DIABETES

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, la microbiología y la nutrición, y específicamente se refiere a un método para predecir o pronosticar la probabilidad de un individuo de padecer enfermedades metabólicas, y preferiblemente, diabetes.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La obesidad se caracteriza por la inflamación subclínica crónica que afecta a la actividad de la insulina en sus tejidos metabólicamente sensibles (tejidos del hígado, músculo y tejido adiposo). Estudios recientes en los últimos diez años han demostrado que esta inflamación metabólica se caracteriza por un exceso moderado de la producción de citoquinas, incluyendo interleuquina (IL) IL-6, IL-1 o factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa), que lesiona las señales de insulina celular y contribuye a la resistencia a la insulina y la diabetes. Pero la investigación reciente ha puesto de relieve los vínculos entre la microbiota intestinal, obesidad y resistencia a la insulina. La creciente evidencia sugiere que la microbiota intestinal contribuye al metabolismo del intestino a través de la comunicación con el tejido adiposo influyendo en el desarrollo de alteraciones metabólicas asociadas con la obesidad. La microbiota intestinal puede contribuir al desarrollo de la inflamación y la resistencia a la insulina por dos mecanismos diferentes, ya sea la microbiota intestinal utilizando sus actividades metabólicas que podrían participar en la extracción de calorías a partir de sustancias alimenticias ingeridas, su almacenamiento en el tejido adiposo anfitrión y el aumento en la producción adipokina y los niveles de ácidos grasos libres en plasma, o por la inflamación crónica que podría inducir, o ambos.

Por otra parte, se ha demostrado que la microbiota intestinal influye en la permeabilidad intestinal en ratones obesos, promoviendo así la translocación de productos bacterianos y estimulando la inflamación característica de bajo grado de obesidad y resistencia a la insulina. Se ha comprobado que el perfil de microbiota asociada a la obesidad humana también se asocia con inflamación local y sistémica, aunque no se ha encontrado una relación entre la composición de la microbiota obesa y la permeabilidad intestinal, lo que sugiere que la composición de la microbiota asociada a la obesidad tiene un efecto proinflamatorio.

La función fisiológica del apéndice humano es en gran medida desconocida, pero varias hipótesis implican interacciones entre el tejido linfoide que existe en abundancia en el apéndice l y la microbiota contenida dentro del apéndice.

Guinane et al. en un estudio reciente concluyeron que el apéndice humano, aunque comparte una cantidad sustancial de microbios con el tracto intestinal, tiene su propio microbioma definido. Esta composición microbiana del apéndice humano está sujeta a una variabilidad extrema y comprende una diversidad de biota que puede desempeñar un papel importante en la salud humana.

De acuerdo con nuestros resultados, Meadows describieron que los Firmicutes están relacionados con el aumento de peso y la resistencia a la insulina, ya que proporcionan una fuente de calorías adicionales por la rotura de los polisacáridos que de otro modo no son digeribles en los mamíferos (Meadows, R. (201 1). Gut Bacteria May Override Genetic Protections against Diabetes. PLoS Biology 9, e1001215. doi: 10.1371/journal.pbio.1001215) 30. Verdam et al. (Obesity (Silver Spring). 2013;21 :E607-15) de manera similar, demostraron que una disminución en Bacteriodetes y un aumento en Firmicutes se asocia con la presencia de la obesidad y la inflamación en los seres humanos (Verdam et al.. Obesity (Silver Spring). 2013;21 :E607-15) Fusobacterium spp. han sido también consideradas como bacterias pro- inflamatorias que participan en el inicio y la proliferación del cáncer colorrectal humano (Tjalsma et al.. Nat Rev Microbiol. 2012; 10:575-82).

Sería importante desarrollar un método de diagnóstico que permita identificar los individuos cuya microbiota les hace propensos a padecer resistencia a la insulina, así como a la expresión de genes relacionados con la inflamación y la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo. Asimismo, sería importante desarrollar una composición probiotica para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina, obesidad, y el síndrome metabólico, incluyendo la diabetes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Una primera invención solventa el problema descrito anteriormente con respecto a identificar los individuos cuya microbiota les hace propensos a padecer resistencia a la insulina, proporcionando un método que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del intestino de dicho individuo, y b) determinar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en la muestra aislada del paso (a), c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, preferiblemente 3 veces mayor, y más preferiblemente 4 veces mayor, de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico, si presenta: i) un porcentaje de Firmicutes y/o Fusobacteria al menos 2 veces superior, preferiblemente 3 veces superior, y más preferiblemente 3,4 veces superior al de un individuo de referencia, y/o ii) un porcentaje de Pseudomonaceae, Prevotellaceae, Fusobacteriaceae, Pseudomonas, Prevotella, Catenibacterium, Veillonella y/o Fusobacterium al menos 3 veces superior, preferiblemente 5 veces superior, más preferiblemente 6 veces superior, y aún más preferiblemente 7 veces superior al de un individuo de referencia y/o iii) un porcentaje de Bacteroidetes y Proteobacteria al menos 1 ,5 veces inferior, más preferiblemente 1 ,75 veces menos, y aún más preferiblemente 2,1 veces inferior al de un individuo de referencia, y/o iv) un porcentaje de Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, enterobacterias, Bacteroides y Blautia al menos 1 ,5 veces inferior, más preferiblemente 1 ,75 veces menos, y aún más preferiblemente 2,1 veces inferior al de un individuo de referencia, siendo el individuo de referencia un individuo con obesidad mórbida sensible a la insulina.

Una segunda invención solventa el problema descrito anteriormente referido a una composición probiotica proporcionando una composición que comprende: i) Cepas bacterianas de las familias que se seleccionan de la lista que comprende

Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Enterobacteriaceae, Erysipelorichaceae, Odoribacteraceae, Porphyromonadaceae, y/o ii) cepas bacterianas de los géneros Bacteroides y Blautia, y/o

iii) componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, obtenidos a partir de la cepa i), la cepa ii), o de ambas, o a partir de una combinación de microorganismos que comprenda al menos una cepa i), cepa ii), o ambas, o cualquiera de sus combinaciones, para su uso en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del sobrepeso, la obesidad, la resistencia a la insulina y/o el síndrome metabólico y/o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los aOTUres de la presente invención han estudiado que los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal pueden emplearse para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico.

Por tanto, un primer aspecto de la primera invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende: a) obtener una muestra biológica aislada del intestino de dicho individuo, y b) determinar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en la muestra aislada del paso (a).

Preferiblemente, la muestra biológica aislada del intestino del individuo es una muestra del apéndice cecal. En otra realización preferida, la enfermedad relacionada con el síndrome metabólico se selecciona de la lista que comprende: sobrepeso, obesidad, hipertrofia de adipocitos, esteatosis hepática o hígado graso, dislipemia, hiperglicemia, resistencia a insulina y diabetes, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, disfunción del sistema inmune, o cualquiera de sus combinaciones. La determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido en el estado del arte.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante PCR. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) además comprende técnicas de pirosecuenciación.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) comprende una Electroforesis en Gel Desnaturalizante en Gradiente (DGGE). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante anticuerpos, preferiblemente fluorescentes. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la determinación de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal del paso (b) se realiza mediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el paso (b) además comprende la medición de la actividad microbiana de los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal. Preferiblemente, la actividad microbiana se mide, aunque sin limitarnos, mediante radioisótopos, microelectrodos e/o isótopos estables.

En esta memoria se entiende por "grupo taxonómico" al grupo de microorganismos clasificados en una determinada categoría taxonómica. Normalmente un grupo taxonómico que clasifique a unos microorganismos abarca uno o varios grupos menores, subordinados al mayor. Una categoría taxonómica constituye un grupo de clasificación. Los rangos o categorías taxonómicas normalmente usados en taxonomía son: Dominio, Reino, Filo o División, Clase, Orden, Familia, Género, Especie.

Un segundo aspecto de la primera invención se refiere a un método para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende determinar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en una muestra biológica aislada según se describe en el primer método de la invención, y además comprende: c) clasificar al individuo del paso (a), en el grupo de individuos con una probabilidad al menos 2 veces mayor, preferiblemente 3 veces mayor, y más preferiblemente 4 veces mayor, de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico, si presenta: i) un porcentaje de Firmicutes y/o Fusobacteria al menos 2 veces superior, preferiblemente 3 veces superior, y más preferiblemente 3,4 veces superior al de un individuo de referencia, y/o ii) un porcentaje de Pseudomonaceae, Prevotellaceae, Fusobacteriaceae, Pseudomonas, Prevotella, Catenibacterium, Veillonella y/o Fusobacterium al menos 3 veces superior, preferiblemente 5 veces superior, más preferiblemente 6 veces superior, y aún más preferiblemente 7 veces superior al de un individuo de referencia y/o iii) un porcentaje de Bacteroidetes y Proteobacteria al menos 1 ,5 veces inferior, más preferiblemente 1 ,75 veces menos, y aún más preferiblemente 2, 1 veces inferior al de un individuo de referencia, y/o iv) un porcentaje de Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, enterobacterias, Bacteroides y Blautia al menos 1 ,5 veces inferior, más preferiblemente 1 ,75 veces menos, y aún más preferiblemente 2,1 veces inferior al de un individuo de referencia, siendo el individuo de referencia un individuo con obesidad mórbida sensible a la insulina.

En una realización aún más preferida los sujetos obesos mórbidos sensibles a la insulina tienen un valor de HOMA-IR <3. Este punto de corte se estableció a partir de la media ± 2Desviaciones Estándar de una población control sana

En otra realización preferida, la muestra biológica aislada del intestino del individuo es una muestra del apéndice cecal.

En otra realización preferida, la enfermedad relacionada con el síndrome metabólico se selecciona de la lista que comprende: sobrepeso, obesidad, hipertrofia de adipocitos, esteatosis hepática o hígado graso, dislipemia, hiperglicemia, resistencia a insulina y diabetes, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, disfunción del sistema inmune, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización aún más preferida, la enfermedad es la diabetes, y aún más preferiblemente, la diabetes tipo II.

Los pasos (b) y/o (c), del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente aOTUmatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (b) o la clasificación computarizada en el paso (c).

Una "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada procede del apéndice cecal.

En esta memoria se entiende por "apéndice cecal" o apéndice vermiforme al cilindro sin salida conectado al ciego del intestino. En humanos, dicho apéndice es un vestigio evolutivo que contiene una determinada diversidad bacteriana. Preferiblemente, la muestra de apéndice cecal comprende todas las partes del tejido que lo conforman.

En esta memoria se entiende como Firmicutes a los microorganismos que componen este Filo. Casi todas las bacterias de este Filo son Gram positivas aunque comprende Gram negativas y otras que son carentes de pared celular. El grupo se divide en varias clases: Bacilli, aerobios facultativos u obligados, Clostridia, organismos anaerobios, Mollicutes etc. En los árboles filogenéticos, los primeros dos grupos parecen ser parafiléticos, así que muy probablemente puedan restructurarse. Actualmente se reconocen más de 274 géneros del filo Firmicutes. Las clases más importantes son: • Bacilli: Orden Bacillales: Bacillus, Listeria, Paenibacillus y Staphylococcus. Orden Lactobacillales: Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus y Streptococcus

• Clostridia: Orden Clostridium, Desulforudis, Heliobacterium y Peptostreptococcus.

Dentro de esta clase están Catenibacterium, Lachnospiraceae y Ruminococcaceae.

• Molí ¡cutes: Mycoplasma, Phytoplasma, Spiroplasma y Ureaplasma

• Erysipelotrichi: Erysipelothrix

• Negativicutes: Selenomonas y Sporomusa. También se encuentra el género Veillonella.

El género Blautia se encuentra dentro de Firmicutes. En esta memoria se entiende como Fusobacteria al filo de bacterias anaerobias obligadas Gram negativas con lipopolisacáridos. Son bacilos que se encuentran como comensales o patógenos. Las familias con sus géneros más importantes son:

• Leptotrichiaceae: Sebaldella, Sneathia, Streptobacillus, Leptotrichia

• Fusobacteriaceae: Cetobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Propionigenium y Psychrilyobacter.

En esta memoria se entiende por "Pseudomonadaceae" a la familia de bacterias que incluye a Pseudomonas, Commamonas, Cellvibrio, Azotobacter. Estos géneros contienen a las: Azomonas, Azorhizophilus, y Azotobacter. La familia Pseudomonadaceae pertenece al dominio Bacteria, reino Bacteria filo Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, orden Pseudomonadales.

En esta memoria se entiende por "Prevotellacae" a la familia de bacterias que pertenece al filo Bacteroidetes, clase Bacteroidetes, orden Bacteroidales. Se encuentran entre los microorganismos cultivables más comunes del rumen y trasera intestino del ganado vacuno y ovino, donde ayudan a la descomposición de proteínas y carbohidratos. También están presentes en los seres humanos. Uno de los géneros que pertenecen a esta familia es P revotell a.

En esta memoria se entiende por proteobacterias (Proteobacteria) como uno de los principales grupos de bacterias. Incluyen una gran variedad de patógenos, tales comoEscherichia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter, Neisseria gonorrhoeae, Burkholderia glumae y muchos otros. Otras son de vida libre, e incluyen muchas de las bacterias responsables de la fijación del nitrógeno. Los subfilos y clases más importantes son: • Subfilo Rhodobacteria: Clase Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria (Orden Enterobacteriales y Familia Enterobacteriaceae) y Zetaproteobacteria.

• Subfilo Thiobacteria: Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria. · Otras clases, dependiendo de los aOTUres, serían: Acidobacteria, Chrysiogenetes, Deferribacteres, Aquificae y Elusimicrobia.

El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término "individuo" en esta memoria, es sinónimo de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

Un tercer aspecto de la primera invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para identificar los grupos taxonómicos que componen la microbiota intestinal en una muestra aislada.

En una realización preferida, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de identificar los grupos taxonómicos mediante la caracterización de la región 16S del ARNr, y donde:

- los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y

22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 (XX), y/o SEQ ID NO: 2 (XXXX);

- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases;

- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID NO: 2

En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende los cebadores para amplificar regiones variables del gen del ARNr 16S. Preferiblemente los cebadores comprenden las secuencias SEQ ID NO: 3 (cebador HDA1) (5'- GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3 ') y SEQ ID NO: 4 (cebador HDA2) (5'-3- GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC '). Los cebadores directos se diseñaron con la secuencia adaptador A SEQ ID NO: 5 (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCA) más una secuencia de teclas SEQ ID NO: 6 (TCAG) y cebadores inversos con la secuencia adaptador B SEQ ID NO: 7 (CTATGCGCCTTGCCAGCCCG) más una secuencia clave SEQ ID NO: 8 (TCGA). 454- adaptadores se incluyeron en el cebador directo seguido de un identificador específico Multiplex- de 10 pb (MID).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un mareaje radiactivo o inmunológico.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida del 16S ARNr de los microorganismos de la microbiota, y/o capaces de hibridar con la secuencia de dichos genes para posterior amplificación por PCR. En una realización particular el programa de PCR fue creado como sigue 95° C 10 min y 30 ciclos de 95°C 1 min, 50°C 1 min, 1 ,5 min 72°C seguido por 72°C durante 10 minOTUs. Después de la electroforesis en gel de agarosa, los productos PCR fueron purificados dos veces utilizando Kit Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Milano, Italia) y se cuantificó utilizando el kit Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA Ensayo (Invitrogen, Burlington, ON) y una piscina equimolar se obtuvo antes de la su posterior procesamiento y secuenciación en una plataforma GS júnior 454 de acuerdo con los protocolos del fabricante mediante el uso de una química de titanio (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

En otra realización preferida, el kit o dispositivo de la invención además comprende los elementos necesarios para realizar una secuenciación masiva, preferiblemente una pirosecuenciación. Preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente ³² P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica. El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.

Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Es también posible que el(los) oligonucleótido(s) estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, normalmente una secuencia de ADN, como sondas (o indicadores). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una micromatriz que comprende oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm de los genes, y/o capaces de hibridar con la secuencias de los genes. Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.

Así, las sondas de oligonucleótidos pueden ser de entre 10 y 100 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 20 y 70 nucleótidos, y aún más preferiblemente, de entre 24 y 30 nucleótidos.

La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse a, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehidos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: ARN mensajero, ARN total, un fragmento de PCR, etc. Un cuarto aspecto de la primera invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención para la obtención de datos útiles para predecir o pronosticar el riesgo de un individuo de padecer síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico.

En una realización preferida, la enfermedad relacionada con el síndrome metabólico se selecciona de la lista que comprende: sobrepeso, obesidad, hipertrofia de adipocitos, esteatosis hepática o hígado graso, dislipemia, hiperglicemia, resistencia a insulina y diabetes, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, disfunción del sistema inmune, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización aún más preferida, la enfermedad es la diabetes, y aún más preferiblemente, la diabetes tipo II. Un quinto aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones de programa para hacer que un ordenador lleve a la práctica el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.

La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.

Un sexto aspecto de la primera invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Un séptimo aspecto de la primera invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N ⁶ -metil-adenina, N ⁶ - terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2- dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi uracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybOTUxosina, pesudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.61 1 ; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA).

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

En la presente invención se entiende por variante o fragmento biológicamente activo, aquellas variantes o fragmentos de los péptidos indicados que tienen un efecto fisiológico, metabólico o inmunológico igual, o presentan la misma utilidad que los descritos. Esto es, son funcionalmente equivalentes. Dichos efectos se pueden determinar mediante métodos convencionales. El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., 1999. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Tal y como se he expresado en el apartado titulado "Breve descripción de la invención", la presente memoria proporciona adicionalmente una composición probiotica. En este sentido, un primer aspecto de la segunda invención se refiere al uso de una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende: i) Cepas bacterianas de las familias que se seleccionan de la lista que comprende

Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Enterobacteriaceae, Erysipelorichaceae, Odoribacteraceae, Porphyromonadaceae, y/o ii) cepas bacterianas de los géneros Bacteroides y Blautia, y/o iii) componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, obtenidos a partir de la cepa i), la cepa ii), o de ambas, o a partir de una combinación de microorganismos que comprenda al menos una cepa i), cepa ii), o ambas, o cualquiera de sus combinaciones, para su uso en la elaboración de un medicamento para la prevención, alivio y/o tratamiento del sobrepeso, la obesidad, la resistencia a la insulina y/o el síndrome metabólico y/o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad relacionada con el síndrome metabólico se selecciona de la lista que comprende: sobrepeso, obesidad, hipertrofia de adipocitos, esteatosis hepática o hígado graso, dislipemia, hiperglicemia, resistencia a insulina, prediabetes, diabetes, síndrome metabólico, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, disfunción del sistema inmune, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad es la prediabetes.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad es la diabetes tipo La composición, definida de forma general, es un conjunto de componentes que está formado al menos por la cepa de la invención en cualquier concentración; o al menos por los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas de la cepa de la invención o cualquiera de sus combinaciones; o por una combinación de los mismos. La composición de la invención, adicionalmente, puede comprender al menos una bacteria láctica o bifidobacteria de origen intestinal, alimentario o ambiental. La bacteria láctica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, una bacteria del género Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Leuconostoc, Weissella, Pediococcus o Streptococcus, o cualquiera de sus combinaciones. Además, adicionalmente puede comprender al menos una cepa de hongo o levadura como por ejemplo, pero sin limitarse, perteneciente al género Saccharomyces, Candida, Pichia, Debaryomyces, Torulopsis, Aspergillus, Rhizopus, Mucor o Penicillium.

Las células que comprende la composición pueden ser no viables o viables y estar en cualquier fase del estado de desarrollo o crecimiento (latente, exponencial, estacionaria, etc.), independientemente de la morfología que presente. Preferentemente, dicho microorganismo adicional comprende al menos una bacteria intestinal o una bacteria láctica.

Opcionalmente, la composición de la invención puede además comprender al menos un componente bioactivo, sustancia activa, principio activo o agente terapéutico, como son por ejemplo otros componentes de alimentos, productos vegetales y/o fármacos. El término "componente bioactivo" hace referencia a un compuesto con actividad biológica en el ámbito de aplicación de la patente que pueda mejorar o complementar la actividad de una cepa o una combinación de cepas bacterianas descritas anteriormente, de la composición de la invención, incluyendo ingredientes o componentes de los alimentos (por ejemplo y sin limitar: ácidos grasos poli-insaturados, ácido linoléico conjugado, prebióticos, fibra, goma Guar, glucomanano, quitosano, picolinato de cobre, calcio, etc.), plantas, extractos o componentes de plantas (por ejemplo y sin limitar polifenoles, efedrina o extractos de Ephedra spp., te verde [Camellia sinensis], naranja amarga [Citrus aurantium]) y fármacos (por ejemplo, pero sin limitarnos, estatinas, orlistat, sibutramina, liraglutide etc.).

Bacteroidaceae Pribram 1933, (Skerman (V.B.D.), McGowan (V.) and Sneath (P.H.A.) (editors): Approved Lists of Bacterial Ñames. Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, 225-420) es una familia de organismos celulares pertenecientes al superreino Bacteria, SuperPhylum Bacteroidetes/grupo Chlorobi; Phylum Bacteroidetes; Clase Bacteroidia; Orden Bacteroidales. El género tipo es Bacteroides Castellani & Chalmers 1919 En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro de la familia Bacteroidaceae de entre los géneros Bacteroides, Acetofilamentum, Acetomicrobium, Acetothermus, Anaerorhabdum, Capsularis, o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, el género es Bacteroides. En otra realización preferida, el género es Bacteroides y aún más preferiblemente la especie se selecciona de la lista que consiste en B. acidifaciens, B. barnesiae, B. caccae, B. cellulosilyticus, B. chinchillae, B. clarus, B. coprocola, B. coprophilus, B. coprosuis, B. denticanum, B. dorei, B. eggerthii, B. faecichinchillae, B. faecis, B. finegoldii, B. fluxus, B. fragilis, B. galacturonicus, B. gallinarum, B. graminisolvens, B. helcogenes, B. heparinolyticus, B. intestinalis, B. massiliensis, B. nordii, B. oleiciplenus, B. ovatus, B. paurosaccharolyticus, B. plebeius, B. propionicifaciens, B. pyogenes, B. reticulotermitis, B. rodentium, B. salanitronis, B. salyersiae, B. sartorii, B. stercorirosoris, B. stercoris, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. vulgatus, B. xylanisolvens, B. xylanolyticus, B. zoogleoformans, B. acidifaciens, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro de la familia Lachnospiraceae de entre los géneros Acetitomaculum, Anaerofilum, Anaerostipes, Butyrivibrio, Catenibacterium, Catonella, Coprococcus, Johnsonella, Lachnobacterium, Lachnospira, Oribaculum, Pseudobutyrivibrio, Roseburia, Ruminococcus, Shuttleworthia, Sporobacterium o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro de la familia Ruminococcaceae de entre los géneros Acetanaerobacterium, Acetivibrio, Anaerobacterium, Anaerofilum, Anaerotruncus, Candidatus Soleaferrea _s Caproiciproducens, Ercella, Ethanoligenens, Faecalibacterium, Fastidiosipila, Gemmiger,

Hydrogenoanaerobacterium, Mageeibacillus, Oscillospira, Papillibacter, Pseudobacteroides, Ruminiclostridium, Ruminococcus, Saccharofermentans, Sporobacter, Subdoligranulum, o cualquiera de sus combinaciones.

La familia Ruminococcaceae Rainey 2010, el tipo es el género Ruminococcus Sijpesteijn 1948 (Approved Lists 1980). VALIDATION LIST no. 132. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60, 469- 472. [RAINEY (F.A.): Family VIII. Ruminococcaceae fam. nov. In: P. DE VOS, G.M. GARRITY, D. JONES, N.R. KRIEG, W. LUDWIG, F.A. RAINEY, K.H. SCHLEIFER and W.B. WHITMAN (editors): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 3 (The Firmicutes), Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, 2009, p. 1016.]

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro de la familia Enterobacteriaceae de entre los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Blochmannia, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Paracolobactrum, Pectobacterium, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia, Yokenella o cualquiera de sus combinaciones.

En esta memoria la familia Enterobacteriaceae Rahn 1937, se define como en el estado del arte actual. El género tipo es Escherichia Castellani and Chalmers 1919 (Approved Lists 1980). SKERMAN (V.B.D.), McGOWAN (V.) and SNEATH (P.H.A.) (editors): Approved Lists of Bacterial Ñames. Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, 225-420 (Approved Lists of Bacterial Ñames in IJSEM Online - Approved Lists of Bacterial Ñames Amended edition). [RAHN (O.): New principies for the classification of bacteria. Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene. Abteilung II, 1937, 96, 273-286.]

En esta memoria la familia Erysipelotrichaceae Verbarg et al. 2004, Se describe como en el estado conocido de la técnica. El tipo es el género Erysipelothrix Rosenbach 1909 (Approved Lists 1980).

Etimología: N.L. fem. n. Erysipelothrix, type genus of the family; suff. -aceae, ending denoting a family; N.L. fem. pl. n. Erysipelotrichaceae, the family of Erysipelothrix.

Reference: VERBARG (S.), RHEIMS (H.), EMUS (S.), FRÜHLING (A.), KROPPENSTEDT (R.M.), STACKEBRANDT (E.) and SCHUMANN (P.): Erysipelothrix inopinata sp. nov., isolated in the course of sterile filtration of vegetable peptone broth, and description of Erysipelotrichaceae fam. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 221-225.

La familia Porphyromonadaceae Krieg 2012, se entiende como normalmente en le estado del arte. El género tipo es Porphyromonas Shah and Collins 1988.

Etimología: N.L. fem. n. Porphyromonas, type genus of the family; suff. - aceae, ending to denote a family; N.L. fem. pl. n. Porphyromonadaceae, the Porphyromonas family.

References: VALIDATION LIST no. 143. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2012, 62, 1-4. [KRIEG (N.R.): Family IV. Porphyromonadaceae fam. nov. In N.R. KRIEG, J.T. STALEY, D.R. BROWN, B.P. HEDLUND, B.J. PASTER, N.L. WARD, W. LUDWIG and W.B. WHITMAN (editors), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 4 (The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres, Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia, Chlamydiae, and Planctomycetes), Springer, New York, 2011 , p. 61.] Los organismos de la familia Porphyromonadaceae son organismos celulares del Supereino Bacteria; Superphylum Bacteroidetes/ grupo Chlorobi; Phylum Bacteroidetes; Clase Bacteroidia; Orden Bacteroidales.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro de la familia Porphyromonadaceae de entre los géneros Porphyromonas y Dysgonomonas.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la bacteria se selecciona dentro del género Blautia, y aún más específicamente de entre las especies Blautia coccoides, Blautia faecis, Blautia glucerasea, Blautia hansenii, Blautia hydrogenotrophica, Blautia luti, Blautia obeum, Blautia producto, Blautia schinkii, Blautia stercoris, Blautia wexierae, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización aún más preferida la composición de la invención comprende organismos de las especies Prevotella stercorea, Mitsuokella multiacida, Veilloneilla dispar y Lactobacillus rhamnosus, o cualquiera de sus combinaciones, y aún mucho más preferidamente la composición omprende una combinación de organismos de las especies Prevotella stercorea, Mitsuokella multiacida, Veilloneilla dispar y Lactobacillus rhamnosus simultáneamente. Aún mucho más preferidamente, la composición de la invención comprende, como organismos vivos, únicamente los pertenecientes a dichas especies.

En otra realización preferida de la invención la composición es una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención. Además, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Aún más preferiblemente la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. Dicho principio activo puede seleccionarse entre otros, pero sin limitarse, de entre estatinas, orlistat, sibutramina, liraglutide, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica es un conjunto de componentes que está formado al menos por la cepa de la invención en cualquier concentración; o al menos por los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas de la cepa de la invención o cualquiera de sus combinaciones, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud o reducción del riesgo de enfermedad. Dicha composición farmacéutica puede ser un medicamento.

El término medicamento tiene un significado más limitado que el significado de "composición farmacéutica", tal como se define en la presente invención, ya que el medicamento implica necesariamente un efecto preventivo o terapéutico. El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término "excipiente" se define como aquella materia que, incluida en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente "farmacéuticamente aceptable" debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes.

La "forma galénica o forma farmacéutica" es la disposición a que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combinación de la forma en la que la composición farmacéutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.

El "vehículo" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

Además, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

En cada caso la forma de presentación de la composición farmacéutica y, por tanto, la del medicamento, se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyección, inhalante, gel, microesfera o aerosol. Según una realización aún más preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se presenta en una forma adaptada a la administración oral. La forma adaptada a la administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. Dicha forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. Otra posibilidad es que la composición farmacéutica se presente en una forma adaptada a la administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica, inhalada o parenteral. La cepa de la invención; los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, obtenidos a partir de la cepa de la invención, o la composición de la invención; pueden ir asociados, por ejemplo, pero sin limitarse, con liposomas o micelas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad del componente de la composición farmacéutica que cuando se administra a un mamífero, con preferencia un humano, es suficiente para producir la prevención y/o el tratamiento, tal como se define más adelante, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamífero, con preferencia un humano. Dicho componente de la composición farmacéutica se refiere a la cepa de la invención; o a los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas; o una combinación de los mismos, y que opcionalmente pueden estar comprendidos en dicha composición en combinación con un componente bioactivo adicional, y que contribuyen al efecto terapéutico de la composición farmacéutica. La cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la actividad de la cepa de la invención; del microorganismo adicional o microorganismos adicionales que comprenda la composición de la invención; de los componentes celulares, metabolitos, moléculas secretadas o cualquiera de sus combinaciones, en cualquier forma de presentación; la cantidad terapéuticamente efectiva variará también según la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particular; y el sujeto que se somete a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la técnica según su propio conocimiento y esa descripción.

En otra realización preferida de la invención la composición es una composición alimentaria del tipo "medical food", de ahora en adelante composición alimentaria de la invención. Preferiblemente, la composición alimentaria de la invención, también llamada composición nutritiva, es seleccionada entre un alimento (que puede ser un alimento para fines nutricionales específicos o un alimento medicinal), un suplemento, un nutracéutico, un probiótico o un simbiótico.

La composición alimentaria de la invención comprende el compuesto de la invención en una cantidad eficaz para la prevención, mejora, alivio y/o tratamiento de la obesidad y/o el síndrome metabólico o una enfermedad relacionada con el síndrome metabólico, en mamíferos, incluyendo un ser humano. Las composiciones alimentarias preferidas se seleccionan de la lista que consiste en: una bebida, leche, yogur, queso, leche fermentada , bebida de leche aromatizada, leche de soja, cereales precocinados, pan, pasteles, mantequilla, margarina, salsas, aceites para freír, aceites vegetales, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de semilla de algodón, condimentos, aderezos para ensaladas, zumos de frutas, jarabes, postres, glaseados y rellenos, productos congelados blandos, dulces, chicles y alimentos intermedios. La composición alimentaria de la invención puede ser un suplemento nutricional o dietético. En otra realización preferida, el suplemento nutricional o dietético comprende una composición estéril que contiene el compuesto de la invención, preferentemente provisto de un revestimiento resistente a los ácidos gástricos, siendo una composición de liberación retardada. En otra realización preferida, la composición alimentaria, incluyendo el compuesto de la invención y/o el suplemento nutricional o dietético comprende "portadores" apropiados tales como diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehículos con los que se administra el compuesto de la invención. Excipientes apropiados adecuados incluyen, pero no se limitan a almidón, glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, sulfato de calcio, gel de sílice , estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. Tales suplementos nutricionales se pueden utilizar para combatir problemas hepáticos, y ayudan a mantener la salud o un estilo de vida saludable al mamífero, preferiblemente un ser humano.

El término "composición alimentaria" o "composición nutritiva" tal como se emplea en la presente invención se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición nutritiva puede estar destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o a la reducir de los factores de riesgo de la enfermedad.

El término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional", "suplemento alimentario" o "suplemento alimenticio" es un componente o componentes destinados a complementar la alimentación, y puede ser un alimento. Algunos ejemplos de suplementos dietéticos son, pero sin limitarse, las vitaminas, los minerales, los productos botánicos, aminoácidos y componentes de los alimentos como las enzimas y los extractos glandulares. No se presentan como sustitOTUs de un alimento convencional ni como componente único de una comida o de la dieta alimenticia, sino como complemento de la dieta.

El término "nutracéutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud. Dicho nutracéutico puede ser un suplemento. El término "probiótico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a microorganismos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas ejercen efectos beneficiosos sobre la salud del organismo hospedador.

El término "simbiótico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a aquellos alimentos que contienen una mezcla de prebióticos y probióticos. Por regla general contienen un componente prebiótico que favorece el crecimiento y/o actividad metabólica y en definitiva el efecto del probiótico con el que se combina, como por ejemplo y sin limitar puede ser la asociación de los fructooligosacáridos o galactooligosacáridos a una bacteria intestinal como por ejemplo una cepa de la especie B. uniformis.

Según una realización más preferida de la anterior, el alimento se selecciona de la lista que comprende: producto lácteo, producto vegetal, producto cárnico, aperitivo, chocolate, bebida o alimento infantil. El producto lácteo se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, producto derivado de leche fermentada (por ejemplo, pero sin limitar yogur o queso) o no fermentada (por ejemplo, pero sin limitar, helado, mantequilla, margarina, suero lácteo). El producto vegetal es, por ejemplo, pero sin limitarse, un cereal en cualquier forma de presentación, fermentado o no fermentado. La bebida puede ser, pero sin limitarse, cualq zumo de frutas o leche no fermentada.

El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados por una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica.

El término "sobrepeso" se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) igual o superior a 25. El IMC es una medida de asociación entre el peso y la talla de un individuo. El IMC tiene la siguiente fórmula para su cálculo: Masa (Kg) / estatura2 (m). El sobrepeso se caracteriza por un IMC de entre≥ 25 a < 30.

El término "obesidad" se refiere a una patología caracterizada porque el sujeto tiene un IMC es igual o mayor de 30. La obesidad se clasifica en diferentes niveles, considerando que sujetos con IMC > 40 padecen de obesidad mórbida. Otras parámetros utilizados para determinar si un individuo padece obesidad central son la circunferencia de cintura absoluta (el sujeto padece obesidad cuando es >102 cm en hombres [obesidad central] y >88 cm en mujeres) o el índice cintura-cadera (el sujeto padece obesidad cuando es >0,9 para hombres y >0,85 para mujeres). Una vía alternativa para determinar la obesidad es medir el porcentaje de grasa corporal (el sujeto padece obesidad cuando tiene aproximadamente >25% de grasa corporal en un hombre y aproximadamente >30% de grasa corporal en la mujer).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Material y métodos

Muestras del apéndice de 5 pacientes IR-MO (insulin resistant morbidly obese) y 5 pacientes NIR-MO (insulin sensitive morbidly obese) emparejados por el IMC (índice de masa corporal), la edad, el sexo y la raza (Tabla 1) se obtuvieron durante la cirugía de bypass gástrico. Las muestras se lavaron, se fragmentaron, y se congelaron en nitrógeno líquido antes de ser almacenado a -80° C. Los individuos afectados por enfermedad hepática y disfunción tiroidea fueron excluidos específicamente por la elaboración bioquímica. Otros criterios de exclusión para los pacientes incluidos fueron los siguientes: diabetes mellitus tipo 2 tratados con insulina o antidiabéticos orales, las enfermedades cardiovasculares en los 6 meses anteriores a la inclusión de un estudio, la artritis, la evidencia de la enfermedad inflamatoria aguda o crónica, enfermedades infecciosas, o aquellos individuos que estaban recibiendo medicamentos que podría alterar el perfil lipídico o los parámetros metabólicos en el momento de su inclusión en el estudio, la afectación renal y la decisión del paciente no participar en el estudio. Se invitó a los sujetos a participar en el Servicio de Endocrinología del Hospital Virgen de la Victoria de Málaga (Málaga, España). El consentimiento informado escrito se obtuvo en todos los casos y el protocolo fue aprobado por el Comité Ético de la Virgen de la Victoria el Hospital.

Análisis de las variables bioquímicas

Se tomaron muestras de sangre después del ayuno nocturno. El suero se separó en alícOTUas y se congeló inmediatamente a -80°C. Los niveles de glucosa en suero, el colesterol, los triglicéridos y el colesterol HDL se analizaron mediante un aOTUanalizador Dimensión (Dade Behring Inc., Deerfield, IL) por métodos enzimáticos (Randox Laboratories Ltd., UK). El colesterol LDL se calculó a partir de la ecuación de Friedewald. La gamma-glutamil transpeptidasa, transaminasa glutamato oxaloacetato y transaminasa glutámico pirúvico (Wako Bioproducts, Richmond, VA, EE.UU.) fueron medidos usando métodos enzimáticos estándar. Además, la insulina se cuantificó por RIA proporcionada por BioSource SA (Nivelles, Bélgica). Los niveles de proteína C reactiva (CRP) de alta sensibilidad se midieron por ELISA kit de BLK Diagnóstico (Badalona, España). La leptina y adiponectina se analizaron por (ELISA) kits de inmunoensayo enzimático (DSL, Webster, TX, y DRG Diagnostics GmbH, Alemania, respectivamente). Se midió GLP-1 por un ser humano GLP-1 inmunoensayo enzimático (EIA) kit de Phoenix Pharmaceuticals (Karisruhe, Alemania). PYY se midió utilizando un kit EIA PYY humano de Phoenix Pharmaceuticals (Karisruhe, Alemania). El HOMA-IR se calculó a partir insulina en ayunas y la glucosa con la siguiente ecuación: HOMA-IR = insulina en ayunas (mlll/ml) / glucosa en ayunas (mol / L) /22.5.

Medidas antropométricas

El peso corporal, talla, cintura y cadera se midieron de acuerdo con los procedimientos estandarizados. El IMC se calcula como el peso (kilogramos) dividido por la altura (metros) al cuadrado.

mRNA de tejido adiposo visceral

El VAT se obtuvo durante la cirugía bariátrica en pacientes con obesidad mórbida. Las muestras de biopsia se lavaron en tampón de solución salina fisiológica y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido hasta su análisis. Tejido adiposo congelado se homogeneizó con un Ultra-Turrax 8 (Ika, Staufen, Alemania). El ARN total se extrajo mediante el kit RNeasy midi tejido de lípidos (QIAGEN Science, Hilden, Alemania), y el ARN total se trató con desoxirribonucleasa 55 U libre de RNasa (QIAGEN Science, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza del ARN se determinó por la absorbancia en ratio 260/280 en el espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc. de Waltham, MA). La integridad del ARN purificado total se verifica por electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa y tinción con bromuro de etidio. El ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc mediante el uso de una alta capacidad de cDNA kit de transcripción inversa con inhibidor de RNasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). El cDNA se utilizó para la PCR cuantitativa en tiempo real con duplicados. Las amplificaciones se realizaron con una placa MicroAmpH óptica de 96 pocilios de reacción (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un Fast Real-Time System ABI 7500 PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Disponible en el mercado y conjuntos de cebador/sonda previamente validado TaqMan ® fueron utilizados de la siguiente manera: ciclofilina A (4333763, RefSeq NM_002046.3), utilizado como control endógeno para el gen diana en cada reacción, TNF alfa (Hs00174128_m1 , RefSeq NM_000594.2) , IL-6 (Hs00174131_m1 , RefSeq NM_000600.2), IL-1 β (Hs00174097_m1 , RefSeq NM_000576.2), CD1 1 b [integrina aM (componente del complemento 3 subunidad del receptor 3)] (Hs01064804_m1 , RefSeq NM_000632.3), el sustrato del receptor de insulina 1 (IRS-1) (Hs00178563_m1 , RefSeq.NM_005544.2), sustrato del receptor de insulina 2 (IRS-2) (Hs00275843_s1 , RefSeq. NM_003749.2). Un ciclo umbral (valor Ct) se obtuvo para cada curva de amplificación y un valor de Ct se calculó primero restando el valor de Ct para la ciclofilina A humana a partir de cDNA del valor Ct para cada muestra y transcripción. Veces de cambios en comparación con el control endógeno se determinaron luego calculando 2 ^"Δα .

Extracción de RNA a partir de apéndice cecal

El ARN total se extrajo a partir de muestras apéndice cecal usando un reactivo TriPure de aislamiento disponible comercialmente (Roche). Los ARN extraídos serán tratados con DNasa (DNasa Set RNasa libre; Qiagen). La concentración de ARN se determinó por absorbancia a 260 nm (A260), y la pureza se estimó mediante la determinación de la relación A260/A280 con un espectrofotómetro Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). La integridad del ARN purificado total se verifica por electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa y tinción con bromuro de etidio. cDNA se sintetizará utilizando superíndices II de la transcriptasa y hexámeros al azar cebadores inversos como se describe en el protocolo del fabricante (Invitrogen Corp).

Amplificación por PCR y análisis de secuencias de rDNA 16S

Las regiones variables 2 y3 del ARNr fueron amplificados utilizando mezcla de Takara Ex Taq PCR (Takara Bio EE.UU., Madison, Wl) y los cebadores PCR HDA1 (5'- GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3 ') y HDA2 (5'-3-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC '). Cebadores directos se diseñaron con la secuencia adaptador A (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCA) más una secuencia de teclas (TCAG) y cebadores inversos con la secuencia adaptador B (CTATGCGCCTTGCCAGCCCG) más una secuencia clave (TCGA). 454-adaptadores se incluyeron en el cebador directo seguido de un identificador específico Multiplex- de 10 pb (MID). El programa de PCR fue creado como sigue 95° C 10 min y 30 ciclos de 95°C 1 min, 50°C 1 min, 1 ,5 min 72uC seguido por 72uC durante 10 minOTUs. Después de la electroforesis en gel de agarosa, los productos PCR fueron purificados dos veces utilizando Kit Agencourt AMPure (Beckman Coulter, Milano, Italia) y se cuantificó utilizando el kit Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA Ensayo (Invitrogen, Burlington, ON) y una piscina equimolar se obtuvo antes de la su posterior procesamiento y secuenciación en una plataforma GS júnior 454 de acuerdo con los protocolos del fabricante mediante el uso de una química de titanio (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

Análisis bioinformático Los datos de pirosecuenciación se analizaron utilizando el software QIIME 1.8.0. Laslos raw de lecturas se filtraron primero siguiendo el procesamiento de amplicones 454. Las lecturas obtenidas después de la pirosecuenciación fueron demultiplexadas y filtradas de nuevo utilizando el script splitjibrary.py de QIIME. Con el fin de garantizar un mayor nivel de precisión, las lecturas fueron excluidas del análisis si tenían una puntuación media de calidad inferior a 25, si había las llamadas bases ambiguas, si hubo desajustes de imprimación y si eran más cortas que 100 pb. El análisis del pipeline utilizado para analizar el gen 16S fue el siguiente:

Se seleccionaron aquellas secuencias que pasaron el filtro de calidad;

- Unidades taxonómicas operacionales (Otus) fueron recogidas por secuencias de agrupamiento en una similitud de >97% y las secuencias representativas, elegido como el más abundante en cada grupo, se presentaron a la UCLUST para obtener la asignación de la taxonomía y la abundancia relativa de cada OTU usando la base de datos de genes 16S rRNA Greengenes.

- Diversidad alfa y beta se evaluaron a través QIIME como recientemente se ha descrito (De Filippis et aal., 2013. PLoS One. 8:e70222.).

Análisis estadístico

El grupo de abundancia se logró con el g-test con el script group_significance.py dentro QIIME con el fin de comprobar si la presencia / abundancia de cualquier OTUs se asoció significativamente a un grupo específico. Se utilizó la matriz de distancia UniFrac ponderada para realizar la prueba estadística ANOSIM través de la secuencia de comandos compare_category.py de QIIME, con el fin de verificar si había diferencias entre los dos tipos de pacientes. La comparación entre los resultados de los pacientes con obesidad mórbida con y sin IR se realizó con la prueba de Mann-Whitney. Se calcularon los coeficientes de correlación de Spearman para estimar las correlaciones entre las variables. Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS versión 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los valores se consideraron estadísticamente significativas cuando el p <0,05. Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar.

RESULTADOS

Características bioquímicas y clínicas junto con la expresión de genes en el tejido adiposo visceral en ambos grupos de estudio. Las características metabólicas y antropométricas de los dos grupos de estudio se muestran en la Tabla 1. Los niveles plasmáticos de triglicéridos, insulina, glucosa, CRP, la leptina y los valores de HOMA-IR fueron significativamente mayores en el grupo IR-MO que en el NIR grupo MO (P <0,05). A la inversa, el GLP-1 , PYY y el nivel de adiponectina fue significativamente mayor en el grupo NIR-MO comparación con el grupo IR-MO (P <0,05).

Por otro lado, también se ha encontrado mayores niveles de expresión de ARNm en tejido adiposo visceral de IL6, IL1 B, TNF-alfa, IRS2 y CD11 b en el grupo IR-MO con respecto al grupo NIR-MO (P <0,05). Sólo los niveles de expresión de IRS1 en tejido de visceras adiposas se encontraron significativamente mayores en el grupo NIR-MO (P <0,05).

Análisis de la diversidad de comunidades microbianas entre los grupos de estudio.

Un total de 45.820 secuencias de genes 16S rRNA de buena calidad con un promedio de 4.582 ± 2,674.45 secuencias por muestra pasaron los filtros aplicados a través QIIME. Para obtener una visión estructural detallada del microbioma de cada sujeto inscrito en este estudio, se ha desarrollado un análisis operativo de unidad taxonómica (OTU). La microbiota después de QIIME estaba compuesta por 1.128 OTUS con una abundancia relativa superior al 1 % en al menos dos muestras (97% de similitud de corte).

Antes de la evaluación de las medidas de diversidad alfa y beta, las muestras fueron normalizadas a 302 seq, que correspondía al número más bajo de las lecturas de calidad obtenidas de cualquier muestra individual en el conjunto de datos. El grupo IR-MO tenía un mayor número de OTU que el grupo NIR-MO (media = 303 frente a media = 282, respectivamente, P> 0,05).

El promedio de la diversidad (índice de Shannon) y la riqueza de la comunidad (índice Chao) se calcularon para estimar la diversidad alfa. Los índices de cada grupo Chao y Shannon sugirieron una riqueza bacteriana similar y la diversidad en las muestras de apéndice del grupo NIR-MO en comparación con los del grupo IR-MO, sin diferencias significativas (P = 0,89 y P = 0,59, respectivamente) (Tabla 2). De acuerdo a lo observado, la distancia comenzó a estabilizarse en aproximadamente 100 lecturas, lo que sugiere que un mayor número de lecturas por muestra no habría proporcionado un catálogo más amplio de tasa bacteriana.

El análisis Principal UniFrac PCoA no ponderado basado en la abundancia relativa de OTUs para cada muestra mostró información útil acerca de la relación filogenética entre la microbiota bacteriana apéndice en ambos grupos de estudio. Todas las muestras del grupo IR-MO fueron separados no totalmente del grupo NIR-MO en las combinaciones de coordenadas, como se demuestra por los dos principales componentes de puntuaciones que representan el 23% y el 16% de las variaciones totales. ANOSIM con permutaciones no reveló diferencias significativas entre los grupos (P = 0,46), indicando que no hay separación notable entre los dos grupos (Figura 1).

Pirosecuenciación del gen ARNr 16S de muestras de pacientes con y sin resistencia a la insulina.

En este estudio, hubo variaciones en la composición de la microbiota del apéndice de los grupos IR-MO y NIR-MO en diferentes niveles bacterianos. A nivel phyla la mayoría de la OTUs pertenecía a Bacteroidetes (37,25% vs. 51 ,67% IR NIR, P = 0,02), Firmicutes fue el siguiente más abundante (47,98% vs. 21 ,45% IR NIR, P <0,001), seguido de Proteobacterias (7,23 IR% vs. 25,90% NIR, P <0,001) y Fusobacteria (7.35% vs. 1.56% IR NIR, P <0,001), que exhibió diferencias significativas entre tanto el IR-MO y los grupos de estudio NIR-MO. El restante de la población bacteriana pertenecían a otros 9 phyla que tenía una abundancia relativa inferior a 1 % (figura 2). Además, la proporción de Firmicutes/Bacteroidetes fue significativamente diferente entre los dos grupos de estudio (1 ,28% vs. 0,41 % IR NIR, P <0,001).

Dentro de los veintidós familias detectadas entre todos los grupos, dieciséis familias se detectaron con una abundancia relativa mayor que 1 % en al menos un grupo. Con respecto al grupo IR-MO, hemos encontrado un aumento significativo en Pseudomonaceae (27,83% vs. 20,72% IR NIR, P <0,001), Prevotellaceae (7,89% vs. 0,46% IR NIR, P = 0,01), y por otra parte en la única familia dentro de los filos Fusobacteria, Fusobacteriaceae (P <0,001); y una disminución significativa en la abundancia de Bacteroidaceae (49,92% vs. 70,41 % IR NIR, P = 0,03), Lachnospiraceae (36, 1 1 % vs. 43,26% IR NIR, P <0,001), Ruminococcaceae (34,85% vs. 43,61 % IR NIR , P <0,001) y Enterobacteriaceae (20,00% vs. 36,04% IR NIR, P <0,001). Por otra parte, no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos de estudio en otras familias abundantes, incluyendo Erysipelorichaceae (5.56% vs. 5.08% IR NIR, P = 0,064), Odoribacteraceae (7.25% vs. 8.04% IR NIR, P = 0,659), Porphyromonadaceae (0.48% vs. 2.65% IR NIR, P = 0, 108), Christensenellaceae (3.03% vs. 0.70% IR NIR, P = 0,783), Rikenellaceae (34,30% vs. 17,53% IR NIR, P = 0,297), Alcaligenaceae (20.87 IR% vs. 4.68% NIR, P = 589), Succinovibrionaceae (19, 13% vs. 1 ,5% IR NIR, P = 0,982), Veillonellaceae (14,39% vs. 5.08% IR NIR, P = 0,984), y Peptococcaceae (1 ,26% IR vs. 0,53% NIR, P = 0,668) (figura 3). También se han encontrado diferencias significativas en la composición microbiana en el nivel de género entre los grupos de estudio. Se identificaron un total de veintiocho géneros entre las muestras del apéndice, con seis géneros significativamente diferente entre los grupos NIR-MO y IR-MO. Pseudomonas (27,83% vs. 20,72% IR NIR, P <0,001), Catenibacterium (3.54% vs. 0.88% IR NIR, P = 0,027), Prevotella (7.89% vs. 0.46% IR NIR, P = 0,01), Veillonella (2,27% IR vs. 0% NIR, P <0,001) y Fusobacterium (P <0,001), alcanzó una mayor abundancia significativa en el grupo IR-MO dentro de los géneros constitutiva más del 1 % de las bacterias filos en las muestras del apéndice. Por otro lado, Bacteroides (49,76% vs. 67,85% IR NIR, P = 0,05) y Blautia (5,56% vs. 8,41 % IR NIR, P = 0,013) exhibió una abundancia significativamente mayor en los pacientes N IR-MO en comparación con el pacientes IR-MO. Además, Odoribacter (6.12% vs. 5.48% IR NIR, P = 0,702), Sutterella (20,87% vs. 4.68% IR NIR, P = 0,589), Succinovibrio (19, 13% frente a 0% IR NIR, P = 1 ,000) , Lachnospira (2.02% vs. 1.75% IR NIR, P = 0,356), Oscillospira (4.04% vs. 1.05% IR, P = 0,770), y Ruminococcus (3.03% vs. 0.35% IR NIR, P = 0,637), son los géneros dominantes en el grupo IR-MO, mientras Butyricimonas (1.13% vs. 2.56% IR NIR, P = 0,395), Parabacteroides (0.48% vs. 2.65% IR NIR, P = 0,107), Megamonas (0,25 vs. 1 ,75% IR NIR, P = 0,650) y Phascolarctobacterium (1.26% vs. 3.33% IR NIR, P = 0,956) dominó en el grupo NIR-MO. Las diferencias en la abundancia de todos estos géneros minoría entre los grupos NIR-MO IR-MO y no fueron significativas (P> 0,05 en todos los casos) (figura 4).

El software QIIME generalmente proporciona asignaciones filogenéticos de confianza en secuencias de ADN hasta el nivel taxonómico de género. Sin embargo, ha sido capaz de detectar los siguientes taxones: Prevotella stercorea, Mitsuokella multacida y Veilloneilla dispar en el grupo IR-MO.

Relación entre la composición de la microbiota intestinal, los parámetros clínicos y la expresión génica inflamación en el tejido adiposo visceral de ambos grupos de estudio.

En los pacientes con IR-MO, se encontró una correlación significativa univariante entre la abundancia de grupos bacterianos específicos y los niveles de glucosa en plasma (r = -0,918 Butyricimonas, P = 0,028), los niveles de insulina en plasma (Bifidobacterium r = -0.975, P = 0.005 ), los niveles de expresión de IL6 {Prevotella r = 0,921 , p = 0,026), IL1 B {Firmicutes r = 0,963, P = 0,009), TNF alfa (Succinovibrio r = 0,975, P = 0,005) y CD11 b (Veillonella r = 0,894, P = 0,041). No hay correlación significativa se encontró en el grupo NIR-MO (P <0,05).

Discusión

Este estudio es el primero que utiliza muestras de apéndices para establecer que los pacientes IR-MO y NIR-MO están asociados con un perfil específico microbiana intestinal utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación. Aunque están disponibles en la composición microbiana del apéndice, se ha postulado que este órgano podría servir como un depósito microbiano para repoblar el tracto gastrointestinal en tiempos de necesidad. El tejido linfoide asociado del apéndice ha sido reconocido para proporcionar una ambiente ideal para el crecimiento de bacterias en los biofilms que actúan como reservorio entérico. En este estudio para analizar la relación entre la composición de la microbiota y la presencia de resistencia a la insulina en los pacientes con obesidad mórbida se han tenido en cuenta factores como el IMC, la raza, el género y la edad de los sujetos de estudio.

Los resultados de los inventores indican que los pacientes IR-MO no han aumentado la diversidad bacteriana dado que no hay ningún clúster separado cuando se compara con el grupo NIR-MO, claramente indicada por PCoA basado OTU. Pero el análisis de pirosecuenciación de las secuencias del gen 16S rRNA de las abundancias relativas de filos predominante, familiares y taxones de géneros en muestras de apéndices reveló grandes diferencias entre los pacientes NIR-MO y IR-MO. Estos resultados sugieren que la microbiota dominante es diferentes en los pacientes IR-mo con respecto a los pacientes NIR-MO. Las alteraciones de la microbiota intestinal también se han sugerido que ocurren en otras enfermedades humanas tales como los pacientes de enfermedad de Crohn, pacientes con colitis ulcerosa, los niños con enfermedad celíaca, y los bebés que sufren de inflamación alérgica.

Por otra parte, los pacientes con obesidad mórbida con un fenotipo microbiota IR tenían un mayor índice de inflamación sistémica con un aumento significativo en los niveles de proteína C reactiva y la leptina, y una disminución en los niveles séricos de adiponectina. Los datos recientes han demostrado que las variaciones en la microbiota intestinal se asociaron con cambios pro-inflamatorias en la expresión génica adiposo. En este estudio también se ha encontrado un aumento significativo en el nivel de expresión de los marcadores inflamatorios tales como IL6, IL1 B y TNF alfa en el visceral tejido adiposo de los pacientes IR-MO. Por otra parte existe una correlación positiva y significativa de la abundancia de Prevotella, Succinovibrio y Firmicutes con el nivel de expresión del tejido adiposo visceral de IL6, TNF alfa e IL1 B respectivamente. Hace unos años, Burcellin et al. sugirió que podría existir la denominado "infección metabólica", lo que sugiere que la microbiota intestinal podría ser un factor importante en bajo grado de inflamación sistémica y el desarrollo de resistencia a la insulina. En este estudio utilizando modelos animales, los aOTUres demostraron que antes de la aparición de la diabetes, y poco después los ratones se cambiaron a una dieta alta en grasas, las bacterias intestinales translocaron desde el intestino al tejido adiposo y la sangre en los que podrían inducir una inflamación de bajo grado. También se ha descrito que el TNF alfa es capaz de fosforilar el sustrato residuo de serina (IRS-1) desde el receptor de insulina, conduciendo a su inactivación. Por tanto, la presencia de una disbiosis local en el apéndice y la inflamación provocada por estas bacterias intestinales del grupo IR-MO podrían ser patológico y podría estar relacionado con el desarrollo de IR en los pacientes con obesidad mórbida. El aumento significativo en la abundancia de Prevotella sugiere una evolución de un nicho- mucina degradantes en el grupo IR-MO. La degradación de mucina por las bacterias es a menudo considerado como una etapa inicial en la patogénesis, ya que perturbaría la protección de las superficies mucosas de acogida y potencialmente conducir a una alteración de la barrera epitelial con un aumento de la permeabilidad intestinal y facilitar la translocación bacteriana y la inducción de la inflamación en el hospedador, como pensamos que se produce posiblemente en los pacientes IR-MO. Además, el aumento significativo en la expresión tejido adiposo visceral de CD11 b en el grupo IR-MO puede ser debido a este aumento en la permeabilidad que desencadenar una respuesta inmune, la inflamación, y la infiltración de células inmunes en el tejido hepático y adiposo. Por otra parte, los inventores han observado una correlación positiva significativa entre la expresión tejido adiposo visceral de CD1 1 b y la abundancia relativa de Veillonella en el grupo IR-MO. Estas bacterias son capaces de fermentar la glucosa y lactato a propionato, acetato y succinato; sin embargo, estos ácidos grasos cortos no inducen la síntesis de mucina, lo que podría resultar en una reducción del conjunto de unión estrecha generando un aumento de la permeabilidad del intestino. Esta situación es capaz de inducir resistencia a la insulina y también reducir los niveles de hormonas intestinales secretadas, tales como GLP-1 y PYY como se ha descrito en pacientes de IR-MO en el presente estudio. Un posible mecanismo para explicar la disminución significativa de la secreción de GLP1 y PYY en los pacientes IR-MO puede ser que su secreción sería modulada por la AGCC producida por su microbiota intestinal alterada. La disminución significativa en la abundancia de Lachnospiraceae y Ruminococcaceae encontrada en este estudio en el grupo IR-MO es muy relevante porque ambas familias son capaces de degradar polisacáridos complejos a ácidos grasos de cadena corta incluyendo acetato, butirato y el propionato de que se puede utilizar para la energía por el anfitrión. Además, estos SCFA actúan como moléculas anti-inflamatorias, capaz de inhibir la activación de NF-kB en el huésped células inmunes mediante la unión a receptores acoplados a proteína G (GPR43 y GPR41), con lo que el bloqueo de las respuestas inflamatorias y la supresión de TNF IL6 y liberación. Además, los estudios anteriores han demostrado también que el butirato induce la síntesis de mucina, disminuye el transporte bacteriana a través del epitelio y disminuye la permeabilidad del epitelio intestinal mediante el aumento de la expresión de proteínas de unión estrecha.

La producción de butirato por bacterias intestinales parece jugar un papel importante en la regulación de glucosa en sangre y el metabolismo lipídico, como se muestra por estudios de trasplante fecales. En el presente estudio, se ha encontrado correlaciones negativas y significativas entre la abundancia de bacterias tales como Butyricimonas (que son los productores de butirato con efectos anti-inflamatorios) y Bifidobacterium con la glucosa en plasma y los niveles de insulina, respectivamente, en los pacientes IR-MO. En estudios anteriores, los niveles de Bifidobacterium también se han relacionado con la mejora de metabolismo de la glucosa, resistencia a la insulina y la inflamación de bajo grado. Además se mejoró la sensibilidad a la insulina tras administrar microbiota intestinal productora de butirato de donantes a sujetos varones con síndrome metabólico.

Los resultados de la presente invención también demuestran que la abundancia de bacterias que pueden actuar como patógenos oportunistas tales como Pseudomonas y Sutterella están elevadas en el apéndice de pacientes IR-MO relativos a los pacientes NIR-MO.

En conclusión, los datos de la presente invención demuestran que el apéndice disbiosis ocurre en pacientes con obesidad mórbida en la etapa previa a la diabetes, como la resistencia a la insulina. Por otra parte, los pacientes IR-MO muestran una pérdida de bacterias esenciales para mantener la integridad intestinal junto con un aumento de mucina en las bacterias que degradan y patógenos oportunistas butirato productoras. Finalmente, el aumento significativo en la expresión de genes de citoquinas inflamatorias y la infiltración de macrofagos en el tejido adiposo provocada por la microbiota presente en el grupo IR-MO puede sugerir que estas bacterias específicas podrían iniciar la inflamación y la resistencia a la insulina asociada con la obesidad. Estos hallazgos podrían ser útiles para el desarrollo de estrategias para controlar el desarrollo de la resistencia a la insulina mediante la modificación de la microbiota intestinal.

Tabla 1. Características bioquímicas y clínicas de ambos grupos de studio junto con la expression de las citoquinas inflamatorias genes de infiltración en macrofagos en tejido adipoo visceral.

Pacientes NIR-MO Pacientes IR-MO *P

N=5 N=5

Edad (años) 48.0±10.5 44.40±8.64 0.570 BMI (kg/m ² ) 59.18±4.71 58.20±4.12 0.735

Circunferencia de la cintura (cm) 146.60±11.71 151.40±14.56 0.580

Circunferencia de las caderas (cm) 162.67±14.36 162.20±17.03 0.964

SBP (mmHg) 132.00±23.28 141.0±27.87 0.595

DBP (mmHg) 82.40±10.90 86.60±10.13 0.546

Colesterol total (mg/dl) 211.60±16.34 207.80±18.70 0.741

HDL colesterol (mg/dl) 51.60±1 1.80 47.40±1 1.30 0.581 LDL colesterol (mg/dl) 130.23 ±17.67 127.33±19.12 0.810

Trigléceridos (mg/dl) 89.04±13.46 159.39±15.9 0.001

Insulina (mg/dl) 8.92±1.74 26.93±3.85 0.001

Glucosa (mg/dl) 94.40±4.36 104.80±3.63 0.003

HOMA-IR 2.18±0.53 8.34±1.44 0.001

GOT (U/1) 27.50±6.47 20.40±5.77 0.104

GPT (U/1) 39.00±15.05 42.80±16.76 0.716

GGT (U/1) 47.27±16.00 42.20±13.84 0.649

CRP (mg/L) 3.62±0.91 5.82±0.52 0.002

Leptina (ng/ml) 59.25±1 1.75 95.08±15.88 0.001

Adiponectina (ug/ml) 13.52±3.54 7.44±1.44 0.007

PYY 0.55±0.17 0.34± 0.10 0.044

GLP1 88.80±9.67 56.40±1 1.52 0.001

IL6_V 0.07±0.02 0.27±0.07 0.001

IL1 B_V 0.08±0.02 0.28±0.07 0.001

TNF_alpha_V 0.002±0.0009 0.006±0.002 0.004

IRS1_V 0.014±0.001 0.005±0.001 0.001

IRS2_V 0.59±0.15 0.63±0.08 0.633

CD11 b V 0.12±0.04 0.35±0.10 0.001

Los valores se representan como media ± SD. N= 5 sujetos por grupo. DBP, presión sanguínea diastólica, SBP, presión sanguínea sistólica; GGT.Gamma-glutamil transferasa; GOT, Glutamic oxaloacetic transaminasa; GPT, Glutamic pyruvic transaminasa, CRP, Proteína C reactiva. Valores significativaente diferentes a *P <0.05.

Tabla 2. índice de riqueza estimada (Chaol) e índice de diversidad (Shannon) entre las comunidades microbianas obtenidas de las miestras de IR-MO y NIR-MO. IR-MO pacientes (n=5) NIR-MO pacientes (n=5) P

Chao 1 99.19± 29.03 102.0± 36.51 0~89

Shannon 3.69± 0.91 3.34± 0.92 0.59

El estimador de riqueza Chao y el estimador de diversidad Shannon fueron calculados al 3 de distancia.