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Title:
METHOD FOR GENETIC TREATMENT USING THE AAV-XBP1S/GFP VIRUS AND USE THEREOF IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/059554
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a method and use of the AAV-XBP1S/GFP virus in the prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis, as presented in the in vivo studies in figure 6/9.

Inventors:
HETZ FLORES, Claudio Andrés (Avda. Independencia N° 1027, Independencia, Santiago, CL)
VALENZUELA PATERAKIS, Vicente Spiro (Avda. Independencia N° 1027, Independencia, Santiago, CL)
Application Number:
CL2016/000056
Publication Date:
April 13, 2017
Filing Date:
September 30, 2016
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDAD DE CHILE (Av. Libertador Bernardo O'Higgins 1058, Santiago, CL)
International Classes:
A61K48/00; A61P21/00; A61P25/28; C07H21/04; C12N15/864
Foreign References:
CL2014003590A12015-07-10
Other References:
VALENZUELA, V. ET AL.: "Activation of the unfolded protein response enhances motor recovery after spinal cord injury.", CELL DEATH DIS., vol. 3, no. 2, 16 February 2012 (2012-02-16), pages e272, XP055377721
VALDÉS, P. ET AL.: "Control of dopaminergic neuron survival by the unfolded protein response transcription factor XBP1.", PROC NATI ACAD SCI U S A., vol. 1, no. 18, 6 May 2014 (2014-05-06), pages 6804 - 9, XP055377722
ZULETA, A. ET AL.: "AAV-medlated delivery of the transcription factor XBP1 s into the striatum reduces mutant Huntingtin aggregation in a mouse model of Huntington's disease.", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., vol. 420, no. 3, 13 April 2012 (2012-04-13), pages 558 - 63, XP028406418
HU , Y. ET AL.: "Differential Effects of Unfolded Protein Response Pathways on Axon Injury-Induced Death of Retinal Ganglion Cells.", NEURON, vol. 73, no. 3, February 2012 (2012-02-01), pages 445 - 452, XP028481311
HETZ, C. ET AL.: "XBP-1 deficiency in the nervous system protects against amyotrophic lateral sclerosis by increasing autophagy.", GENES DEV., vol. 23, no. 19, October 2009 (2009-10-01), pages 2294 - 306, XP009126025
MATUS, S. ET AL.: "ER Dysfunction and Protein Folding Stress in ALS.", INTERNATIONAL JOURNAL OF CELL BIOLOGY, 2013, pages 1 - 12, XP055377724
PRELL, T. ET AL.: "The unfolded protein response in models of human mutant G93A amyotrophic lateral sclerosis.", EUR J NEUROSCI., vol. 5, no. 5, 3 March 2012 (2012-03-03), pages 652 - 660
HAREENDRAN, S. ET AL.: "Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.", REV. MED. VIRAL., vol. 23, no. 6, 2013, pages 399 - 413, XP055377725
GRAY, S. ET AL.: "Production of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors and Use in In Vitro and In Vivo Administration", October 2011, JOHN WILEY & SONS, INC., Hoboken, NJ, USA, ISBN: 978-0-471-14230-0, article "Production of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors and Use in In Vitro and In Vivo Administration.", XP055377726
Attorney, Agent or Firm:
BEUCHAT, BARROS & PFENNIGER (Europa 2035, Providencia, Santiago, CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. - Método de aplicación terapéutico con un vector adenoasociado, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas:

a) el contacto de las células neuronales con el virus adenoasociado AAV- XBP1s/GFP, como el descrito en la tabla I; y

b) expresión del transgén en las células neuronales.

2. - Método de aplicación terapéutico con un vector adeno-asociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO, porque las vías de administración están supeditadas al paso del virus de la barrera hematoencefálica y comprenden la vía nasal; por inyección directa cerebrointraventricular y/o intratecal, entre otras. 3.- Método de aplicación terapéutico con un vector adenoasociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO, porque las inyecciones son realizadas en el ventrículo del SNC, alcanzando corteza frontal del cerebro y la médula espinal. 4.- Método de aplicación terapéutico con un vector adeno-asociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO donde el vector adeno-asociado o su composición farmacéutica que lo contiene es administrada sistémicamente o localmente.

4. - Uso de un vector adeno-asociado, según la reivindicación 1, CARACTERIZADO para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de la esclerosis amiotrófica lateral un mamífero.

5. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque ese mamífero es un humano.

6. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 4, CARACTERIZADO donde el vector adenoasociado o la composición farmacéutica que lo contiene requiere la expresión del polinucleótido de interés en el tejido neuronal.

7. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque retrasa la fase sintomática del fenotipo de esclerosis amiotrófica lateral un mamífero.

8. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque ese mamífero es un humano.

9. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque disminuye la agregación proteica de la enzima Superoxido Dismutasa 1 , SOD1.

10.- Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque la disminución de la agregación proteica de SOD1 , revela una disminución en lo oligómeros que forman los agregados. 11.- Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque disminuye la agregación proteica de SOD1 , en las especies de alto peso molecular.

12. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque genera una completa reducción de la astrogliosis en mamíferos.

13. - Uso de un vector adenoasociado, según la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque ese mamífero es un humano.

14. - Un vector adenoasociado (AAV), CARACTERIZADO porque comprende una secuencia viral recombinante donde dicho genoma comprende un cásete de expresión que comprende una región reguladora de la transcripción específica de tejido neuronal unido operativamente a un polinucleótido de interés.

15. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque el serotipo del AAV está seleccionado de un grupo que comprende AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9, AAV10, AAV1 1 , AAVs pseudotipados.

16. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque el serotipo del AAV es AAV2.

17. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el serotipo AAV2 es el adenovirus que le da preferencia de transducción hacia motoneuronas. 18.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 14, 15, 16 y 17, CARACTERIZADO porque la región reguladora de la transcripción específica de tejido neuronal comprende una región promotora del grupo que comprende: cmv, Pgk 1, CamIIK, ChATy Thy 1, entre otros. 19.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 18, CARACTERIZADO porque la región de promotora de la secuencia codificante para Xbpl s seleccionada del grupo es cmv.

20.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 14, 15, 16 y 17, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo Egfp, Ha, Flag, Gfp, His y Myc, entre otras.

Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 14, 15, 16 y 17, CARACTERIZADO porque comprende en reemplazo del sitio de respuesta inmune una región nucleotídica azarosa no codificante o una secuencia de ADN scramble. 22.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 20, CARACTERIZADO porque comprende la región codificante para Egfp o Gfp.

23. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 18, CARACTERIZADO porque la secuencia para un sitio de respuesta inmune comprende una región de promotor seleccionada entre EF-1a, cmv, cba, Pgk 1, Cam 2 y Thy 1, entre otros.

24. - Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 23, CARACTERIZADO porque la región de promotora de la secuencia codificante de GFP y EGFP es EF-1a.

25. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 a 24, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende una secuencia nuecleotídica que es endógenamente regulada de forma post-transcripcional.

26. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 14 a 25, CARACTERIZADO donde los IRTs del virus adenoasociado son IRTs derivados de AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 AAV10, AAV1 1 , AAVs pseudotipados, de preferencia AAV2.

27. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 a 26, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir comprende a XBP1s.

28. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 14 a 27, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica proteínas dentro del grupo que comprende a XBP1s , la cual actúa sistémicamente cerca o con células neuronales.

29. - Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 28, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés, codifica la proteína XBP1s. 30.- Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 28, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células en el córtex y médula espinal. 31.- Un vector adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 28, CARACTERIZADO porque el polinucleotido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células en el cortex y medula espinal y células de Purkinje en el cerebelo.

32.- Una composición farmacéutica, según la reivindicación 14, CARACTERIZADA porque comprende un vector adenoasociado descrito en las reivindicaciones 14 a 31 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 33.- Una composición farmacéutica, según la reivindicación 32, CARACTERIZADA porque comprende una dosis del virus en un rango entre 109 a 1013 copias de genoma (CG) por mi de composición.

34. - El uso de una composición farmacéutica, según las reivindicaciones 6 y 32, CARACTERIZADO para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de la esclerosis amiotrófica lateral un mamífero.

35. - Un polinucleótido CARACTERIZADO, porque comprende un cásete de expresión flanqueado por los ITRs de un virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés.

36. - Un polinucleótido, según la reivindicación 35, CARACTERIZADO, porque la región del promotor seleccionado del grupo que comprende de: cmv, Pgk 1, Cam II, ChATy Thy 1, entre otros.

37. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 36, CARACTERIZADO porque la región promotora de la secuencia codificante para Xbp1-s seleccionada del grupo es cmv.

38. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicaciones 35, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo Egfp, Ha, Flag, Gfp, His y Myc, entre otras.

39. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 38, CARACTERIZADO porque comprende en reemplazo del sitio de respuesta inmune una región nucleotídica azarosa no codificante o una secuencia de ADN Scramble.

40. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 38, CARACTERIZADO porque comprende la región codificante para Egfp o Gfp. 41.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 38, CARACTERIZADO porque la secuencia para un sitio de respuesta inmune comprende una región de promotor seleccionada entre EF-1ct, cmv, cba, Pgk 1, Cam 2 y Thy 1, entre otros. 42.- Un vector adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 41 , CARACTERIZADO porque la región de promotor es EF-1ct.

43.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 35 a 42, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende una región regulada post-transcripcionalmente.

44. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 35, CARACTERIZADO porque la secuencias objetivo a transcribir comprende a la secuencia XBP1s.

45. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 35 a 44, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, que codifica la proteína que comprende XBP1s, la cual actúa sistémicamente cerca o en células neuronales.

46.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 44, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica la proteína XBP1s.

47.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 35, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés que actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es específico para células de la corteza frontal y medula espinal y células de Purkinje del cerebelo.

48.- Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las secuencias de un adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés, tal como la secuencia descrita en la tabla I.

49. - Un virus adenoasociado, CARACTERIZADO porque comprende el genoma viral descrito en las reivindicaciones 35 a 48.

50. - Un método para obtener un vector viral adenoasociado CARACTERIZADO porque comprende los pasos de:

a.- proveer una célula que comprende un polinucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 48, con las proteínas AAV Cap, con las proteínas AAV Rep y las proteínas virales de las cuales depende AAV para su replicación;

b.- mantener las células bajo condiciones adecuadas para el ensamblaje del AAV; y

c- purificar el vector viral adenoasociado producido por la célula.

51. - Un método, de acuerdo a la reivindicación 50, CARACTERIZADO porque el AAV es dependiente de la replicación derivada desde el adenovirus.

52. - Un método, de acuerdo a las reivindicaciones 50 y 51 , CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado son derivadas desde un AAV seleccionados de los serotipos AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV y AAVs pseudotipados.

53. - Un método, de acuerdo a las reivindicación 52, CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado es derivado desde el serotipo AAV2.

Description:
Método de tratamiento genético utilizando el virus AAV-XBP1s/GFP, y su uso en la prevención y tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica

CAMPO TÉCNICO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

La presente invención se aplica en el campo de la medicina, específicamente en la prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas de preferencia la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o (ALS), mediante el uso de los virus adeno-asociados (AAV) que sóbreexpresan el factor de transcripción XBP1s en neuronas del sistema nervioso central (SNC), de preferencia en neuronas motoras y de la médula espinal, mejorando la capacidad de adaptación de las neuronas y previniendo del desarrollo del ELA o ALS. ANTECEDENTES Y DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DEL ARTE

La investigación científica sobre las enfermedades del SNC ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con alteraciones motoras. El tratamiento de enfermedades relacionadas con la motricidad no tiene hoy enfoques terapéuticos genéticos para disminuir los síntomas.

Una de las enfermedades neurodegenerativas motoras más característica es la esclerosis lateral amiotrófica (ELA o ALS). Esta enfermedad progresiva afecta a las neuronas motoras en el cerebro y a la médula espinal que conduce a la parálisis y la muerte. El mal plegamiento y la agregación de la proteína superoxido dismutasa 1 (SOD1) se asocia con la aparición de formas esporádicas y familiares de ELA o ALS. Aunque el principal mecanismo responsable de la pérdida progresiva de las neuronas motoras en la ELA o ALS sigue siendo poco conocido, la última evidencia resalta la contribución de las alteraciones de la proteostasis o el equilibrio proteico a nivel de cantidad y calidad en el proceso de la enfermedad. Uno de los eventos detectados en una etapa temprana pre-sintomática de ELA o ALS, en modelos de ratón, es la presencia de proteínas de respuestas a estrés en el retículo endoplasmático (RE) de las neuronas motoras secundarias.

El estrés en el retículo endoplasmático (ER) es amortiguado por la activación de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), una red de señalización homeostática que orquesta la recuperación de la función del organelo. Por otro lado, la falta de adaptación al estrés del RE resulta en la disfunción neuronal y apoptosis. La UPR está mediada por la sobre- regulación/activación de tres factores de transcripción principales conocidos como X-Box proteína de unión-1 (XBP1), factor activador de la transcripción-6 (ATF6) y la activación de factor de transcripción-4 (ATF4), que junto con reprogramar el programa transcripcional hacia la adaptación al estrés, o en el caso de ATF4 hacia la eliminación de células dañadas irreversiblemente por apoptosis. Las terapias farmacológicas y genéticas existentes hoy en día apuntan principalmente a la capacidad de adaptación celular, con el fin de restablecer la proteostasis del retículo endoplasmático (RE) a través de la expresión génica de UPR. Estos estudios se han realizado en modelos preclínicos de enfermedades neurodegenerativas con resultados exitosos.

La terapia génica usando virus recombinantes se está utilizando en nuestro laboratorio como una estrategia atractiva para entregar los componentes de las UPR activas para áreas específicas del cerebro. Este método también puede evitar los posibles efectos pleiotrópicos de la administración sistémica y crónica de compuestos con el objetivo de controlar el estrés de RE. Los virus adeno-asociados (AAV) son una de las opciones para la administración de genes terapéuticos en el cerebro y la columna vertebral debido a su seguro perfil terapéutico, como se ha demostrado en ensayos clínicos.

El estado del arte en el tratamiento y/o prevención del ELA o ALS es amplio, desde enfoques terapéuticos clásicos con medicamentos como los compuestos derivados del 1 ,3-benzotiazol, tales como el Riluzol donde se retrasa la ventilación asistida derivada de la enfermedad a través del boqueo de los canales de sodio sensibles a tetradotoxina (Rilutek®). Por otro lado, el enfoque genético ha utilizado diferentes constructos para tratar diferentes enfermedades, como IGF-1 (Factor de crecimiento insulino-1) mediante el virus AAV4 (Adenovirus Asociado Serotipo 4) dado a conocer en el documento EP 2489733 A2; o el constructo HIF1-alfa (factor inducible de hipoxia 1 , subunidad alfa) y un virus adeno-asociado general, dado a conocer en el documento EP 2497500 A1 , entre otros. Parte de la presente patente es la información contenida, en su más variada amplitud, en la solicitud de patente CL 3590-2014. En la solicitud de patente previamente mencionada, se protege el adenovirus asociado con la secuencia XBP1s para la mejora de la memoria específicamente en células neuronales del hipocampo, sin ser restrictivo solamente a esta secuencia especifica de XBP1. Por otro lado, existen depósitos biológicos del plásmido pAAV-XBP1 s-HA con fecha 5 de Noviembre de 2014 en el organismo internacional de depósito biológico, American Type Culture Collection (ATCC), bajo el número de depósito de PTA-121708.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) se basa en la perdida de motoneuronas en el sistema nervioso central y como consecuencia de esto la pérdida de capacidad locomotora. La inducción de la expresión de nuevos genes en distintas regiones del cerebro, aunque mayoritariamente en corteza frontal del cerebro y medula espinal, donde el mal plegamiento y agregación de SOD1 se asociaría a la aparición de ELA o ALS. Al parecer el estrés en el retículo endoplásmico (RE) aparece como un evento temprano en la etapa asintomática de la enfermedad. Este estrés gatilla la activación de la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), sin embargo a nivel fisiológico esta activación es insuficiente para otorgar adaptación celular, por lo tanto estas motoneuronas mueren. Este mecanismo ha sido indicado como uno de los principales en corregir la función de plegamiento proteico del RE dentro de una gran cantidad de otros factores involucrados. En la búsqueda de diferentes reguladores de la expresión de UPR, se identificó uno de tres activadores funcionales, XBP1s, componente clave de la respuesta frente a proteínas mal plegadas (UPR).

Sorprendentemente, el aumento de la expresión de XBP1s ya sea por la sobreexpresión en el SNC de XBP1s en ratones transgénicos (como modelo animal de esclerosis lateral amiotrofica), por medio de la entrega mediada por un virus directamente en el SNC (intracerebroventricular), logra un aumento en la sobrevida en estos modelos de ratones (aumentando la etapa presintomática), sin atenuar la etapa sintomática de la enfermedad.

Un dato relevante en la presente invención es el grado de homología en las secuencias de XBP1 en ratones y humanos el cual es por sobre el 75%, de preferencia el 83%. Las secuencias XBP1s de ratón y XBP1s humana pueden verse en las tablas número IV y II respectivamente.

Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para retrasar la etapa sintomática de ELA o ALS en mamíferos, de preferencia en humanos, utilizando un virus que induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en el cerebro, de preferencia en la corteza frontal del cerebro y médula espinal.

Un segundo aspecto de la presente invención provee un método de tratamiento terapéutico para retrasar la etapa sintomática de ELA o ALS en mamíferos, de preferencia en humanos. El método comprende la administración intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o ¡ntranasal y/o intraneural y/o intracerebroventricular y/o cualquier vía que introduzca el virus al cerebro pasando la barrera hemato-encefálica de un paciente o sujeto.

El virus induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en un rango de dosis de 1 6 a 1 30 unidades virales por individuo.

Un tercer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para disminuir SOD1 en mamíferos, de preferencia en humanos, utilizando un virus que induce la sobreexpresión de XBP1s en el SNC, de preferencia en la corteza frontal del cerebro y médula espinal.

Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un virus que permite la transducción estable y por ende permite sobreexpresión sostenida en el tiempo de XBP1s, lo cual se convierte en un medicamento eficaz y que evita administraciones repetitivas, con el fin de retrasar la etapa sintomática de ELA o ALS en mamíferos, de preferencia en humanos. La presente patente presenta también, la secuencia del plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en la Tabla I o cualquier variante de este fragmento, que codifique y sobreexprese el factor de transcripción neurona! XBP1 , de preferencia XBP1s humano, tal como la secuencia descrita en la tabla II.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología particular, compuestos, materiales, técnicas de manufactura, usos y aplicaciones aquí descritas, pues éstas pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada aquí es usada con el solo propósito de describir una representación particular, y no intenta limitar la perspectiva y el potencial del presente invento.

Debe notarse que el uso y método, aquí, en el pliego de reivindicaciones y en todo el texto que el singular no excluye el plural, salvo que en el contexto claramente lo implique. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método", es una referencia a uno o más usos o métodos e incluye equivalentes conocidos por quienes conocen de la materia (el arte). Similarmente, como otro ejemplo, la referencia a "un paso", "una etapa" o a "un modo", es una referencia a uno o más pasos, etapas o modos y que puede incluir sub pasos, etapas o modos, implícitos y/o sobrevinientes. Todas las conjunciones usadas han de entenderse en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" debe entenderse en su sentido lógico ortodoxo, y no como un "o excluyente", salvo que el contexto o el texto expresamente lo necesite o indique. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos han de entenderse que también se refieren a aquellos equivalentes funcionalmente y así evitar enumeraciones taxativas interminables.

Las expresiones usadas para indicar aproximaciones o conceptualizaciones deben entenderse así, salvo que el contexto mande una interpretación distinta.

Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos aquí empleados tienen el significado común que le otorga una persona común, calificada en estas materias, salvo indicación expresa, distinta.

Los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones son descritos aunque métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos pueden ser usados o preferidos en la práctica y/o pruebas de la presente invención.

Se incorporan todas las patentes y otras publicaciones como referencias, con el propósito de describir y/o informar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones, que puedan resultar útiles en relación con el presente invento.

Se incluyen estas publicaciones sólo por su información previa a la fecha de registro de la presente solicitud de patente.

A este respecto nada debe considerarse como una admisión o aceptación, rechazo o exclusión, de que los autores y/o inventores no estén legitimados de serlo, o de estar ante-fechadas dichas publicaciones en virtud de otras anteriores, o por cualquier otra razón.

La presente invención describe vectores adeno-asociados basados en los serotipos AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 , incluyendo AAVs pseudotipados capaces de mediar de manera eficiente la transferencia de genes al cerebro, de preferencia a neuronas motoras cuando se administra localmente.

La administración sistémica de estos vectores también conduce a un suministro de genes eficiente tanto al cerebro como a las neuronas motoras. Aunque la entrega de genes mediada por el vector AAV2 es más eficiente, la entrega en el caso de la administración sistémica no está restringida solo al cerebro o a las neuronas motoras. La presente invención presenta que el vector de AAV2 con regiones proximales del promotor del factor de transcripción XBP1 , permite la generación de una respuesta en un clúster de factores de forma inespecífica de interés en el cerebro y en específico en las neuronas motoras. En particular, la administración local del vector AAV2 que comprende un cásete de expresión en el que la secuencia codificante para XBP1s puede estar bajo el control de uno o varios promotores dentro del grupo cmv, Pgk 1, CamKII y Thy 1, ChAT, cva, entre otros, de preferencia el promotor de citomegalovirus cmv, además de una región codificante para la proteína GFP, la cual se puede encontrar regulada por las regiones promotoras tales como EF-1a, Pgk 1, cmv, cba, CamKII y Thy 1, de preferencia EF-1a logrando un retardo en la aparición sintomática de ELA por la mejora en neuronas motoras del sistema nervioso en individuos sanos in vivo. Esta región codificante para proteína GFP puede existir, como puede ser que exista en su reemplazo, otra región nucleotídica azarosa no codificante o una secuencia de ADN Scramble (ADN de control negativo)

Por otro lado, el vector AAV de serotipo 2 o AAV2 es el instrumento genético que la da la especificidad de tejido blanco, tal como las motoneuronas asociadas a su falla, en ALS.

I. Definición de términos y expresiones generales Los términos "virus adeno-asociado", "virus AAV", "virión de AAV",

"partícula viral AAV", y "partícula de AAV", como se usa en el presente documento son intercambiables, se refieren a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo de AAV en particular) y un polinucleótido del genoma de AAV encapsidado. Si la partícula comprende un polinucieótido heterólogo (es decir, un polinucieótido distinto de un genoma de AAV de tipo nativo como un transgén para ser entregado a célula de mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del AAV, que se conoce típicamente como un "vector de partículas de AAV o "vector de AAV". AAV se refiere a virus que pertenecen al género Dependovirus de la familia Parvoviridae. El genoma de AAV es de aproximadamente 4,7 kilobases de longitud y está compuesto por ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ssDNA) que puede ser censada como positiva o negativa. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la cadena de ADN, y dos marcos abiertos de lectura (ORFs): REP y CAP (Replicasa y Cápside). El marco REP está formado por cuatro genes superpuestos que codifican para proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) requeridas para el ciclo de vida del AAV. El marco CAP contiene nucleótidos de solapamiento de 20 secuencias de proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3, que interactúan entre sí para formar una cápside de una simetría icosaédrica.

Actualmente se han descrito alrededor de 1 1 serotipos de AAVs de humanos y alrededor de 100 AAVs de primates que pueden ser utilizados como vectores. Cada serotipo representa ventajas y desventajas con respecto a estabilidad, productividad, inmunogenicidad, biodisponibilidad, tropismo, etc. Sin embargo, muchos laboratorios han desarrollado vectores pseudotipados, es decir, AAVs modificados que contienen proteínas de cubierta de diferentes serotipos, para así obtener las ventajas de distintos serotipos o evitar las desventajas de algunas proteínas de cubierta de algunos serotipos.

El término "virus adeno-asociado IRT" o "AAV ITR", como se usa aquí, se refiere a la terminal invertida que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma de un virus adeno-asociado. Se requieren de las secuencias ITR para la multiplicación eficiente del genoma de AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocopia que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena de ADN. Los IRTs también mostraron ser necesario tanto para la integración del ADN del AAV de tipo nativo en el genoma de la célula hospedera y del rescate de ella, así como para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de su completo ensamblaje. El término "AAV2", como se usa en la presente invención, se refiere al serotipo 2 del virus adeno-asociado con una secuencia del genoma tal como se define en el número de acceso GenBank: AF043303.1

El término "vector de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere además a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminal de AAV (ITR). Tales vectores de AAV pueden ser replicados y empaquetados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula huésped que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes REP y CAP (es decir las proteínas AAV REP y CAP), y donde la célula hospedera ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa una proteína del marco de lectura del adenovirus E4orf6. Cuando un vector de AAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido utilizado para la clonación o transfección), entonces el vector de AAV se denomina típicamente como un "pro-vector". El pro-vector puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del AAV y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6.

El término "sitio de unión específico para la región reguladora de transcripción de XBP1", como se usa en la presente invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que sirven como un promotor (es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionado, unido operativamente al promotor), y que afecta a la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en células de tejidos específicos, tales como las neuronas. El sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción del tejido neuronal puede ser constitutivo o inducible. El término "gen CAP' o "gen CAP de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere a un gen que codifica para una proteína CAP. El término "proteína CAP", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un AAV nativo (VP1 , VP2, VP3). Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1 , VP2 y VP3 incluyen la capacidad para inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN de hebra sencilla, facilitar el empaquetamiento del ADN de AAV en la cápside (es decir, la encapsidación), unirse a receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un hospedero.

El término "cápside", como se usa en la presente invención, se refiere a la estructura en la que se envasa el genoma viral. Un cápside consta de una estructura oligomérica con subunidades estructurales de proteínas CAP. Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3.

El término "composición de células", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material tipo compuesto que comprende las células de la invención y al menos otro componente. La composición puede formularse como una sola formulación o se puede presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para el uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, donde cada uno de los componentes se formula y se empaqueta individualmente.

El término "promotor constitutivo", como se usa en la presente invención, se refiere a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante en todo un organismo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con poca o ninguna consideración a las condiciones ambientales y externas de la célula.

El término "potenciador", como se usa aquí, se refiere a un elemento de la secuencia de ADN a la que se unen los factores de transcripción para aumentar la transcripción de los genes.

El término "cásete de expresión", como se usa aquí, se refiere a una construcción de ácidos nucleicos, generados por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico en particular, en una célula diana.

El término "genes que proporcionan funciones de ayuda", como se usa aquí, se refiere a genes que codifican polipéptidos, que realizan funciones sobre las que AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen aquellas funciones necesarias para la replicación de AAV, incluyendo estos fragmentos involucrados en la activación de la transcripción de genes AAV, las etapas específicas del empalme (splicing) de mARN de AAV, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de CAP y el ensamblado de la cápside de AAV. Funciones virales accesorias se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, virus herpes, lentivirus y el virus vaccinia. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, lentivirus WHV. El término "unido operativamente", como se describe en el presente documento, se refiere a la relación funcional y localización de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante la cual afecta la transcripción de esa secuencia). Generalmente, un promotor unido operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión. El término "administrado localmente", como se usa aquí, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, y/o composiciones farmacéuticas de la invención se administran al sujeto en o cerca de un sitio específico.

Los términos "portadores farmacéuticamente aceptables", "diluyentes farmacéuticamente aceptables", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", son intercambiables en el presente documento, se refieren a un sólido no tóxico, semisólido, o líquido de relleno, diluyente o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional. Un portador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los recipientes empleados en las dosificaciones y concentraciones y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y la naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de administración deseada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica.

El término "promotor", como se usa aquí, se refiere a una región de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situado aguas arriba de la secuencia del polinucleótido(s), y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para DNA dependiente de la ARN Polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción, y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado a, los sitios de unión de factores de transcripción, represor, y sitios de unión a proteína activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "específico de tejido" sólo se activa en determinados tipos de células o tejidos diferenciados. El término "polinucleótido", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene deoxiribonucleótidos o ribonucleótidos respectivamente. El ácido nucleico puede ser doble cadena, de cadena sencilla, o contener partes tanto de secuencia de doble cadena o de cadena sencilla. El término "polinucleótido" incluye, pero no está limitado a, secuencias de ácidos nucleicos con la capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarios a un polinucleótido endógeno de la célula o el sujeto tratado con la misma de modo que, tras la transcripción del mismo, genera una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN, siARN) capaz de hibridarse e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno.

El término "cadena" en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (incluyendo o no incluyendo nucleótidos naturales modificados o no naturales). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una forma una parte de, moléculas separadas, o pueden ser covalentemente interconectadas, por ejemplo, mediante un enganche, por ejemplo, un enlazador como polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que es suficientemente complementaria a un ARN diana.

Una segunda cadena del agente de dsARN, que comprende una región complementaria a la cadena antisentido, se denomina la "hebra sentido". Sin embargo, un agente siARN también puede formarse a partir de una sola molécula de ARN que es al menos parcialmente auto-complementaria, formando, por ejemplo, una horquilla o estructura de ojal, que incluye una región dúplex. Estos últimos son en lo sucesivo denominadas ARN corto horquilla o shARNs. En tal caso, el término "cadena" se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN.

El término "región reguladora post-transcripcional", como se usa aquí, se refiere a cualquier polinucleótido que facilita la expresión, estabilización o localización de las secuencias contenidas en el cásete o el producto génico resultante.

El término "genoma viral recombinante", como se usa aquí, se refiere a un genoma de AAV en el que se inserta al menos un cásete de polinucleótido ajeno a la expresión en el genoma de AAV nativo.

El término "gen rep" o "gen rep de AAV, como se usa aquí, se refiere a un gen que codifica una proteína Rep. El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína nativa rep de AAV (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78). Una "actividad funcional" de un proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, incluyendo la facilitación de la replicación del ADN a través del reconocimiento, unión y corte del origen de la replicación del ADN de AAV, así como la actividad helicasa de ADN. Las funciones adicionales incluyen modulación de la transcripción de AAV (u otros heterólogos) promotores y la integración sitio-específica del ADN de AAV en un cromosoma del huésped.

El término "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, tal como un humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpancé u otro simio y especies de monos), un animal (por ejemplo, pájaros, peces, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos), o un animal de laboratorio (por ejemplo roedores, tales como ratones, ratas, ratones con genes silenciados (ratones knockout), ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos) y conejillos de indias). El término no denota una edad o sexo particular. El término "sujeto" incluye un embrión y un feto. El término "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", como se usa en el presente documento, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran a un sujeto en una forma no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la invención puede alcanzar varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a nuevos órganos o tejidos del sujeto específicos. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la invención puede dar lugar a la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto.

El término "región regulatoria transcripcional", como se usa aquí, se refiere a un fragmento de ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la invención incluyen un promotor y opcionalmente un potenciador.

El término "transducción", como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de nucleótidos foráneos es introducida dentro de la célula en un vector viral. El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucariotas destinatarias.

El término "vector", como se usa aquí, se refiere a un constructo capaz 5 de entregar, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, ADN o vectores de expresión de ARN desnudos, plásmido, vectores cósmidos o fagos, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN í o encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser auto-replicantes. No hay limitaciones en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y para la obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de 15 expresión incorporados a varios organismos heterólogos. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión procariotas, fagos y vectores lanzadera y vectores de expresión eucariota basada en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociados así como retrovirus y lentivirus), así como vectores no virales tales como pSilencer 4,1-CMV.

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Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo los métodos y las composiciones del virus AAV con el inserto XBP1s-GFP, se pueden utilizar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en la presente invención, así como con cualquier vía de administración descrita en la presente invención.

Los "agentes siARN o siARN" son un término utilizado para describir fragmentos dúplex de ARN de entre 15 y 25 pares de bases, de preferencia de 19 a 21 pares de bases de longitud.

El término "cADN" o "ADN complementario", se refiere a una secuencia de ADN totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual, se sintetiza por RT-PCR.

Como se usa en este documento, el término "complementario" se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que una unión estable y específica tiene lugar entre un compuesto y una molécula de ARN diana, la unión específica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias no- objetivo en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que los ensayos se han realizado.

Ligandos

Las propiedades de un virus, incluyendo sus propiedades farmacológicas, se pueden influenciar y hacer a la medida, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. En adición, las propiedades farmacológicas de un agente viral se pueden mejorar mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus. Los ligandos, se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos que se unen a un agente viral, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunidad monomérica conjugada con el ligando. Los ejemplos se describen más adelante en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con ligando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un virus.

Un ligando altera la distribución, dirección, o tiempo de vida de un agente viral en el que se incorpore. En las modalidades preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad para un objetivo seleccionado, por ejemplo una molécula, célula, o tipo de célula, un compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular u órgano, un tejido, o región del cuerpo, por ejemplo, como se compare con una especie en la que esté ausente este ligando. Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación, y especificidad de la molécula objetivo, para la presente invención, del virus.

Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes reticulantes; fracciones que confieran resistencia a la reacciones inmunes; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen moléculas lipofílicas, lípidos, lectinas,

(por ejemplo, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, oligo-lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico), proteínas, agentes de enlace de proteínas, moléculas de dirección de integrina, policationes, péptidos, poliaminas, y míméticos de péptidos. Otros ejemplos incluyen los ligandos receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como transferrina.

El ligando puede ser una molécula que se presente naturalmente o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un poli- aminoácido sintético. Los ejemplos de los poli-aminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli-ácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico, copolímero de estireno- anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli-(láctico-co-glicólico), copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxi-propil)-metacril- amida (HMPA), polietilenglicol (PEG), polivinil-alcohol vinílico (PVA), poliuretano, poli-(ácido 2-etil-acrílico), polímeros de N-isopropil-acril-amida, o polifosfazina. Los ejemplos de las poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudo-peptidica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa-helicoidal.

Los ligandos también pueden incluir grupos de dirección, por ejemplo un agente de dirección a una célula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteína A de tensoactivo, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glicosilado, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un mimético de péptido de RGD.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glicoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo lipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero, o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de célula especificado. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, mañosa multivalente, o fucosa multivalente.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que pueda aumentar la absorción del agente viral dentro de la célula, por ejemplo mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo mediante la alteración de microtúbulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la célula.

En un aspecto, el ligando es un lípido, o una molécula basada en lípido. Este lípido o esta molécula basada en lípido, de preferencia, se enlazan con una proteína de suero, por ejemplo suero de albúmina.

En una modalidad alternativa se empacarán los virus.

Para la preparación de las soluciones inyectables de virus se preparan diluyendo la concentración de virus necesaria en PBS (buffer fosfato salino) cuya formulación es la siguiente.

PBS 1x

1. - Disolver la dosis viral en 800ml de agua destilada con:

8 g of NaCI

0,2 g of KCI

1 ,44 g of Na 2 HP0 4

0,24 g of KH 2 P0 4

2. Ajustar el pH to 7,4 con HCI.

3. Ajustar el volume a 1L con agua destilada adicional H20.

4. Esterilizar y autoclavar. Diseño y Selección

El control de la síntesis de proteína y la inducción de la expresión del gen es la clave para el tratamiento del ALS

El término "ELA" o "ALS", como se usa aquí, es una enfermedad que afecta de forma fatal a neuronas motoras generando un daño progresivo en el cerebro y en la medula espinal (1). Esta enfermedad se presenta de forma esporádica (sALS) mayoritariamente, solo un 10% de los casos tienen una etiología genética familiar (fALS), causada por múltiples variantes en los genes (2). Genéticamente las causas más comunes de los fALS son la expansión por repetición de un hexanucleótido en la región intrónica de C9orf72 y mutaciones en los genes como la superoxido dismutasa (SOD1) (3). Mayoritariamente la enfermedad ELA o ALS aparece en adultos, donde el periodo sintomático es breve. Al parecer trastornos del RE y su proteostasis son la base en la generación de la enfermedad (4).

El término "retículo endoplásmático (RE)" es considerado como un compartimento implicado en el plegamiento de proteínas y de su control de calidad (5). Se han informado una serie de marcadores del estrés que sucede en el ER y esto se ha relacionado con la incidencia de ALS en humanos y modelos transgénicos animales (6), y es uno de los primeros eventos que se detectan antes de que ALS sea sintomático (7). Se ha manipulado farmacológica y genéticamente la respuesta al plegamiento de proteínas (UPR) con el fin de hacer frente al estrés del ER y se han demostrado consecuencias favorables y funcionales en el control de ALS. (8-10).

La respuesta al plegamiento de proteínas (UPR) se gatilla principalmente por tres sensores de estrés IRE 1 , PERK y ATF6.

IRE 1 es una proteína con actividad quinasa y endorribonucleasa, que tras su activación cataliza el corte y empalme de mARN que codifica un factor transcripcional X-Box de unión a proteína (XBP1), convirtiéndola en un poderoso activador de numerosos genes UPR-sensibles conocido como XBP1s (11). A su vez, XBP1s está envuelto en el control de la expresión de genes que controlan el plegamiento, secreción, control de calidad proteica y degradación por el ER (ERAD) (12, 13). Por otro lado, la activación de PERK también desencadena la inhibición de la traducción de las proteínas en el ER y así una reducción de la carga sobre el ER de proteínas mal plegadas. PERK a su vez desencadena la expresión de ATF4, la cual, en situaciones de estrés prolongado en el RE genera un efecto pro-apoptótico. (14, 15).

Finalmente ATF6 posterior a los episodios de estrés del RE, se transporta al Golgi, donde se escinde y libera un fragmento citosólico ATF6f, que opera como un factor de transcripción regulando los genes ERAD (5, 6). En otras palabras, el control de estos tres factores de transcripción tiene respuestas únicas sobre UPR donde afectan la vida o muerte celular. (17)

La relación del estrés del ER y la enfermedad ALS (fALS y sALS) se ha visto en estudios post-mortem en humanos donde se ha informado de la activación de UPR (18 a 22). También se ha descrito factores de transcripción XBP-1 y ATF4 en la médula espinal de pacientes con ALS (23). Por otro lado, en modelos animales con fALS se ha observado la presencia de estrés de ER (9, 24 a 33). El potencial terapéutico de UPR como blanco para el tratamiento de ALS no es claro todavía. Un análisis de disección por láser a un grupo de neuronas muertas tempranamente durante el curso de la enfermedad y a otro grupo de neuronas resistentes a la neurodegeneración (7), mostró que solo se vieron afectadas las motoneuronas de fALS en modelos de ratones que eran propensos selectivamente al estrés crónico del ER, convirtiendo al estrés de ER como uno de los marcadores moleculares detectados más temprano, incluso antes de la denervación en animales pre-sintomáticos. Por otro lado, se ha demostrado que cultivos de neuronas motoras humanas generadas desde células iPS derivadas de pacientes con fALS portadores de una mutación SOD1 generan estrés de forma espontanea a en el ER como respuesta a una actividad fisiológica alterada (34). También alteraciones en la proteostasis se ven en neuronas motoras derivadas de iPSC desde pacientes que expresan la mutación C9orf72 (la más común de la fALS)(34). Finalmente estos estudios sugieren que un mal plegamiento de proteínas es una característica sobresaliente en neuronas de pacientes con ALS (35). Para la presente invención se desarrolló un modelo de ratón knockout para investigar y probar el rol de XBP-1 en el sistema nervioso motor relacionado con ALS. Inesperadamente, la supresión del factor de transcripción UPR que aumentaría la gravedad de la ALS experimental debido a la alteración a la adaptación al estrés dado el plegamiento de proteínas, se observó que estos ratones eran más resistentes a desarrollar la enfermedad. Lo cual sugirió que este efecto se daba como un efecto compensatorio en la red de proteostasis que mejoraba los niveles de autofagia mejorando la supervivencia y atenuando los signos de la enfermedad en el modelo de ratón (37). Por otra parte se demostró que los ratones deficientes de ATF4 son más resistentes a desarrollar ALS, posiblemente por expresar reducidamente de factores de stress del ER pro-apoptóticos como CHOP y BIM (38). Por su parte, una deficiencia de BIM retrasa el inicio de ALS (39). En general diversos estudios postulan que el estrés de ER contribuye a la disfunción de las neuronas motoras en ALS, los enfoques farmacológicos y genéticos sobre UPR alteran la progresión de la enfermedad en modelos de ratones in vivo de ALS (7, 30, 40 y 41). También el tratamiento de ratones transgénicos mutantes para SOD1 con atenuadores del estrés de RE como guanabenz o salubrinal (42 y 43), reduce la traducción de proteínas en el ER por la mejora en la fosforilación de elF2a (44), retrasando la enfermedad.

Todos estos estudios presentan la complejidad de la vía que involucra UPR, donde las consecuencias de la modificación de sus componentes específicos pueden tener efectos contrastantes y distintos en la evolución de la enfermedad (8 y 45), tal como se puede ver en la figura 1/9

Para la presente invención se manipuló la UPR durante el desarrollo utilizando modelos de ratones Knockout con el fin de desarrollar respuestas en la red de homeostasis proteico para poder generar fenotipos que no reflejen la participación directa de estrés en el ER en ALS. La terapia genética a través de virus recombinantes se está convirtiendo en una vía terapéutica atractiva para entregar componentes de UPR activos en tejidos específicos. Este enfoque evita efectos pleitotrópicos por la administración sistémica y tópica de compuestos que tengan como objetivo el estrés del ER (8), evitando así barreras fisiológicas terapéuticas como la barrera hemato-encefálica. Una opción genética en la entrega de estos factores son los virus adeno-asociados (AAV), ya que cuentan con perfiles terapéuticos estudiados y seguros (46). Para explorar la participación de XBP1 , específicamente XBP1s en las funciones motoras del SNC, se revisó la capacidad de adaptación de la célula con el fin de restablecer la proteostasis utilizando la adaptabilidad de UPR. Frente a una lesión motora inducida de médula espinal, se ha logrado la mejora motora y la mayor supervivencia de oligodendrocitos inyectando AW en la columna vertebral forzando la expresión de XBP1s (47). Por otro lado, se demostró por inyección estereotáxica de AAV-XBP1s/GFP se logra una disminución de la agregación de huntignina mutante en el cuerpo estriado in vivo. (Corea de Huntington)(48). Desarrollo de los vectores (AAVs) para expresar activamente XBP1s.

En orden a analizar la función de XBP1 in vivo, se generaron constructos para la producción de virus adenoasociados que expresaran el caset de xbpl. El casette de xbpl fue escindido desde un pcDNA3-XBP-1s como el fragmento Mfel/ Sphl e insertado en el plásmido previral pAAVsp70 que contiene al AAV serotipo 2 (AAV-2) con terminales invertidos ITRs. El Vector lleva una casette de expresión para EGFP que sirve como un marcador fluorescente para identificar las células infectadas. Este vector es referido como AAV-XBP1s/GFP tal como se ve en la figura 2/9.

El vector recombinante AAV-XBP1s/GFP fue producido por una triple transfeccion de células T239 usando un plásmido rep/cap y pHelper, para luego ser purificado por una columna de afinidad cromatográfica (50). Para purificar y concentrar las partículas de AAV, las células T239 (previamente infectadas) fueron lisadas con tripsina y nucieasa seguido por una cromatografía de intercambio iónico usando hidroxiapatita cerámica y DEAE-Sefarosa, en combinación con una cromatografía de afinidad con sulfato de celufina. Como control para este vector se utilizó el vector AAV-Mock/GFP, tal como se ve en la figura 2/9.

Las titulaciones virales se determinaron en tiempo real a través del ensayo TaqMan PCR con partidores específicos para la secuencia BGH poliA. La metodología seleccionada utilizó los dos constructos descritos en la figura 2/9 y sus concentraciones fueron confirmadas por medición directa del contenido de DNA (51). Estas concentraciones se presentan en la Tabla V:

Tabla V:

Para hacer las titulaciones se probaron 2 sistemas, el primero a través de Genzyme y el segundo en el laboratorio de los inventores (Hetz). EGFP es co-expresado en la identificación de células transformadas, un control para estas células es infectando con AAV-Mock/GFP células que promueven la sobreexpresion de EGFP, sin el gen objetivo. Este control es importante para eliminar efectos inespecíficos virales que se producen en este tipo de procedimientos. De esta manera se pueden medir fehacientemente los efectos biológicos concretos al aplicar AAV-XBP1s/GFP y su actividad transcripcional.

Para verificar la infectividad y los niveles de expresión, se realizó la medición de los niveles de mARN de gfp/actina y Xbpls/actina por qPCR donde se realizaron diferentes diluciones entre 1 :2500 a 1 :80000, para AAV- Mock/GFP (control), como para AAV-XBP1s/GFP. Esto confirmó la eficiencia de la infección con AAV-XBP1s/GFP en células HEK 293. Estos resultados se presentan en la figura 3/9, confirmando la alta transducción del constructo AAV- XBP1s/GFP.

Al ver los excelentes resultados in vitro en células HEK 293, se procedió con un estudio in vivo para ver la eficiencia de la transducción a través de la inyección intracerebroventricular (ICV) de una titulación equivalente de ambos AAVs en crías de ratón recién nacidas. Tal como se presenta en la figura 4/9. Esta inyección lleva a la difusión de las partículas virales a través del fluido cerebro-espinal (CSF), generando una transducción masiva global de neuronas en el sistema nervioso central que puede ser detectada en un patrón conservado en hipocampo, cortex cerebral, células ependimales, cerebelo, tractos corticoespinales en la médula espinal (52 y 53). La eficiencia de la transducción en el sistema nervioso central fue similar para ambos constructos de AAVs. La especificidad de la expresión fue obtenida a través del uso de un serotipo específico del virus AAV, el serotipo AAV 2, el cual demostró un alto tropismo con neuronas (54). Usando esta estrategia se verifico la transducción de grandes regiones del cerebro y de la médula espinal (50). Los estudios de la presente patente confirmaron el alto tropismo para neuronas motoras con los virus AAVs serotipo 2.

La mayor parte de las células transducidas de los ratones, son células de Purkinje del cerebelo, por lo tanto, este tejido fue utilizado para demostrar el éxito de cada tratamiento. Adicionalmente, el punto anterior, fue demostrado con los altos niveles de mARN de Xbp1 y gfp. La transducción positiva en ratones fue de alrededor de un 95% y no se mostraron cambios significativos de muerte perinatal en los ratones luego de la inyección de los AAVs.

El siguiente paso en el desarrollo de esta patente fue ver los niveles en el SNC (Sistema nervioso central) de mARN de Xbpls y gfp en ratones tratados perinatalmente con AAV-XBP1s/GFP.

Para esto, los niveles de mARN de Xbpls y gfp fueron cuantificados en la corteza frontal del cerebro, médula espinal y cerebelo en ratones silvestres de 90 días de edad o P90, inyectados perinatalmente con AAV-XBP1s/GFP. Los procesos de extracción de ARN, síntesis de cADN y PCR, fueron los convencionales para la producción de XBP1s y su digestión desde el cADN plus Pstl, reveló solo una tendencia a incrementar los niveles de mARN de Xbpls en la corteza frontal de ratones tratados con AAV-XBP1s/GFP en comparación con el control, tal como se ve en la figura 5/9 superior izquierda.

Por otro lado, se presenta la evaluación por qPCR de los niveles de mARN de Xbpls, donde la tendencia fue confirmada, figura 5/9 superior derecha. Sin embargo cuando el ARN del cerebelo (figura 5/9 inferior izquierda) fue evaluado, el incremento de mARN de Xbpls fue evidente y significante (alrededor de 2 veces). Sorprendentemente, los niveles de mARN de Xbpls, en médula espinal (figura 5/9 inferior derecha) fueron más evidentes que en el corteza frontal (alrededor de 2,3 veces). Todos estos resultados confirmaron la amplitud de la sobreexpresión del mARN de Xbpls en ratones tratados.

Desarrollo del virus adenoasociado (AAV)

Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (AAV), éste comprende al genoma recombinante viral que comprende un caset de expresión que incluye una región regulatoria transcripcional constitutiva operativamente unida al polinucleótido de interés.

El virus adenoasociado (AAV) de acuerdo a la presente invención incluye cualquier serotipo conocido de los 42 tipos y son derivados de los parvovirus. En general los diferentes serotipos de AAV son secuencias genómicas con una homología significativa a nivel de aminoácidos y ácidos nucleicos, los cuales proveen idénticas funciones genéticas, proveen vibriones que son esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación, ensamblaje utiliza prácticamente los mismos mecanismos.

En particular en la presente invención se utilizó el AAV serotipo 2 (tal como por ejemplo los mencionados en GenBank número de acceso

AF043303.1 (AAV 2), tal como se presenta en la Tabla III. El genoma de los AAV de acuerdo a la presente invención, normalmente comprenden un actuador en cis 5 y una secuencia de repetición terminal invertida en 3 ' y un cásete de expresión. Las secuencias ITR o LTR tienen 141 pares de bases de largo. Preferiblemente, la secuencia completa de los LTRs es usada en la molécula y solo se permiten leves modificaciones de las secuencias. En una forma preferente del presente invento, el genoma recombinante del AAV comprende los 5 ' y 3 ¾ AAV LTRs. En otra forma preferente del presente invento el 5 ' y 3 ' AAV LTRs deriva desde el AAV serotipo 2. En otra forma más preferente del presente invento el genoma recombinante de los AAV carecen del marco de lectura abierto Rep y Cap.

Por otro lado, los ITRs pueden provenir desde otros serotipos de AAV.

El AAV de la presente invención comprende una cápside desde cualquier serotipo. En particular para la presente invención se prefiere la cápside derivada de los serotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Aunque se desea de manera preferente la cápside del AAV del serotipo 2.

En algunas realizaciones, una cap del AAV para uso en el método de la invención puede ser generada por mutagénesis (es decir, inserciones, deleciones o sustituciones) de uno de los AAV caps o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la cap de AAV es de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% o más similar a uno o más de los mencionados casquillos de AAV. En algunas realizaciones, el cap de AAV es quimérico, comprende los dominios de dos, tres, cuatro, o más de los mencionados AAV caps. En algunas realizaciones, el cap del AAV es un mosaico de los monómeros VP1 , VP2, VP3 y procedentes de dos o tres AAV diferentes o un AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, una composición de rAAV comprende más de uno de los mencionados CAPS.

En algunas realizaciones, un CAP AAV para su uso en una composición de rAAV está diseñado para contener una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, una secuencia de péptido o proteína que confiere focalización selectiva o la evasión inmune puede ser por ingeniería genética en una proteína Cap. Alternativamente, o además, la Cap puede ser modificada químicamente de manera que la superficie de la rAAV presente modificaciones químicas específicas, a modo de ejemplo polietileno glicolado, lo que puede facilitar la evasión inmune. La proteína Cap también puede generarse mutagenizado (por ejemplo, para eliminar su receptor natural de unión, o para enmascarar un epítopo inmunogénico). En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de al menos una secuencia de XBP1 que se puede seleccionar de la siguiente tabla: Tabla IV (Xbpls) (NCBI secuencia de referencia NM_001271730.1 ). Las referencias de secuencias fueron obtenidas desde http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/411147450?report=genb ank&loq$=nuclt op&blast rank=1&RID=7TM54X2201 R (Xbpls)

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbpls, que se puede seleccionar de la tabla IV, quedando como se presenta en la tabla I.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia blanco que tiene una homología de 85% con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla IV.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbpls, que se puede seleccionar de la tabla II.

En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia blanco que tiene una homología de 85% con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla II. En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que es un equivalente funcional con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas.

La región reguladora de la transcripción puede comprender un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora. Preferiblemente, el promotor es seleccionado del presente listado: CMV, EF-1a, PGK1, CAMKII, 7 7/1 , ChAT entre otros. El potenciador no necesita ser específico para el tejido neuronal. En una realización, el promotor es específico para Xbpls, por ejemplo, el de citomegalovirus, también conocido como CMV.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la Calcio calmodulina kinasa 2, también conocido como CAMKII.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, también conocido como Thy1.

En otra realización, el cásete de expresión que forma parte del AAV de la invención comprende además una región de regulación post-transcripcional.

El cásete de expresión que forma parte del AAV de acuerdo con la invención comprende un "polinucleótido de interés". En una realización preferida, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa sistémicamente. En otra realización, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa dentro de una neurona. En una realización preferida, la proteína que actúa dentro de dicha neurona es XBP1s.

El límite de tamaño de los envases de los vectores de AAV es limitado al tamaño del genoma de AAV de tipo silvestre, que varía en tamaño según el serotipo de AAV (es decir, entre 4087 a 4767). Por ejemplo, AAV-2 nativo tiene un tamaño de genoma de 4680 pares de bases. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante pueden ser limitados y una secuencia de codificación deseada pueden implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases el genoma del virus. Genes de gran tamaño pueden, por lo tanto, no ser adecuados para uso en un vector de AAV recombinante estándar, en algunos casos. El experto medio apreciará que las opciones están disponibles en la técnica para la superación de una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, el AAV IRT úe dos genomas puede hibridar para formar la cabeza a la cola concatámeros, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de empalme permite la remoción del IRT después de la transcripción. Otras opciones para la superación de una capacidad de clonación limitada serán evidentes para el experto en la materia.

Vías de administración

Las vías de administración del virus están supeditadas a que el mismo pueda pasar la barrera hemato-encefálica para infectar las neuronas objetivo o que sea inyectado directamente.

Para lograr este propósito en la presente invención se han definido principalmente 2 vías de administración. La primera de estas vías es la nasal (18), generalmente los medicamentos administrados por vía nasal pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, puede penetrar al cerebro directamente, o en algunos casos puede seguir ambas vías. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo de fármaco a través de cada una de estas vías no están completamente definidos. En general hay tres rutas por las que un fármaco administrado en la cavidad nasal puede viajar. Estas rutas incluyen la entrada en la circulación sistémica directamente de la mucosa nasal, la entrada en el bulbo olfatorio por el transporte axonal a través de las neuronas, y la entrada directa en el cerebro. La evidencia que apoya el papel de cada una de estas rutas para una variedad de sustratos modelo se resume a continuación para diferentes tipos de virus.

vías de transporte seguidas por varios solutos virales a través de la administración por vía nasal

Soluto Modelo animal 1 Vía de Administración 1 Vía seguida

Virus

Virus de la hepatitis Ratón Inoculación Nasal Nervio olfatorio

Virus del herpes Simplex Ratón Gotas nasales Directa, Sistémica, Nervio Olfatori

Virus de la encefalitis Ratón Inoculación Nasal Nervio olfatorio

Neumococos Ratón Gotas nasales Directa

Esta tabla no pretende ser exhaustiva en la naturaleza, sino más bien para resaltar algunos de los solutos de diferentes clases han demostrado seguir una o más vías. La segunda vía es directa en el sistema nervioso central. La inyección directa en espacios fluidos, como intracerebroventricular (ICV) ; el humor vitreo en el ojo; o en el fluido cerebral de la columna vertebral a través de diferentes rutas, intraventricular o intratecai ( ** ) para su entrega al plexo coroideo, las capas ependimarias/meníngeas, y desde allí en el cerebro adyacente a través de procesos que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la barrera sangre-cerebro o barreras sangre-tumorales mediante inyección intra- arterial combinada con una interrupción osmótica o farmacológica temporal.

La inyección ICV, requiere será definida más adelante en la descripción de Materiales y métodos.

Cálculo de Dosis

Según Ulusoy et al (20), la titulación del vector requiere un rango entre 10 9 a 10 13 copias de genoma (CG) por mi con una dosis probada entre 2,9 x10 12 - 4,5 x10 12 cg/ml. Por otra parte, en cualquier tasa de dilución de los vectores a titular tienen que tener un rango bajo-medio de 10 11 cg/ml, lo cual resulta en la desaparición de la toxicidad. Dosis en humanos:

El rango de dosis en humanos se encontraría en el rango de entre 10 9 a 10 30 unidades virales/Kg de peso, sin restringir este rango a la aplicación en grupos etarios diferentes o con volúmenes de distribución modificados por edad o patología.

La máxima concentración o nivel de una sustancia, hallada experimentalmente o por observación, que no causa alteraciones adversas detectables en la morfología, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguibles de los observados en organismos normales (control) de la misma especie y cepa, bajo condiciones definidas de exposición.

Descripción de Figuras

Figura 1/9

En esta figura se ve un esquema de la respuesta de la proteína desplegada (UPR) y los enfoques genéticos y farmacológicos en modelos de ratones con ELA (ALS).

La figura muestra también una representación esquemática de los eventos de señalización de la UPR.

Figura 2/9

En esta figura, en el punto A, se presentan los diagramas de los vectores usados AAV-Mock/GFP y AAV-XBP1s/GFP. Por otro lado se presenta en el punto B, la secuencia completa AAV CMVmXBP1-EF1Aegfp de 7206 pares de bases en un diagrama del plásmido.

Donde las posiciones de los diferentes componentes de la secuencia se detallan a continuación:

5'ITR: 7010-7153

Promotor EFIalfa: 1-1100

eGFP: 1139-1858

señal po!yA SV40: 1937-2134

Hebra complementaria

señal polyA BGH: 2165-2369

mXBPIs: 2499-3614

Promotor CMV: 3686-4302

3' ITR: 4449-4585

Figura 3/9

En esta figura se presenta a la izquierda, la eficiencia de la infección midiendo los niveles de mARN por qPCR de Xbpls normalizados con los niveles de mARN de actina, luego de la infección de células HEK 293 con AAV- Mock/GFP y AAV-XBP1s/GFP. En la figura de la derecha se mide la eficiencia de la infección midiendo los niveles de mARN por qPCR de Xbpls normalizados con los niveles de mARN de actina, luego de la infección de células HEK 293 con AAV-Mock/GFP y AAV-XBP1s/GFP. También se tratan células HEK 293 con 1 ,0 [ig del estresor de RE Tunicamicina (Tm) por 8 horas como control del qPCR.

Figura 4/9

En esta figura, a mano izquierda se presenta un esquema y foto de la inyección manual de una solución concentrada de AAVs en los ventrículos cerebrales de ratones recién nacidos. Este esquema muestra el ángulo con el cual debe entrar la aguja para una inyección representativa y correcta. La foto presenta el lugar de inyección. El esquema de la derecha presenta un resumen de la metodología. Figura 5/9

La presente figura, en su parte superior izquierda muestra los niveles relativos de mARN de Xbpls, Xbpl u, gfp y actina desde mARN de cerebelo de ratones tratados con AAV-XBP1s por PCR convencional.

En la parte superior derecha de la figura, se presenta los resultados de los niveles relativos de mARN de Xbpls en cortex frontal.

En la parte inferior izquierda de la figura, se presenta los resultados de los niveles relativos de mARN de Xbpls en cerebelo.

En la parte inferior derecha de la figura, se presenta los resultados de los niveles relativos de mARN de Xbpls en médula espinal.

Estos resultados fueron obtenidos por el tratamiento con AAV-XBP1s en ratones a través de qPCR.

Los niveles de mARN de Xbpls fueron normalizados con niveles de mARN de Actina.

N.S., no significante.

* , p<0,05. N=3 por grupo.

Figura 6/9

En general estas figuras representan el tratamiento a través de inyecciones ICV de la terapia génica con AAV-XBP1s, donde se aumenta la supervivencia de ratones SOD1 G86R y donde se retrasa el inicio de la enfermedad.

El esquema superior central muestra una curva de Kaplan-Meyer donde se muestra la supervivencia obtenida por ambos grupos de SOD1 G86R en ratones transgénicos tratados con AAV-Mock/GFP o AAV-XBP1s/GFP. Ambos tratamientos de ratones Non-Tg no presentaron muertes en ese momento y fueron excluidos del grupo para una mejor visualización. La curva de Kaplan-Meyer en el esquema medio izquierdo, fue definida por la aparición de la pérdida de peso corporal calculado por la reducción del 5% del peso total.

La curva de Kaplan-Meyer en el esquema medio derecho, midió la duración de la fase sintomática de acuerdo con inicio del peso corporal y la curva de supervivencia basada en los datos de cada uno de los animales individuales.

La curva de Kaplan-Meyer en el esquema inferior izquierda, se define por el rendimiento de la prueba de Rotarod;

La curva de Kaplan-Meyer en el esquema inferior derecho, muestra el cálculo de duración de la enfermedad basado en la determinación de la aparición de la enfermedad por pérdida de peso corporal.

Algunos ratones no pasaron los criterios del período de entrenamiento y fueron excluidos del análisis.

Estadísticas: prueba de Mantel Cox para las curvas de supervivencia. T de Student para la prueba de columna en grupos, d: día.

N = 7-11 por grupo.

Gráfico de barras: desviación stdr.

N. S. = no significativo.

Figura 7/9

Esta figura superior la cuantificación de neuronas motoras por inmunofluorecencia con la tinción NeuN y la segregación por tamaño en neuronas del asta ventral de la médula espinal.

La figura inferior representa la cuantificación de la intensidad de GFAP en el cuerno ventral de una sección cruzada de la médula espinal desde un estado final de un ratón tratado con AAV-XBP1s/GFP y el vector de control.

N=3-4 por grupo

Gráfico de barras: desviación stdr. T de Student. * = p < 0,05

N.S., No significativo

Escala de la barra: 200 micrones. Figura 8/9 La presente figura muestra en su parte superior izquierda el resultado de un ensayo de Western Blot de los oligómeros de SOD1 desde un extracto de proteínas de corteza frontal bajo condiciones no reductoras. Fue utilizado un anticuerpo anti-actina como control de carga proteica. El esquema de la derecha superior la cuantificación de la agregación de

SOD1 normalizada con los niveles de la proteína actina.

La fotografía del centro a la izquierda presenta el resultado de un ensayo de Western Blot de los oligómeros de SOD1 desde uñ extracto de proteínas de la médula espinal bajo condiciones no reductoras. Fue utilizado un anticuerpo anti-actina como control carga.

El Esquema del centro a la izquierda corresponde a la cuantificación de la agregación de SOD1 normalizada con los niveles de la proteína actina. La fotografía inferior izquierda corresponde a un experimento con las mismas muestras de los resultados presentados en la fotografía del centro a la izquierda con una trampa de filtro. Se realizó el Western Blot de los monómeros desde las mismas muestras también utilizadas como control de carga.

El esquema inferior derecho presenta la cuantificación de los oligómeros de SOD1 retenidos por ensayo de trampa de filtro.

HWM: Alto peso molecular

T de Student. * = p < 0,05

N=3 por grupo

N.S., No significativo

Figura 9/9

Esta figura presenta los niveles mARN de XBP1s para los genes blanco Edem y Erdj4 en el SNC en presintomático (P90) y la fase tardía sintomática en el tratamiento con AAV-XBP1s/GFP a ratones SOD1 G86R .

Los esquemas superiores de la derecha e izquierda presentan los niveles relativos de mRNA de Edem y Erdj4 en la corteza frontal y la médula espinal de los ratones SOD1 G86R tratados con XBP1s sintomáticos, obtenidos mediante qPCR. Los niveles de mRNA se cuantificaron y se normalizaron con los niveles de actina.

Los esquemas inferiores derecho e izquierdo presentan los niveles relativos de mRNA de Edem y Erdj4 en la corteza frontal y la médula espinal de los ratones SOD1 G86R tratados con XBP1s sintomáticos, obtenidos mediante qPCR. Los niveles de mRNA se cuantificaron y se normalizaron con los niveles de actina.

T de Student. * = p < 0,05

N.S., No significativo.

N = 3 por grupo.

EJEMPLO DE APLICACIÓN PRUEBA EXPERIMENTAL 1

Para la determinación de los efectos terapéuticos de la introducción de programas para la expresión de XBP1s en el tratamiento de ALS y/o la reparación de defectos en la proteostasis de ER, XBP1s fue entregado a las carnadas de ratones, en el SNC de un muíante SOD1 G86R de ratón transgénico y en un ratón no transgénico (Non-Tg). Se monitorizó el efecto de los tratamientos con AAV-XBP1s/GFP y AAV-Mock/GFP en la progresión de ALS, usando carnadas independientes de animales. Extraordinariamente, hubo un incremento substancial en la esperanza de vida de los ratones transgénicos mutantes de SOD1 G86R cuando se les proporcionó una inyección con AAV- XBP1s/GFP. (Figura 6/9 superior central)

El incremento del porcentaje de la esperanza de vida en los ratones tratados con XBP1s basados en la terapia génica fue dramática y aproximadamente aumentada en 60 días cuando se compara con el grupo control al cual se le inyectó AAV-Mock/GFP, lo cual representa un efecto de protección fuerte en comparación con otros estudios del estado del arte (7, 23 y 38).

Se monitoreó la progresión de la enfermedad con relación a la pérdida de peso, por la declinación en la actividad motora usando el ensayo Rotarod, además de marcar un conjunto de signos de la enfermedad (Parálisis, tremores, curvatura de la médula espinal, etc.). Estos datos nos ayudaron a conocer el comienzo del inicio del estado sintomático de la enfermedad de acuerdo a cada parámetro. El comienzo de la etapa sintomática de la enfermedad se definió como una caída del 5% del peso corporal desde un máximo de peso medido fuera del tiempo de la prueba. En la figura 6/9 media, se muestra el tratamiento de animales con partículas de AAV-XBP1s/GFP conduciendo a un significativo retraso en el inicio de la enfermedad del mutante SOD1 en comparación con el control del virus AAV-Mock/GFP.

El inicio de la enfermedad usando ensayos acelerados de Rotarod, fue definido por el decrecimiento en 50% en el rendimiento de la medición, por el tiempo medio empleado en la tarea antes de fallar. Este análisis confirmó un retraso significativo en la aparición de alteraciones motoras en ratones con ALS en comparación con los ratones tratados con AAV-Mock/GFP, tal como se presenta en la figura 6/9 inferior.

La comparación de la supervivencia animal y el comienzo de la enfermedad en animales individuales revela que la duración de la fase sintomática no difiere en los grupos inoculados con AAV-XBP1s/GFP y AAV- Mock/GFP (Figura 6/9 media derecha e inferior derecha).

Los mismos resultados fueron obtenidos cuando el marcador de la enfermedad fue definido a través de la observación visual. Por otro lado, la inyección de animales Non-Tg del vehículo (PBS) o del AAV control no gatillaron ninguna novedad fenotípica en todos los ensayos.

PRUEBA EXPERIMENTAL 2

Para validar los resultados entregados se analizaron los niveles de agregación proteica en ratones mutantes SOD1 , número de neuronas motoras y la astrogliosis en ratones SOD1 tratados con XBP1s en la fase sintomática.

El retraso en el inicio de la enfermedad puede ser asociado a cambios en las características de ALS como la astrogliosis, pérdida de neuronas motoras y/o agregación de proteínas en ratones mutantes SOD1. Para poder definir esta problemática se analizaron tejidos de la corteza frontal del cerebro y la médula espinal desde el mismo ratón evaluado en curvas de supervivencia viendo su rendimiento a través de análisis histológicos y bioquímicos de las características de ALS.

Para evaluar una baja de pérdida de neuronas motoras, se utilizó inmunofluorecencia para detectar neuronas mediante la utilización del anticuerpo anti-NeuN y la exclusión por tamaño utilizando un software ImageJ, para así analizar específicamente las motoneuronas, las cuales presentan mayor tamaño del soma que interneuronas. El tratamiento de ratones SOD1 G86R con AAV-XBP1s/GFP mostró un decrecimiento en grandes neuronas localizadas en el cuerno ventral, lo cual también se observó en los mismos ratones tratados con AAV-Mock/GFP. De hecho, no hay diferencias significativas entre los grupos experimentales de ratones SOD1 G86R , tal como se muestra en la figura 7/9 superior. Sorprendentemente, la sobreexpresión de la proteína XBP1s en ratones transgénicos SOD1 G86R condujo a una casi completa reducción en la astrogliosis en el cuerno ventral de los ratones sintomáticos, tal como se presenta en la figura 7/9 inferior. Estos resultados confirman los efectos beneficiosos de la terapia con XBP1s en los astrocitos de la médula espinal en ratones SOD1 G86R .

Otra característica del modelo de ALS utilizado de ratón es la presencia de agregados de SOD1 en la corteza frontal del cerebro y en la médula espinal, observado en los análisis de Western Blot. El análisis de estos ratones que agregan SOD1 revela una significante disminución en los oligómeros y agregados en los mutantes de SOD1 en la corteza frontal, en los animales tratados con AAV-XBP1s/GFP en comparación con sus controles de AAV- Mock/GFP, tal como se ve en la figura 8/9 superior izquierda y derecha. Sorprendentemente, las muestras proteicas de médula espinal desde el mismo ratón no mostraron una significante reducción de los agregados de SOD1 , en los ratones tratados con XBP1s. Esto se puede ver en la figura 8/9 media derecha e izquierda. Ahondando en este resultado se decidió cambiar de enfoque y observar los agregados proteicos utilizando el ensayo de trampa de filtro. El ensayo de trampa de filtro se realizó seguido de un blot para SOD1 , revelando la tendencia al decrecimiento de las especies de SOD1 de alto peso molecular en los ratones SOD1 G86R tratados con AAV-XBP1s/GFP. (Estos resultados se ven en las la fotografía y esquema inferior izquierdo y derecho respectivamente).

Por lo tanto, el aumento en la expresión de XBP1s en el SNC posee dos impactos fundamentales relacionados con ALS, y asociados a un mayor tiempo de vida y a una mejora en el rendimiento motor, como son: (i) La reducción de los agregados de SOD1

(ii) La reducción de las reacciones astrocíticas adversas.

Otro de los estudios realizados para confirmar los resultados obtenidos en las pruebas anteriores fue el análisis transcripcional en la etapa presintomática y en la etapa sintomática en ratone perinatales inyectados con los AAV-XBP1s.

Una sobreexpresión temprana y sostenida de XBP1s en el SNC y un retraso en el inicio de la enfermedad sugieren cambios transcripcionales asociados a la activación rio abajo de los blancos de UPR. Un posible objetivo de XBP1s asociado con una reducción de la agregación de la SOD1 se asocia a un aumento de la maquinaria de degradación del RE. Un marcador clásico de este evento es la proteína EDEM. A través del análisis por qPCR de los niveles de mRNA de Edem en la corteza frontal total o en la médula espinal de ratones SOD1 G86R con 90 días de edad perinatal tratados con AAV-XBP1s/GFP reveló un aumento significativo sólo en muestras de médula espinal, tal como se presenta en la Figura 9/9 superior izquierda y derecha.

Otro posible objetivo de XBP1s es la activación de las proteínas que corrigen las proteínas mal plegadas, tales como chaperonas y proteínas compañeras de chaperonas. Erdj4 es una cochaperona donde se ha mostrado su activación directamente por XBP1s. Sorprendentemente, se observó un aumento significativo de los niveles del mARN de Erdj4 en muestras de corteza frontal y de médula espinal en ratones SOD1 G86R tratados con XBP1s al comparar el resto de los grupos experimentales analizados, tal como se ve en la Figura 9/9 superior izquierda y derecha.

Para la fase sintomática el tratamiento con XBP1s no mostró diferencias significativas entre AAV-Mock/GFP o AAV-XBP1s/GFP en ratones inyectados SOD1 G86R , tal como se ve en la Figura 9/9 inferior izquierda y derecha. Experimentalmente, el tratamiento utilizado consistió en la administración intracerebroventricular (ICV) [2] de 2 μΙ_ de AAV que contienen la secuencia codificante de XBP1s de ratón, cuya expresión está regulada bajo el promotor constitutivo ef1 (del inglés elongation factor 1), en 5 camadas neonatas distintas de padres SOD1 G86R x SODI 1" , es decir, entre los días P0 a P2.

Además este vector contiene la secuencia codificante de la proteína GFP que se expresa bajo el promotor constitutivo cmv. Este corresponde a AAV-XBP1s (concentración 2,9*10e12 DRP/mL). Se utilizarán como control ratones inyectados ICV con 2 μΐ_ de AAV que contiene a la secuencia codificante de la proteína GFP regulada bajo el control del promotor cba a 5 camadas distintas de padres SOD1 G86R x SODI^. Este corresponde a AAV- GFP (concentración 1 ,22 * 10e12 DRP/mL). Además se monitorearán ratones SODI^ y SOD1 G86R no inyectados. Se utilizaron AAVs de serotipo 2, ya que se demostró que este serotipo posee alto tropismo por motoneuronas.

Materiales y métodos

Animales y Procedimientos de Inoculación:

Para estudiar el efecto de la sobreexpresión de XBP1s en el sistema nervioso centra! usando AAVs en ratones mutantes SOD1 G86R sobre la capacidad locomotora, en el peso corporal y en la sobrevida se utilizaron ratones de la línea C57BLJ6j transgénicos para SOD1 , en este caso poseen una mutación que cambia el residuo 86 de glicina por uno de arginina (SOD1 G86R ). Esta mutación equivale a la mutación SOD1 G85R encontrada en humanos. Los ratones SOD1 G86R presentan los marcadores clásicos de ELA o

ALS, como la presencia de agregados proteicos de alto peso molecular de la proteína SOD1 , así como de astrogliosis, ambos en estado sintomático tardío.

El tratamiento a utilizar consiste en la administración ICV de 2 pL de AAVs que contienen la secuencia codificante de XBP1s de ratón, cuya expresión está regulada bajo el promotor constitutivo efí (del inglés elongation factor 1) en 5 carnadas distintas de padres SOD1 G86R x SODI™ 1" , entre los días P0 a P2. Además este vector contiene la secuencia codificante de la proteína GFP que se expresa bajo el promotor constitutivo cmv. Este corresponde a AAV-XBP1s (concentración 2,9 * 1 Oe 12 DRP/mL).

El control, son ratones inyectados ICV con 2 μΙ_ de AAV que contiene a la secuencia codificante de la proteína GFP regulada bajo el control del promotor cba a 5 carnadas distintas de padres SOD1 G86R x SODI^. Este corresponde a AAV-GFP (concentración 1 ,22*10e 12 DRP/mL). Además se monitorizó a ratones SODI^ y SOD1 G86R no inyectados.

Se utilizaron AAVs de serotipo 2, ya que este serotipo posee tropismo por motoneuronas [55].

La metodología de la inyección ICV, se siguió según los protocolos indicados en las referencias. Luego de 21 días post-inyección ICV, los ratones son sexados, destetados y genotipificados. Después de establecer los ratones experimentales, éstos son observados 3 veces por semana para determinar peso corporal, cambios fenotípicos asociados al comienzo de la etapa sintomática de ELA o ALS mediante observaciones visuales y su capacidad locomotora utilizando el Rotarod.

Para determinar el tiempo de sacrificio de los ratones SOD1 sintomáticos, se utilizó el criterio de las observaciones visuales. Además, se incluye el sacrificio de un hermano de carnada SODI^. El onset o la edad correspondiente al inicio de la etapa sintomática se determinan arbitrariamente de acuerdo a la observación de un cambio drástico de un parámetro medido.

En este caso, el onset de peso corporal se estable como la caída de un 5% en el peso del ratón con respecto a su peso máximo, siempre en un contexto de caída de peso, es decir, para establecer el onset debe haberse registrado al menos tres mediciones previas de peso decreciente.

El onset de Rotarod se ha determina como la caída de un 50% del tiempo de Rotarod máximo, también en el mismo contexto decreciente.

Para todos los experimentos en animales presentados en este desarrollo se utilizaron las directrices establecidas por el comité de cuidado y uso de animales en la Universidad de Chile, Chile.

Para el análisis de los niveles de agregación de la proteína SOD1 mutada, el número de motoneuronas y la astrogliosis en la médula espinal de ratones inyectados con AAV-XBP1s del sistema nervioso central en ratones SOD1 G86R en estado sintomático tardío, se utiliza el análisis bioquímico montado en el laboratorio del investigador.

Se detecta la agregación de la proteína SOD1 , más la expresión de los transgenes GFP y XBP1 s, mediante ensayo de Western blot; además se estudia la presencia del ARN que codifica a XBP1s [56]. Pruebas de comportamiento:

Todos los experimentos se realizaron a ciegas, y distintas cohortes de animales se utilizaron para cada ensayo.

Rotarod

Los ratones fueron colocados en una barra que gira a 4 rpm durante un minuto aclimatación. La varilla se aceleró a 0,1 rpm/s hasta 40,0 rpm. La prueba continuó por dos minutos. Se registró la latencia en caer y las rpm en el momento de la caída para cada ratón. Se realizaron tres ensayos por ratón y se promediaron. Criterio de Observaciones Visuales

Este criterio de determinación del inicio de la enfermedad mediante observaciones visuales [56] se cumple cuando se observa la espalda evidentemente arqueada, desaseo personal y parálisis de las extremidades posteriores del ratón.

Producción de vectores Adeno-asociado

Las partículas del virus AAV serotipo 2 (AAV2) fueron producidos por la transfección de células 293-AAV (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se purificaron en un gradiente de iodixanol seguido por cromatografía de afinidad en columna. El número de partículas de AAV que contiene el genoma en la suspensión, así como la infectividad de la suspensión del vector en células HEK293T se determinaron mediante ensayos TaqMan qPCR.

Preparación del plásmido adenoviral (pAAV) para XBP1s.

Para el desarrollo de este objetivo, el caset de expression del gen murino de Xbpls fue escindido del plasmidio pcDNA3-XBP-1s como un fragmento Mfel/Sphl e insertado en el plasmidio pre-viral pAAVsp70 que contiene los terminales invertidos repetidos (ITRs). El vector contiene el caset de expresión GFP que sirve como marcador de células transducidas, aunque ■ podrían ser utilizados otros como Egfp, Flag, Gfp, His y Myc, entre otras. Para el caso de la proteína GFP, ésta se descubrió en una especie de medusa llamada Aequorea victoria. Para mejorar la estabilidad de la proteína a la temperatura de los mamíferos (37°C), se realizó una mutación a la secuencia que codifica a la proteína GFP (F64L), otorgándole mayor estabilidad a temperatura corporal. Esta nueva proteína se denomina EGFP (de enhanced GFP) y es una proteína utilizada en el presente desarrollo. El virus

recombinante AAV2-XBP1s fue producido mediante triple transfeccción de células HEK-29^3 utilizando los plasmidios rep/cap y el pHelper (Stratagene, La Jolla CA, USA) y purificado mediante cromatografía en columna de afinidad, como previamente descrito [1]. Para obtener partículas virales puras y concentradas, tratamos los Usados virales de células 293T con tripsina y nucleasa seguido de cromatografía de intercambio iónico usando hidroxiapatita cerámica y DEAE-Sefarosa en combinación con cromatografía de sulfato de celufina. Los títulos virales fueron determinados mediante PCR en tiempo real mediante sonda TaqMan, con partidores que son específicos para la secuencia poliA de BGH.

Invecciones ¡ntracerebroventriculares La inyección intracerebroventricular es un método extensamente utilizado para obtener alta transducción viral en todo el sistema nervioso central (Castillo, K., et al., Measurement of autophagy flux in the nervous system in vivo. Cell death & disease, 2013. 4: p. e917, Glascock, J.J., et al., Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. Journal of visualized experiments : JoVE, 2011 (56)) y recientemente comentado por nuestro laboratorio (Matus, S., V. Valenzuela, and C. Hetz, A new method to measure autophagy flux in the nervous system. Autophagy, 2014. 10(4): p. 710-4). Protocolo de la inyección intracerebroventricular

Materiales:

Alícuota de AAV en el hielo 1 mi de PBS en hielo

1 % FastGreen (tinción)

Jeringa de insulina

Cinta adhesiva

P200 y micropipeta P20, consejos

Tablero de corcho, cubierto con papel de aluminio, con un poco de almohada hecha de papel de aluminio para la cabeza de la cría

Bolsa de hielo

Parafilm

Luz fría

Marcador punta fina

Este protocolo debe ser realizado en una instalación de virus especial. Preparación AAV: . Diluir 2 uL de FastGreen en 28 uL de PBS

2. Añadir 2,5 ul de la dilución FastGreen a 10 uL de AAV.

3. Inyección de carga es de 2,5 uL por cría

4. La cantidad de virus utilizada en cada inyección corresponde a 2 uL del título viral del AAV de menor concentración (AAV-GFP), es decir 2,44 * 10 9 partículas virales. Por lo tanto, previamente, el AAV-XBP1s debe ser diluido 2,3 veces para así tener un título viral equivalente al control AAV-GFP. Preparación mesón de inyección:

1. Preparar la luz fría y la tabla de corcho frente a su lugar. Ponga hielo sobre la mesa de corcho para mantenerlo frío.

2. Ponga un pedazo de parafina pegada en el lugar de trabajo, junto a la tabla de corcho, dibujar sobre el parafilm un círculo. Este círculo va a ser el lugar para poner la gota de preparación de AAV. Coloque la gota de preparación de AAV (2,5 uL) sobre el círculo dibujado y luego cargarla con cuidado en la jeringa de insulina para evitar burbujas.

3. Retirar la cría de la madre. Este paso es crucial. Para retirar la cría de su madre, que es muy importante para evitar el estrés de la madre (la madre se da cuenta de que hay una cría, esta es una situación estresante para ellos).

Primero se impregnan los guantes del investigador con el olor de la cama antes y después recoger la cría. Para recoger la cría, golpear la jaula en el lugar opuesto del nido para obligar a la madre a abandonar el nido. Cuando se logra, se retira inmediatamente sólo una cría a la vez. A continuación, poner la cría sobre el hielo para anestesiar. Espere hasta que no se mueva más (entre 2 y 4 min.).

4. Cuando el ratón está completamente anestesiado, coloque la cría en la tabla de corcho (dorsal hacia arriba) y manténgalo suavemente sujetado con 2 tiras de masking tape, uno sobre la espalda y la otra sobre su nariz.

5. Dibuje un punto sobre el bregma y luego un punto en la distancia media entre bregma y un globo ocular (yo uso el lado izquierdo, para diestros), este es el punto de la inyección.

6. Ponga la jeringa cargada en el punto de inyección, tenga en cuenta que el bisel debe estar apuntando a la línea media, luego rotar la posición de la jeringa aproximadamente 10 grados hacia la derecha (hacia fuera) y los 10 grados a usted (ver figura). A continuación, inserte la jeringa entre 3 y 4 mm en la dirección del eje de la jeringa e inyectar el contenido suavemente, luego retire la jeringa cuidadosamente. Usted debe ver a la difusión del colorante a través de ambos ventrículos laterales, a veces se puede ver que va a través de la parte posterior del cerebro. La inyección es fallida cuando se observa la tinción con distribución subcutánea.

7. Poner a la cría en una fuente caliente hasta que empiece a abrir su boca (esto es después de los primeros movimientos de las extremidades), que tarda alrededor de 20 segundos. A continuación, poner la cría de nuevo en la jaula, específicamente en el lugar opuesto del nido de la madre, medio enterrado, a continuación, "llamar" a su madre golpeando la jaula, la madre empieza a buscarlo. Es una buena señal cuando la madre toma a la cría y la ubique en el nido. 8. Se eliminaron todos los residuos que tuvieron contacto con el virus en un recipiente especial.

Preparación de tejidos para el análisis bioquímico

Los ratones fueron sacrificados por narcosis de C0 2 , los cerebros se retiraron, luego la corteza y la médula espinal, de ambos hemisferios se diseccionaron rápidamente en un plato de plástico enfriado con hielo. Después, se homogeniza el tejido (médula espinal o corteza cerebral) en tampón fosfato salino PBS, luego el homogenizado se divide en dos fracciones:

1) homogenizado de proteínas; y

2) homogenizado en Trizol para extracción de ARN. El homogenizado de proteínas se vuelve a dividir para dejar una mitad en tampón RIPA, tampón usado para observar proteínas en general; y la otra mitad en solución de Tritón 1 % en PBS, detergente más suave para conservar los agregados proteicos. Se cuantifica la cantidad de proteínas de cada muestra por el protocolo de BCA y se cargan los geles con las siguientes muestras:

1) Muestras en Tritón X-100 1% sin DTT en un gel de poliacrilamida al 15%. Este gel se utiliza para observar agregados proteicos, en este caso, agregados de la proteína SOD1. 2) Muestras en tampón RIPA con DTT en 2 geles de poliacrilamida al 8% para observar las proteínas reporteras GFP y XBP1s por separado.

Extracción de ARN y PCR en tiempo real

El ARN total fue aislado de medula espinal y corteza del cerebro total. El homogenizado dejado en Trizol se utiliza para extraer ARN. Se realizará síntesis de cADN a partir de ARN. Luego se realizará el ensayo de PCR para amplificar un fragmento correspondiente al cADN de Xbp1. Luego este producto de PCR será incubado con la enzima de restricción Pstl, la cual digiere exclusivamente el fragmento que corresponde a la forma no procesada de Xbp1 , por lo tanto este ensayo permite resolver de forma adecuada las formas procesada (Xbp s) y no procesada (Xbpl u) de Xbp1 en un gel de agarosa al 2,5% bajo corrida electroforética [6]. Específicamente, el cADN se sintetizó con un kit de cADN de transcripción reversa de alta capacidad (Applied Biosystems). SYBR green y un Sistema (Stratagene) Mx3005P QPCR fueron utilizados para el RT-PCR cuantitativo. La cantidad relativa de mARN se calculó por el método de ciclo umbral comparativo con β-actina como control.

Western blot de tejido.

La extracción de proteínas a partir del tejido de ratón se llevó a cabo en tampón RIPA (20 mM Tris pH 8,0, NaCI 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato, 0,5% de Tritón X-100) que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa y una mezcla de inhibidores de la fosfatasa (Sigma, EE.UU.). Ejemplo de esta cuantificación se realizó con el kit de ensayo BCA (Pierce, EE.UU.). Extractos celulares totales se separaron por SDS-PAGE y fueron transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis de inmunoblot: Hsp90 (1 :3000, Santa Cruz), anti-SOD1 (1 :3000, Calbiochem 574597). Preparación del tejido y el análisis histológico

Los ratones fueron sacrificados por narcosis de CO 2 , y se perfundieron con paraformaldehído al 4%. Los cerebros fueron extraídos, después fijados durante la noche a 4°C en la misma solución y posteriormente se colocó al 30% de sucrosa (Merck, EE.UU.) a 4°C durante 48 h. Los cerebros se congelaron en un compuesto óptimo para su corte a temperatura adecuada (Tissue Tek, EE.UU.), secciones transversales de 25 μιη de médula espinal se cortaron en un crióstato (Leica, Alemania) y a continuación, se montaron en portaobjetos y realizaron incubaciones con anticuerpos correspondientes para identificar neuronas o astrocitos. Se determinará los niveles de transducción viral en diversos tejidos del sistema nervioso central (cerebro, médula espinal y nervio ciático) mediante la observación de la fluorescencia de la proteína reportera GFP en un microscopio de fluorescencia. Para determinar los cambios celulares asociados al tratamiento, se realizará inmunofluorescencia utilizando anticuerpos para identificar distintos tipos celulares como neuronas (anti-NeuN, MAB377, Millipore Bioscience Research Reagents, Billerica, MA, USA), astrocitos (N1506, Dako, Glostrup, Denmark) y microglia (MCA74G, Serotec, Morphosys, Oxford, UK).

Protocolo de inmunofluorescencia de cortes de médula espinal montados en portaobjetos

Materiales

Cajas de incubación (cámara húmeda)

Coupling de incubación, PBS

Anticuerpos

Buffer de bloqueo

Fluoromount

Preparación buffer de bloqueo:

Albúmina de suero de bovino (BSA) al 5% en tritón al 0,05%.

Procedimiento

Se lava tres veces los portaobjetos con PBS por 10 minutos c/u.

Se bloquean con buffer de bloqueo por una hora en cámara húmeda. Se coloca el Anticuerpo primario diluido en buffer de bloqueo por 2-3 horas u o.n. en cámara húmeda

Se realizan tres lavados de 10 minutos con PBS

Se coloca el Anticuerpo secundario diluido en buffer de bloqueo por 2 horas en cámara húmeda

Se realizan tres lavados de 10 minutos con PBS

Se Montan los cortes con Fluoromount y se sellan los cubreobjetos con esmalte Se guardan los portas en caja de incubación seca a 4°C. Se determino los niveles de transducción viral en diversos tejidos del sistema nervioso central (cerebro, médula espinal y nervio ciático) mediante la observación de la fluorescencia de la proteína reportera GFP en un microscopio de fluorescencia. Para determinar los cambios celulares asociados al tratamiento, se realizará inmunofluorescencia utilizando anticuerpos para identificar distintos tipos celulares como neuronas (anti-NeuN, MAB377, Millipore Bioscience Research Reagents, Billerica, MA, USA), astrocitos (N1506, Dako, Glostrup, Denmark) y microglia (MCA74G, Serotec, Morphosys, Oxford, UK). Estadísticas

Los datos se expresan como media y SEM. En función de los experimentos, los resultados fueron comparados estadísticamente utilizando la prueba T de Student o la prueba de Mann-Whitney, de dos vías ANOVA seguido por Holm-Sidack o Bonferroni como prueba post-hoc o Kruskal-Wallis ANOVA de una vía en rangos seguidos por el Método de Dunn o Bonferroni como prueba post-hoc.

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