La presente invención se refiere a un método para la detección de genes específicos de la bacteria Helicobacter pylori, en muestras fecales, como biomarcadores no invasivos para la identificación de infección por dicha bacteria. El método permite determinar la presencia de material genético (ADN) de la bacteria H. pylori en muestras fecales de sujetos, mediante la técnica nested-qPCR, usando como marcador el gen UreC (Fosfoglucosamina mutasa, secuencia SEQ ID No:9), y además permite genotipificar dicha bacteria, mediante la identificación del gen CagA (Citotoxina asociada al gen A, secuencia SEQ ID No.:10), presente en aquellas cepas bacterianas más agresivas.

Antecedentes del Arte Previo

Actualmente, existen dos tipos de pruebas para detectar infección H. pylori, aquellas de tipo invasivo y aquellas de tipo no invasivo. Las pruebas invasivas incluyen el cultivo, la histología y el test rápido de ureasa (RUT). No obstante, dichas pruebas tienen el inconveniente de requerir una endoscopia para tomar una biopsia gástrica, lo cual implica que el paciente debe acudir a un centro hospitalario para solicitar este examen, que no sólo es costoso, si no que implica molestias para el paciente.

Entre las pruebas no invasivas destacan el test de aire espirado (C13-UBT) y el análisis de antígenos fecales. C13-UBT es un método rápido y simple que detecta la presencia de H. pylori en el aire que espira el paciente, detectando la actividad ureasa del patógeno en la mucosa gástrica. No obstante esta técnica es costosa para el paciente y además requiere de un equipamiento costoso para implementar la técnica, lo cual no es posible en la mayoría de los servicios públicos de salud de muchos países. Además, el uso de drogas antisecretoras (IBO) y/o antibióticos, anterior o concomitante a la prueba, puede afectar los resultados. Las pruebas que detectan antígenos de H. pylori en muestras fecales presentan alta sensibilidad y especificidad, y últimamente los costos se han hecho más accesibles a la población general. Sin embargo, la exactitud de estos métodos disminuye cuando las fecas son acuosas, porque los antígenos de H. pylori, se diluyen. Estos métodos tampoco son recomendados en pacientes con úlcera gástrica, pues el sangrado o microsangrado interfieren con la detección.

Por otro lado, ni el C13-UBT ni la detección de antígenos en heces, permite identificar las cepas más agresivas de H. pylori. En este contexto, el uso de qPC (PCR cuantitativo) para la detección de H. pylori en muestras fecales es una alternativa potente para identificar de forma no invasiva al patógeno y además reconocer aquellas cepas más agresivas, aun en pacientes con úlcera gástrica o muestras fecales acuosas. El problema actual es que cada sujeto que requiere un diagnóstico por infección de H. pylori debe someterse a una endoscopia digestiva. Este examen es invasivo y costoso, por lo que muchos sujetos lo evitan. Y aunque está disponible en los sistemas públicos de salud de muchos países, estos sistemas sostienen una lista de espera para la realización de este examen que puede fácilmente superar los 3 meses.

Por otra parte, entre los documentos de patente específicos que se pueden considerar como compartiendo el mismo objetivo o un objetivo similar a la presente invención, se pueden mencionar:

KR20030031243 presenta un método diagnóstico basado en qPCR para la detección de H. pylori, utilizando los partidores para los genes vacA (citotixina vacuolizante A) y cagA (citotoxina asociada al gen A) de H. pylori. Este documento no menciona el tipo de muestra para el cual está diseñado el protocolo.

US 5928865 describe secuencias nucleotídicas localizadas en la región 5' del gen CagA, y busca proteger a las proteínas que codifica y al uso de estos genes y proteínas para diagnóstico y vacunas. US2008/076127 proporciona un conjunto de partidores oligonucleotidicos para amplificar al menos una secuencia objetivo del gen CagA de Helicobacter pylori, los que se usan en un método para detectar Helicobacter pylori. Como muestra se puede usar saliva, una muestra de biopsia, sangre, tejido de piel, cultivo líquido, fecas u orina. US2003/175746 divulga un método para la detección y/o tipificación de cepas de Helicobacter pylori presente en diversas muestras biológicas, que comprende la amplificación de los genes VacA y CagA con partidores adecuados, y luego la detección específica de estos amplicones mediante hibridación con sondas marcadas. Este método es muy diferente del nuestro, a pesar de que en una primera parte realizan amplificación por PCR. Tampoco determinan la presencia de la bacteria utilizando el gen UreC.

WO2006076010 enseña un ensayo de reacción de cadena polimerasa tipo multiplex para detectar Helicobacter pylori en diferentes muestras. Esta reacción de PCR está diseñada para amplificar simultáneamente un fragmento de DNA de 0.86 kb, el gen Urea A, el gen 16S rRNA, una secuencia de DNA que codifica un antígeno de 26 kDa, y el gen Hpa A. Esta técnica difiere mucho de la nuestra en el diseño metodológico del PCR, además se basa en PCR convencional y no en qPCR.

JP2006075139 enseña un método para detectar Helicobacter pylori mediante PCR, determinando la presencia del gen CagA. Sin embargo, no menciona en que tejido se puede aplicar, y se basa en PCR convencional.

US2011/165576 divulga un kit y método capaz de detectar simultáneamente 4 genes de Helicobacter pylori, uno para identificación, (rRNA16S Hpy), y tres genes de virulencia (CagA, VacAml, DupA). También divulga los partidores para dicho kit.

De acuerdo esto, la presente invención es no invasiva, fácil de implementar en muestras fecales (ventaja sobre otros métodos), económica, está disponible para la población entera. Por otro lado, nuestro método permite detectar aquellas cepas más agresivas, esto último aun no es posible por técnicas de rutina conocidas. Breve Descripción de la Invención

La presente invención se refiere a un método para la detección de genes específicos de la bacteria Helicobacter pylorí, en muestras fecales, los cuales son biomarcadores no invasivos para la detección de una infección por dicha bacteria. El método permite determinar la presencia del material genético (ADN) de la bacteria H. pylorí en muestras fecales de sujetos, mediante la técnica de nested-qPCR, usando como marcadores los genes UreC (Fosfoglucosamina mutasa) y CagA (Citotoxina asociada al gen A). De esta forma, es posible detectar aquellas cepas más agresivas, asociadas al desarrollo de cáncer gástrico (cepas CagA positivas [+]).

Es importante hacer notar que esta técnica, a diferencia de otras similares ya patentadas, es capaz de detectar estos genes en muestras fecales, lo cual la convierte en un método simple y no invasivo para la detección de una infección por H. pylorí. Por otro lado, simultáneamente permite detectar aquellas que son cepas CagA+, asociadas al desarrollo de cáncer gástrico.

Así, La presente invención hace posible detectar fácilmente, y de forma económica, en la población que lo requiera, la presencia de H. pylorí y establecer además si tal infección ocurre o no, por una cepa más o menos agresiva, que pudiese inducir el desarrollo de cáncer gástrico.

Otra ventaja de la presente invención es que como el método no necesita para su correcta aplicación, una persona especializada para la toma de muestra, entonces las muestras pueden ser tomadas en cualquier lugar, para luego ser envidas a un centro de análisis, y así, se traslada la muestra al centro de análisis en lugar de que lo haga el paciente, como ocurre en el caso de las endoscopias.

La tabla 1 muestra en forma comparativa las ventajas de la presente invención por sobre las soluciones ofrecidas por el arte previo. Tabla 1

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1: Ilustra montaje de frascos originales, rotulados y conteniendo la materia fecal. Figuras 2A-2C: Muestra pasos purificación DNA protocolo Kit Mag-Bind Stool DNA ^® (Omega).

Figuras 3A-3D: Muestra la integridad de ADN proveniente de 68 muestras fecales de sujetos de la región, visualizadas en gel de agarosa al 1%.

Figura 4: Muestra el diseño de partidores NCBI, indicando los parámetros específicos para el diseño del gen UreC de H. pylorí, a través del programa PubMed _^ NCBI. Las mismas condiciones se utilizaron para el diseño de los partidores del gen CagA.

Figura 5: Muestra el resultado de la amplificación del gen UreC en 5 muestras fecales positivas (RUT e histología). Además se usó como control DNA de H. pylorí (26695). Figura 6: Curva de Melt para el gen UreC, realizado con 5 muestras positivas para H. Pylori, además de la cepa de referencia 26695. Se observa que todas las muestras amplifican a la misma temperatura de disociación, 78 ^° C (Tm).

Figura 7: A. Gel de agarosa al 2,5% que muestra la amplificación del gen UreC en las muestras 2, 18, 21 y 43, además de DNA de H. pylori (control +), con partidores externos (lado izquierdo) y partidores internos (lado derecho). B. Gráfico de amplificación por qPCR que muestra claramente como amplifica el DNA genómico de H. pylori (control +), utilizando los partidores externos de UreC, mientras aún no se observa la amplificación de las muestras evaluadas. C. Gráfico de amplificación por qPCR, utilizando los partidores internos para UreC, que muestra la amplificación del DNA control (+) y las muestras 2 y 21, que resultaron positivas, mientras que las muestras 18 y 43 resultaron negativas. D. Curva de Melt de la amplificación de DNA control con partidores externos. E. Curva de Melt de las muestras positivas y el control (+),con partidores internos.

Descripción detallada del Invento

La presente invención se refiere a un método para determinar la presencia de material genético (ADN) de la bacteria Helicobacter pylori en muestras fecales de sujetos, mediante la técnica nested-qPCR, usando como marcadores los genes UreC y CagA, y además permite genotipificar dicha bacteria mediante la determinación de la presencia de este último gen. En particular las cepas cagA positivas (+) se asocian al desarrollo de cáncer gástrico.

Para esto, se extrae ADN desde las muestras fecales, utilizando un kit comercial diseñado para este tipo de muestras, Qlamp Stool mini kit (Qjagen), o E.Z.N.A. ^® Stool DNA Kit (Omega Blotek)}. Posteriormente, una vez extraído el material genético, a partir de 100 ng de ADN, se amplifica mediante PCR convencional, y utilizando partidores externos específicos (ver tabla 2, partidores UreC Externos y CagA Externos), una región de 224 y 235 pb para los genes UreC y CagA respectivamente. Posteriormente, 2 μΙ de este producto de PCR se utilizan para una segunda ronda (nested) mediante qPCR utilizando partidores internos (ver tabla 2, partidores Urec Internos y CagA internos), los cuales amplifican una región de 127 y 100 pb respectivamente. En particular, el gen UreC se utiliza solo como marcador para detectar infección, mientras que el gen CagA, se utiliza como marcador para detectar la presencia de una cepa más agresiva de la bacteria, y relacionada con el cáncer gástrico.

Los partidores (ver tabla 2) de la presente invención son pequeñas secuencias de ADN específicas, de 18-25 nucleotidos que reconocen y se unen a una secuencia de ADN blanco, contenida en los genes para los cuales fueron dirigidos, en este caso, los genes UreC y cagA.

Mediante el presente método, en un tiempo de 3 horas aproximadamente, incluyendo el uso de la técnica PCR convencional, más la técnica qPCR (en conjunto, denominado nested qPCR), y utilizando los partidores para UreC, se detecta si el sujeto cuya muestra fecal es analizada, presenta o no, una infección por Helicobacter pylori. En caso de presentar la infección, se hace un segundo ensayo, el que es idéntico al anterior, pero utilizando los partidores para cagA, y se establece si el sujeto es positivo o negativo para la cepa agresiva CagA+.

Ejemplo

Protocolo

1: Extracción de DNA desde materia fecal.

Las muestras fecales fueron obtenidas de sujetos sintomáticos digestivos que se habían realizado endoscopia digestiva alta (EDA).

La recolección de muestras, se realizó durante un período de 3 meses, y con depósitos de muestras de heces (aprox. 5 g), en un tubo ancho de 30 mi, sellado, con tapa rosca, de material desechable, conteniendo 5 mi de un establizador de ácido nucleicos, preferentemente RNA later ^® . (Figura 1) Cada tubo se rotuló debidamente, y se procesaron aproximadamente entre 200-300 mg de materia fecal por caso, con el kit Qlamp Stool mini kit (Qjagen) o el Kit Mag-Bind Stool DNA ^® (Omega), que se usaron conforme a los protocolos de los fabricantes y en condiciones de esterilidad. Brevemente, el procedimiento comienza con la descongelación de la muestra fecal y la transferencia de 200 - 300 mg de esta materia fecal a un tubo de eppendorf, el que se incuba en una solución de lisis que contiene NaCI, EDTA y SDS; se eliminan las proteínas y partículas insolubles, siguen etapas de lavado rápido para eliminar trazas contaminantes, finalmente el ADN purificado es eluído con 50 μΙ de agua libre de nucleasas.

Estos kits proporcionan un método rápido y fácil de aislamiento del ADN genómico de las muestras fecales que contienen alto contenido de ácidos húmicos (Fig. 2).

Cada ADN purificado se cuantifico, midiendo la absorbancia a 260 nm para determinar su concentración, y a 280 nm para medir su pureza, utilizando un espectrofotómetro UV (UV-9200, RAILEIGH). La integridad del ADN purificado se determinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% teñido con Bromuro de etidio (Figura 3). 2. Diseño de Partidores para Nested PCR

Los partidores fueron diseñados en la base de datos del NCBI— BLAST— PRIMERS BLAST en http://www.ncbi. nirn.n.h.gov/ (Figura 4). Se diseñaron partidores para los genes UreC y CagA, un par externo y un par interno para cada uno de ellos (ver tabla 2). Tabla 2: Par de Partidores para Nested PCR.

3. Ensayo de nested-qPCR en muestras fecales

El gen UreC se amplificó a partir del DNA purificado desde las muestras fecales. Como control se usó ADN de la cepa H. pylori 26695 (Helicobacter pylori ATCC 700392, cepa control)

Para ello se realizó nested-qPCR que consiste en los dos siguientes pasos: PCR convencional: 2 μΙ del stock de cada muestra de ADN purificado (100 ng/μΙ) se incubaron en presencia de 5 μΙ de Tampón 5x; 1,5 μΙ MgCb 25mM; 0,5 μΙ dNTPs 10 mM; 1 μΙ de cada partidor (ver tabla 2) (10 μΜ cada uno); 0,75 μΙ Taq pol, en un volumen final de 25 μΙ. La reacción se realizó en un termociclador modelo AXYGEN MAXYGENE GRADIENT, con las siguientes condiciones de ciclado: denaturación a 94°C durante 5 min; seguidos de 25 ciclos divididos en denaturación 94°C, 45 seg; hibridación a 59°C 45 seg.; y extensión a 72°C, 45 seg. Posteriormente se realizó una extensión de 10 min a 72 °C .

A partir de este amplicón (producto PCR) se realiza qPCR.

Real-Time PCR (qPCR): Las amplificaciones de las muestras fueron por duplicado y en cada ensayo se colocó un control positivo de H. pylori y un control negativo (agua libre de nucleasas), para evaluar la calidad del ensayo. Se adicionaron 2 μΙ de una dilución 1/10 del producto de PCR anterior, y se incubó en presencia de 5 μΙ de SYBR Green kit 2x (este reactivo contiene: Tampón 2x, 2,5 mM MgCI ₂ ; 0,4 mM dNTPs y 0,2 U de Taq polimerasa), y 0,1 μΜ de cada partidor específico (ver tabla 2, partidores internos) (lOMm), en un volumen final de 10 μΙ. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: denaturación inicial, 95°C, 5 min, seguido de 40 ciclos de PCR con denaturación a 95°C, 10 seg y extensión a 60°C, 30 seg. Los resultados fueron visualizados mediante el programa EcoTM Real-Time PCR System Ilumina ^® .

Los resultados se compararon con los resultados obtenidos mediante pruebas de referencia, RUT e Histología, en los sujetos evaluados.

Análisis de los datos

Los datos fueron analizados directamente desde el Software Eco v4.1 PCR System y con el programa XLSTAT Versión 2.06, calculando sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo del test de PCR para detectar infección de sujetos sintomáticos digestivos en las muestras fecales. La significancia estadística fue establecida con la prueba de X ² (p= 0,05). Resultados

La amplificación del ADN de H. pylori en las muestras fecales y en el DNA control, comenzó en todas las muestras luego del ciclo 20 de qPCR. Todas las muestras que presentaron un máximo en la curva de "melt" a 78°C fueron consideradas como positivas, mientras que la ausencia de un máximo a esa temperatura, o la aparición de una curva a otra temperatura, se consideraba negativa. El control positivo amplificó en cada uno de los ensayos y el control negativo no pasó la línea umbral, es decir, no tuvo amplificación alguna en los gráficos, lo cual validó los resultados (figuras 5 y 6).

Todos los resultados fueron tabulados y comparados con el test rápido de ureasa (RUT) y la histología (Tabla 3). Los resultados de cada test se muestran en las tablas 4, 5 y 6.

De acuerdo a esto, se aprecia que el mejor test para detectar la presencia de H. pylori, es el método nested-qPCR, con una sensibilidad del 100% (Tabla 7).

Tabla 3: 60 muestras fecales codificadas de sujetos con sintomatología digestiva.

Tabla 4. Resultados de RUT

Tabla 7. Tabla comparativa de los métodos RUT, Histología y Nested qPCR para la detección de H. pylori.