptides, ce qui a été apprécié par HPLC en gel filtration à pH 2,2 (détection à 210 nm).

La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n° 2, par chroma ograph ie d'échange d ¹ ions, selon la méthode précitée de FOLEY et BATES. Différentes analyses ont été conduites

FEUILLE DE REMPLACEMENT

sur les diverses fractions obtenues:

. L ' é 1ec trophorèse en gel de polyacryla- mide (15%) - SDS des différentes fractions a été réal isée sur un équipement BIORAD selon la méthode de LAEMvLI U.K. (1978) "Nature, 227, 680-685".

La Figure 2, dont la légende est la sui¬ vante, représente le diagramme obtenu: A : 1a i t huma i n B : rétentat n° 1 C : perméat n° 1

D : rétentat n° 2 E : perméat n° 2 F : ré entat n° 3 G : lactoferrine isolée H : protéines étalons (Lf : lactoferrine;

Sa: sérum albumine; Lys : lysozyme; La : <=*( -lac¬ talbumine; provenant de la Société SIGMA Chemical Co . , Saint Louis, U.S.A. ).

Les différentes fractions ont égale- ment été soumises à une chroma tograph i e HPLC en gel filtration, par util isation d'une colonne TSK 2000 SW d'une longueur de 60 cm. La phase mobile était constituée par du phosphate monopotassique 0,01M amené à pH 2,2 avec de l 'acide or thophosphor i que . Le débit était de 1 ml .mn ^"1 , et la détection a été effectuée à 210 nm.

La Figure 3, dont la légende est la sui¬ vante, représente les chroma togrammes ob enus: A : lait huma in B : perméat n° 1

C : perméat n° 2 D : ré tentât n° 2 E : rétentat n° 3 1 : exclusion 2 : caséines

FEUILLE DE REMPLACEMENT

3 : «(-lactalbumine

4 : fractions peptidiques.

On a également effectué une analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par mi- crof i l tra ion, des produits séparés par 1 'ul raf il tra ion de l'étape (2), du rétentat n° 3 et de la lactoferrine isolée par chromatograph ie d'échange d' ions, les chromatogrammes obtenus étant représentés sur les Figures respec ivement 4 à 7. Une colonne C 18 VYDAC 218 TP 54 a été util i¬ sée. L'élution a é é réalisée par un gradient éta¬ bli à l'aide de deux tampons: tampon A (eau-TFA 0,1%) et tampon B (eau-acéton i tr i le 20/80-TFA 0,1%). Le gradient, de 30 à 90% de tampon B, a été effectué en 30 minutes. Le débit était de l ml. mn , et la longueur d'onde a été fixée à 280 nm. Légende de la Figure 4:

Analyse HPLC en phase inverse des pro¬ duits séparés par la microfiltration de l 'étape (1):

A : lait humain écrémé B : perméat n° 1 C : rétentat n° 1 1 : lactoferr ine 2 : sérum albumine

3 : caséines

4 : o^ -lactalbumine Légende de la Figure 5:

Analyse HPLC en phase inverse des pro- duits séparés par I ' u1 raf i 1 rat ion de l 'étape (2):

A : perméat n° 1

B : perméat n° 2

C : rétentat n° 2 1 : 1 actoferr ine

FEUILLE DE REMPLACEMENT

2 : se rum a 1 bumi ne

3 : ' -lactalbumine Légende de la Figure 6:

Analyse HPLC en phase inverse du réten- tat n° 3:

A : o -lactalbumine étalon

B : rétentat n° 3 Légende de la Figure 7:

Analyse HPLC en phase inverse de la lac- toferrine isolée par ch roma tog raph i e d' échange d ' ions :

A : lactoferrine étalon

B : lactoferrine puri fiée.

En concl usion, la microfi l tration du lait écrémé permet un perméat n° 1 contenant des peptides, de 1 ' o -lac albumine et des protéines de poids moléculaire plus élevés que les précé¬ dents, non iden t i f i es _^ 1 or s de l 'analyse HPLC en gel fi l trat ion (figure 3B) . Au cours de la microfi l ra ion, le flux de perméat ion et le taux de rétention protéique varient respectivement de 54,5 à 45,5 1. h ^" .m et de 33 à 42% au bout de 35 minutes, ce qui figu¬ re dans le tableau suivant:

FEUILLE DE REMPLACEMENT

TABLEAU 1

Rendement de l 'extraction de 1 ' ~*l - 1 ac ta1 bumi ne lors de la microfiltration de l 'étape (1 )

Temps β -lacta. __ -lacta Debi t Per for Taux mn . réétteennttaatt ppeerrmmééaat l.n ^' ,m mance de re¬ g/i g/1 membra- ten-

10 3,20 2,12 54,5 115 33

15 4,02 2,25 52,5 118 44

25 4,68 2,8 48, 75 130 42

35 5,08 2,93 45,5 133 42

Les résultats démontrent que dans les conditions expérimen ales util isées, il n'y a pas de colmatage rapide de la membrane.

La diaf i 1 trat ion du rétentat n° 1 permet d'éliminer la majeure partie de l ¹ -^-lactalbumine et des peptides. Le rétentat n° 1 final ainsi ob- tenu contient encore de 29 à 34% de lactoferrine ( figure 4C) .

L ' u1 traf i l tra t ion de l 'étape (2) conduit à la séparation de l' ^ -lactalbumine (perméat n° 2). Les protéines de poids moléculaires plus éle- vés, à savoir la lactoferrine et la sérum albumi¬ ne, sont retenues dans le rétentat n° 2 (Figure 5). La d iaf i 1 trat ion élimine la quas i-total i té de 1 ' c-\- 1acta1 bumine , et le rétentat n° 2 final ainsi obtenu (Figure 5C) contient, par rapport aux pro- téines vraies, de la lactoferrine (32 à 35%) de la sérum albumine (9-12%) et d'autres matières azo¬ tées non identifiées (probablement des peptides).

FEUILLE DE REMPLACEMENT

L ' u 1 t ra f i 1 ra t i on de l 'étape (3) concen¬ tre 1 ' ^~ ~ -lactalbumine en éliminant les fractions de plus faible poids moléculaire.

L'analyse en gel filtration du rétentat n° 3 (Figure 3E) montre la présence d'un seul pic, alors que la chromatograph ie HPLC en phase inverse (Figure 6B) met en évidence, outre le pic princi¬ pal , un petit pic surnuméraire également présent dans la protéine purifiée de référence (Figure 6A).

La composition en acides aminés de 1 ' - - lactalbumine isolée est en accord avec cel le pu¬ bl iée par FINDLAY 3 . B .C . , BREW K. 1972 "Eur. J. Bio Chem. , 27, 65-86", avec un coefficient de cor- r lation de 0,986.

La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n° 2 en util isant ses propriétés basiques. La technique util isée permet d'obtenir cette protéine avec un degré de pureté élevée (Figure 7). La comparaison de sa composition en acides aminés avec cel le publ iée par QUERINJEAN P. , MASSON P.L. , HEREM NS J.F. 1971 "Eur. J. Biochm. 20, 420-325", donne un coefficient de cor¬ rélation de 0,974. Le profil ch roma tograph i que ob- tenu en phase inverse et 1 ' é 1ec t rophorèse en SDS montre une homogénéité de la lactoferrine obtenue. Elle contient 0,75 ^mo 1 e de fer/ immole de pro¬ téines, ce qui représente une saturation de 37,5%. La Figure 8 représente la courbe de sa¬ turation de la lactoferrine humaine par addition progressive d'une solution de Fe (NH^^^O _^ ^ U,2 rrM dans HC1 0,01M. La saturation est atteinte lorsque 0,71 de fer/mg de protéine sont ajoutés. Ceci correspond à la fixation de 0,96

FEU/LLE DE REMPLACEMENT

~ de lactoferrine. L'adsorption à 470 nm montre que la lactoferrine initiale contient 0,54 de fer/mg de protéine. La saturation initiale est donc de 37,5%. La capa- cité de fixation totale est de 1 , Hi o I e/ no 1 e de protéines, soit 85% de la capacité théorique.

Ainsi, avec le procédé de l ' invention, les deux protéines majeures du lactosérum humain sont séparées et purifiées sans que la capacité de séquestration du fer de la lactoferrine en soit apparemment affectée. Il est à noter que le pro¬ cédé proposé permet également de récupérer, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres compo¬ sants du lait tels que caséines et protéines de poids moléculaire élevé dans le rétentat π° 1, et peptides glycosylées ou non dans le perméat n° 3.

FEUILLE DE REMPLACEMENT