CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo de transformação genética de bactérias acidófilas quimiolitotróficas, sem alterar as propriedades fisiológicas naturais das bactérias, de modo que a nova cepa transformada possa ser capaz de sobreviver e se multiplicar em seu habitat natural.

A presente invenção também se refere a um processo para tratamento das células de bactérias acidófilas quimiolitotróficas capaz de permeabilizar transientemente a membrana celular da bactéria, de modo que a membrana se torne permissiva à entrada de material genético exógeno. Adicionalmente, a presente invenção tem por objeto o processo de inserção de material genético de interesse nas cepas de bactérias acidófilas quimiolitotróficas e, também a construção de um vetor capaz de se auto-replicar quando inseridos em células de bactérias acidófilas quimioiítotróficas.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

As bactérias do género Aciditiobacillus são acidófilas, autótrofas e quimiolitrótofas, ou seja, essas bactérias vivem em pH ácidos de 0 a 4, sua fonte de carbono é o CO2, e sua fonte de energia são os compostos inorgânicos. Sendo que duas espécies desse género são importantes e muito utilizadas na biomineração: Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans.

A espécie Acidithiobacillus ferrooxidans representa bactérias Gram-negativas, não patogênicas, com ótimo crescimento em torno de 30°C e pH em torno de 2,0 e tem sido utilizada como um microrganismo modelo em estudos de processos de biolixiviação (Holmes et ai., 2008, BMC Genomics 9: 597).

Como mencionado acima, Acidithiobacillus ferrooxidans é um dos microrganismos mais utilizados na lixiviação bacteriana de metais, processo este denominado biolixiviação. Durante o processo de biolixiviação, o metabolismo microbiano causa a solubilização dos minerais que apresentam, em sua constituição, formas reduzidas de enxofre e ferro. Esta solubilização pode ocorrer de forma direta pelo ataque enzimático, ou indireto, através da produção de H2SO4 e Fe ³⁺ pelo metabolismo da bactéria.

A biolixiviação é uma tecnologia já consolidada na indústria mínero-metalúrgica e é aplicada com sucesso no tratamento de minérios refratários de ouro e na recuperação de cobre contido em minérios marginais e rejeitos. A biolixiviação é definida como o método para solubilização dos metais a partir de matrizes complexas em um meio ácido, empregando a ação direta ou indireta dos microrganismos (Rawlings 2005, Microb. Celi. Fact. 4(1): 13). A biolixiviação é direta quando os microrganismos atuam no metal ou em seu contra-íon, liberando um ion do metal de interesse dentro da solução em ambos os casos. Por outro lado, a biolixiviação é indireta quando o microrganismo gera condições químicas que acelerem e favorecem a solubilização do metal.

A biolixiviação é responsável por aproximadamente 10% da produção mundial de cobre e é particularmente importante na recuperação de metais a partir de minérios de baixo teor, os quais não seriam economicamente viáveis de se extrair por processos convencionais como a pirometalurgia. Desse modo, a aplicação da biolixiviação para recuperação de metais a partir de minérios de baixo teor demonstrou ser uma alternativa economicamente e ambientalmente viável, pois o processo não requer alto consumo de energia e, comparado com o processo pirometalúrgico pode ser considerado uma estratégia menos poluente (Jonhson & Rawlings, 2007, Microbiology 153: 315-24).

As espécies pertencentes ao género Acidithiobacillus são utilizadas em processos de biolixiviação, sendo que a espécie Acidithiobacillus ferrooxidans favorece a oxidação do Fe ² " em Fe ³⁺ empregando oxigénio como um aceptor de elétrons. O Fe ³⁺ gerado é um agente com maior potencial de oxidação e pode oxidar os sulfetos presentes ou qualquer composto que necessite ser oxidado. Apesar da grande utilização de Acidithiobacillus ferrooxidans no processo de biolixiviação, o crescimento lento do microrganismo associado à sua sensibilidade ao íon cloreto e a metais pesados como As ³⁺ , Hg ²⁺ e Ag ⁺ têm limitado uma aplicação mais abrangente desta tecnologia.

Em razão da importância de Acidithiobacillus ferrooxidans no processo de biolixiviação, torna-se importante a capacidade de manipular geneticamente este microrganismo. O emprego de um método eficaz de transformação das células da bactéria pode aperfeiçoar a atividade de oxidação; aumentar a resistência aos compostos tóxicos; acelerar o crescimento e incorporar propriedades de interesse.

A transformação genética de Acidithiobacillus spp tem-se mostrado muito complexa. No entanto, devido à relevância de Acidithiobacillus ferrooxidans no processo de biolixiviação torna-se imprescindível a padronização de processos que permitam a transformação genética dessa espécie, melhorando suas condições de crescimento e oxidação, bem como a incorporação de propriedades interessantes, como a resistência a compostos tóxicos.

Informações básicas sobre a genética molecular de Acidithiobacillus ferrooxidans foram acumuladas durante os anos. Muitos autores descreveram tentativas de promover a transferência de material genético para Acidithiobacillus spp utilizando diversas abordagens, como por exemplo, a utilização de sistemas de conjugação entre cepas acidofilílicas e £. coli e, principalmente, através da utilização da técnica de eletroporação.

O cultivo das bactérias do género Acidithiobacillus é complexo, já que estas bactérias devem ser mantidas em pH extremamente ácido. Esta característica dificulta o processo de transformação destes microrganismos.

Tem sido desafiador e nem sempre promissor a padronização de um processo de transformação genética reprodutível para Acidithiobacillus ferrooxidans e para os demais microrganismos acidófilos quimiolitotróficos utilizados nos processos de biolixiviação, como por exemplo, os microrganismos Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus prosperus, Leptospirillum ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Sulfoiobus metallicus, Sulfolobus acidocaldarius, Acidianus brierleyi e Acidianus infernus.

Roberto e Bruhn (Roberto e Bruhn; 1992, Geomicrobioiogy Journal 10(3-4), 249-55) descreveram que o uso da eletroporaçâo é limitado para transformar bactérias acidofilas e que a técnica de conjugação parece ser mais aplicável.

Kusano e colaboradores (Kusano et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 6617-6623) descreveram a eletroporaçâo de 30 cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans com um vetor contendo um gene de resistência ao mercúrio (operon mer). Apenas uma das cepas foi transformada e a reprodutibilidade da técnica foi muito baixa, tanto que nenhum outro grupo se mostrou capaz de reproduzir o processo descrito por esses autores.

Em 1995, English e colaboradores (English et ai., 1995, Appl. Environ. Microbiol, 61 : 3256-3260) descreveram um experimento de eletrotransformação deThiobacillus. neapolitanus com um vetor contendo o replicon carboxissoma deThiobacillus. intermedius. Apesar dos resultados da eletroporaçâo terem sido positivos, os autores não conseguiram demonstrar a expressão da proteína, o que seria um indicativo de não funcionalidade do vetor.

Foram identificados estudos que demonstram o interesse em modificações e/ou identificação de fatores genéticos em microrganismos acidófllos e quimiolitotróficos com a intenção de melhorar a atividade destes microrganismos na biolixivíação (Bruscella et al; 2007, Microbiology 153 (1): 102-10; Farah et al; 2005, Appl. and Environ. Microbiol. 71 (11): 7033-7040).

Estudos com base no sistema de conjugação geraram quatro publicações que descreveram a transferência genética entre cepas de Escherichia. coli e Acidithiobacillus spp (Yankofsky et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 652-657; Jin et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58: 429-430; Liu et al., 2000, J. Bacteriol. 182: 2269-2276 e van Zyl et al., 2008, Appl Environ. Microbiol. 74; 5686-5694). Entretanto, apenas o estudo de van Zyl e colaboradores demonstrou ser uma técnica eficientemente capaz de gerar um mutante nulo de uma cepa de Acidithiobacillus caldus, porém esse tipo de abordagem ainda não está descrita para linhagens de Acidithiobacillus ferrooxidans.

Recentemente, o pedido de patente americano US 2009/0035864 descreve um processo para transformar Acidithiobacillus spp baseado na modificação das condições de crescimento das bactérias. O grupo relata que culturas de Acidithiobacillus spp adaptadas a uma faixa de pH entre 5 e 7 são passivas de serem transformadas por qualquer processo já conhecido, especialmente por eletroporação. No entanto, considerando que o pH ótimo de crescimento de Acidithiobacillus ferrooxidans varia entre 1 ,5 e 2,5, a adaptação desse organismo a um pH muito maior (pH entre 5 e 7) representa uma alteração severa da fisiologia das bactérias. Uma cepa transformada sob condições fisiológicas alteradas tem seu metabolismo adaptado a condições específicas, e assim sendo, esse novo microrganismo pode perder a capacidade de crescer em suas condições naturais. Segundo Suzuki (Suzuki, 200 , Biotechnology Advances 19: 119-132) os microrganismos atuantes em processos de biolixiviaçao/biooxidação de minerais, para apresentarem boa atuação, precisam ter características específicas, como por exemplo, a possibilidade de atuar numa faixa expandida de temperatura (de 30° a 70°C), faixa de pH ácido (1,8 a 2,2) e alta relação dos íons Fe ³⁺ / Fe ²⁺ . Assim, as bactérias nativas apresentam vantagem sobre cepas de coleção, pois já estão adaptadas às condições climáticas, à mineralogia e à composição química de minérios a serem tratados.

Em resumo, até o momento não existe um processo conhecido e reprodutível capaz de transformar células de Acidithiobacillus ferrooxidans sem alterar as suas propriedades fisiológicas. O mesmo se aplica aos demais microrganismos acidófilos quimiolitotróficos empregados nos processos de biolixíviação, não sendo limitado, portanto, a bactéria Acidithiobacillus ferrooxidans.

Adicionalmente, há poucos trabalhos publicados nesta área e a maioria com resultados inconclusivos ou impossíveis de serem reproduzidos, uma vez que esses microrganismos são de difícil manipulação genética. Além do crescimento lento e do baixo número de células, o cultivo desses microrganismos em meio sólido é difícil, inviabilizando a realização de vários experimentos.

Assim, sendo Acidithiobacillus ferrooxidans o microrganismo mais comumente utilizado em processos de bíolixiviação, o desenvolvimento de um processo de transformação genética de Acidithiobacillus ferrooxidans, sem alterar sua fisiologia natural, é extremamente importante para o campo da bíolixiviação. Buscando obter células de Acidithiobacillus ferrooxidans transformadas para melhorar a bíolixiviação, foi desenvolvido um processo de transformação de linhagem permissiva de Acidithiobacillus ferrooxidans, sem alterar a fisiologia natural da espécie utilizando um vetor funcionai capaz de se replicar no interior da célula.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um processo de transformação de bactérias acidófilas quimiolitotróficas, sem alterar as propriedades fisiológicas naturais das bactérias, de modo que a nova cepa transformada possa ser capaz de sobreviver e se multiplicar em seu habitat natural.

De acordo com a presente invenção o processo de transformação consiste das etapas de: (a) obtenção das células competentes de Acidithiobacillus ferrooxidans através da alteração da permeabilidade da membrana celular; (b) construção de um vetor capaz de se auto-replicar quando inserido em Acidithiobacillus ferrooxidans; (c) transformação das células de Acidithiobacillus ferrooxidans previamente induzidas ao estado transiente de competência, através da utilização da técnica de eletroporação.

Um segundo aspecto da presente invenção trata da construção de um vetor auto-replicador, ou seja, vetor que contém sequências de DNA que o torna funcional.

Adicionalmente, a presente invenção também compreende um processo para o tratamento das células de Acidithiobacillus ferrooxidans, capaz de permeabilizar transientemente a membrana celular da referida bactéria de modo que ela se torne permissiva à entrada de material genético exógeno como, por exemplo, vetores.

Outro aspecto da presente invenção consiste da importância da origem de replicação, a ser inserida no vetor. Esta origem tem que permitir a replicação do plasmídeo no interior das células de Acidithiobacillus ferrooxidans.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra o diagrama do vetor pAF destacando características essenciais as quais o torna funcional em Acidithiobacillus spp. A OriE - permite a replicação do plasmídeo em Escheríchia. coli, necessário para subclonagens; Tc - gene de resistência à tetraciclina; Kan - gene de resistência à canamicina; OriV - permite a replicação do plasmídeo em Acidithiobacillus spp.

A figura 2 mostra um gel de agarose 1% com a recuperação do vetor pAF de rLRpAF: (1) marcador de peso molecular 1 kb plus (lnvitrogen ^® ), (2) DNA plasmideal isolado de rLRpAF, (3) DNA de uma cultura de Acidithiobacillus ferrooxidans LR não recombinante e (4) 1 pg de DNA de pAF (controle positivo).

A figura 3 mostra a amplificação da OriV a partir de rLRpAF: (1) marcador de peso molecular 100 pb (lnvitrogen ^® ), (2) PCR a partir de uma cultura de Acidithiobacillus ferrooxidans LR, (3) PCR a partir de uma cultura de rLRpAF, (4) PCR a partir de DNA de pAF, (5) PCR sem amostra (controle negativo) e (6) marcador de peso molecular 100 pb (lnvitrogen ^® ).

A figura 4 mostra um gráfico da curva de oxidação do Fe ²⁺ de Acidithiobacillus ferrooxidans LR não transformada e transformada (rLRpAF). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um processo de transformação de bactérias acidófilas quimiolitotróficas, mais especificamente da linhagem LR de Acidithiobacillus ferrooxidans. Sendo que para o processo de transformação é utilizado um vetor caracterizado por conter uma origem de replicação vegetativa, a qual confere ao vetor, a capacidade de se replicar no interior da célula transformada.

É importante ressaltar que a presente invenção não é limitada a linhagem LR de Acidithiobacillus ferrooxidans e nem as bactérias do género Acidithiobacillus. A presente invenção também pode ser empregada para transformação de outros microrganismos acidófilos químiolitotróficos termotolerantes ou não, como por exemplo, e não se restringindo, a Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus prosperus, Leptospiríllum ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfídooxidans, Sulfolobus metallicus, Sulfolobus acidocaldarius, Acidianus brierleyi e Acidianus infernus.

A transformação de bactérias é um processo através do qual o DNA plasmideal (vetor) é introduzido na célula bacteriana, temporariamente permeável, com a função de introduzir material genético de interesse.

De acordo com a presente invenção o processo de transformação das bactérias ocorre de forma a não alterar suas propriedades fisiológicas naturais, de modo que a nova cepa transformada possa ser capaz de sobreviver e se multiplicar em seu habitat natural.

De acordo com a presente invenção o processo de transformação consiste nas etapas: (a) obtenção das células competentes de bactérias acidófilas quimiolitotróficas através da alteração da permeabilidade da membrana cefuiar; (b) construção de um vetor capaz de se auto-replicar quando inserido em células de bactérias acidófilas quimiolitotróficas; (c) transformação das células de bactérias acidófilas quimiolitotróficas previamente induzidas ao estado transiente de competência, através da técnica de eletroporação.

De acordo com a presente invenção o termo "células competentes" compreende células permissivas a entrada de material exógeno.

De acordo com a presente invenção, um dos requisitos para o sucesso do processo de transformação de linhagens de Acidithiobacillus ferrooxidans, bem como dos demais microrganismos acidófilos químiolitotróficos, é o desenvolvimento de vetores capazes de se auto-replicar no interior das células bacterianas.

Com a finalidade de se obter um vetor funcional, algumas características foram exploradas. Alguns plasmídeos conhecidos como plasmídeos de largo espectro de hospedeiros (broad-host-range) têm a capacidade de se replicar em diversas espécies de bactérias, sendo considerados plasmídeos promíscuos. Os plasmídeos de largo espectro de hospedeiros, especialmente os pertencentes ao grupo de incompatibilidade das bactérias Gram-negativas (plasmídeos IncQ e IncP), foram os mais estudados e apresentaram características adequadas para o desenvolvimento de um sistema hospedeiro-vetor para as linhagens de bactérias que não apresentam plasmídeos naturais ou que ainda não possuam plasmídeos descritos.

De acordo com a presente invenção, uma característica comum e importante nos vetores é a presença de uma sequência de DNA denominada de origem de replicação vegetativa (OriV), sequência esta responsável pela habilidade de replicação do material inserido em muitos tipos de bactérias Gram-negativas.

Ra lings e colaboradores (Rawlings et al., 1989, J. Bacteriol. 171 : 2735-2739), isolaram uma região de replicação de um plasmídeo de largo espectro de hospedeiros de Acidithíobacillus ferrooxidans (pTF-FC2). Esta região possui grande similaridade com a OriV de um plasmídeo IncQ de Escherichia coli. A clonagem desta sequência de DNA de Acidithíobacillus ferrooxidans permite que o vetor replique na linhagem GW125a de Escherichia coli (linhagem deficiente na produção de DNA polimerase), sugerindo que um plasmídeo que contenha uma sequência similar seria capaz de se replicar dentro de linhagens de bactérias Gram-negativas, inclusive Acidithíobacillus ferrooxidans.

Na presente invenção, nota-se que a OriV de 200 pb amplificada a partir de um transposon comercial (EZ-Tn5™), apresentou 44,05% de similaridade com a sequência encontrada no plasmídeo PTF-FC2 descrito por Rawlings e colaboradores (Rawlings et al., 1989, J. Bacteriol. 171 : 2735-2739), e 100% de similaridade com IncP e com os plasmídeos promíscuos R18, R68, RK2, RP1 e RP4 de E. coli (Peng et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 2892-2897). Sendo assim, tem-se que a inserção desta OriV, retirada do transposon EZ-Tn5™, permite a construção de um vetor com grande probabilidade de replicação em Acidithiobacillus ferrooxidans. Assim, esta abordagem, assumida na presente invenção, demonstrou ser eficiente, uma vez que o vetor pAF foi capaz de replicar dentro das células de Acidithiobacillus ferrooxiddans, como pode ser observado nas figuras 2 e 3. Sendo que a disponibilidade de uma origem de replicação promíscua comercial facilita a construção de vetores para transformação genética de linhagens de Acidithiobacillus e demais microrganismos acidófilos quimíolitotróficos, no caso de ausência de plasmídeos naturais nas linhagens a serem transformadas.

A construção de um vetor funcional deve conter alguns elementos básicos: (1) origem de replicação de E. coli (Ori E), permitindo que as subclonagens sejam feitas em linhagens de E. coli; (2) um promotor adequado, preferencialmente o lac P (promotor do gene que codifica para β-galactosidase); (3) genes de resistência a antibióticos, preferencialmente a ampiciiina, canamicina ou tetraciclina, para promover a seleção das células transformadas; (4) um sítio de clonagem múltipla (MCS) para inserir os genes ou fragmentos de interesse; e finalmente, (5) um gene repórter que codifica, por exemplo, uma enzima, como a β-galactosidase ou uma proteína verde-fluorescente como marcador secundário.

De acordo com a presente invenção, o vetor foi construído utilizando técnicas de biologia molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) como descrito no Exemplo 1.

Uma vez construído o vetor, a próxima etapa, de acordo com a presente invenção, consiste na transformação da linhagem LR de Acidithiobacillus ferrooxidans, empregada como exemplo.

A transformação genética de espécies do género Acidithiobacillus e demais bactérias acidófilas quimiolitotróficas, empregadas em processos de biolixiviação, tem sido particularmente desafiadora. Uma questão importante que contribui para a sua dificuldade é o substrato onde essas bactérias são cultivadas. O fato de o substrato ser uma mistura de sais inorgânicos ajustado para uma faixa de pH muito baixa, interfere em quase todos os passos necessários para a manipulação genética destes microrganismos. A maneira ideal é que a transformação genética ocorra de uma forma a não alterar a fisiologia das bactérias, evitando problemas como a sua readaptação fisiológica de crescimento e estabilidade do DNA plasmideai.

Assim com a finalidade de solucionar o problema existente, a presente invenção descreve um processo de transformação genética que permite transformar as bactérias acidófilas quimiolitotróficas, como Acidithiobacillus ferrooxidans, por eletroporação mantendo o seu cultivo, após o processo de transformação, nas mesmas condições do habitat natural da bactéria, ou seja, mesmo pH e temperatura, não sendo alterado seu estado fisiológico natural.

O processo de transformação genética é composto por seis etapas importantes: (1 ) padronização da fase de crescimento do inoculo, para que a bactéria esteja mais suscetivel à permeabilização de sua membrana; (2) permeabilização ou enfraquecimento da parede celular da bactéria resultando na obtenção de células competentes; (3) aplicação de pulsos elétricos, (4) incorporação do DNA plasmideai com genes de interesse utilizando vetores apropriados; (5) inoculo e recuperação e (6) seleção das células transformadas.

De acordo com a presente invenção, a fase de crescimento ótima é a fase na qual o cultivo das células atinge a faixa entre 50% a 80% de oxidação de Fe ²⁺ no meio, preferencialmente entre 60% e 70%, uma vez que foi observado que as células nessa faixa de crescimento são mais permissivas às próximas etapas do processo.

Após as células cultivadas atingirem a fase de crescimento ótima, as células são lavadas com solução salina com a finalidade de aclimatá-las em uma solução com pH adequado para a manutenção da estabilidade dos reagentes e do DNA que serão utilizados nas etapas subsequentes. Esta alteração do substrato é fundamental para que o vetor utilizado na etapa de transformação e o antibiótico utilizado para a etapa de seleção, não sejam desnaturados ou degradados pelo baixo pH do meio. Após as lavagens com a solução salina, as células cultivadas são incubadas com um agente permeabilizador de parede celular, gerando células de bactérias acidófilas quimiolitotróficas eletrocompetentes. Os processos mais comuns de eletroporação utilizam como agentes permeabilizadores o glicerol ou a glicina. Porém, durante os experimentos verificou-se que o glicerol foi tóxico para as células de Acidithiobacillus ferrooxidans promovendo lise celular mesmo em baixas concentrações (0,5%). No entanto, a incubação das células em soluções contendo de 0,5% a 3,0%, em massa/volume, de glicina, preferencialmente de 1 ,0 a 2,0%, em massa/volume, em uma concentração ótima de 1,0 a 1 ,5%, em massa/volume, demonstrou ser eficiente na permeabilização da parede celular sem provocar a lise das células, gerando células eletrocompetentes permissivas à incorporação do DNA.

Na próxima etapa do processo ocorre a incubação das células eletrocompetentes (células de Acidithiobacillus ferrooxidans LR previamente tratadas com glicina) com 1 a 5 g de DNA (Vetor pAF), seguido da aplicação do pulso gerado pelo equipamento BioRad Gene ® Pulser, responsável por promover a formação de poros temporários na membrana celular. O vetor penetra na célula através desses poros transientes, que foram abertos durante o pulso elétrico sob condições ótimas, condições estas determinadas após diversas tentativas. De acordo com a presente invenção as condições do pulso elétrico consideradas ótimas são: Capacitância de 25 F; Resistência de 200Ω; Tensão entre 1 ,0 e 2,0 kV, sendo a tensão ótima preferencial de 1 ,0 a 1,5 kV; e com duração do pulso de 2 a 5 milissegundos.

Com o objetivo de recuperar e estabilizar a membrana celular após o pulso elétrico, as células de Acidithiobacillus ferrooxidans foram incubadas por 1 hora em um meio de cultura apropriado, como por exemplo, o T&K suplementado com FeS0 ₄ .7H ₂ 0, pH entre 1 ,5 a 2,5, preferencialmente em pH 1 ,8. Sendo que esta etapa permite que as células eletroporadas, se recuperem no meio de cultivo ideal, restaurando suas condições fisiológicas naturais.

Foi utilizado o meio de cultura T&K, desenvolvido por Tuovinen & Kelly (1973), com pequenas modificações, que representa um dos meios específicos para cultivo da espécie Acidithiobacillus ferrooxidans. O meio T&K é formado pela mistura de duas soluções A e B na proporção de 4:1, respectivamente. Sendo a Solução A composta por 0,4 g/l de K ₂ HP0 ₄ .3H ₂ 0, 0,4 g/l de MgS0 ₄ .7H ₂ 0, 0,4 g/l de (NH ₄ )2S0 ₄ ; e a Solução B composta somente por 33,4 g/l de FeS0 ₄ .7H ₂ 0.

Após serem estabilizadas, as células transformadas foram submetidas à etapa de seleção, etapa esta que tem como finalidade selecionar as células que mantiveram o DNA plasmideal incorporado, ou seja, as células transformadas (recombinantes). A seleção é realizada na presença de um agente seletivo, e neste caso em particular, o agente seletivo é um antibiótico, e as células transformadas apresentam resistência a este antibiótico. No caso da presente invenção, as células transformadas apresentam resistência ao antibiótico canamicina.

Após o período de recuperação, o inoculo é novamente lavado várias vezes com solução salina, a fim de equilibrar as células em um substrato adequado para o tratamento com o antibiótico, uma vez que a maioria dos antibióticos conhecidos são degradados em uma faixa de pH abaixo de 4,0. Em seguida, as células foram incubadas por um período de no mínimo 2 horas e no máximo 8 horas, sendo o período de incubação preferencial de 4 horas, em solução salina contendo 50 pg/ml de canamicina. O período de incubação preferencial de 4 horas foi previamente padronizado e garante que todas as células que sobrevivem a esta seleção contenham o gene de resistência a canamicina, ou seja, são células recombinantas/transformadas, as quais As células foram coletadas por filtração em membranas de 0,45 m e lavadas várias vezes com solução salina (NaCI 0,9%, em massa/volume, em água Milli-Q, pH 5,8 a 7,4). Para obtenção das células eietrocompetentes de Acidithiobacillus ferrooxidans LR, a biomassa proveniente de 500 ml de cultura foi incubada em 1 ml de solução salina contendo glicina 1-2%, em massa/volume, sendo a concentração ótima de 1 a 1 ,5% de glicina, em massa/volume, por 30 minutos, sob agitação (250 rpm) a 30°C. Em seguida, as células foram coletadas e incubadas em gelo por 1 hora. Após incubação as células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (5 mM de fosfato de sódio, 1 mM de cloreto de magnésio; pH 5,8 a 7,4) e finalmente, ressuspendidas em 200 μΙ de tampão de eletroporação (1 M de sacarose, 3 m de cloreto de magnésio, pH 5,8 a 7,4). Exemplo 3: Eletrotransformação de Acidithiobacillus ferrooxidans LR

As células eietrocompetentes de Acidithiobacillus ferrooxidans LR foram obtidas como descrito no exemplo 2. Para cada 45 μΙ de células eietrocompetentes foi adicionado 1 g de DNA plasmidiaí (vetor pAF construído de acordo com a presente invenção). Essa mistura foi submetida à eletroporação em cubetas de 0,2 mm conservadas em gelo até o momento da emissão do pulso. As condições de eletroporação foram 1,0 - 2,0 kV, 200 Ω, por 2,4 a 5 milissegundos. Logo em seguida, as células foram recuperadas em 1 ml de meio T&K suplementado com FeS0 ₄ 7H ₂ 0 (pH 1 ,8) e incubadas por 1 hora sob agitação (250 rpm) a 30°C. As células recuperadas foram coletadas e lavadas duas vezes com solução salina, e inoculadas em 2 ml de solução salina contendo 50 Mg/ml de canamicina por 4 horas (sob agitação de 250 rpm e a 30° C), com o objetivo de induzir a expressão do gene de resistência ao antibiótico. Após essa seleção, as células foram coletadas e inoculadas em 10 ml de meio T&K contendo FeS0 ₄ .7H ₂ 0 (pH 1,8) e incubadas a 30°C sob agitação de 250 rpm.

As células de Acidithiobacillus ferrooxidans LR eletrotransformadas (recombinantes) com o vetor pAF deu-se o nome de rLRpAF. É importante destacar que as células recombinantes da linhagem LR podem ser cultivadas em meio T&K ρΗ 1 ,8, o que significa que o processo da presente invenção é adequado para transformar a bactéria sem alterar o seu estado fisiológico.

Exemplo 4: Recuperação do vetor pAF a partir do cultivo de rLRpAF

As células da bactéria Acidithiobacillus ferrooxidans LR transformadas com o vetor pAF e selecionadas com canamicina por 4 horas, foram inoculadas em 500 ml de meio T&K suplementado com FeS0 ₄ .7H ₂ 0 (pH 1 ,8) até a cultura atingir 90% de oxidação de Fe ²⁺ no meio, com a finalidade de se obter células suficiente para a extração de DNA plasmideal.

O DNA plasmideal foi isolado com o kit Invitrogen® Mini Prep e submetido à eletroforese em gel de agarose 1%. A Figura 2 mostra uma foto do gel de agarose 1 % contento o marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen ^® ), DNA plasmideal isolado de rLRpAF, DNA plasmideal isolado a partir de uma cultura de Acidithiobacillus ferrooxidans LR e 1 g de DNA do vetor pAF (controle positivo). A presença da banda (indicada por seta) mostra que a linhagem LR recombinante possui o DNA plasmideal presente no vetor pAF.

Um meio alternativo para testar a presença do vetor pAF dentro de rLRpAF foi através da técnica de PCR da região que contém a OriV do plasmídeo. O tamanho esperado do fragmento amplificado era de aproximadamente 350 pb. As reações de PCR foram realizadas com massa celular obtida a partir do cultivo de rLRpAF e LR. Como controle positivo de PCR foi feita a amplificação do DNA do vetor pAF e como controle negativo foi realizada uma reação em branco. O resultado é apresentado na Figura 3 que mostra a amplificação da OriV de rLRpAF.

Exemplo 5: Curva de oxidação do Fe ²⁺ de Acidithiobacillus ferrooxidans LR transformada e não transformada

Com o objetivo de comparar a oxidação de Fe ²⁺ por Acidithiobacillus ferrooxidans LR transformada com vetor pAF e não transformada, tanto a bactéria transformada como a não transformada foram inoculadas em meio T&K suplementado com FeS0 ₄ .7H ₂ 0 (pH 1 ,8) e incubadas sob agitação (250 rpm) a 30°C. Como mostra a Figura 4, a rLRpAF apresenta um atraso na oxidação do Fe ²⁺ em relação à linhagem não transformada devido ao período necessário para a bactéria se recuperar do processo de transformação. Com esse experimento é demonstrado que a linhagem transformada é capaz de oxidar o Fe ²⁺ .