La présente invention concerne une méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales et ses applications, notamment pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient, ainsi que pour cribler des médicaments anticancéreux. La présente invention concerne également une bibliothèque de référence comprenant les profils des capacités de réparation de l' ADN de différents sous-types d’un cancer, obtenus par la méthode de l’invention, et ses applications pour la classification des cancers.

Les traitements conventionnels des cancers (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie) reposent sur des protocoles adaptés à chaque cancer en fonction du stade d’évolution et du type de cancer, déterminés selon les critères standards de classification, tels que la classification TNM ( Tumor , Node, Métastasés ). L’immunothérapie des cancers qui a révolutionné la prise en charge des patients en échec thérapeutique, comprend l' utilisation d’anticorps monoclonaux, en particulier des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire tels que des anti-CTLA-4, anti-PD-l, et anti-PD-L1, et des anticorps bispécifiques qui lient les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires.

Pour optimiser la prise en charge thérapeutique des patients, de multiples biomarqueurs sont développés pour stratifier (ou classifier) les patients à différentes étapes de leur prise en charge, en particulier pour le diagnostic, le pronostic, le choix, le suivi et la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement.

Bien qu’elle soit indispensable, la stratification des patients atteints de cancer est très compliquée et implique l’utilisation de nombreux biomarqueurs. Ceci s’explique du fait de l’hétérogénéité de chacun des types et sous-types de cancer et de la complexité des mécanismes d’apparition des cancers et de résistance au traitement. Cette complexité et ses difficultés sont illustrées par quelques exemples.

Les cancers sont notamment classifiés en différents sous-types en fonction de l’expression de marqueurs par les cellules tumorales. Par exemple, les cancers du sein sont classifiés en sous-types en fonction de l’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR) et de HER2/ERB2/neu. Généralement les cancers ER+ et PR+ sont traités par le tamoxifène. Cependant tous les cancers du sein ER+ ne répondent pas au traitement et d’autres marqueurs sont recherchés pour identifier les non-répondeurs. Les cancers du sein triple négatifs (ER-, PR-, ERB2-) sont traités par chimiothérapie mais les taux d’échec et de récidive sont fréquents. De nombreux biomarqueurs sont explorés pour caractériser ces sous-types, mais aucun n’a montré d’utilité clinique pour le moment.

Les technologies « omiques » ont été utilisées pour caractériser les cancers du sein au niveau ADN, ARN, protéines, carbohydrates (Judes et al., Cancer Lett., 2016, 382, 77- 85 ; WO 2001/075160). Ces marqueurs ne sont pas suffisamment robustes et précis pour être utilisés en clinique.

Les cancers sont également classifiés en différents sous-types par la présence d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral, telles que des mutations dans certains gènes clés, des remaniements chromosomiques ou des amplifications de gènes, à l’origine d’activation de voies de prolifération et de survie cellulaire. Par exemple, les mélanomes sont classés en sous-types en fonction des mutations dans différents gènes clés (BRAF, NRAS), responsables de l’activation constitutive de la voie des MAP Kinases. Cependant, l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques dirigés contre les protéines BRAF mutées par exemple, n’est pas toujours associée comme attendu à l’inactivation des voies de signalisation (Manzano et al., Ann. Transl. Med., 2016; 4, 237). La classification ainsi obtenue n’est donc pas suffisante pour identifier les répondeurs et ne permet pas d’administrer le bon traitement aux patients.

Les cancers sont aussi classifiés en fonction d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral (mutations, taux de mutation, instabilité micro- satellitaire (MSI), amplifications de gènes) favorisant l’apparition de néo-antigènes sur les tumeurs, qui sont susceptibles de prédire la réponse aux immunothérapies. Toutefois, les technologies d’amplification d’ADN utilisées pour identifier les mutations à l’origine de néo-antigènes introduisent des biais et des erreurs, et ne sont pas fiables pour cette application (« The problem with neoantigen prédiction », Nat. Biotech., 2017, 35, 97). D’une façon générale, les méthodes qui reposent sur la détection d’altération génomiques dans l' ADN tumoral n’analysent que très partiellement les défauts pouvant survenir et surtout n’en étudient ni les causes ni les conséquences au niveau fonctionnel.

En plus des biomarqueurs précédents, les défauts dans les systèmes de réparation de l' ADN sont également utilisés comme biomarqueurs indicatifs du développement, de la progression et de la réponse au traitement des cancers. Six systèmes de réparation ont été identifiés chez l’Homme, dont deux ont pour fonction d’éliminer les bases modifiées de l' ADN. Le système de Réparation par Excision de Bases (REB ou BER pour Base Excision Repair) est plus spécifiquement dédié à la réparation des petites lésions des bases de l' ADN (dommages oxydatifs, sites abasiques, fragmentations, méthylations et Éthéno-bases). Le système de réparation par excision de nucléotide (REN ou NER pour Nucléotide Excision Repair) prend en charge les lésions volumineuses induisant une distorsion de la double-hélice d’ADN (adduits acétylamino- fluorène, cisplatine et psoralène ; dimères induits par les UV B et C ; lésions covalentes formées entre une base de l' ADN et une autre molécule). Ces deux systèmes de réparation présentent des caractéristiques communes et comprennent dans tous les cas : (i) une étape d’excision au cours de laquelle le nucléotide modifié est éliminé et (ii) une étape de resynthèse qui met en œuvre les polymérases présentes dans le milieu, au cours de laquelle au moins un nucléoside triphosphate (nucléotide) présent dans le milieu est incorporé en remplacement dans le brin d’ADN.

La Demande US 2017/198360 décrit un test moléculaire qui permet de distinguer des sous-types de cancers en fonction de défauts génétiques de la réparation de l' ADN, conduisant à la surexpression ou la sous-expression de transcrits liés à la réparation de l' ADN. Cette stratification est utilisée pour sélectionner les chimiothérapies les plus appropriées parmi les drogues ciblant l' ADN ou les activités de réparation de l' ADN. Toutefois, il est bien connu que la résistance ou la sensibilité de tumeurs aux traitements affectant directement ou indirectement l' ADN ou la réparation de l' ADN provient de dérégulation de la réparation de l' ADN, mais également de dérégulation de la signalisation appelée réponse au dommage de l' ADN ( DNA Damage Response ou DDR) et de plusieurs senseurs et effecteurs moléculaires régulant à leur tour la DDR et appartenant notamment aux voies de signalisation /prolifération cellulaire. Ces réseaux complexes font intervenir des réseaux enzymatiques redondants, régulés notamment au niveau post-traductionnel ou par interactions protéines-protéines. Ainsi le dosage des transcrits de gènes n’apporte pas d’information effective sur les activités de réparation réellement fonctionnelles ou réellement inactives. De plus, certains défauts dans les activités peuvent être compensés par l’intervention de protéines/enzymes différentes. Ces mécanismes compensatoires ne peuvent pas être détectés au niveau génétique non plus. Ainsi, le test moléculaire proposé ne peut pas déterminer précisément et avec pertinence, les capacités fonctionnelles de réparation de l' ADN dans les tumeurs. En conséquence, les méthodes de stratification de patient proposées aujourd’hui ne sont pas suffisantes et sont très limitées par rapport au sous-type de cancer qu’elles caractérisent. Elles ne permettent pas de choisir la thérapie la plus appropriée parmi le choix des protocoles proposés aujourd’hui, en fonction de la classe thérapeutique des agents utilisés ou pour des combinaisons d’agents thérapeutiques de classes différentes. Elles ne permettent pas d’identifier les patients qui vont répondre aux différentes thérapies.

En conséquence, il existe un besoin de disposer de méthodes de stratification des patients qui soient plus performantes.

Les défauts de l' ADN s’accumulent lorsque les systèmes de réparation de l' ADN sont déficients au niveau fonctionnel. Ces déficiences fonctionnelles peuvent être causées par des dysfonctionnements à différents niveau des régulations moléculaires régissant la réparation de l' ADN : niveau épigénétique, ADN, ARN, Protéines, modifications post- traductionnelles. Il est donc beaucoup plus pertinent de chercher à caractériser directement la fonctionnalité des systèmes de réparation que le statut mutationnel dans certains gènes ou zones du génome choisis a priori.

Des études ont montré qu’il existe une association entre des types de cancer ou des sous-types de cancer et la capacité de réparation des protéines nucléaires d’une tumeur/d’un cancer (Forestier, et al, PLoS One., 2012, 7, e5l754). En particulier, les activités de réparation de l' ADN sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaire et à leur fonctionnalité. Des mutations dans des voies de signalisation/prolifération cellulaire impactent les capacités de réparation de l' ADN (Velic D et al, Biomolecules, 2015, 5, 3204-3259). Les activités de réparation de l' ADN sont étroitement associées à des mutations, des translocations, des amplifications, des instabilités de microsatellites. Les capacités de réparation révèlent des défauts de réparation qui ont des conséquences au niveau fonctionnel.

Le mélanome métastatique a longtemps fait l’objet d’un mauvais pronostic avec des taux de réponse de 15-20% à la chimiothérapie et à la radiothérapie (Quirt et al., Oncologist, 2007, 12, 1114-1123). Les mécanismes de réparation de l' ADN seraient responsables de ce fort taux d’échec (Sarasin A and Dessen P, Curr. Mol. Med., 2010, 10, 413-418 ; Tentori et al., Curr. Med. Chem., 2009, 16, 245-257). Plus généralement l’efficacité de la réparation par excision de nucléotide module la réponse des patients au cisplatine (Gavande et al., Pharmacol. Ther., 2016, 160, 65-83) et l’efficacité de la radiothérapie dépend des capacités de réparation des cassures double -brin (Biau et al, Neoplasia, 2014, 16, 835-844).

La demande internationale WO 2004/059004 décrit un procédé d’évaluation quantitative des capacités globales et spécifiques de réparation de l' ADN d’au moins un milieu biologique dans lequel la réparation de lésions de l' ADN par les enzymes de réparation présentes dans le milieu biologique à tester est réalisé en présence d’un seul nucléotide marqué.

Or, l’utilisation d’un seul nucléotide marqué ne permet pas d’être dans des conditions optimales pour étudier la réparation de chacune des lésions et déterminer quelle voie en particulier la répare.

En effet, les différentes lésions sont formées par des réactions chimiques ou physiques à partir de bases ou nucléosides bien spécifiques (C, G, T ou A) et sont réparées par des voies ne conduisant pas au simple remplacement de la lésion mais au remplacement éventuel en plus, de nucléotides entourant la lésion, en fonction de la nature de la voie empruntée. Le BER peut intervenir par une voie de « resynthèse courte » (short patch ; remplacement de 1 à 3 nucléotides) ou une voie de « resynthèse longue » (long patch ; remplacement d’une dizaine de nucléotides) ; le NER peut également intervenir et conduire au remplacement de 25 à 30 nucléotides. Parfois le mécanisme NER peut se substituer au mécanisme BER.

Si la réparation d’une lésion L1 emprunte une voie BER de synthèse courte, c’est majoritairement le nucléotide à l’origine de la formation de L1 qui sera incorporé. Or si la réaction de réparation a lieu avec un nucléotide marqué différent, la réparation sera mal évaluée car considérée comme inefficace alors qu’elle n’aura pas été quantifiée dans les conditions appropriées.

Si la réaction de réparation de la lésion L1 a lieu avec le nucléotide marqué correspondant mais pas avec d’autres nucléotides on ne pourra pas comparer l’efficacité d’incorporation des différents nucléotides et on ne pourra pas dire si la réparation est fautive ou pas.

Si la réparation d’une lésion L1 emprunte la voie BER avec synthèse longue ou la voie NER, on aura une incorporation statistique identique de tous les nucléotides. Mais il est indispensable de conduire la réaction avec au moins 2 nucléosides différents pour le vérifier.

L’utilisation d’un seul nucléotide peut conduire à des interprétations fausses, ne donne pas d’informations sur la fidélité de la réparation et ne permet pas de conclure quant au mécanisme de réparation par excision resynthèse sollicité.

Il n’existe donc pas dans l’art antérieur de méthode permettant d’établir un profil précis des capacités de réparation de l' ADN d’une tumeur.

La Demanderesse a développé une méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales permettant de pallier ces inconvénients.

Ainsi, la présente invention concerne une méthode in vitro pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales, comprenant au moins les étapes suivantes:

(a) l’incubation d’un extrait de cellules tumorales comprenant une activité de réparation de l' ADN avec au moins deux molécules d’ADN endommagées comprenant des lésions distinctes de l' ADN et aux moins deux nucléotides différents marqués,

(b) la mesure de la quantité de chaque nucléotide marqué incorporé dans chaque molécule d’ADN endommagée qui résulte de l’activité des enzymes de réparation présentes dans ledit extrait cellulaire à l’étape (a),

(c) la détermination, à partir des valeurs mesurées à l’étape (b), de l’un au moins des paramètres suivants :

(c ₁ ) la signature enzymatique de la réparation de l' ADN;

(c ₂ ) la contribution de la réparation de chacune des lésions de l' ADN par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et

(c ₃ ) le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN, et

(d) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN desdites cellules tumorales à partir des paramètres déterminés à l’étape (c).

Au sens de la présente invention, on entend par « cellules tumorales », les cellules tumorales isolées à partir d’un échantillon biologique prélevé chez un patient et les lignées de cellules tumorales. Les cellules tumorales sont notamment isolées à partir d’un échantillon de tumeur ou d’un échantillon de sang contenant des cellules tumorales circulantes, prélevés chez un patient. L’échantillon de tumeur est par exemple obtenu par biopsie ou exérèse chirurgicale de la tumeur. Les cellules tumorales sont généralement isolées par dissociation du tissu tumoral, notamment par digestion enzymatique, par exemple avec la collagénase. Cette étape préalable n’est pas nécessaire lorsque l’échantillon biologique contient des cellules tumorales circulantes.

Au sens de la présente invention, on entend par « tumeur », une tumeur maligne, c’est-à-dire une tumeur associée à un cancer. Une tumeur inclut une tumeur primitive et une métastase. La métastase peut être localisée dans un ganglion lymphatique drainant la tumeur (métastase ganglionnaire) et/ou dans un tissu ou un organe différent de la tumeur primitive.

Les cancers qui peuvent être classifiés par la méthode de l’invention incluent notamment, les cancers liés à l’exposition à des agents génotoxiques comme le mélanome, en particulier le mélanome métastatique (lié à l’exposition aux ultra- violets), le cancer du poumon (lié à l’exposition au tabac) et le cancer de la tête et du cou (lié à l’exposition au tabac et à l’alcool) ; d’autres cancers comme le cancer du sein, le cancer des ovaires, le cancer de l’endomètre, les sarcomes ; et tout cancer solide pour lesquels une biopsie ou un ganglion envahi est disponible.

Au sens de la présente invention, on entend par « tumeur préalablement caractérisée », une tumeur caractérisée par les méthodes conventionnelles de classification des tumeurs et éventuellement les nouvelles méthodes de biologie moléculaire ou toute autre méthode permettant d’établir des catégories de tumeurs.

Les méthodes conventionnelles de classification des tumeurs incluent en particulier : la classification anatomo-pathologique et histologique qui prend en compte l’organe ou le tissu d’origine et le type histologique de la tumeur et permet de déterminer le type de cancer ; la classification en grades qui permet d’évaluer le degré de différenciation de la tumeur et son évolution (lente et locale ou rapide) ; la classification TNM ( Tumor , Node, Metastasis) qui permet de déterminer le stade d’avancement du cancer.

Les nouvelles méthodes de classification des tumeurs reposent sur une division des tumeurs en sous-types, en fonction de biomarqueurs indicatifs, tels que des marqueurs génétiques, épigénétiques, protéomiques, glycomiques, d’imagerie ou d’autres biomarqueurs. Les biomarqueurs indicatifs de la présence d’un cancer, notamment des marqueurs spécifiques de certains types de tumeur, sont utiles pour le diagnostic. Les biomarqueurs indicatifs de l’évolution future d’un cancer (progression, prédiction et suivi de la réponse à un traitement), sont utiles pour le pronostic, le choix du traitement, le suivi et la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement. A titre d’exemples de biomarqueurs, on peut citer les gènes, ARN, protéines, métabolites ou les processus biologiques.

Les types de cancers peuvent être notamment caractérisés ou classifiés en différents sous-types en fonction des marqueurs exprimés par les cellules tumorales. Par exemple, le cancer du sein est divisé en sous-types en fonction de l’expression des récepteurs aux œstrogènes (ER) et à la progestérone (PR) et de HER2 par les cellules tumorales.

Les types de cancers peuvent également être caractérisés ou classifiés en différents sous-types par la présence d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral, telles que des mutations dans certains gènes clés, des remaniements chromosomiques ou des amplifications de gènes, à l’origine d’activation de voies de prolifération et de survie cellulaire. Ces altérations génomiques sont notamment des gènes de fusion, des délétions, des points chauds ( hot-spots ) de mutation, des variants de gènes, des taux de mutations élevés, des gènes avec de multiples copies (amplifications de gènes), des marqueurs d’instabilité des microsatellites (MSI), des mutations dans des gènes clés connus pour être responsables de l’activation de voies de signalisation de prolifération et d’oncogenèse ou des anti-oncogènes, et des combinaisons de ces altérations génomiques. A titre d’exemple des mutations précédentes, on peut citer les mutations dans des gènes de réparation de l' ADN, de la réponse au dommage de l' ADN ( DNA Damage Response), des récepteurs à activité tyrosine kinase, des kinases, en particulier EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1, ERBB2, PTEN, MEK, MAP2K1, KIT, CDKN2A, MYC, ou des anti-oncogènes comme TP53. Par exemple, dans le cadre de la classification du mélanome métastatique, les sous types de cancer sont BRAF muté, NRAS muté et non muté pour BRAF et NRAS.

Les cancers sont également classifiés en fonction d’altérations génomiques dans l' ADN tumoral (mutations, taux de mutation, instabilité microsatellitaire, amplifications de gènes) qui favorisent l’apparition de néoantigènes sur les tumeurs et sont susceptibles de prédire la réponse aux immunothérapies.

Les altérations génomiques sont mises en évidence par des méthodes « omiques » (génomique, protéomique, transcriptomique, métabolomique) ou tout autre méthode permettant la caractérisation directe ou indirecte d’altérations génomiques. Les différents sous-types de cancers ne réagissent pas de la même manière aux traitements thérapeutiques recommandés.

Au sens de la présente invention, on entend par « patient » un individu, humain ou animal, de préférence un humain, atteint de cancer.

On entend par « traitement », un traitement thérapeutique anti-tumoral ou anti cancéreux. Il s’agit notamment de la chimiothérapie, la radiothérapie, la thérapie ciblée et 1’ immunothérapie .

Au sens de la présente invention, on entend par « plasmide », un plasmide superenroulé, c’est-à-dire sans cassure simple-brin ou double-brin de l' ADN.

On entend par « réparation », la réparation de l' ADN ; « signature de réparation », la signature des capacités de réparation de l' ADN ; « profil de réparation », le profil des capacités de réparation de l' ADN.

On entend par « ADN endommagé », « molécule d’ADN endommagée », « ADN lésé » ou « molécule d’ADN lésée », une molécule d’ADN comprenant des lésions de l' ADN, de préférence un seul type de lésions de l' ADN, ou plusieurs lésions créées par un même agent génotoxique ou chimique.

Dans un mode de mise en œuvre de l’invention, lesdites cellules tumorales sont isolées à partir d’un échantillon de tumeur ou de sang d’un patient.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, lesdites cellules tumorales sont isolées à partir d’au moins une tumeur préalablement caractérisée.

En particulier, la tumeur est définie par les critères conventionnels de classification des tumeurs tels que définis ci-dessus. En outre, la tumeur est définie par au moins un marqueur d’intérêt pour le diagnostic et/ou le traitement de ce type de cancer, notamment un biomarqueur ou une combinaison de biomarqueurs spécifiques d’un sous-type de ce type de cancer, éventuellement associés à un ou plusieurs biomarqueurs de la progression, de la prédiction et/ou du suivi de la réponse à un traitement de ce type ou sous-type de cancer.

La tumeur caractérisée correspond notamment au sous-type du cancer du patient à tester ou pour lequel on recherche de nouveaux agents antitumoraux ou un traitement plus efficace. La mise en œuvre de la méthode de l’invention sur des cellules tumorales isolées à partir d’une tumeur caractérisée telle que définie ci-dessus permet d’obtenir un profil de réparation de cellules tumorales qui est spécifique d’un sous-type de cancer particulier. Un tel profil de réparation qui est associé à sous-type de cancer particulier est dénommé profil de réparation référence ou profil de référence.

La méthode de l’invention est avantageusement mise en œuvre avec un ensemble de tumeurs différentes d’un même type de cancer préalablement caractérisées (Bibliothèque ou Banque de tumeurs), de façon à obtenir un ensemble de profils de référence dénommé bibliothèque ou banque de référence. De préférence, la méthode de l’invention est mise en œuvre avec des tumeurs correspondants à différents sous-types d’un type de cancer incluant au moins les sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix du traitement chez les patients, de façon à obtenir des banques de profils de référence spécifiques des différents sous-types de différents types de cancer, en particulier des sous-types de cancer qui conditionnent le choix du traitement chez les patients. Pour chacun de ces sous-types de cancer particuliers, la banque de référence inclut de préférence le profil de référence de patients répondeurs et/ou non-répondeurs pour le traitement thérapeutique recommandé, en particulier une thérapie ciblée, notamment une thérapie guidée par des mutations dans des gènes clés, comme par exemple les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.

Dans un mode de mise en œuvre de l’invention, le patient est atteint d’un cancer lié à l’exposition à des agents génotoxiques, par exemple un mélanome, notamment un mélanome métastatique de sous-type déterminé, à savoir, BRAF muté, NRAS muté ou non muté pour BRAF et NRAS.

Pour la mise en œuvre de la méthode de l’invention, les cellules tumorales isolées sont préalablement traitées de façon à extraire les protéines nucléaires qui contiennent les enzymes de réparation de l' ADN. L’extraction des protéines nucléaires à partir des cellules tumorales isolées est réalisée selon les techniques standards bien connues de l’Homme du métier. Les cellules tumorales isolées sont généralement lysées pour isoler les noyaux puis les noyaux sont ensuite lysés de façon à extraire les protéines nucléaires. Pour préparer l’extrait de protéines nucléaires, on peut utiliser les protocoles décrits pour les tests de transcription in vitro ou les tests de réparation de l' ADN in vitro, comme par exemple ceux décrits par Dignam JD et al. (Nucleic Acids Research, 1983, 11;1475-1489); Kaw L et al. (Gene Analysis Techniques, 1988, 5, 22-31); Iliakis G et al. (Methods Mol. Biol., 2006, 314, 123-31); Luo Y et al. (BMC Immunol., 2014, 15, 586-). Les extraits nucléaires peuvent en outre être fractionnés ou dialysés selon les méthodes conventionnelles. Toutes les étapes de préparation de l’extrait de protéines nucléaires sont réalisées dans des conditions qui ne dénaturent pas les activités enzymatiques et les protéines contenues dans les cellules tumorales, de façon à ce que l’activité de réparation de l' ADN initialement présente dans l’échantillon de cellules tumorales soit préservée dans l’extrait cellulaire qui est analysé dans la méthode de l’invention.

Dans un mode de mise en œuvre de l’étape (a) de la méthode de l’invention, l’extrait de cellules tumorales comprenant une activité de réparation de l' ADN est un lysat cellulaire, de préférence un lysat nucléaire, de manière préférée un extrait de protéines nucléaires desdites cellules tumorales.

Conformément à la méthode de l’invention, l' ADN endommagé qui sert de matrice de réparation pour les enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales est un ADN simple brin ou double-brin, linéaire ou circulaire, court (inférieur à 100 bases) ou long (supérieur à 100 bases). Il s’agit notamment de courts ou longs fragments d’ADN tels que décrits dans la Demande WO 01/90408 ou d’un ADN double- brin circulaire superenroulé, notamment un plasmide tel que décrit dans la Demande WO 2004/059004, Millau et al., Lab. Chip., 2008, 8, 1713-1722 ; Prunier et al., Mutation Research, 2012, 736, 48-55. De préférence, l' ADN endommagé est un plasmide endommagé.

Conformément à la méthode de l’invention, l' ADN endommagé comprend des lésions induites par un agent physique ou chimique génotoxique connu, notamment par traitement d’un plasmide isolé ou de cellules comprenant ledit plasmide, par l’agent génotoxique. Parmi les lésions présentes dans l' ADN endommagé ou lésé, on peut citer notamment, les lésions des bases puriques ou pyrimidiques, des sucres, de la structure de la double-hélice et les cassures simple-brin et double -brin.

Les lésions des bases puriques ou pyrimidiques incluent :

- les sites abasiques (AbaS), notamment les dépurinations qui peuvent être générés par traitement acide de l' ADN à une température élevée comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al., précités ; - les glycols de thymine et/ou de cytosine (Glycol), qui peuvent être générés par traitement de l' ADN avec du permanganate de potassium comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al., 2008, précités ;

- l’alkylation, notamment la formation d’éthéno-bases (Éthéno), telles que l’éthéno-guanine et/ou l’éthéno-adénosine, en particulier l’éthéno-guanine, induites notamment par le trans,trans -2-4 decadiénal (DDE), comme décrit dans la Demande WO 2004/059004, Millau et al. et Prunier et al., précités ; ou le mélange éthéno-guanine et éthéno-adénosine créé par du chloroacétaldéhyde (B. Tudek, et al. IARC Sci Publ (1999) 279-93).

- les lésions oxydatives, notamment la formation de 8-oxo-guanine (8-oxo- G) ou 8-oxo-2’désoxyguanosine (8-oxo-dG); la 8-oxo-G est notamment induite par photosensibilisation en présence de riboflavine, comme décrit dans Millau et al. et Prunier et al. ; la formation de 8-oxo-dG est notamment induite par traitement avec un endoperoxyde tel que DHPN0 ₂ , comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ;

- les photoproduits, notamment les dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, induits par les UV B ou C, comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., précités ; les dimères de pyrimidines formés par photosensibilisation aux UV A en présence de norfloxacine, comme décrit dans Sauvaigo S, et al, Photochem. Photobiol. 200l;73, 230-237;

- les adduits chimiques, induits notamment par des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)) tel que le Benzo[a]Pyrène ; des agents alkylants tels que le cisplatine, la mitomycine et le chlorambucil ; des amines aromatiques ; et des mycotoxines ;

- la désamination;

- la méthylation ; et

- la déméthylation.

Les lésions de la structure de la double-hélice incluent la formation de pontages intra-brins et inter-brins, généralement provoqués par les ultraviolets et les antitumoraux bifonctionnels, tels que les UV B, le cisplatine, le psoralène en présence d’UV A, la mitomycine et le chlorambucil ; les agents intercalants forment des liaisons covalentes stables entre les bases opposées des brins d’ADN. Les lésions du cisplatine, en majorité des pontages G-G et G-A intra-brins et des pontages G-G inter-brins, sont notamment générées comme décrit dans Millau et al. et Prunier, précités. Les lésions du psoralène, notamment des pontages T-T intra-brins et inter-brins, sont générés par photosensibilisations aux UV A, comme décrit dans Millau et al.

Les lésions des sucres (désoxyriboses) entraînent une rupture des liaisons phosphodiesters au niveau du site lésé, suivie d’une rupture du brin d’ADN.

Les cassures simple-brin et double-brin sont notamment produites par des agents tels que les radiations ionisantes et par l’action des radicaux libres.

De préférence, l' ADN endommagé comprend des lésions des bases puriques et/ou pyrimidiques ou des lésions de la structure de la double-hélice telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire des lésions qui n’induisent pas de cassures simple-brin ou double-brin de l' ADN.

Conformément à la méthode de l’invention, chaque ADN endommagé, de préférence un plasmide endommagé, porte des lésions prédéfinies, distinctes des lésions d’un autre ADN endommagé. En conséquence, les lésions de chaque ADN endommagé sont caractérisées préalablement à la mise en œuvre de l’étape (a), c’est-à-dire que la nature ou le type de lésions et le nombre de lésions présentes sur chaque ADN sont déterminés comme décrit dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., précités.

En outre, la fraction super-enroulée de chaque plasmide est sélectionnée après le traitement de l' ADN par l’agent génotoxique ou la combinaison d’agents génotoxiques qui induit des lésions des bases puriques et/ou pyrimidiques et/ou de la structure de la double- hélice telles que définies ci-dessus, de façon à exclure les cassures de brin (structure relâchée) et éviter l’action des nucléases.

Dans un mode de mise en œuvre avantageux de la méthode de l’invention, l’étape (a) est réalisée avec au moins deux ADN endommagés comprenant des lésions distinctes, de préférence sélectionnées dans le groupe constitué par :

(1) 8-oxo-G ;

(2) Sites abasiques (AbaS) ;

(3) Éthénobases (Éthéno), notamment Éthéno-guanines (Éthéno-G) et/ou Éthéno- Adénines (Éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; (4) Glycols de thymine et/ou de cytosine (Glycols) ; et

(5) Photoproduits, notamment dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange.

Les ADN endommagés sont avantageusement des plasmides endommagés.

De préférence, chaque ADN endommagé porte un seul type de lésions telles que listées ci-dessus, à savoir 8-oxo-G, AbaS, Éthéno, Glycols ou Photoproduits.

Dans un mode de mise en œuvre avantageux de la méthode de l’invention, l’étape (a) est réalisée avec au moins un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant un seul type de lésions réparées par le système de réparation par excision de base (REB ou BER pour « Base Excision Repair ») et au moins un second ADN, de préférence un plasmide, comprenant un seul type de lésions réparées par le système de réparation par excision de nucléotides (REN ou NER pour « Nucléotide Excision Repair).

De préférence, les lésions réparées par la BER sont sélectionnées dans le groupe constitué par : (1) 8-oxo-G ; (2) sites abasiques (AbaS) ; (3) Éthénobases (éthéno), notamment Éthéno-guanines (éthéno-G) et/ou Éthéno-Adénines (éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; (4) Glycols de thymine et/ou de cytosine, et les lésions réparés par le NER sont des photoproduits, notamment des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et des pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, de préférence en mélange.

Selon une disposition avantageuse des modes de mise en œuvre précédents, l’étape (a) est réalisée avec au moins un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant des lésions 8-oxoG et au moins un second ADN, de préférence un plasmide, comprenant des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et des pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP), seuls ou en mélange, de préférence en mélange.

De préférence, l’étape (a) est réalisée avec :

- un premier ADN, de préférence un plasmide, comprenant des lésions 8- oxoG ;

- un deuxième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des sites abasiques (AbaS) ;

- un troisième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des Éthénobases (Éthéno), notamment Éthéno-guanines (Éthéno-G) et/ou Éthéno-Adénines (Éthéno-A), en particulier Éthéno-G ; - un quatrième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des Glycols de thymine et/ou de cytosine ;

- un cinquième ADN, de préférence un plasmide, comprenant des dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) ; et

- un sixième ADN, de préférence un plasmide, comprenant un mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP).

De préférence, l' ADN endommagé ou lésé (étape (a)) est immobilisé sur un support solide, permettant ainsi d’éliminer facilement les nucléotides marqués non-incorporés à l’étape (a), par une étape de lavage, avant l’étape (b) de mesure de l’incorporation du nucléotide dans l' ADN endommagé. Le support solide est un support approprié à l’immobilisation des acides nucléiques et notamment de l' ADN, tel que par exemple un support en verre, polypropylène, polystyrène, silicone, métal, nitrocellulose ou nylon, optionnellement modifié par un film poreux, notamment un film de nylon ou d’hydrogel, par exemple un hydrogel de polyacrylamide. Il s’agit notamment d’une lame de verre ou de silicone recouverte d’un hydrogel. Le support est avantageusement un support miniaturisé du type micropuce. De tels supports modifiés par un film poreux sont notamment décrits dans la Demande WO 2006/136686 ; Millau et al. et Prunier et al., précités. Pour immobiliser l' ADN sur le support, l' ADN est déposé sur le support, par exemple de façon automatisée à l’aide d’un robot tel qu’un robot piézo-éléctrique.

La méthode de l’invention peut être réalisée en parallèle sur plusieurs extraits de cellules tumorales, avec un support sur lequel sont immobilisées différentes séries d’ADN lésé. Il s’agit notamment d’une méthode à haut-débit, partiellement ou entièrement automatisée.

Conformément à la méthode de l’invention, les nucléosides utilisés comme marqueurs sont les nucléosides classiques Adénosine, Cytidine, Guanosine, Thymidine ou Uracile, sous forme triphosphate, c’est à dire des nucléotides. La méthode est conduite avec au moins deux nucléosides triphosphates (nucléotides) parmi dCTP, dGTP, dATP et dUTP.

L’emploi de dGTP permet d’obtenir des signaux plus intenses qu’avec les autres dNTPs pour la réparation des lésions réparées par la BER et formées à partir de la base guanine comme par exemple la 8-oxo-guanine. L’emploi d’un autre dNTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dGTP est incorporé en majorité par rapport aux autres dNTPs.

L’emploi de dATP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base adénine comme par exemple l’éthénoadenine et les sites abasiques. L’emploi d’un autre dNTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dATP est incorporé en majorité par rapport aux autres dNTP.

Les sites abasiques sont également formés à partir de la dépurination de la guanosine, il est ainsi intéressant de comparer l’incorporation de dATP, dGTP et d’un autre dNTP pour la réparation de cette lésion.

Les lésions Éthénobases sont généralement constituées d’un mélange d’Éthéno-A et Étheno-G, l’emploi d’un nucléotide de nature différente de dATP et dGTP sert de point de comparaison et permet de bien s’assurer que le dATP et le dGTP sont incorporés en quantité plus importante que les autres dNTP.

L’emploi de dCTP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base cytosine comme par exemple les glycols de cytosine.

L’emploi de dUTP permet d’obtenir des signaux plus intenses pour la réparation des lésions réparées par la BER et créées à partir de la base thymine comme par exemple les glycols de thymine.

L’emploi d’un dNTP différent de dCTP ou dUTP sert de référence.

L’emploi d’au moins deux dNTPs différents permet de s’assurer que la réparation des photoproduits est bien conduite par la voie NER. Bien que la formation des photoproduits advienne surtout au niveau des T et des C, leur réparation qui passe par l’élimination et le remplacement d’une trentaine de bases, va conduire à l’incorporation statistiquement équivalente des 2 nucléotides.

Les aberrations de réparation mesurées par comparaison des signatures obtenues en présence des différents nucléotides permettent d’identifier les échantillons aux voies de réparation dysfonctionnelles.

De préférence, l’étape (b) de la méthode de l’invention est mise en œuvre avec au moins les nucléotides dGTP et dCTP marqués, de manière préférée les nucléotides dCTP, dGTP, dATP et dUTP marqués. Le dCTP est préféré pour le choix, le suivi, la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’une thérapie ciblée, guidée par la présence de mutations dans des gènes clés comme les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.

Les nucléotides sont marqués, ce qui permet de les détecter et de les quantifier lorsqu’ils sont incorporés à l' ADN endommagé suite à la réaction de réparation de l' ADN. Le traceur ou marqueur qui est utilisé pour le marquage des nucléotides est détectable par la mesure d’un signal qui est proportionnel à la quantité de nucléotide incorporé dans l' ADN endommagé, notamment les plasmides endommagés.

Les moyens et les techniques de marquage des nucléotides sont bien connus de l’Homme du métier et incluent le marquage radioactif, magnétique, fluorescent, colorimétrique ou autre, qui peut être effectué directement ou indirectement. Les traceurs ou agents de marquage direct sont notamment des isotopes radioactifs ou des composés luminescents (radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents ou phosphorescents), tels que les fluorophores comme de façon non-limitative Cyanine 3, et Cyanine 5. Les agents de marquage indirect incluent notamment les molécules d’affinité telles que la biotine (système streptavidine/biotine), la digoxygénine ou toute molécule pouvant être révélée par une interaction ligand-récepteur, notamment à l’aide d’un anticorps ou par un traitement chimique.

Le marquage des dNTP, notamment un marquage fluorescent, radioactif, magnétique ou colorimétrique est détectable par toute technique connue de l’Homme du métier telle que de façon non-limitative, la microscopie de fluorescence, la cytométrie de flux, la gammagraphie, l’imagerie de résonance magnétique et la spectrométrie de masse.

L’utilisation de marqueurs différents permet d’effectuer une seule réaction de réparation par ADN endommagé (étape a)) mais nécessite un détecteur spécifique pour chaque marqueur (étape (b)). L’utilisation d’un seul marqueur pour les différents nucléotides impose d’effectuer la réparation (étape a)) dans des réactions séparées pour chaque nucléotide, avec chaque ADN endommagé mais permet d’utiliser un seul détecteur pour mesurer le signal de réparation (étape b)).

De préférence, le marquage est un marquage fluorescent, direct ou indirect. De manière préférée, les nucléotides sont marqués par un fluorophore. De manière encore plus préférée, tous les nucléotides sont marqués par le même fluorophore.

La réaction de réparation (étape a)) est mise en œuvre dans des conditions permettant la réparation des lésions de l' ADN par les enzymes de réparation présentes dans ledit extrait cellulaire et l’incorporation de chaque nucléotide marqué dans chaque ADN endommagé. Ces conditions qui sont bien connues de l’Homme du métier sont décrites dans la Demande WO 2004/059004 ; Millau et al. et Prunier et al., 2008, précités. La réaction de réparation est réalisée en présence d’ATP, d’un système de régénération de l'ATP et tout autre agent nécessaire à l’activité des enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales. Par exemple, le tampon de réparation contient 200 mM Hepes/KOH, pH 7,8 ; 35 mM MgCl2 ; 2,5 mM DTT ; 1,25 mM de chacun des quatre dNTP ; 1 mM ATP, 17 % glycérol ; 50 mM phosphocréatinine ; 10 mM EDTA ; 250 μg/mL créatine phosphokinase et 0,5 mg/L de BSA. La réaction de réparation est généralement réalisée avec un extrait de protéines nucléaires contenant 0,2 à 2 mg de protéines par mL. La réaction est effectuée une température favorisant la réaction de réparation, de préférence à 30°C, pendant un temps suffisant, généralement compris entre une et cinq heures. La réaction est avantageusement réalisée dans les micropuits d’un support miniaturisé du type micropuce tel que défini ci-dessus.

Conformément à l’invention, les réactions de réparation (étape (a)) sont réalisées en parallèle avec un ADN contrôle, non lésé, qui sert à mesurer le bruit de fond de la réaction de réparation (étape (b)). En conséquence, l’étape (a) comprend en outre, des réactions contrôles pour chaque nucléotide marqué, dans lesquelles l’extrait cellulaire est incubé avec un ADN contrôle, non-endommagé et, séparément, avec chacun des nucléotides marqués.

Préalablement à l’étape (b) de mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN lésé (signal de réparation), le support sur lequel est fixé l' ADN, est généralement lavé au moins une fois à l’aide d’une solution saline contenant un tensioactif non ionique, notamment un tampon phosphate 10 mM, contenant 0,05 % de Tween 20, puis est ensuite rincé à l’eau, au moins une fois.

Conformément à l’invention, l’étape (b) comprend la mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN lésé, de préférence le plasmide lésé, pour les différentes réactions de réparation de l’étape (a). Chaque réaction de l’étape (a) correspondant à la réparation d’un ADN comprenant un seul type de lésions telles que définies ci-dessus avec un seul dNTP marqué tel que défini ci-dessus.

En outre, l’étape (b) comprend également la mesure du signal d’incorporation du marqueur dans l' ADN contrôle non-lésé, pour chacun des nucléotides marqués de l’étape (a), de façon à mesurer le bruit de fond de la réaction de réparation pour chacun des nucléotides marqués.

La mesure du signal est réalisée par une méthode adaptée au marqueur, à l’aide d’une instrumentation adaptée au support et au marqueur utilisé. Par exemple, si le marqueur est un fluorophore, on procède à la mesure directe des signaux de fluorescence émis par les différents dépôts (ou spots) du support. On pourra utiliser un scanner pour l’analyse d’image en fluorescence. On utilise de préférence un appareil capable d’exciter le fluorophore et de mesurer le signal émis par l’excitation.

La signature enzymatique de la réparation de l' ADN des cellules tumorales (étape ci)), issues notamment d’une tumeur d’un patient, correspond à l’ensemble des signaux mesurés à l’étape (b) pour la réparation de toutes les lésions présentes (n lésions au total) par l’extrait desdites cellules tumorales, avec chacun des nucléotides marqués (aux moins deux nucléotides X et Y, et éventuellement un troisième nucléotide Z et un quatrième nucléotide W).

La signature de réparation obtenue avec les nucléotides X et Y est l’ensemble :

Où

- X est le premier nucléotide pour lequel on détermine la signature de réparation de toutes les lésions,

I _X1 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une première lésion,

I _x2 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une deuxième lésion,

I _Xn est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X vis-à-vis d’une énième lésion,

I _C/x est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide X avec le plasmide contrôle,

- Y est le deuxième nucléotide pour lequel on détermine la signature de réparation de toutes les lésions,

I _Y1 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une première lésion,

I _Y2 est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une deuxième lésion, I _Yn est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y vis-à-vis d’une énième lésion, et

I _C/Y est la valeur de signal mesurée pour le nucléotide Y avec le plasmide contrôle.

Pour chaque échantillon de cellules tumorales, en particulier isolées à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, la signature de réparation obtenue est différente et dépendante du nucléotide marqué utilisé (Figure 1A à 1D). Elle est analysée par des méthodes classiques de classification (« clustering ») qui prennent en compte l’ensemble des signaux obtenus pour un échantillon donné pour comparer les échantillons entre eux et par rapport à la bibliothèque de référence (Figure 2 A à 2E). La signature de réparation permet de caractériser les capacités de réparation d’un échantillon de façon globale et compare essentiellement les valeurs d’intensités obtenues. L’utilisation d’au moins deux nucléotides différents permet de comparer l’échantillon à la bibliothèque de référence obtenue dans chacune des conditions et de vérifier la cohérence de la classification ou de mettre en évidence les discordances. Par exemple, un échantillon peut être dans une certaine classe définie par la signature de réparation de la bibliothèque avec le nucléotide X (correspondant à un sous-type), et être dans une autre classe définie par la signature de réparation avec le nucléotide Y, ce qui révèle une incohérence dans la classification. Cette incohérence indique que l’échantillon est différent des autres échantillons de la classe et donc risque de ne pas répondre à la thérapie prescrite pour cette classe.

Cette première analyse est particulièrement adaptée pour identifier les répondeurs aux thérapies ciblées prescrites sur la base de mutations connues. En effet, les signatures de réparation sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaires et à leur fonctionnalité. Par comparaison avec les profils de référence des bibliothèques de référence, on déterminera si le profil de la tumeur portant une ou des mutations guidant la prescription de thérapies ciblées, correspond au profil de référence portant la mutation qui répond au traitement. Si des discordances apparaissent, cela indique que la thérapie ciblée ne sera pas efficace.

La signature de réparation obtenue permet également d’identifier les échantillons dans lesquels les activités de réparation pour une lésion donnée sont absentes : cette absence peut être partielle si un signal est mesuré avec au moins un nucléotide, totale si elle n’est mesurée avec aucun nucléotide. L’absence de certaines activités révélée par la méthode va caractériser des tumeurs présentant des mutations ou des défauts génomiques importants qui sont plus favorablement susceptibles de répondre aux immunothérapies.

Les signatures de réparation sont étroitement associées aux défauts de mécanismes de réparation de l' ADN. Eux-mêmes sont responsables de la sensibilité et résistance aux chimiothérapies et radiothérapies. Les signatures de réparation peuvent permettre de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique à suivre parmi des traitements par inhibiteurs de la réparation de l' ADN, par chimiothérapie et radiothérapie, ou combinaisons.

Les différentes valeurs obtenues à l’étape (b) sont soumises à différents classements ou calculs, combinés ou pas : signature de réparation, contribution, taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide, afin d’obtenir un profil de réparation donnant le plus d’informations possibles sur les capacités de réparation des protéines de réparation de la tumeur.

Le profil de réparation distingue les différents mécanismes de réparation fonctionnels tout en les quantifiant. Plus particulièrement, ce profil permet de distinguer :

Si des tumeurs d’un même type ou sous-type de cancer, déterminé sur la base d’une mutation dans un gène clé, ou sur la base d’autres marqueurs déterminant le choix d’un traitement, sont rangées dans le même groupe (sont similaires) ou dans un groupe différent (pas de similarité) ;

Si au moins une activité de réparation prenant en charge une lésion donnée est bien fonctionnelle ;

Si une lésion donnée est réparée par plusieurs activités de réparation ;

Si une lésion donnée est réparée par la réparation par excision de base (REB) ou la réparation par excision de nucléotide (REN) ;

Si lorsqu’une lésion est réparée par la BER, c’est le « short patch repair » (resynthèse courte) ou le « long patch repair » (resynthèse longue) qui fonctionne et donc quelle polymérase intervient (beta ou delta/epsilon) ;

Si la réparation est fidèle ;

A partir de la signature de réparation obtenue à l’étape (c ₁ ), on peut déterminer la contribution de la réparation de chacune des lésions par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués étape (c ₂ )). Par exemple, la contribution (en pourcentage) de la réparation de la première lésion par rapport à la réparation totale (n lésions), pour les nucléotides X et Y est déterminée, sous la forme d’un pourcentage, en suivant la formule :

La contribution permet de déterminer l’importance relative des différentes voies de réparation pour chaque échantillon (Figure 3A à 3D). La signature « contribution» permet une caractérisation précise de l’efficacité de chacune des voies de réparation dosée par rapport aux autres. La contribution donne un paramètre indépendant de la valeur absolue des signaux mesurés et est donc complémentaire de la signature de réparation. La contribution varie pour chaque échantillon en fonction du nucléotide utilisé. Chaque échantillon sera caractérisé par autant de profils « contribution » que de nucléotides utilisés. Ces profils « contribution » pourront être comparés aux profils « contribution » de la bibliothèque de référence pour vérifier la cohérence de la classification.

Par exemple, un échantillon peut être dans une certaine classe « contribution » de la bibliothèque avec le nucléotide X (correspondant à un sous-type), et être dans une autre classe « contribution » avec le nucléotide Y, ce qui révèle une incohérence dans la classification. Cette incohérence indique que l’échantillon est différent des autres échantillons de la classe et donc risque de ne pas répondre à la thérapie prescrite pour cette classe.

Les profils « contribution » sont étroitement associées aux voies de signalisation/prolifération cellulaires et à leur fonctionnalité.

Les profils « contribution » sont étroitement associés aux capacités de tumeurs à répondre à la chimiothérapie et à la radiothérapie.

A partir de la signature de réparation obtenue à l’étape (c ₁ ), on peut également déterminer le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN (étape (c ₃ )).

Par exemple, dans une réaction de réparation réalisée avec 4 nucléotides marqués différents (X, Y, Z et W), le taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de deux lésions (première et deuxième lésion) est déterminé, indépendamment pour chacune des lésions, en suivant la formule suivante :

Taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de la première lésion :

Taux relatif d’incorporation du nucléotide X pour la réparation de la deuxième lésion :

Ce calcul, illustré à la Figures 4A à 4D, permet de déterminer si les mécanismes de réparation sont fonctionnels dans les échantillons, et en particulier l’étape faisant intervenir des polymérases, sont bien ceux attendus par rapport à la bibliothèque de référence. L’intérêt est d’identifier directement les dysfonctionnements responsables de mutations ou de tout autre défaut génomique favorisant l’apparition de néo-antigènes à la surface des tumeurs, associés à une meilleure efficacité des traitements immunologiques. La détection directe des profils de réparation et en particulier du taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide évite l’utilisation de méthodes d’amplification PCR nécessaire à la prédiction des néo-antigènes, qui introduisent des biais (The problem with neoantigen prédiction, Nat. Biotech., 2017, 35, 97). Les tumeurs pour lesquelles des activités de réparation sont absentes ou présentent des dysfonctionnements à cause de mutations ou des défauts génomiques sont plus favorablement susceptibles de répondre aux immunothérapies.

Ainsi, l’utilisation de deux nucléotides pallie aux inconvénients de l’utilisation d’un seul nucléotide qui ne donne qu’un profil partiel de la tumeur et qu’une information partielle sur les voies de réparations fonctionnelles. En particulier, l’utilisation d’un seul nucléotide ne permet pas de savoir quelle voie de réparation est sollicitée ; quelle polymérase est impliquée ; si la réparation est fidèle ; si, en cas d’absence de signal, une autre voie est susceptible d’intervenir en remplacement ; elle ne permet qu’une comparaison partielle avec une bibliothèque de référence ; elle ne permet pas de déterminer quel est le nucléoside préférentiellement incorporé pour la réparation de chaque lésion. De préférence, la méthode de l’invention comprend l’établissement du profil de réparation de cellules tumorales isolées à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, et la comparaison dudit profil avec au moins un profil de référence, obtenu pour le même sous-type de cancer. Le profil de référence est établi, simultanément ou préalablement au profil de réparation des cellules de la tumeur du patient. De préférence, la comparaison est effectuée avec une bibliothèque de référence comprenant les profils de référence de différents sous-types d’un cancer incluant au moins les sous- types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix des traitements chez les patients.

De préférence, le profil de l’étape (d) comprend:

La signature enzymatique de la réparation de l' ADN des cellules tumorales, la contribution de la réparation de chacune des lésions de l' ADN par rapport à la réparation totale, indépendamment pour chacun des nucléotides marqués, et le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour au moins deux lésions de l' ADN, indépendamment pour chaque lésion de l' ADN.

On pourra combiner les signatures de réparation, les profils de « contribution » et les taux relatifs d’incorporation pour la comparaison avec la bibliothèque de référence traitée dans les mêmes conditions.

Les profils de réparation peuvent en outre être utilisés pour prédire les réponses aux chimio- et radio-thérapies ou pour sélectionner les patients répondeurs aux inhibiteurs de la réparation de l' ADN. Le même profil de réparation pourra ainsi être utilisé pour choisir le meilleur traitement parmi plusieurs classes de thérapies ou parmi des combinaisons de thérapies.

La méthode selon l’invention est utile pour choisir la meilleure option thérapeutique pour le patient en fonction du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules de la tumeur du patient, obtenu par la méthode selon l’invention. La meilleure option thérapeutique est choisie parmi plusieurs classes de thérapies ou parmi des combinaisons de thérapies.

Les profils de réparation obtenus à l’étape (d) conditionnent le traitement à donner à un patient :

Si le profil de réparation de la tumeur correspond au profil de la bibliothèque de référence pour les mêmes types ou sous-types de cancer, les traitements efficaces pour les échantillons classifiés de la même façon dans la bibliothèque de référence seront appliqués ;

Si le profil de réparation montre des dysfonctionnements de la réparation de l' ADN (absence de certaines activités, défauts de polymérases,..) les immunothérapies pourront être utilisées ;

Le profil de réparation obtenu pourra être utilisé pour choisir un traitement par radiothérapie, ou chimiothérapie ou tout autre traitement endommageant l' ADN.

Le profil de réparation pourra être utilisé pour choisir un inhibiteur de la réparation de l' ADN par exemple pour inhiber une voie spécifique à l’origine de la résistance de la tumeur aux traitements ciblant l' ADN, ou bien pour inhiber une voie redondante d’une voie sous exprimée, de façon à créer une létalité synthétique ;

Le profil de réparation pourra être utilisé pour choisir des combinaisons de différents traitements.

Une activité spécifique de réparation élevée peut être associée à une radio ou chimiorésistance. On pourra dans ce cas utiliser un inhibiteur de la réparation spécifique de cette voie. L’inhibiteur pourra être donné, en association ou pas avec une radio ou chimiothérapie créant des lésions réparées par une autre voie ou la même voie. Des combinaisons d’inhibiteurs de voies complémentaires peuvent également être envisagées, pour éviter des compensations de réparation dues à l’activation de voies redondantes.

A l’inverse une activité faible peut être associée à une radio ou chimiosensibilité. On choisira de préférence un traitement qui crée des lésions réparées par la voie dysfonctionnelle.

Lorsque toutes les activités de réparation sont élevées, on pourra utiliser une thérapie ciblée visant les voies de signalisation régulant la réparation de l' ADN, si une cible activatrice est identifiée.

Les tumeurs pour lesquelles des activités de réparation sont absentes ou présentent des dysfonctionnements pourront être traitées par immunothérapie.

Dans tous les cas on peut combiner des traitements de classe différente (radio ou chimiothérapie, thérapie ciblée et immunothérapie).

La présente invention a également pour objet l’utilisation de la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention, pour le pronostic du cancer, le choix, le suivi et/ou la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient, en fonction du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules tumorales obtenu à l’étape (d).

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d’un cancer chez un patient, comprenant :

l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales issues dudit patient selon la méthode de l’invention ;

le choix du traitement le plus approprié pour le patient en fonction du profil de réparation obtenu ; et

l’administration du traitement au patient.

Le traitement est notamment sélectionné parmi la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. La chimiothérapie affecte, directement ou indirectement, l' ADN ou la réparation de l' ADN.

La présente invention a également pour objet une méthode de pronostic d’un cancer chez un patient, comprenant :

l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales issues dudit patient selon la méthode de l’invention ;

la détermination du pronostic du cancer du patient en fonction du profil de réparation obtenu.

La méthode de pronostic selon la présente invention permet notamment de déterminer la survie du patient. En effet, il existe une corrélation entre l’intensité du signal de réparation mesuré avec la méthode d’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN selon l’invention et la survie du patient. De préférence, le cancer est lié à l’exposition à des agents génotoxiques, par exemple un mélanome, notamment un mélanome métastatique de sous-type déterminé, à savoir, BRAF muté, NRAS muté ou non muté pour BRAF et NRAS.

La présente invention a également pour objet l’utilisation du profil de réparation de cellules tumorales isolées à partir d’une tumeur d’un patient, obtenu par la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention, comme biomarqueur du pronostic du cancer, du choix, du suivi et/ou de la prédiction de l’efficacité thérapeutique d’un traitement du cancer chez un patient. La présente invention concerne également les bibliothèques de référence comprenant les profils des capacités de réparation de tumeurs caractérisées (profils de référence), correspondants à différents sous-types de différents cancers, obtenus par la méthode pour générer un profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales selon l’invention.

Les bibliothèques de référence contiennent les profils de référence de différents sous-types de différents cancers incluant au moins les sous-types de cancer des patients à tester, en particulier les sous-types de cancer qui orientent ou conditionnent le choix des traitements anti-cancéreux chez les patients. Pour chacun de ces sous-types de cancer particuliers, la banque de référence inclut le profil de référence de patients répondeurs ou non-répondeurs pour le traitement thérapeutique recommandé, en particulier une thérapie ciblée, notamment une thérapie guidée par des mutations dans des gènes clés, comme par exemple les mutations dans les gènes BRAF et NRAS pour le mélanome.

La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre de la méthode selon l’invention, comprenant :

au moins deux ADN endommagés comprenant des lésions distinctes tels que définis ci-dessus, de préférence des plasmides endommagés tels que définis ci- dessus, de manière préférée immobilisés sur un support approprié tel que défini ci- dessus ; et au moins deux tampons de réparation,

un tampon de réparation comprenant les agents nécessaires à l’activité des enzymes de réparation de l' ADN présentes dans l’extrait de cellules tumorales tels que définis ci-dessus et au moins deux nucléotides différents marqués, dans un seul tampon ou dans des tampons séparés pour chaque nucléotide

La présente invention concerne également une méthode de classification d’un cancer de type défini, à partir d’un échantillon de tumeur d’un patient, comprenant au moins les étapes suivantes :

(i) l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN de cellules tumorales isolées à partir dudit échantillon, selon la méthode de l’invention ;

(ii) la comparaison du profil des capacités de réparation obtenu à l’étape précédente avec une bibliothèque de référence contenant les profils des capacités de réparation de différents sous-types du cancer; et (iii) la détermination du sous type de cancer affectant le patient par similitude du profil des capacités de réparation obtenu chez le patient avec un profil de référence d’un sous type de cancer de la bibliothèque de référence.

La présente invention concerne également une méthode de criblage d’agents anti tumoraux, comprenant au moins les étapes suivantes :

la mise en contact de cellules tumorales avec au moins un agent à tester ;

l’établissement du profil des capacités de réparation de l' ADN des cellules tumorales traitées par ledit agent et de cellules tumorales non-traitées, par la méthode de l’invention, et

la sélection des agents capables de moduler le profil de réparation de l' ADN desdites cellules tumorales.

De préférence, la méthode de criblage est mise en œuvre avec des cellules tumorales en culture.

Les agents anti-tumoraux sélectionnés par la méthode de criblage selon l’invention sont utiles pour le traitement des cancers.

Outre les dispositions qui précèdent, l’invention comprend encore d’autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l’objet de la présente invention qui ne sont nullement limitatifs, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :

- la figure 1 représente les signatures de réparation de différentes lésions de l' ADN par des extraits de mélanomes métastatiques, en présence de différents nucléotides marqués. A. dCTP. B. dGTP. C. dATP. D. dUTP. 8oxoG : 8-oxo-guanine. AbaS : sites abasiques. CPD : dimères de pyrimidine de type cyclobutane. CPD-64 : mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP). Éthéno : mélange d’Éthéno-guanines (Éthéno-G) et Éthéno- Adénines (Éthéno-A). Glycols : Mélange de Glycols de thymine et de cytosine .

- la figure 2 représente la classification des signatures de réparation par similarité de réparation. A. Toutes données confondues. B. dCTP. C. dGTP. D. dATP. E. dUTP.

- la figure 3 représente la contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale pour chacun des nucléotides marqués. A. dCTP. B. dGTP. C. dATP. D. dUTP. X : non testé. - la figure 4 représente le taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide marqué pour la réparation de chacune des lésions. A. 8oxoG : 8-oxo-guanine. B. AbaS : sites abasiques. C. CPD : dimères de pyrimidine de type cyclobutane. D. CPD-64 : mélange de dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD) et de pyrimidines (6-4) pyrimidones (photoproduits 6-4 ou 6-4PP). E. Glycols : Mélange de Glycols de thymine et de cytosine. F. Éthéno : Mélange d’Éthéno-guanines (Éthéno-G) et Éthéno-Adénines (Éthéno-A). * : seuls dCTP et dGTP ont été utilisés.

- la figure 5 représente la corrélation entre la survie (abscisse) et l’intensité du signal de réparation (ordonnée)) par groupe de mutation et par dNTP. A. WT-dCTP. B. NRAS-dCTP. C. BRAF-dCTP. D. WT-dGTP. E. NRAS-dGTP. F. BRAF. dGTP. G. WT- dATP. H. BRAF-dATP. I. WT-dUTP. J. BRAF-dUTP.

EXEMPLE : Etablissement des signatures et profils de réparation d’échantillons de mélanomes métastatiques

1. Matériels et méthodes

1.1 Patients

Les échantillons (ganglion ou tumeur) sont issus de patients atteints de mélanome métastatique de sous-type connu (BRAF ; NRAS ; WT (non muté pour BRAF et NRAS) dont les données cliniques sont présentées dans le Tableau I.

Les différents types de traitement administrés aux patients de l’étude sont présentés dans le Tableau II ci-dessous.

Tableau : Traitements administrés aux patients

1.2 Préparation des échantillons

Les échantillons de tumeur ou de ganglions sont prélevés par exérèse chirurgicale puis préparés comme suit. a. Dissociation cellulaire

La dissociation cellulaire est réalisée à partir d’une biopsie de ganglions ou de tumeurs de mélanome métastatique. La biopsie, d’environ 5 mm ³ , est déposée dans une boîte de pétri de diamètre 100 mm avec quelques gouttes de RPMI-1640 Glutamax (Life Technologies). Elle est ensuite découpée en fragments à l’aide d’un scalpel. Ces fragments sont transférés dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 5 mL de milieu de digestion (1 mg/mL Collagénase D (Roche) ; 50 U I/m L DNase I (Roche), RPMI-1640 Glutamax (Life technologies)). Le tube contenant les fragments est incubé 30 minutes à 37°C dans une étuve et les fragments sont remis en suspension toutes les 10 minutes à l’aide d’une pipette de 10 mL. A la fin de l’incubation, un volume de 2.5 mL de milieu de digestion conservé à température ambiante est ajouté. Les fragments sont de nouveau incubés 30 minutes à 37°C dans une étuve et remis en suspension toutes les 10 minutes à l’aide d’une pipette 10 mL. A la fin de l’incubation, le tube est centrifugé à 1200 rpm, pendant 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans 10 mL de tampon PBS- EDTA froid (10 mM EDTA (Sigma), IX D-PBS (Life Technologies)). Les cellules sont ensuite déposées sur un tamis cellulaire 70 μm (Dutscher), positionné sur un tube à centrifuger de 50 mL conservé dans la glace. Le tube de 15 mL est rincé par ajout de 5 mL de tampon PBS-EDTA froid supplémentaires et les fragments résiduels sont passés sur le tamis. Un prélèvement est réalisé afin de dénombrer les cellules. Le tube de 50 mL est centrifugé à 1200 rpm, pendant 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé et le culot est repris dans une solution de cryopréservation Albumine/DMSO (90% Albumine Humaine, 10% DMSO (Sigma)), à raison de 4.10 ⁶ cellules par cryotube. Les cellules sont congelées progressivement à -80°C dans un container de congélation puis transférées en azote liquide pour une conservation de longue durée. b. Préparation d’extraits nucléaires

Les cellules tumorales sont décongelées à température ambiante, puis centrifugées à 500 RCL (Relative Centrifugal Lorce), pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant est éliminé, et les cellules lavées avec 1 mL de PBS froid, puis re-centrifugées à 500 RCF, 5 minutes, à 4°C. Les cellules sont reprises dans 1 mL de tampon A (10 mM HEPES pH 7,8, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KC1, 0.02% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) et incubées 10 minutes dans la glace. Chaque tube est vortexé durant 30 secondes. Les cellules sont centrifugées 5 min à 2300 RCF, le surnageant est éliminé, puis les cellules sont reprises dans 30 μL de tampon B (10 mM HEPES pH 7.8, 1,5 mM MgCl2, 400 mM KC1, 0.2 mM EDTA, 25% glycérol, 0.5mM DTT, 0.5 mM PMSF, 100 μL antiprotéases 0.7X (Complete-mini, Roche). Après 20 minutes d’incubation sur glace, la lyse de la membrane nucléaire est réalisée par deux cycles de congélation/décongélation dans de l’azote liquide à -l80°C et à 4°C. Les tubes sont centrifugés à 16000 RCF, 10 minutes, à 4°C. Le surnageant est réparti en aliquots de 10 μL. Une fraction du surnageant est prélevée pour un dosage protéique en utilisant la méthode micro-BCA (Interchim). Les aliquots sont soumis à une congélation rapide de 30 secondes dans de l’azote liquide à -l80°C puis stockés à -80°C.

1.3 Analyse des activités enzymatiques de réparation de l' ADN

L’analyse a été réalisée sur des puces comprenant des plasmides lésés, préparées comme décrit précédemment (Millau et al., Prunier et al., précités).

Un mélange réactionnel est préparé pour chaque dNTP-biotine, de façon à obtenir des signatures enzymatiques de réparation de l' ADN en présence de différents dNTP marqués à la biotine. La réaction a lieu 3h à 30°C dans des chambres réactionnelles remplies avec 12 μL de milieu constitué de 4,8 μL de tampon 5X (200 mM Hepes KOH pH 7.8, 35 mM MgCl ₂ , 2.5 mM DTT, 1.25 pM de chaque dNTP non marqué (Perkin Elmer), 17% Glycérol, 50 mM phosphocréatine (Sigma), 10 mM EDTA, 250 pg/mL créatine phosphokinase, 0.5 mg/mL BSA, 0.5 μL ATP 100 mM (Amersham) et 1.25 pM de dNTP-biotin (Perkin Elmer)), en présence d’extraits nucléaires à une concentration finale de 0.2 mg/mL, la solution étant complétée à 24 μL avec H ₂ O. Chaque échantillon est testé sur deux puces (dans deux chambres réactionnelles) pour chacun des dNTP-biotine.

Après l’incubation les lames sont rincées 2 fois 3 minutes avec du PBS/Tween 0.05%, puis 2 fois 3 minutes à l’eau MilliQ. Les lames sont incubées dans un bain de Streptavidine-Cy5 à 225 ng/mL, en présence de BSA à 0.1 mg/mL, durant 30 min à 30°C. Les lames sont rincées 2 fois 3 minutes avec du PBS/Tween 0.05%, puis 2 fois 3 minutes à l’eau MilliQ. Enfin les lames sont centrifugées 30 secondes, puis séchées 10 min à 30°C. Les lames sont scannées à 635 nm (Innoscan Innopsys) pour la quantification de la fluorescence. La valeur de fluorescence du plasmide contrôle (pas de lésions) est soustraite à la valeur de l’intensité totale obtenue pour chaque lésion. Les données sont normalisées comme décrit dans Millau et al., précité. Les données sont exprimées en Intensité de Fluorescences (Unités arbitraires) et déviation standard pour chaque échantillon et chacun des dNTPs testés.

1.4 Analyses statistiques

Les valeurs d’intensité de fluorescence obtenues sont centrées-réduites, c’est-à-dire que leur moyenne est ramenée à 0, et leur écart-type à 1.

Les données sont ensuite analysées par classification hiérarchique tel que décrit dans la publication Forestier et al, en utilisant la distance euclidienne (PLoS One. 20l2;7:e5l754).

2. Résultats

2.1 Signatures de réparation

La méthode selon l’invention a été mise en œuvre sur des échantillons de mélanome métastatique (ganglions ou tumeurs) de patients pour lesquels le statut mutationnel des gènes BRAF et NRAS est connu (Tableau I). Les réactions de réparation ont été conduites avec 0.2 mg/ml d’extrait de protéines nucléaire en dupliqua pendant 3h à 30°C. Les intensités de fluorescence ont été mesurées avec un scanner pour quantifier le niveau d’incorporation de chaque nucléoside triphosphate au niveau de chaque plasmide. Les intensités de fluorescence obtenues au niveau du plasmide-contrôle sont soustraites (I _x1 - I _c )·

- Signatures de réparation avec les différents dNTP

Les différents nucléotides marqués révèlent des profils de valeurs de réparation différents pour une même lésion pour chaque groupe de mutation (Figures 1A à 1D) permettant ainsi d’obtenir des informations plus précises sur les mécanismes de réparation spécifiques

Les mutations BRAF et NRAS affectent la signature de réparation de l' ADN à différents niveaux (de manière globale et sur des activités spécifiques). En particulier, les échantillons présentant le gène BRAF muté présentent une très faible activité de réparation en comparaison au sauvage. Classification des signatures de réparation toutes données combinées

Les données sont ensuite centrées-réduites (moyenne à zéro - écart- type à 1) pour chaque lésion, de façon à permettre une classification sans biais.

On réalise ensuite une classification hiérarchique, avec distance euclidienne. Les échantillons, en nombre suffisant, servent à la fois à constituer la bibliothèque de référence comprenant le classement des signatures de réparation en fonction des mutations (BRAF, NRAS, par exemple), et à déterminer les différences de chacun des échantillons par rapport à sa classe théorique.

Les échantillons sont classés par similarité de signatures de réparation. Les résultats montrent que les différents dNTPs déterminent des classes différentes à quelques exceptions près (Figure 2A). Cela indique que chaque dNTP apporte des informations distinctes et complémentaires sur les échantillons.

En particulier, lorsque tous les résultats sont considérés et classés ensemble, on voit que les échantillons analysés avec dCTP restent groupés mais séparés par groupe de mutation. Cela montre que les mutations BRAF et NRAS exercent un effet dominant sur la signature de réparation de l' ADN.

Cela confirme que l’analyse par dCTP montre que les mutations dans les voies de signalisation (MAP Kinase) impactent la signature de réparation de l' ADN. Cette information est importante et confère un rôle particulier à l'analyse par dCTP, surtout si le traitement appliqué est la thérapie ciblée (guidée par les mutations dans BRAF et NRAS).

Lorsque dGTP est utilisé, les WT sont d’un côté, et les BRAFm et NRASm sont dans une autre classe. Deux catégories d’échantillons de BRAFm sont identifiées : un premier groupe présentant une faible activité de réparation et un deuxième groupe regroupé avec les NRASm présentant une forte activité de réparation (Figure 2C).

Les résultats obtenus avec dATP et surtout dUTP, sont plus éclatés.

Les analyses individuelles par dNTP, apportent des informations complémentaires (Figures 2B, C, D, E). Classification des signatures de réparation obtenues avec le dCTP marqué

L’utilisation de dCTP discrimine les BRAF mutés des autres catégories d’échantillon (Figure 2B). Tous les échantillons BRAF mutés sont dans une classe commune. Elle est cependant séparée en 2 sous-classes, ce qui distingue 2 catégories d’échantillons BRAF mutés (Classe 1.1. contient 1507 et 1514 ; et Classe 1.2 contient 1405, 1502 et 1401).

La Classe 1.1. correspond aux patients qui ont la plus longue survie.

Les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble (Figure 2B).

En revanche, l’échantillon 1506_WT est classé avec une majorité d’échantillons BRAF muté (Figure 2B). Il a donc un profil similaire aux échantillons BRAF mutés de la Classe 1.1 (1507 et 1514) et pas aux échantillons WT.

Les échantillons NRAS mutés sont dans un groupe commun (Figure 2B). On distingue cependant l’échantillon 1402_NRAS qui est à part avec un profil particulier (Figure 2B) et qui a une survie très faible. Classification des signatures de réparation obtenues avec le dGTP marqué

Pour dGTP, comme pour dCTP, les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur similarité de profil (Figure 2C). De même, 1506_WT est classé à part, avec des échantillons BRAF mutés (1502, 1507 et 1514),

(Figure 2C).

Tous les échantillons BRAF mutés et NRAS mutés sont classés dans un même groupe, séparé en 2 sous-groupes (Figure 2C). Les échantillons 1405_BRAF et 1401_BRAF sont proches des NRAS mutés dans cette classification (Figure 2C).

dGTP distingue les échantillons WT pour BRAF et NRAS des échantillons mutés pour BRAF et NRAS ; l’utilisation de ce nucléotide permet de distinguer les échantillons ayant des voies de signalisation activées des échantillons ayant des voies de signalisation non activées. Classification des signatures de réparation obtenues avec le dATP marqué

Pour dATP, comme pour dCTP et dGTP, les échantillons 1404_WT et 1407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur similarité de profil (Figure 2D).

Tous les BRAF mutés sont classés dans le même groupe, qui inclut à nouveau 1506_WT, confirmant que cet échantillon a un profil similaire aux échantillons BRAF mutés (Figure 2D).

L’utilisation de dATP ne discrimine pas les 2 WT (1404 et 1506) des NRAS (1505 et 1511) exception faite de 1408_NRAS qui révèle un profil particulier (Figure 2D). Classification des signatures de réparation obtenues avec le dUTP marqué Pour dUTP, comme pour dCTP, dGTP et dATP, les échantillons 1404_WT et l407_WT sont classés ensemble, ce qui confirme leur très forte similarité de profil (Figure 2E).

L’utilisation de dUTP révèle une similarité des échantillons 1404_WT et 1407_WT avec le 1505_NRAS (Figure 2E).

L’ensemble des autres échantillons est dans une classe divisée en 2, où les groupes de mutation sont mélangés mais où on retrouve l506_WT avec les BRAF mutés et en particulier 1507_BRAF, 1502_BRAF et 1401_BRAF (Figure 2E).

Comme avec dGTP, l’échantillon 1405_BRAF est proche d’échantillons NRAS mutés dans cette classification réalisée à partir des données dUTP (Figure 2E).

En conclusion, malgré la diversité génomique reconnue des mélanomes métastatiques, la méthode selon l’invention fait apparaître des signatures de réparation type pour chacune des mutations dans les gènes BRAF ou NRAS et dans le groupe ne comportant pas de mutations dans ces gènes.

L’utilisation de différents dNTPs marqués permet d’identifier des similarités de profils qui ne peuvent pas être déterminés en se basant sur la détection des seules mutations et d’établir des classes au-delà de la classification par type de mutations, qui n’est pas suffisante pour prédire la réponse aux thérapies. Une analyse combinée des résultats obtenus avec les différents dNTPs révèle des informations inattendues et fait apparaître des nouveaux sous-groupes.

Les classifications dNTP par dNTP identifient les patients discordant pour la classification des sous-types par la détection des mutations et en conséquence identifient les dysfonctionnements dans la régulation de la réparation de F ADN par les voies de signalisation. On peut utiliser ces informations dans le cas de prescription de thérapies ciblées, pour lesquelles ce sont les mutations dans les gènes clés comme BRAF et NRAS qui guident la prescription.

On compare les différents profils de réparation observés dans chaque sous-type de mélanome (WT, BRAF mutés, NRAS) avec les profils de réparation de la bibliothèque de référence, afin de déterminer les profils qui correspondent aux patients répondeurs aux thérapies ciblées. Cette comparaison permet ainsi d’administrer le bon traitement au bon groupe de patients.

2.2 Contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale 1 Pour le calcul de la contribution, les données négatives sont ajustées à 0, à savoir ((I _{x i} — I _c ) = zéro, si négatif). Ce paramètre quantifie les activités de réparation spécifiques les unes par rapport aux autres pour un même échantillon, et identifie les activités manquantes.

Par comparaison avec la bibliothèque de référence constituée de types et/ou sous- types de cancers, il identifie les activités de réparation spécifiques dérégulées (augmentées ou réduites ou absentes) par rapport aux autres.

- Marqueur dCTP

L’analyse de la contribution de chaque voie de réparation à la réparation totale, pour les réactions de réparation effectuées avec dCTP, révèle une différence entre les échantillons BRAF mutés et les autres catégories, essentiellement au niveau de la réparation de la 8oxoG et des Éthénobases (Éthéno), (Figure 3A). Les échantillons BRAF ont des profils très particuliers par rapport aux autres échantillons NRAS ou WT

Concernant la 8oxoG, pour 4 échantillons sur 5, l’incorporation relative de dCTP est soit plus faible que pour les autres échantillons (pour 1405, 1502 et 1401) soit nulle (pour 1514).

Il en est de même au niveau de l’incorporation de dCTP pour la réparation d’Éthéno (diminuée pour 1405 et 1502, nulle pour 1514).

Inversement pour l’échantillon 1507, l’incorporation de dCTP est élevée par rapport aux autres échantillons pour la réparation de 8oxoG et Éthéno et relativement faible pour Glycols ; ce qui distingue cet échantillon BRAF muté des autres.

- Marqueur dGTP

Au niveau de l’analyse « contribution », le marqueur dGTP permet de distinguer les échantillons WT des autres échantillons essentiellement au niveau de son incorporation pour la réparation de la 8oxoG, qui est en général plus élevée (Figure 3B).

Inversement les BRAF mutés sont distingués des autres échantillons par un niveau d’incorporation de dGTP plus faible au niveau de 8oxoG (Figure 3B).

On note l’absence de réparation des Glycols avec ce marqueur pour l506_WT, ce qui distingue cet échantillon des 2 autres WT (Figure 3B).

On note également l’absence de réparation des CPD-64 avec ce marqueur pour l402_NRAS (Figure 3B), qui a une survie très faible.

- Marqueur dATP La contribution de dATP à la réparation de CPD-64 pour les 2 échantillons BRAF où elle est mesurable (1502 et 1401), est très faible par rapport aux autres échantillons (Figure 3C)._Ce marqueur n’est pas incorporé par l’échantillon l507_BRAF, quelle que soit la lésion considérée (Figure 3C). Marqueur dUTP

Ce marqueur n’est pas incorporé par l’échantillon l507_BRAF, quelle que soit la lésion considérée (Figure 3D). La contribution de dUTP à la réparation de CPD-64 est nulle pour l’échantillon BRAF 1401 (Figure 3D).

En conclusion, les calculs de la contribution font apparaître des profils spécifiques qui caractérisent les échantillons indépendamment de l’intensité de fluorescence. Cela permet une comparaison quantitative de l’importance relative de chaque voie de réparation par rapport à toutes les activités de réparations fonctionnelles dosées en même temps.

Malgré la diversité génomique reconnue des mélanomes métastatiques, des profils de réparations types peuvent être associés à chacune des mutations dans les gènes BRAF ou NRAS et dans le groupe ne comportant pas de mutations dans ces gènes. Ainsi il est nécessaire de prendre en considération cette information lorsque l’on veut identifier l’ensemble des défauts de réparation.

2.3 Taux relatif d’incorporation de chaque nucléotide pour la réparation de chacune des lésions

Ce calcul nécessite de faire une combinaison des valeurs obtenues indépendamment en réalisant les réactions de réparation en présence des différents dNTPs. On examine pour chaque échantillon dosé, quelle est la contribution de chaque dNTP marqué à la fluorescence totale obtenue, pour l’ensemble des 4 dNTPS ou des 2 dNTPS (dans certains exemples). L’information obtenue complète le profil de signature de réparation et le profil « contribution ». Les échantillons l5l4_BRAF et l402_NRAS ont été caractérisés uniquement avec dCTP marqué et dGTP marqué. Tous les autres échantillons ont été caractérisés avec les 4 dNTP marqués. Les résultats sont présentés aux Figures 4A à 4F.

dGTP est le nucléotide majoritaire incorporé pour la réparation de 8oxoG (Figure 4A). On note que pour l’échantillon l505_NRAS, les autres nucléotides sont incorporés de façon relativement importante, ce qui signe l’implication de voies de réparation alternative, ou des erreurs des polymérases intervenant dans la resynthèse et distingue cet échantillon (Figure 4A). L’échantillon 1507_BRAF se distingue des autres échantillons pour la réparation des sites Abasiques (Figure 4B).

Si aucun défaut de la réparation n’est présent, pour la réparation d’une lésion donnée, on s’attend à une contribution identique de chaque dNTP. En effet, pour une lésion donnée, les systèmes de réparation, grâce à leur spécificité, devraient être identiques entre échantillons. Or on observe des disparités entre les échantillons, permettant de mettre en évidence des défauts de la réparation. Les profils non conformes au profil attendu pour chaque groupe de mutation peuvent signer des altérations d’un ou plusieurs mécanismes de réparation ce qui conduisent à l’incorporation de certains nucléotides à la place de ceux attendus, et favorisent l’apparition de mutations.

2.4 Corrélation entre la signature de réparation et la survie des patients

La capacité de la signature enzymatique de réparation à prédire la survie a été analysée à partir des données centrées réduites regroupant le patient décédé 18 mois après le prélèvement de l’échantillon de tumeur (1514) et des patients non décédés après 24 mois (M24) ; les patients perdus de vue non pas été incorporés dans l’étude. Quatre groupes de survie ont été définis :

- M3 : décès à 3 mois post-prélèvement

- M7 : décès à 7 mois post-prélèvement

- M9 : décès à 9 mois post-prélèvement

- Ml 8 : décès à 18 mois post-prélèvement

- M24 : survie minimum de 24 mois post-prélèvement.

Les résultats sont à distinguer selon le groupe de Mutation considéré :

- Patients WT pour BR AF et NRAS- dCTP : Une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5A). Les mesures de réparation les plus discriminantes sont CPD-64, Glycols, AbaS, et CPD (Figure 5A).

- dGTP : De même que pour dCTP, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5D). Les mesures de réparation les plus discriminantes sont 8oxoG, CPD, CPD-64 et AbaS (Figure 5D).

- dATP : De même que pour les nucléotides précédents, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 5G). Deux lésions sont discriminantes : Éthéno et AbaS (Figure 5G). - dUTP : De même que pour les nucléotides précédents, une très mauvaise survie est associée à de très faibles capacités de réparation de l' ADN (Figure 51). Deux lésions sont discriminantes : Glycols et AbaS (Figure 51).

- Patients BRAF mutés

- dCTP : La survie est inversement proportionnelle à certaines activités de réparation de l' ADN (Figure 5C). En particulier, on observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de CPD-64 et la survie. Pour les patients décédés à 3 ou 9 mois post-prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 18 ou 24 mois pour CPD-64, AbaS, CPD, et Glycols (Figure 5C).

- dGTP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de certaines activités de réparation de l' ADN, en particulier AbaS et la survie (Figure 5F). Pour les patients décédés à 3 ou 9 mois post-prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 18 ou 24 mois pour AbaS, 8oxoG, CPD, et CPD-64 (Figure 5F).

- dATP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de AbaS, Éthéno, et la survie (Figure 5H). Pour les patients décédés à 3 mois post prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédé ou encore en vie à 24 mois pour AbaS, Éthéno, CPD et CPD-64 (Figure 5H).

- dUTP : On observe une relation linéaire inverse entre le niveau de la réparation de Glycols, AbaS, et la survie (Figure 5J). Pour les patients décédés à 3 mois post prélèvement, le niveau de réparation est plus fort que pour les patients décédés ou encore en vie à 24 mois pour Glycols, AbaS, CPD-64 et 8oxoG.

- Patients NRAS mutés- dCTP : On observe une relation proportionnelle entre la survie et le niveau de réparation de l' ADN pour CPD-64 et Glycols et une relation inverse pour Éthéno et 8oxoG (Figure 5B).

- dGTP : On observe une relation proportionnelle entre la survie et le niveau de réparation de l' ADN pour CPD-64 et AbaS et une relation inverse pour Éthéno et 8oxoG

(Figure 5E).

Tableau III : Corrélation entre l’intensité du signal de réparation

et la survie du patient

Cette étude montre que la signature de réparation prédit la survie du patient ; certaines activités sont plus prédictives que d’autres (Figure 5). De façon intéressante, la relation intensité du signal de réparation / survie des patients varie en fonction du groupe de mutations (Tableau III).

Tableau I : Données cliniques relatives aux patients testés