[1] A presente invenção se insere no campo cie aplicação da ciência médica, mais especificamente na área de diagnóstico, uma vez que se refere a um método de identificação de metabólitos (biomarcadores) para a detecção precoce de colestase em recéfli-nascidos . A presente invenção também se refere a um kit de identificação desses biomarcadores e seu uso.

Fundamentos da invenção:

[2] Colestase neonatal (Chol) é a interrupção ou redução do fluxo biliar, que ocorre dentro dos primeiros 90 dias de vida. A incidência sugerida em diferentes populações é entre 1 e 1.500 a cada 9000 bebés nascidos, além disso, sua manifestação está associada a diversas patologias intra ou extra hepáticas.

[3] Os casos intra-hepáticcs correspondem a aproximadamente 70% de todas as causas de Chol neonatal, e as principais condições envolvidas são doenças infecciosas, metabólicas e endócrinas congénitas, hipopiasia intra- hepática dos dutos de bile, medicamentos, infecções e doenças genéticas e origem idiopática. Os casos extra-hepáticos representam os outros 30% de todas as causas de Chol neonatal, e a principal doença envolvida é atresia biliar (BA), uma doença grave que conduz a cirrose e a morte prematura, se a interferência cirúrgica não for executada tão rapidamente quanto possivel.

[4] Os principais sinais clínicos são ictericia e fezes claras além de duas semanas de idade. No entav.to, outros sintomas como urina escara/ prurido, esteatorréia e hemorragias profusas inexplicáveis também podem ser manifestações colestáticas . Não obstante estes sinais serem inespecíficos, a Sociedade Norte-Americana de Gastroenterologia Pediátrica, Hepatologia e Nutrição (NASPGHAU) recomenda a medição dos níveis séricos de bilirrubina total e direta para confirmar a Chol . Uma vez confirmada, outros exames podem auxiliar no diagnóstico etiológico, dentre eles a uitrasscnografia de fígado e vias biliares, biópsia hepática percutânea, cintilografia hepatobiliar, e aspirado duodenal.

[5] Neste contexto, os métodos para o reconhecimento precoce da doença têm sido desenvolvidos, tais como o cartão de fezes. Este método é um ensaio colorimétrico diretamente relacionado com a quantidade de bilirrubina eliminada nas fezes. O mesmo foi introduzido no rastreio de recém-nascidos em Taiwan e é referido çomo sendo favorável em 5 anos de resultados no diagnóstico da Chol causada pela BA, com 73,6% de sensibilidade, dentro dos primeiros 60 dias de vida. No entanto, apesar de o cartão de fezes apresentarem níveis aceitáveis de sensibilidade e especificidade, é usado apenas após o inicio dos sintomas de Chol. Além disso, os resultados de sensibilidade, especificidade e mortalidade são relacionados apenas com Chol causada pela BA, e hão para Chol relacionada a outras causas etiológicas.

[6] Métodos baseados em cromatografia e espectrometria de massas (MS) foram desenvolvidos para ajudar no diagnóstico da Chol, e perfilamento metabólico foi avaliado para eleger biomarcadores potenciais da doença. As amostras de manchas de sangue seco em papei filtro recolhidos no primeiro ano de vida, têm sido o foco de estudos nos últimos 25 anos. Mills, et al., em 1998, publicou o primeiro estudo para medir os ácidos biliares (BAc) em amostras de sangue seco coletadas de crianças com menos de um ano de idade utilizando ESI-MS e os padrões de BAc marcados com deutériç. Dados preliminares mostraram grande potenciai do método para medir BAc em casos de Chol causados peia BA, galactosemia, hepatite citomegalovirus, síndromes hipoplasia do dueto biliar, colangite esclerosante neonatal, tyros^mia, hemangiomata hepática, hepatite de células gigantes idiopá.tica e distúrbios peroxissomais . No entanto, o estudo não apresentava valores.de especificidade e sensibilidade, e não é possivel afirmar se o método é eficaz para detectar esta doença obtida de crianças de 7-10 dias após o nascimento .

[7] Mushtaq, et ai., em 1999, com o mesmo pbjetivo, usaram um método semelhante com base em MS e padrões de deutério em manchas de sangue seco de amostras de triagem neonatal. Depois dê avaliar a concentração de BAc em hepatite neonatal idiopática, síndrome Allagile, BA, distúrbios metabólicos, hepatite por citomegalovirus, alfa 1 antitripsina e outras causas de Chol, o estudo obteve, respectivamente, 96% e 62% de especificidade e sensibilidade para todas as doenças colestáticas hepatobiliares.

[8] Recentemeíité, Janzen et al., em 2010, desenvolveu um método baseado em cromatografia liquida acoplada com MS (LC-MS) para detectar e quantificar BAc e seus precursores em manchas de sangue seco de triagem neonatal em casos de BA, galactosemia e defeitos peroxisomais . Para tal, apresentaram um método útil para o diagnóstico e monitoramento destas doenças, no entanto, o estudo não mostra dados de sensibilidade e especificidade.

[9] Zhou, et al., em 2012, desenvolveu um método semelhante com base na LC-MS para quantificar BAc em manchas de sangue seco de triagem neonatal para BA, outras causas de icterícia neonatal e indivíduos saudáveis. A sensibilidade e especificidade alcançadas apenas para diagnóstico BA foram, respectivamente, 79,1% e 62,5%, o que não é tão bom como o teste que avalia bilirrubína conjugada e os cartões coiorímétricos para fezes, embora possam permitir o diagnóstico precoce apenas para BA antes do aparecimento dos sintomas.

[10] Portanto, o método de triagem neonatal ideal para Chol deve ser realizado o mais cedo possível, incluindo todas as causas etiológicas, usando um fluxo de trabalho simples, direto e com sensibilidade e especificidade de quase 100%. Uma vez que estes resultados ainda não tenham sido alcançados por quaisquer um dos outro3 estudos anteriores, a presente invenção propõe uma nova estratégia baseada em espectrometria de massas dom preparação mínima de amostra para identificar biomar.cadores de Chol em amostras de sangue coletados em papel filtro para triagem neonatal, proporcionando desta forma uma triagem precoce nos 10 primeiros dias de vida, antes mesmo do aparecimento dos sintomas.

Estado da técnica:

[11] Alguns documentos do estado da técnica descrevem métodos para identificação de biomarcadores de doença, incluindo da colestase.

[12] O documento WO20D716331 se refere a um estudo de mutações envolvidas no desenvolvimento de colestase causada por doenças genéticas. 0 mesmo propõe um método baseado em biologia molecular apenas para as doenças genéticas com as quais o desenvolvimento de colestase está relacionado. Desta forma, outras causas não genéticas não são detectadas por este método. Diferentemente, a invenção proposta: avalia moléculas envolvidas diretamente com a colestase, e detecta este sintoma independente de ser causado por doenças genéticas ou não, como por exemplo, colestases causadas por atresia biliar e infecções por citomegalovirus . Além disso, a presente invenção propõe uma metodologia baseada em espectrometria de massas de análise de moléculas relacionadas diretamente com o desenvolvimento da colestase.

[13] 0 documento US20060246489 se refere a um método para o diagnóstico de marcadores envolvidos com danos hepáticos que pode ter várias causas, incluindo a colestase. 0 mesmo propõe um kit de detecção de marcadores envolvidos com danos hepáticos, porém não define se há marcadores específicos para colestase. Diferentemente, à presente, invenção propõe marcadores específicos para colestase.

[14] 0 artigo. "Identification of Serum Protein 3iomarkers in Biliaty Atresia by Mass Spectrometry and Enzyme-linked Immunosorbent Assay" de Song et al. (2012), refere a análise de proteínas para diagnóstico precoce da atresia biliar, umas das causas de colestase. A invenção proposta difere do referido artigo pelo fato de os marcadores não serem proteínas, mas sim marcadores de baixa massa molecular. Além disso, a presente invenção propõe o monitoraraento de marcadores par.a várias causas de colestase, sendo a atresia biliar uma delas.

[15] Já o artigo "Slevated Bile Acids in Newborns with Biliary Atresia (BA)" de Zhou et ai. (20125 se refere a determinação de ácidos biliares através de um método que utiliza cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massas. Diferentemente, o método proposto pela presente invenção realiza a injeção direta da amostra em espectrômetro de massas, e são monitoradas outras moléculas além de ácidos biliares para a detecção não só de atresia biliar, mas de colestase independente da etiologia. Além disso, o referido artigo apresenta 79,1% de especificidade e 62,5% de sensibilidade para determinação de ácidos biliares. Enquanto a invenção apresentou 35% de especificidade e 85% de sensibilidade para o diagnóstico da colestase.

[16j Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve um método de obtenção de metabólitos para ser utilizado como marcadores para a detecção precoce de colestase em recém-nascidos, tal como proposto pela presente invenção.

Breve descrição da invenção:

[17] A presente invenção refere-se a um método de identificação de metabólitos de amostras de sangue baseado em espectrometria de massas, entre os metabólitos estão os biomarcadores, que fornecem evidência molecular de colestase» O método é eficaz em detectar alterações bioquímicas nos primeiros dias de vida, antes mesmo dos primeiros sinais de colestase, promovendo um diagnóstico precoce, e possibilitando o monitoramento da doença. Além de simples, o método é feito por injeção direta da amostra em espectrômetro de massas e apresentar 95% de especificidade e 85% de sensibilidade.

[18] 0 método compreende as seguintes etapas: a) obter a amostra;

b) Inserir a amostra em recipiente de pesquisa juntamente com uma mistura de solventes contendo metanol : água : tetraidrofurano;

c) submeter o recipiente com a solução obtida em (b) compreendendo os solventes e a amostra em banho uitrassônico;

d) Diluir a solução obtida em (c) em solução de metanol -água;

e) filtrar a solução obtida em (d);

f} adicionar ácido fórmico na solução obtida em íe) ; g) analisar solução obtida em (f) por espectrometria de massas com ionização por spray de elétrons (ESI-MS) ; e

h) identificar e monitorar as intensidades dos ^' ions correspondentes -aos biomarcadores de Colestase Neonatal .

[19] A presente invenção refere-se ainda a um kit de identificação dos biomarcadores e uso.

Breve descrição das figuras :

[20] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[21] A Figura 1 representa graficamente os espectros de massas representativos no modo positivo (400-1200 m/z) dos grupos: (A.) controle e (B) colestase.

[22] A Figura 2 representa graficamente a análise discriminatória ortogonal por mínimos quadrados parciais (OPLS-DA) comparando os grupos controle e colestase.

[23] A Figura 3 representa graficamente a curva ROC entre Controle e colestase, em que os resultados calculados conduziram a 95% de especificidade e 85% de sensibilidade para os 7 marcadores monitorados em conjunto.

Descriçao detalhada da invenção:

[24 ] A presente invenção refere-se a um método de obtenção de metabólitos para ser utilizado como marcadores para a detecção precoce de colestase em recém-nascidos.

[25] 0 referido método compreende as etapas de:

a) obter a amostra de sangue;

b) Inserir a amostra em recipiente juntamente com 0,5 a 2 ml de uma mistura de solventes compreendendo metanol : água: tetraidrofurano;

c) submeter o recipiente compreendendo os solventes e amostra em banho ultrassônicc por 1 a 10 minutos;

d) Diluir a solução obtida em (c) na proporção 10-100 uL amostra para 990-900 μL de solução de metanol : água;

e) filtrar a solução obtida em (d), preferencialmente por membranas de polivinildieno difluoreto (PVDF) ;

f) adicionar 0,1 a 2% de ácido fórmico na. solução obtida ^' em (e) ;

g) analisar solução obtida em (f) por espectrometria de massas com ionização por spray de elétrons (ESI-MS) ; e h) identificar e monitorar as intensidades dos íons correspondentes aos biomarcadores de Colestase Necnatal.

[26] Sendo que:

- na etapa (a), a amostra é, preferencialmente, um papel de filtro com sangue do paciente, preferencialmente sangue seco.

na etapa (h) , os biomarcadores serem palmitoilcarnitina; 3-ácído oxicólico e/ou 7-ác.ido cetodesoxicólico; (3a, 5b, 7a) -23-carboxi-7-hidroxi-24- norcolan-3-yl, b-D-Ácido glucopiranosidurônico;

Leucotrieno C4; isômeros de ácidos fosfatídicos; esfíngomilelína; e ísômeros de diacilglicerol .

[27] O procedimento de coleta de amostras utilizado na etapa "a" já é utilizado na rotina de triagem neonatal. Recéro-nascídos com até 10 dias devem ser encaminhados aos postos de coleta; o pé do recém-nascido é furado com a ajuda de uma agulha ou lanceta e o sangue resultante é disposto sobre o papel filtro comercial que já é utilizado no programa de triagem neonatal.

[28] Na etapa "b", previamente ao papel filtro com o sangue seco ser colocado em recipientes adequados, os papéis filtro com o sangue seco (amostras) são cortados, preferencialmente em círculos com no mínimo 2 mm de diâmetro.

[29] Ainda na etapa "b", o referido recipiente adequado utilizado é um tubo sem resíduos de bisfencl.

[30] Para extração seletíva de moléculas, que compreende os bíomarcadores alvo da presente tecnologia, ainda na etapa "b", é realizada uma mistura de solventes compreendendo metanol : água : tetraidrofurano em uma proporção que varia de 47,5:47,5:5 a 37,5:37,5:25, preferencialmente 45:45:10.

[31] Posteriormente, na etapa "c", o tubo contendo a amostra é submetido a banho ultrassônico na frequência de 35 a 45 kHz por 1 a 10 minutos.

[32] Na etapa "d", a amostra é então diluída na proporção 10-100 yL amostra para 990-900 uL de solução de metanol : água na proporção que varia 7:3 a 3:7, preferencialmente 1:1.

[33] Ainda para extração dos bíomarcadores, na etapa ^,x e", as amostras são filtradas através de membranas com 0,22 μπ\.

[34] Após a extração dos biomarcadores das amostras (etapas "b", "c", "d" e "e") , a amostra deverá passar por uma etapa de ionização em solução para ser analisada por espectrometria de massas. Para tal, na etapa "f" é realizada a adição de ácido fórmico nas amostras, em concentração que varia de 0,1 a 2%.

[35] Em seguida, na etapa "g", a amostra é injetada diretaraente em ESI-MS e analisada ^' na faixa de massa de 400- 1200 m/z, considerando os seguintes parâmetros do equipamento: resolução nominal de no mínimo 30.000 (FWHM), 5 unidades arbitrárias de gás de arraste, fluxo na faixa de 10 a 20 μL/min, voltagem do spray de 5 kv e temperatura do capilar na faixa de 280-285 °C. Os espectros de cada amostra devem ser adquiridos, por no mínimo 30 a 90 segundos e sempre na faixa de massa especificada (400-1200 m/z) na qual serão encontrados os biomarcadores.

[36] Depois de realizada a análise por espectrometria de massas, os biomarcadores relacionados â Colestase Neonatai devem ser monitorados, como na etapa "h", através da avaliação da intensidade das seguintes relações massa/carga: 422, 429, 551, 643, 663, 685 e 701, que correspondem respectivamente aos biomarcadores: palmitoiicarnitiria; 3-écído oxicólico e/ou 7-ácido cetodesoxicólico; (3a, 5b, 7a) -23-carboxi-7-hidroxi-24- norcolan-3-yl, b-D-Ácido glucopiranosidurônico; Leucotrieno C4; isômeros de ácidos fosfatidicoe; esfingoiailelina e lsômeros de diacilglicerol .

[37] Desse modo, o método aqui proposto obtém os acima citados sete biomarcadores estatisticamente validados para colestase, que apresentaram 95% de especificidade e 85% de sensibilidade qua,ndo monitorados em conjunto.

[38] Assim, o presente método se demonstrou eficaz em detectar alterações bioquímicas rios primeiros dias de vida, antes mesmo dos primeiros sinais de colestase, promovendo um diagnóstico precoce.

[39] Para melhor entendimento, a seguir são apresentados exemplos da invenção.

Exeaplos da Invenção:

- Seleçao de amostras de triagem neonatal:

[40] A coleta dé amostras foi aprovada pelo Comité de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências. Médicas - Universidade de Campinas/Brasil. No grupo Colestase (Chol) foram incluídos 14 pacientes que desenvolveram Chol intra ou extra-hepática (IHC e EHC respectivamente) dentro das primeiras semanas de vida, enquanto o grupo controle incluiu 21 pacientes da mesma idade, que não desenvolveram Chol.

[41] As amostras de sangue recolhidas como manchas de sangue seco em papel filtro pelo Programa de Triagem Neonatal dentrp das primeiras horas de vida foram usadas para este estudo retrospectivo. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos aplicáveis em matéria de amostras de origem humana.

- Preparo de amostra:

[42] 0 papel de filtro contendo as amostras de sangue seco da triagem neonatal foi cortado em círculos de diâmetro de 6 mm, os quais foram extraídos com 1 mL de metanol : água : tetra-hidrofurano (45:45:10) em ultrassom por 2 minutos. 10 ul da solução resultante foram diluídas em 990 mL de metanol: água (1:1). Todas as amostras foram filtradas através de membranas de 0,22 mícrons polivinildieno difluoreto (PVDF) e 1 ul de ácido fórmico adicionou-se a cada amostra.

- Análise por espectrometria de massas:

[43] As amostras foram injetadas diretamente em um instrumento ESI-LTQ-XL Orbitrap Discovery, com resolução nominal de 30.000 (FWHM) sob aá seguintes condições: taxa de fluxo de 10 μL.min ^-1 tensão de pulverização de 5 kV, bainha de gás à 10 unidades arbitrárias, temperatura capilar de 280 °C.

[44] As análises foram realizadas em triplicata e todos os dados foram adquiridos no modo positivos usando o intervalo de massa 400-1200 m/z.

- Análise estatística e eleição biomarcadotes :

[45] Análise Discriminatória Ortogonal dos Mínimos Quadrados Parciais (OPLS-DA) usando o software online Metabo Analyst 3,0 foi realizada para selecionar os íons característicos de cada grupo; esta escolha foi realizada considerando a lista de pontuação VIP (Importância variável na projeção) . Para verificar a precisão dos biomarcadores candidatos escolhidos por lista pontuação VIP, foi realizada a Característica da (ROC) Curve Receiver Opera ting.

[46] Os bancos de dados online Lipid Maps, HMDB versão 3.6, METLIN e KEGG Pathway Database foram consultados para eleger os potenciais biomarcadores com erro de massa não superiores a 2 ppm.

- Resultados :

[47] A idade de admissão de pacientes do grupo Chol variou de 11 dias para 90 dias, com mediana de 51 dias. A idade de início da icterícia variou desde o nascimento até 60 dias, com mediana de 15 dias. Os diagnósticos . finais deste grupo foram: atresia biliar (6) , síndrome de Alagille (3), idíopática (2), infecção por cítomegalovírus (1), galactosemia (15 e multifatorial (1) .

[48] A Figura 1 mostra os espectros de massa representante no modo positivo (400-1200 m/z) de cada grupo, em que (A) é o grupo controle, e (B) colestase.

[49] As análises estatísticas foram realizadas utilizando OPLS-DA comparando os grupos controle e Chol para eleger biomarcadores específicos para Chal. O OPLS-DA (Figura 2) mostra a separação completa dos grupos de controlo e Chol.

[50] A partir dessas análises, 7 (sete) biomarcadores (palmitoilcarnitina; ,3-ácido oxicólico e/ou 7-ácido cetodesoxicólico; (3a, 5b, 7a) -23-carbcxi-7-hidroxi-24- norcolan-3-yl, b-D-Ácidó glucopirancsidurônico; Leuc.otr.ieno C4; isômeros de ácidos fosfatídicos; esfingcmiieiina; e isômeros de diacílglíceroi) para o grupo controle, todos com pontuações VIP acima de 4,

[51] Para avaliar a relevância destes biomarcadores, uma curva ROC foi construída, apresentando 95% de especificidade (IC 95%: 85,8 - 98,7) e 85% de sensibilidade (IC 95%: 70, 1-93, 9) (Figuira 3). Informações pormenorizadas sobre os biomarcadores eleitos para os grupos de controle e Chol pode ser vistas na Tabela 1.

[52] Os marcadores do grupo controle são determinados apenas para prova que este grupo possui moléculas esperadas em indivíduos saudáveis. As moléculas do grupo colestase são indicativas da presença da doença. Todas as moléculas foram determinadas com o erro máximo de 2ppm calculado a partir de sua massa experimental e massa teórica. A tabela também apresenta os IDs de cada uma destas moléculas nos seguintes bancos de dados: HMDB, Metlin e Lipid Maps.

- Discussão dos Marcadores:

[53] O leite materno é a única fonte de alimentação para recém-nascidos composto principalmente de água, macro e micronutrientes. Entre os macronutrientes, as proteínas são as mais abundantes, seguido de lípidos, dentre eles triacilgliceróis (TAG) e fosfolipídeos . Entre os fosfolípidos, fosfatidiiinositol (PI) (1,017 m/z) foi eleito como bíomarcador e é o mais abundante no grupo controlo em comparação com o grupo Chol. Isto acontece porque, possivelmente, esta classe de lipídeos em particular é utilizada como um mensageiro em resposta à inflamação iniciada por Chol, e, por conseguinte, será mais consumido pelo processo inflamatório presente no grupo Chol.

[541 Lipídeos imunossupressores também estão presentes no leite humano, tais como as prostaglandinas, que regulam a resposta do .sistema imunitário da mucosa intestinal nos primeiros dias de vida, evitando danos na mucosa intestinal. Prostagiandina F2 alfa (PGF2) é relatado para ser produzido em concentrações elevadas no leite humano nos primeiros dias após o nascimento, o que corrobora a eleição do metabclito humano de 20-hidroxi-PGF2a (209 m/z) como um biomarca.dor controle. [55] Os oligossacáridos são os terceiros macronutrientes mais abundantes presentes no leite humano, e o seu papel biológico está intimamente relacionado com a sua estrutura.

[56] Os biomareadores encontrados no grupo de controlo, a saber, 3 ' -sialil-lactose (616 m/z) e 6-sialil-N- acetiliactosamina (675 m/z) são oligossacáridos com ácido siálico terminal, ê são relatados para ser absorvidos pelo intestino humano e manter-se no sangue em concentrações elevadas. A estrutura destes hidratos de carbono apresenta propriedades antí-inflamatórias, uma vez que o terminai ácido siálico reduz a adesão mediada glicano de leucócitos a células endoteliais.

[57] Portanto, quando a capacidade do fígado para o transporte de solutos no canalículo é comprometida por vários mecanismos e não há diminuição da formação de bile, o desenvolvimento de Chol ocorre, bem como um decréscimo da absorção de nutrientes do leite, com o acúmulo de muitas moléculas do figado e na circulação sistémica.

[58] A produção de bile pelos hepatócitos é regulada por várias vias e mediadores, tais como a proteina quinase C (PKC) . A ativaçâo de diferentes ísoformas de PKC está envolvida na Chol induzida por ácido biliar e apoptose, e requer a ligação de diacilgliceróis (DAG) e/ou Ca ²⁺ e de interacção com os lipidos da membrana ácidas que explicam a eleição do DAG para o grupo Chol. Este biornarcador também é suportado pelas alterações no metabolismo de TAG no fígado, uma vez que a elevaqào de ácidos biliares também ativa muitas lipases, responsáveis pela diminuição dos níveis de TAG e de produção de DAG (701 m/z) e ácido fosfatídico (PA) (663 m/z), também eleito como biomarcadores de Chol.

[59] A diminuição dos ácidos biliares no intestino impede a absorção de colesterol, TAG e DAG, ao passo que a absorção de ácidos gordos (FA) é mantida a certa medida, fornecendo uma fonte de energia para o corpo, embora limitada.

[60] Carnitina ajuda de cadeia longa FA entrar na mitocôndria por beta-oxidação, e palmitoilcarnitina (422 m/z), eleitos como blomarcador, é relatada a ser elevada em crianças com Chol. Devido à diminuição da secreção biliar e fluxo de duetos biliares, ácidos biliares, fosfolipidios, colesterol e bilirrubina agora passam a se acumular no fígado e sangue, explicando a eleição do ácido biliar ácido 3- Oxocólico e/ou ácido 7-Ketodeoxicóiico (429 m/z) como biomarcadores Chol.

[61] No entanto, nas fases iniciais da doença, a acumulação de ácidos biliares é mais lenta do que a. bilirrubina, que é relatado para diminuir, a peroxidação lipidica no fígado, a produção de Fator de Necrose Tumoral- aifa (TNFa) e a atividade da esfingomielinase (SMase) .

[62] SMase é responsável pela hidrólise da esfingomielina e esfingosina para ceramida, mediadores de apoptose. Em modelos animais, dentro dos primeiros 9 dias de Chol, a atividade de SMase é reduzida pela acumulação de bilirrubina. No entanto, após este período, a bilirrubina é constantemente produzida pelo organismo e o aumento da concentração de ácidos biliares intensifica a peroxidação lipidica e da produção de TNFa. Esties achados corroboram a eleição de esfingomielina (685 m/z) como biomarcadores Chol, sugerindo o desenvolvimento de Chol nas primeiras horas após o nascimento, e indicam que o diagnóstico precoce da doença, mesmo antes do surgimento dos sintomas, é possivei.

[63] A acumulação de ácidos biliares em concentrações elevadas faz com que a citotoxicidade, assim como as suas propriedades detergentes, e acumulação nas células do figado, levem ao- estresse ôxidativo, apoptose e subsequente lesão do parênquima do figado.

[64] Glucuronidação de ácidos biliares é a principal via de desintoxicação do organismo e, após conjugação com um grupo glucoronidios altamente hidrofilico, as moléculas são geralmente mais facilmente excretadas na urina. Este mecanismo justifica a eleição de (3a, 5b, 7a) -23-carboxi-7- hidroxi-24-ncrcholan-3-ilo, ácido BD-Glucopyranosiduronic (551 m / z), produto da glucoronidação do ácido quenodesoxicólico, como um biomarcador Chol.

[65] Cistéinil-leucotrienos, tais como o biomarcador leucotrieno C4 (643 m/z), são mediadores de lesão hepática em várias doenças, incluindo Chol. Sob condições normais, esta classe de leucotrienos é predominantemente eliminado por via biliar. No entanto, a acumulação no figado leva a um aumento da permeabilidade vascular que solicita o edema hepático resultante em um aumento do fluxo biliar.

[66] Adicionalmente, a presente invenção réfere-se ao uso do método aqui proposto para diagnóstico precoce de colestase, para ser incorporada em testes de triagem neonatal, uma vez que não existem marcadores específicos e um método diagnóstico único para a doença.

[67] O diagnóstico atual da doença é realizado através de observações clínicas e um conjunto de testes laboratoriais e exames de imagens. Desta forma, o presente método pode ser considerado uma alternativa rápida e eficaz para a triagem de colestase neonatal.

[68] Portanto, uma vez que o diagnóstico precoce da colestase continua a ser uma necessidade médica não atendida e a identificação de sua etiologia permite as intervenções necessárias com maior rapidez, diminuindo a mortalidade associada à condição, a presente invenção propõe um método de obtenção de 7 biomarcadores estatisticamente validados para colestase, que apresentam 95% de especificidade e 85% de sensibilidade quando monitorados em conjunto proporcionando desta forma uma triagem precoce nos 10 primeiros dias de vida, antes mesmo do aparecimento dos sintomas .