Die antimikrobielle Ausrüstung von Oberflächen und das Aufbringen von antimikrobiel- len Wirkstoffen auf verschiedene Substrate („Depositioning") sind für unterschiedliche technische Anwendungen von großer praktischer Bedeutung. In der Medizintechnik und in vielen Bereichen der häuslichen und Klinikums-Hygiene spielt die dauerhafte Vermeidung einer Bakterien-Besiedlung eine entscheidende Rolle.

Ein Ziel bei der Aufbringung antimikrobieller Wrkstoffen ist es, einen oder mehrere Wrkstoffe, die die Vermehrungsfähigkeit und/oder die Infektiosität von Mikroorganis- men reduzieren, so auf der Oberfläche von Substraten bzw. Gegenständen zu immobilisieren, dass die Wirkstoffe während der Anwendung nicht unkontrolliert von der Oberfläche herunter gewaschen werden und somit der Schutz verloren geht. Da verschiedene Oberflächen ganz unterschiedlich behandelt werden, beispielsweise gewaschen werden oder der Witterung ausgesetzt sind, werden verschiedene Immobilisierungs- Techniken angewandt. Diese Verfahren bewirken oftmals auch eine Inaktivierung der antimikrobiellen Wrkstoffe oder sie binden die antimikrobiellen Wrkstoffe nicht fest genug an die Oberflächen, so dass die Wrkstoffe zu schnell ausgewaschen werden und die Oberflächen ihre antimikrobiellen Eigenschaften verlieren. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein möglichst einfaches Verfahren zur Immobilisierung eines oder mehrerer antimikrobieller Wrkstoffe zu entwickeln, das für unterschiedliche Wirkstoffe und verschiedene Oberflächen anwendbar ist. Das Verfahren unter Einsatz des Cystein-reichen Proteins Hydrophobin soll auch nicht zur Inaktivierung der antimikrobiellen Wirkung führen. Insbesondere kationische antimikrobielle Wirkstoffe (z. B. das Antiseptikum Polyhexamethylenbiguanid) haben eine sehr gute antimikrobielle Wirkung und kommen in vielen Anwendungsbereichen zum Einsatz. Ein Verfahren zur Immobilisierung auf Oberflächen ist daher für die Stoffklasse der kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe besonders von Interesse. Bereits 2006 wurde die Adsorption des antimikrobiellen Wirkstoffs Polyhexamethylenbiguanid an Cellulose-Substraten beschrieben. Der Wirkstoff wird auf hydrophilen, anionischen Oberflächen aufgebracht (siehe R. Blackburn et al., Langmuir 2006, 22, 5636-5644, „Sorption of Poly-(hexamethylenebiguanide) on Cellulose"). Die Bindung des Wrkstoffs erfolgt dabei über Wasserstoffbrücken und ionische Wechselwirkungen. Die kovalente Immobilisierung von kationischen, antimikrobiellen Wirkstoffen wie z. B. antimikrobiellen Peptiden setzt Modelloberflächen mit funktionellen Gruppen oder das Einführen funktioneller Gruppen auf inerten Polymer-Oberflächen (wie z.B. Silikon und PVC) voraus (siehe S. Haynie et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 02- 1995, 301-307; V. Humblot et al., Biomaterials 30, 2009, 3503-3512).

Weiterhin müssen die funktionellen Gruppen oder die zu immobilisierenden antimikrobiellen Wrkstoffe aktiviert werden, um kovalente Bindungen zu knüpfen. Das Einführen funktioneller Gruppen und die Aktivierung sind jedoch zusätzliche Schritte, die mit technischem Aufwand und Kosten verbunden sind. Weiterhin wird die Wrkung der antimikrobiellen Wrkstoffe durch die kovalente Immobilisierung deutlich reduziert, so dass die so ausgerüsteten Oberflächen nicht dauerhaft in der Lage sind, die Kolonisierung durch Bakterien effektiv zu verhindern (siehe V. Humblot 2009; Bagheri et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 03-2009, 1 132-1141).

Eine technische Alternative zur kovalenten Immobilisierung von kationischen Wirkstoffen ist die Adsorption mit Hilfe von Polyelektrolyt-Schichten. Dabei kann der kationische Wrkstoff selbst ein Polyelektrolyt sein (siehe US2007/0243237) oder der kationische Wrkstoff kann in eine Polyelektrolytschicht eingebettet werden (siehe US2009/0258045).

In US2007/0243237 wird ein Verfahren zur Aufbringung einer anti-mikrobiellen Be- schichtung beschrieben, bei dem eine negativ geladene Poly-Elektrolyt-Komponente sowie eine positiv geladene Poly-Elektrolyt-Komponente als Film auf ein Substrat auf- getragen werden, wobei mindestens eine der Komponenten eine anti-mikrobielle Aktivität aufweist. Beispielsweise kann eine bekannte biozide Komponente kovalent an ein geladenes Polymer gebunden werden. In US 2009/0258045 wird eine beschichtete Struktur beschrieben, die zum einen mit einem geladenen, anti-mikrobiellen Peptid und zum anderen mit einer Poly-Elektrolyt-Komponente beschichtet ist. Durch eine zweila- gige Beschichtung kann eine Konservierung des Substrats erreicht werden. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass auf eine Aktivierung, die zum Schließen einer kovalenten Bindung notwendig ist, verzichtet werden kann. Allerdings ist es im Fall von inerten Polymer-Oberflächen (wie z.B. Silikon und PVC) vor der Adsorption der ersten Polyelektrolyt-Schicht oftmals notwendig, anionische Ladungen auf die zu beschich- tende Oberfläche aufzubringen (siehe US 2002/0146385). Ein Ziel dieser Behandlung ist eine bessere Adhäsion der Polyelektrolyte. Weiterhin ist es oftmals nötig, mehrere Schichten aus anionischen und kationischen Polyelektrolyten auf die zu behandelnde Oberfläche aufzutragen (siehe US 2007/0243237). Alle diese zusätzlichen Schritte sind mit hohem Aufwand und Kosten verbunden. Weitere Probleme des Standes der Technik sind die Inaktivierung der kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe durch Ladungskompensation mit anionischen Polyelektrolyten und ungünstige Release-Kinetiken (siehe O. Etienne et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 10-2004, 3662-3669). Beide führen oftmals zu einer verminderten oder verkürzten antimikrobiellen Wirkung (siehe auch US 2009/0258045).

Auch die Immobilisierung von Wirkstoffen durch Proteine wie Hydrophobin ist per se bekannt, so beschreibt WO 2004/000880 die Bindung von Enzymen auf mit Hydrophobin behandelten Oberflächen. Hydrophobine sind bekannt als kleine, Cystein- reiche Proteine, welche z. B. in filamentösen Pilzen wie Schizophyllum commune vorkommen. Natürlich vorkommende Hydrophobine weisen oft etwa 100 bis 150 Aminosäuren auf. Sie weisen in aller Regel acht Cystein-Einheiten im Molekül auf. Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, sie können aber auch mittels gentechnischer Verfahren gewonnen werden, wie beispielsweise in WO 2006/082251 oder WO 2006/131564 offenbart.

Die oberflächenaktive und die emulgierende Wrkung von Hydrophobinen sowie verschiedene Anwendungen für Hydrophobine wurden beschrieben. WO 1996/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdickungsmittel, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-ÖI-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kos- metische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen. WO 2006/082253 offenbart Formulierungen zur Be- schichtung von Oberflächen, z. B. von feinteiligen anorganischen oder organischen Partikeln, mit Hydrophobinen. Dazu werden die wässrigen Hydrophobin-Lösungen auf die zu beschichtende Oberfläche aufgebracht.

WO 2006/103215 offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur schmutzabweisenden Behandlung von harten Oberflächen, wie beispielsweise Fußböden. WO 2006/103230 offenbart die Verwendung von wässrigen Formulierungen von Hydrophobinen zur Oberflächenbehandlung von gehärteten mineralischen Baustoffen.

In WO 2004/000880 wird die nicht-kovalente Bindung von Antikörpern, Enzymen, Peptiden, Lipiden, Nukleinsäuren und Kohlenhydraten an mit Hydrophobin behandelten Oberflächen beschrieben. US 7393448 beschreibt das nicht-kovalente Einschließen von Substanzen, die selbst kleiner sind als das Protein Hydrophobin, in ein Hydrophobin-Coating auf einer Sensoroberfläche.

WO 2000/40968 beschreibt ein Verfahren für die Herstellung von Immuno- absorbierenden Materialien unter Anbindung von Antikörpern an eine Oberfläche durch Verwendung von Hydrophobin. Unter dem Begriff „Hydrophobine" (H) im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden insbesondere Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)

X _n -C ¹ -Xi -5o-C ² -Xo-5 ^_ C ³ -Xi -1 oo"C -Xi -1 oo"C ⁵ -Xi -5o-C ⁶ -Xo-5-C ⁷ -Xi -5o-C ⁸ -X _m (I) verstanden werden, wobei jedes X unabhängig für eine Aminosäuresequenz bestehend aus Aminosäuren ausgewählt aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gin, Arg, lle Met, Thr, Asn, Lys, Val, Ala, Asp, Glu, Gly) stehen kann. Dabei können die Reste X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden nummerischen Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren in der jeweiligen Aminosäuresequenz (Teilsequenz) X dar, und jeder Aminosäure-Rest in jedem X kann unabhängig gleich oder verschieden sein zu den benachbarten Resten. C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300 und geben die Anzahl von Aminosäure-Resten enthaltend in der jeweiligen Aminosäuresequenz X an.

Die Polypeptide gemäß der Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakteri- siert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergrößerung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche. Die mit C ¹ bis C ⁸ benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine. Sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C ¹ bis C ⁸ aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken.

Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.

Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der ein- zelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.

Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)

Xn-C ¹ -X ₃ -25-C ² -Xo-2-C ³ -X5-50-C -X2-35-C ⁵ -X2-15"C ⁶ -Xo-2-C ⁷ -X ₃ -35-C ⁸ -X _m (II) zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 350, bevorzugt 15 bis 300 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindes- tens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein. Bevorzugt werden auch Hydrophobine der allgemeinen Formel (III)

X _n -C ¹ -X5-9-C ² -C ³ -Xn-39-C -X2-23-C ⁵ -X5-9-C ⁶ -C ⁷ -X6-i8-C ⁸ -X _m (III) eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein. Bei den Resten X _n und X _m kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder bei beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste X _n und/oder X _m zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptidsequenz verlängert ist.

Falls es sich bei X _n und/oder X _m um natürlicherweise nicht mit Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren lang. Es kann sich beispielsweise um Sequenzen aus 20 bis 500, bevorzugt 30 bis 400 und besonders bevorzugt 35 bis 100 Aminosäuren handeln. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden.

Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.

Fusions-Hydrophobine aus Fusionspartner und Hydrophobinteil sind beispielsweise in WO 2006/082251 , WO 2006/082253 und WO 2006/131564 beschrieben. Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es kann nur ein einziger Fusionspartner mit dem Hydrophobinteil verknüpft sein, oder es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (X _n ) und am Carboxyterminus (X _m ) des Hydrophobinteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (X _n oder X _m ) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden. Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in Escherischia coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 16 in WO 2006/082251), yaae (SEQ ID NO: 18 in WO 2006/082251), Ubiquitin und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren, bzw. Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht. Die Zuordnung der Se- quenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenz und die entsprechenden Sequenzprotokolle findet sich in der Anmeldung WO 2006/103225 (S. 13 der Beschreibung und Sequenzprotokoll) und in der vorliegenden Anmeldung.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem genannten Fusionspartner als eine der Gruppen X _n oder X _m oder als terminaler Bestandteil einer solchen Gruppe noch eine so genannte Affinitätsdomäne (affinity tag / affinity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen wechselwirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His) _k -, (Arg) _k -, (Asp) _k -, (Phe) _k - oder (Cys) _k - Gruppen, wobei k im allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His) _k -Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht. Hierbei kann die Gruppe X _n und/oder X _m ausschließlich aus einer derartigen Affinitätsdomäne bestehen oder aber ein natürlicherweise oder nicht natürlicherweise mit einem Hydrophobin ver- knüpfter Rest X _n bzw. X _m wird um eine terminal angeordnete Affinitätsdomäne verlängert. Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielsweise mit Glutardialdehyd.

Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine bzw. deren Deriva- ten ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem speziellen Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird. Die Durchfüh- rung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μΙ und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche. Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl , basf2. Diese Hydrophobine inklusive ihrer Sequenzen sind beispielsweise in WO 2006/082251 und im folgenden Sequenzprotokoll offenbart. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgend angegebenen Sequenzen auf die in WO 2006/082251 offenbarten Sequenzen. Eine Übersichtstabelle mit den SEQ-ID-Nummern befindet sich in WO 2006/082251 auf Seite 20. Erfindungsgemäß insbesondere geeignet sind die Fusionsproteine yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen (SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21 , SEQ ID NO 23), insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Hydrophobin yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19 / SEQ ID NO: 20) eingesetzt.

Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ I D NO. 20, 22 oder 24 dargestell- ten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deletion von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt e, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden. Besonders zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad- Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Derivate. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden.

Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis 150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren ein- gesetzt werden. Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner bzw. den Fusionspartnern kann dazu genutzt werden, den Fusionspartner abzuspalten und das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).

Bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung das Protein yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897) eingesetzt, welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von hydrophoben Oberflächen verwendeten Hydrophobine lassen sich chemisch durch be- kannte Verfahren der Peptidsynthese, wie beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen. Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J. Cell. Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 1996/41882 verwiesen. Ein gentechnisches Herstellverfahren für Hydrophobine ohne Fusionspartner aus Talaromyces thermophilus ist in US 2006/0040349 beschrieben.

Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäuresequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren beispielsweise ist von WO 2006/082251 oder WO 2006/082253 offenbart. Die Fusionspartner erleichtern die Herstellung der Hydrophobine erheblich. Fusions- Hydrophobine werden bei den gentechnischen Verfahren mit deutlich besseren Aus- beuten produziert als Hydrophobine ohne Fusionspartner. Die nach dem gentechnischen Verfahren von den Wrtsorganismen produzierten Fusions-Hydrophobine können in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgearbeitet und mittels bekannter chromatographischer Methoden gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das in WO 2006/082253, Seiten 1 1/12 offenbarte, vereinfachte Aufarbei- tungs- und Reinigungsverfahren eingesetzt werden. Hierzu werden die fermentierten Zellen zunächst aus der Fermetationsbrühe abgetrennt, aufgeschlossen und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bodies) getrennt.

Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Ein- schlusskörper, beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergentien in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions-Hydrophobine freizusetzen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion- Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0, 1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden.

Die erhaltenen Lösungen können - ggf. nach Einstellen des gewünschten pH-Wertes - ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden. Die Fusions-Hydrophobine können aus den Lösungen aber auch als Feststoff isoliert werden. Bevorzugt kann die Isolierung mittels Sprühgranulieren oder Sprühtrocknen erfolgen, wie in WO 2006/082253, Seite 12 beschrieben wird. Die nach dem vereinfachten Auf- arbeitungs- und Reinigungsverfahren erhaltenen Produkte umfassen neben Resten von Zelltrümmern in der Regel ca. 80 bis 90 Gew.-% Proteine. Die Menge an Fusions- Hydrophobinen beträgt je nach Fusionskonstrukt und Fermentationsbedingungen in der Regel 30 bis 80 Gew.-% bezüglich der Menge aller Proteine. Die isolierten, Fusi- ons-Hydrophobine enthaltenden Produkte können als Feststoffe gelagert werden und zum Einsatz in den jeweils gewünschten Medien gelöst werden.

Die Fusions-Hydrophobine können als solche oder auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als„reine" Hydrophobine zur Ausführung dieser Erfindung verwendet werden. Eine Spaltung nimmt man vorteilhaft nach der Isolierung der Einschlusskörper und deren Auflösung vor. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem eingesetzten Hydrophobin um mindestens ein Fusi- ons-Hydrophobin mit einer Polypeptidsequenz ausgewählt aus der Gruppe von yaad- Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa- basf1-his (SEQ ID NO: 24) und yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897). Insbesondere bevorzugt ist der Einsatz eines Fusions-Hydrophobins mit einem verkürzten Fusionspartner wie Protein yaad40-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 26 in WO 2007/014897), welches einen auf 40 Aminosäuren verkürzten yaad-Rest aufweist. Verschiedene Arten von antimikrobiellen Substanzen, die auf Oberflächen von Substraten aufgebracht werden, sind seit Jahrzehnten bekannt. Kationische antimikrobielle Wrkstoffe werden ebenfalls seit langem in Desinfektionsmitteln eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung eines oder mehre- rer antimikrobieller Wirkstoffe auf der Oberfläche eines Substrats umfassend die Be- handlung der Oberfläche mit mindestens einem Hydrophobin (H) sowie mindestens einem kationischen antimikrobiellen Wirkstoff (W).

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Immobilisierung ei- nes oder mehrerer antimikrobieller Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem als kationischer antimikrobieller Wirkstoff (W) eine höhermolekulare, kationische Verbindung eingesetzt wird, beispielsweise eine poly-kationische Substanz. Dies kann z. B. eine Verbindung sein, die z.B. mehr als 3, insbesondere mehr als 5 und häufig mehr als 10 kationische Gruppen enthält.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem als kationischer antimikrobieller Wirkstoff (W) eine niedermolekulare, kationische Verbindung eingesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem als kationischer antimikrobieller Wirkstoff (W) eine höhermolekulare quaternäre Ammonium- Verbindung, eine höhermolekulare Polyiminocarbonyl-Verbindung oder ein höher- molekulares Polyethylenimin-Peptid-Konjugat eingesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung von antimikrobiellen Wrkstoffen auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem eine höhermolekulare kationische Verbindung und eine niedermolekulare kationische Ver- bindung zusammen eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem als Hydrophobin (H) ein Fusionsprotein eingesetzt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein oben beschriebenes Verfahren zur Immobilisierung, umfassend die Behandlung der Oberfläche mit mindestens einer Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Hydrophobin (H) und/oder mindestens einen kationischen antimikrobiellen Wirkstoff (W).

Die vorliegende Erfindung betrifft zum einen Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei denen das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Benetzen der Oberfläche des Substrats mit einer Zusammensetzung (Z1), enthaltend die folgenden Komponenten: (i) mindestens ein Lösemittel (L1),

wobei das Lösemittel (L1) mindestens 60 Gew. % Wasser enthält,

(ü) mindestens ein Hydrophobin (H),

(iii) gegebenenfalls ein oder mehrere Additive (A), b) Aufbringen einer antimikrobiellen Zusammensetzung (Z2),

enthaltend die folgenden Komponenten:

(i) mindestens ein Lösemittel (L2),

(ü) mindestens einen kationischen antimikrobiellen Wirkstoff (W),

(iii) gegebenenfalls eine oder mehrere Hilfskomponenten (HK).

Die vorliegende Erfindung betrifft zum anderen Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei denen das Verfahren als einen Schritt das Benetzen der Oberfläche des Substrats mit einer Zusammensetzung (Z3) umfasst, enthaltend die folgenden Komponenten:

(i) mindestens ein Lösemittel (L1),

wobei das Lösemittel mindestens 60 Gew. % Wasser enthält,

(ü) mindestens ein Hydrophobin (H),

(iü) mindestens einen kationischen antimikrobiellen Wrkstoff (W),

(iv) ggf. ein oder mehrere Additive (A) und/oder Hilfskomponenten (HK). Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem die Konzentration der Hydrophobin-Komponente (H) in der Zusammensetzung (insbesondere in einer der Zusammensetzungen (Z1) und/oder (Z3)) 0,05 bis 5.000 ppm beträgt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem die Konzentration des kationischen antimikrobiellen Wirkstoffs (W) in der Zusammensetzung (insbesondere in den Zusammensetzungen (Z2) und/oder (Z3)) 0,05 Gew.-% bis 20 Gew.-% beträgt. Die Konzentration des kationischen antimikrobiellen Wirkstoffs (W) in der Zu- sammensetzung hängt dabei unter anderem von der Art des Wirkstoffs (bzw. der Kombination von Wrkstoffen) und der Art der zu behandelnden Oberfläche ab. Häufig reichen auch 0,05 Gew.-% bis 10 Gew.-% des kationischen antimikrobiellen Wirkstoffs

(W).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem die Konzentration der Additive (A) in der Zusammensetzung (insbesondere in einer der Zusammensetzungen (Z1) und/oder (Z3)) 0,01 Gew.-% bis 3 Gew.-% beträgt und die Konzentration der Hilfskomponenten (HK) in der Zusammensetzung 0,01 Gew.-% bis 3 Gew.-% beträgt. Die Konzentration der Hilfskomponente (HK) in der Zusammensetzung hängt dabei unter anderem von der Art des Wirkstoffs (bzw. der Kombination von Wirkstoffen), der Art der Hilfskomponente und der Art der zu behandelnden Oberfläche ab.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Immobilisierung eines anti- mikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, bei dem es sich bei der Oberfläche um eine hydrophobe Oberfläche aus Silikon oder einem polymeren bzw. copolymeren Kunststoff aus der Gruppe Polyethylen PE, Polypropylen PP, Polyvinylchlorid PVC, Polyethylenterephthalat PET, Polyurethan PUR, Linoleum und Gummi handelt. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zusammensetzung zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, enthaltend (bzw. bestehend aus) folgenden Komponenten:

80 bis 99,95 Gew.% an Lösemittel (L),

0,05 bis 20 Gew.% mindestens eines kationischen antimikrobiellen Wirkstoffs (W)

0,05 bis 5.000 ppm mindestens eines Hydrophobins (H),

gegebenenfalls 0,01 bis 3 Gew.% eines oder mehrerer Additive (A),

gegebenenfalls 0,01 bis 3 Gew.-% einer oder mehrerer Hilfskomponenten (HK). wobei die Summe aller Komponenten gerade 100 Gew.-% ergibt.

Gegenstand ist auch eine Zusammensetzung zur Immobilisierung eines antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche eines Substrats, enthaltend (bzw. bestehend aus) folgenden Komponenten: 80 bis 99,95 Gew.% an Lösemittel (L), wobei das Lösemittel

mindestens 60 Gew. % Wasser enthält,

0,05 bis 20 Gew.% eines kationischen antimikrobiellen Wirkstoffs (W)

0,05 bis 5.000 ppm mindestens eines Hydrophobins (H),

gegebenenfalls 0,01 bis 3 Gew.% eines oder mehrerer Additive (A),

gegebenenfalls 0,01 bis 3 Gew.-% einer oder mehrerer Hilfskomponenten (HK), wobei die Summe aller Komponenten gerade 100 Gew.-% ergibt,

und wobei das Gewichtsverhältnis von kationischem antimikrobiellen Wrkstoff (W) zu Hydrophobin (H) von 1000: 1 bis 10: 1 beträgt, und wobei es sich bei dem antimikrobiellen Wirkstoff (W) um einen polykationischen Wirkstoff handelt. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend mindestens ein Hydrophobin (H) und mindestens einen kationischen antimikrobiellen Wirkstoff (W) zur Immobilisierung des antimikrobiellen Wrkstoffs auf der Oberfläche des Substrats. Die Verwendung einer Zusammensetzung ist auch von Interesse, wobei die Zusammensetzung ein Fusions-Hydrophobin (H) und mindestens einen polykationischen antimikrobiellen Wirkstoff (W) enthält, zur Immobilisierung des polykationischen antimikrobiellen Wirkstoffs auf der Oberfläche des Kunststoff- Substrats. Typische Beispiele für kationische antimikrobielle Wrkstoffe (W) im Sinne der vorliegenden Erfindung sind:

Kationische Tenside, quarternäre Ammoniumverbindungen, Ampho-Tenside, Alkylamine und Aminderivate, kationische Polymere, antimikrobielle Peptide und Proteine, Peptido-Mimetika und quarternäre Phosphonium-Verbindungen.

Die kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe (W) können dabei niedermolekular (Molmasse kleiner 1000 g/mol) sein (wie z. B. Benzalkoniumchlorid (284g/mol) oder Cetyltrimethylammoniumbromid (364 g/mol)).

Weitere Beispiele für die kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe (W) sind:

A) Quaternäre Ammoniumverbindungen,

Benzyl-C12-18- alkyldimethyl- ammoniumchlorid,

Benzyl-C12-16-alkyldimethyl-ammonium-chlorid

Di-C8-10-alkyldimethyl-ammoniumchlorid

C12-14- Alkyl[(ethylphenyl)methyl]dimethyl-ammoniumchlorid und entsprechende Ammoniumverbindungen mit:

(Benzylalkyldimethyl (Alkyl aus C8- C22, gesättigt und ungesättigt, und

Talgalkyl, Kokosalkyl und Soyaalkyl) Chloride, Bromide oder Hydroxide)

(Dialkyldimethyl (Alkyl aus C6-C18, gesättigt und ungesättigt, und Talgalkyl,

Kokosalkyl und Soyaalkyl) Chloride, Bromide oder Methylsulphate)

(Alkyltrimethyl (Alkyl aus C8-C18, gesättigt und ungesättigt, und Talgalkyl, Kokosalkyl und Soyaalkyl) Chloride, Bromide oder Methylsulphate)

Benzalkonium Chloride (Alkyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid) Alkyl-didecyl-polyoxethyl-ammoniumpropionat,

Alkyl-dimethyl-Verbindungen alkylbenzyl-ammoniumchlorid,

Alkyl-dimethyl-ethyl-ammoniumchlorid,

Alkyl-didecyl-polyoxethyl-ammoniumpropionat

Alkyl-dimethyl-alkylbenzyl-ammoniumchlorid

Alkyl-dimethyl-ethyl-ammoniumchlorid

Alkyl-dimethyl-ethylbenzyl-ammoniumchlorid

Benzalkoniumpropionat

Cocos-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid

Cocos-dimethylbenzyl-ammoniumchlorid,

Lauryl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid

Myristyldimethyl-benzyl-ammoniumchlorid

Benzethoniumchlorid

Benzyl-di-hydroxyethyl-cocosalkyl-ammoniumchlorid

Cocosdimethyl-benzyl-ammoniumchlorid

Dialkyl-dimethyl-ammoniumchlorid

Didecylmethyloxyethylammoniumpropionat

Mecetroniumethylsulfat

Methylbenzethoniumchlorid

n-Octyl-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid

Undecylamidopropyltrimoniummethosulfat

Oleyltrimethylammoniumchlorid

Dioctyldimethylammoniumchlorid

Didecyldimethylammoniumchlorid

Dicocodimethylammoniumchlorid

Cocosbenzyldimethylammoniumchlorid

Cocosalkylbenzyldimethylammoniumchlorid.

B) Amphotenside

wie beispielsweise

Alkyloligoamincarbonsäure

Cocamidopropyl Betain

Alkyl Dimethyl Betain

Cocoamidopropyl Hydroxysultain

Dipalmitoyllecithin

Alkylbetaine

Talgamphopolycarboxyglycinat

Cocosamphopolycarboxyglycinat

Cocosfettiminopropionat

Octyliminodipropionat Cocoiminoglycinate

C) Alkylamine und Aminderivate

wie beispielsweise

Bis(3-aminopropyl)dodecylamin

n-Cocospropylendiammoniumborat

Dodecylaminsulfamat

η-3-Dodecylaminopropylglycin

n-Dodecyl-n-(3-aminopropyl)1 ,3-propandiamin

Glucoprotamin

Cocospropylendiamin

Cocosaminacetat.

D) Polymere kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe

wie beispielsweise

Dodecyldipropylentriamin

Polylysin

Chitosan

Polyhexamethylenbiguanid

Polyethylenimin

polymere, quarternäre Ammoniumverbindungen

polymere Guanide

polymere Biguanide

Polynorbornene

Arylamide Oligomere

Phenylen Ethynylene

Kenawy et al., 2007 (The Chemistry and Applications of Antimicrobial Polymers: A

State-of-the-Art Review) und darin zitierte Literatur

Polymethacrylate

polymere, quarternäre Pyridiniumverbindungen

Acyl-Lysin Oligomere

N-alkylierte Polyethylenimine

Konjugate aus Polyethylenimin und antimikrobiellen Peptiden.

E) Antimikrobielle Peptide und Proteine

wie beispielsweise Peptide aus der Datenbak "The Antimicrobial Peptide Database"

(http://aps.unmc.edu/AP/main.php), z.B.

antimikrobielles Peptid P18

Protamin

Lysozym. F) Peptidomimetika

wie beispielsweise

Aminosterole

Amphiphile, kationisch-hydrophobe Verbindungen.

G) Quarternäre Phosphoniumverbindungen

wie beispielsweise

Trihexyl(tetradecyl)phosphonium bromid

Trihexyl(tetradecyl)phosponium decanoat

Tetradecyl(trihexyl)phosphonium bis-(2,4,4-trimethylpentyl)phosphinat

Tetradecyl(trihexy) phosphonium dicyanamid

Triisobutyl(methyl) phosphonium tosylat

Tributyl(methyl)phosphonium methylsulfat

Tetradecyl(trihexyl) phosphonium bistriflamid

Tetradecyl(trihexyl) phosphonium hexafluorophosphat

Tetradecyl(trihexyl) phosphonium tetrafluoroborat

Hexadecyl(tributyl) phosphonium bromid

Tetrabutylphosphonium bromid

Tetrabutylphosphonium Chlorid

Tetra-n-octylphosphonium bromid

Tetradecyl(tributyl) phosphonium Chlorid

Ethyl(tributyl)phosphonium diethylphosphat

Tetradecyl(tributyl)phosphonium dodecylbenzenesulfonat

Tetradecyl(trihexyl)phosphonium dodecylbenzenesulfonat

Tetrabutylphosphonium acetat

tetrabutylphosphonium bromid

Tetrabutylphosphonium Chlorid

Tetra-n-octylphosphonium bromid

Tetradecyl(tributyl)phosphonium Chlorid

Tetradecyl(trihexyl)phosphonium Chlorid

Octadecyl(trioctyl)phosphonium iodid.

Die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe (W) sind häufig auch höhermolekular (Molmasse größer 1000 g/mol) oder hochmolekular, was die langfristige Immobilisierung an der Oberfläche noch verbessern kann.

Beispiele für kationische antimikrobielle Wrkstoffe (W) sind insbesondere quaternären Ammoniumverbindungen (so genannte„Quats"), die z. B. für die antibakterielle Ausrüstung von Textilien in der Literatur beschrieben sind. Substanzen dieser Klasse decken oftmals ein breites Keimspektrum mit hervorragender Wirkung ab. So wird in Karl Heinz Wallhäusser, Praxis der Sterilisation Desinfektion - Konservierung, 5. Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York 1995, Seite 586 ff. diese Substanzklasse im Detail beschrieben. Es ist bekannt, dass quaternäre Ammoniumverbindun- gen insbesondere dann bakterizid wirken, wenn mindestens einer der vier Substituenten am quaternären Stickstoff eine Kettenlänge von 8 bis 18 C-Atomen aufweisst, vorzugsweise von 12 bis 16 C-Atomen. Die anderen Substituenten können z. B. gerade oder verzweigte Alkylreste sein oder Reste mit Heteroatomen oder Reste mit Aroma- ten. Häufig sind auch ein oder mehrere Benzylreste an den quaternären Stickstoff im Molekül gebunden. Auch quaternäre Ammoniumverbindungen mit zwei Methylgruppen, einer n-Alkylgruppe mit zwischen 10 bis 18 C-Atomen und einer 3- Trimethoxysilylpropylgruppe können eingesetzt werden.

Quaternäre Ammoniumverbindungen haben jedoch häufig die Eigenschaft, dass sie in Wasser gut löslich sind. Diese Eigenschaft kommt der wässrigen Applikation im industriellen Ausrüstungsprozess entgegen. Gleichzeitig führ diese Eigenschaft aber dazu, dass solche Verbindungen schnell von den Substraten herunter gewaschen werden, da die Haftung an der Oberfläche primär mittels Van-der-Waals-Kräften und ggf. lonen- paarbindungen möglich ist. Um die Beständigkeit auf Oberflächen zu verbessern, kön- nen die Vorstufen der Quats, nämlich tertiäre Amine auch beispielsweise mit 3- Chlorpropyltrimethoxysilan quaternisiert werden. Es gibt z. B. Handelsprodukte mit einer Trimethoxysilylpropylgruppe am quarternären Stickstoff, wobei die Produkte aus der Umsetzung mit Didecylmethylamin beziehungsweise mit Tetradecyldimethylamin beziehungsweise aus der Umsetzung mit Octadecyldimethylamin erhalten werden können. Die Quarternisierung von Aminen wird z. B. in DE-A 199 28 127 beschrieben.

Weiterere höhermolekulare kationische antimikrobielle Wirkstoff (W) sind auch Polyiminocarbonyl-Verbindungen, wie z. B. die bekannte Substanz Polyhexamethylen- biguanid, die durch folgende Formel beschrieben werden kann:

( - NH - C(=NH) - NH - C(=NH) - NH - (CH ₂ ) ₆ -)n

Bevorzugt sind die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe (W) polykationische Verbindungen, die über mehrere (z. B. mehr als 5, häufig mehr als 10) positiv geladene Gruppen tragen.

Die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe (W) können z. B. auch Konjugate aus Polyethyleniminen mit Peptiden sein. Die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe (W) töten Bakterien bzw. verhindern deren Vermehrung, indem sie mit der negativ geladenen Membran und/oder der negativ geladenen Zellwand der Bakterien interagieren und dabei lebenswichtige Prozesse (wie den Erhalt des Membran-Gradienten) stören. Für die Interaktion mit den negativ gela- denen Zellkomponenten ist die kationische Ladung der antimikrobiellen Wirkstoffe essentiell.

Neben den negativ geladenen Zellkomponenten können kationische antimikrobielle Wrkstoffe auch über elektrostatische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an hydrophile, anionische Oberflächen wie Cellulose oder anionische Polyelektrolyte binden. Allerdings bewirkt die Bindung über elektrostatische Wechselwirkung eine Inaktivierung der antimikrobiellen Wirkung, da die kationischen Ladungen der antimikrobiellen Wirkstoffe nun nicht mehr für die Interaktion mit den anionischen Zellkomponenten der Bakterien zur Verfügung stehen.

Verschiedene Organismen wie Bakterien und Pilze sind unterschiedlich empfindlich gegenüber unterschiedlichen kationischen antimikrobiellen Wrkstoffen. Um einen unempfindlichen Organismus zu inhibieren, wird eine größere Menge an Wirkstoff benötigt. Daher ist es insbesondere für die antimikrobielle Ausrüstung von Oberflächen vor- teilhaft, eine möglichst große Menge an Wrkstoff dauerhaft auf die Oberfläche zu bringen und das Abwaschen des Wirkstoffs durch eine gute und dauerhafte Immobilisierung zu verhindern. Auf diese Weise kann eine gute Wirkung gegen ein breites Spektrum verschiedener Organismen für einen längeren Zeitraum erreicht werden. Überraschenderweise wurde gefunden, dass kationische antimikrobielle Wrkstoffe auch an hydrophobe Polymer-Oberflächen ohne polare, hydrophile Gruppen und ohne anionische Ladungen so adsorbiert werden können, dass auch nach intensivem Waschen der Polymer-Oberflächen eine antimikrobielle Wirkung bestehen bleibt. Derartige Oberflächen können z. B. aus Silikon, Linoleum, Gummi oder Kunststoffen, insbesondere aus der Gruppe Polyethylen PE, Polypropylen PP, Polyvinylchlorid PVC, Polyethylenterephthalat PET, Polyurethan PUR, bestehen. Die Oberflächen können dabei planar aber auch beliebig geformt sein, beispielsweise bei Oberflächen von medizinischen Geräten.

Weiterhin zeigte sich, dass ein Hydrophobin-Coating von Oberflächen trotz der anionischen Ladungen des Hydrophobins geeignet ist, die Bindung der kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe auf ganz unterschiedlichen Oberflächen zu verbessern ohne diese zu inaktivieren. Die Bindung der Wrkstoffe mit Hilfe von Hydrophobin führt dabei zu einer Erweiterung des Wirkspektrums. In zahlreichen Versuchen konnte eine synergistische Wirkung hinsichtlich der antimikrobiellen Eigenschaften durch die Kombination von Hydrophobin und kationischem antimikrobiellen Wirkstoff beobachtet werden. Die Bindung der kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe (W) an das Hydrophobin- Coating kann als einfache Adsorption über nicht-kovalente Wechselwirkungen (a) oder durch eine Kombination aus nicht-kovalenten und kovalenten Wechselwirkungen (b) erfolgen. Die bekannten Hydrohobine binden an eine Vielzahl verschiedener Oberflächen. Nach Bindung der Hydrophobine können die Oberflächeneigenschaften durch die Eigenschaften der Hydrophobine dominiert werden.

Die Hydrophobin-Eigenschaften entsprechen in der Regel der Summe der typischen Proteineigenschaften der Hydrophobine (i) und der Eigenschaften einzelner Aminosäure oder Gruppen ähnlicher Aminosäuren (ii) auf der Oberfläche der Hydrophobine. Die typischen Proteineigenschaften der Hydrophobine (i) ergeben sich auch aus der dreidimensionalen Anordnung ihrer Aminosäuren. Neben der Bindung an beliebige Oberflächen kann hier vor allem die damit verbundene Änderung der Oberflächenpolarität von Bedeutung sein. Durch ein Hydrophobin-Coating können insbesondere hydrophobe Oberflächen hydrophiler aber im Prinzip auch hydrophile Oberflächen hydrophober gemacht werden. Die Eigenschaften der Aminosäuren (ii) werden im Wesentlichen durch ihre funktionellen Gruppen bestimmt. So haben unterschiedliche Aminosäuren unterschiedliche funktionelle Gruppen, wie z.B. Aminofunktionen (Lysin), Hydroxylfunktionen (Serin, Tyrosin), Thiole (Cystein und Methionin), Guanidinofunktion (Arginin) und Carboxylfunktionen (Glutamat und Aspartat). Daher werden durch ein Hydrophobin-Coating typischerweise auch funktionelle Gruppen und Ladungen auf die Oberflächen gebracht. Dies ist insbesondere bei inerten Oberflächen aus z.B. Silikon, Polypropylen, Polyethylen, PVC, Glas, Keramik, Titanoxid und Metallen und deren Legierungen von großem Nutzen.

An der Adsorption (a) kationischer antimikrobieller Wrkstoffe sind in der Regel alle Arten der nicht-kovalenten Wechselwirkung beteiligt (hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen). Dabei können die ionischen Wechselwirkungen von besonderem Interesse sein.

So können die kationischen antimikrobiellen Wrkstoffe (W) auch durch die negativen Ladungen der Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste der Hydrophobine an die Oberflächen gebunden werden, ohne dass dadurch eine Inaktivierung erfolgt. Das Coating der Oberflächen durch Hydrophobine (H) und die Bindung kationischer anti- mikrobieller Wirkstoffe kann in einem Schritt (i) oder aber in zwei Schritten (ii) erfolgen. Entsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Immobilisierung unter Aufbringung nur einer Wirkstoff-haltigen Zusammensetzung aber auch ein Verfahren zur Immobilisierung unter Aufbringung mehrerer Wirkstoff-haltiger Zusammensetzungen.

Beim für viele Oberflächen besonders geeigneten Zweischrittverfahren (ii) erfolgt zunächst der Schritt des Coatings der Oberfläche durch mindestens ein Hydrophobin (H). Dazu wird die Oberfläche z.B. mit einer Zusammensetzung (in der Regel wässrige Lösung) von mindestens einem Hydrophobin (H) behandelt. In einem weiteren, separaten Schritt wird dann der kationische antimikrobielle Wrkstoff (W) z. B. mit einer Zusammensetzung (in der Regel wässrigen Lösung) aufgebracht und z. B. nicht-kovalent an das Hydrophobin-Coating adsorbiert. Dazu wird die Oberfläche häufig mit einer Lösung mindestens eines kationischen antimikrobiellen Wrkstoffs (die auch weitere Komponenten enthalten kann) in Kontakt gebracht.

Beim Einschrittverfahren (i) wird eine Zusammensetzung (häufig eine wässrige Lösung) von mindestens einem Hydrophobin (H) und den antimikrobiellen kationischen Wrkstoffen (W) hergestellt und die zu behandelnde Oberfläche mit dieser Lösung behandelt. Diese Lösung kann neben dem mindestens einem Hydrophobin und den kat- ionischen antimikrobiellen Wrkstoffen weitere Substanzen enthalten, die für die spezifische Anwendung und für die Stabilisierung der Lösung notwendig sind. Die Behandlung der Oberflächen kann durch Überschichten, Eintauchen, Spin-Coating oder Besprühen erfolgen. Die einfache Adsorption ist besonders bei polymeren Wrkstoffen und bei Anwendungen, bei denen eine kovalente Bindung nicht möglich ist, vorteilhaft.

Die einfache Adsorption der kationischen, antimikrobiellen Wrkstoffe (W) kann durch kovalente Bindungen (b) verstärkt werden. Dies kann besonders bei niedermolekularen Wrkstoffen vorteilhaft sein. Dazu können die antimikrobiellen kationischen Wirkstoffe an die Hydrophobine gekuppelt werden. Bei der Kupplung werden insbesondere die funktionellen Gruppen der Hydrophobine (H) oder die funktionellen Gruppen der kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe aktiviert und im Anschluss mit den jeweiligen funktionellen Gruppen der Gegenseite umgesetzt.

Die Kupplung kann an das Hydrophobin-Coating auf der Oberfläche (ii) oder mit den freien Hydrophobinen (i) erfolgen. Bei der Kupplung an das Coating (ii) wird zunächst das Hydrophobin an die Oberfläche gebunden. Dann werden das Hydrophobin-Coating oder der kationische antimikrobielle Wrkstoff (W) aktiviert und im Anschluss beide Komponenten zusammen gegeben. Alternativ kann auch der kationische, antimikrobielle Wirkstoff (W) zunächst nur an das Coating adsorbiert werden und die kovalente Bindung im Anschluss geknüpft werden. Bei der Kupplung an das freie Hydrophobin (i) werden Hydrophobin-Wirkstoff- Konjugate in Lösung hergestellt, die dann an die Oberfläche adsorbiert werden können. Die Synthese der Hydrophobin-Wirkstoff-Konjugate erfolgt ebenfalls durch Aktivierung der funktionellen Gruppen der Hydrophobine oder der der kationischen antimikro- biellen Wirkstoffe.

Die Aktivierung der funktionellen Gruppen kann durch quervernetzende Substanzen (Crosslinker) erfolgen. Dabei richtet sich die Wahl des Crosslinkers nach der Art der zu kuppelnden funktionellen Gruppen. Für die Kupplung von Aminen eignen sich bei- spielsweise:

Imidoester-Crosslinker, N-Hydroxy-Succinimid-Crosslinker

und andere aminoreaktive Crosslinker. Für die Kupplung von Aminen an Thiole eignen sich beispielsweise: bifunktionelle N-Hydroxy-Succinimid-Haloacetyl-Crosslinker,

N-Hydroxy-Succinimid-Maleinimid-Crosslinker und

N-Hydroxy-Succinimid-Pyridyldithiol-Crosslinker.

Für die Kupplung von Carboxylfunktionen an Amine können z.B.:

Carbodiimide wie 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide, Hydrochloride oder Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimide in Kombination mit N-Hydroxysuccinimide oder N-Hydroxysulfosuccinimide verwandt werden. Mit Hilfe von hetero-bifunktionalen N-[p-Maleimidophenyl]isocyanate können Hydroxylfunktionen und Thiole konjugiert werden. Um zwei Thiole zu kuppeln eignen sich bifunktionelle Crosslinker mit Maleinimid- oder Pyridyldithiol-Funktionalitäten.

Die beschriebenen Verfahren ermöglichen zahlreiche technische Anwendungen, beispielsweise:

Antimikrobielle Ausrüstung von Bodenbelägen oder Medizinalgeräten wie Implantaten, Kathetern, Stents und Endotrachealtuben

Antimikrobielle Ausrüstungen von Textilien, Filtern und Non-Wovens

Depositioning und Immobilisierung von bioziden (insbesondere antibakteriellen) Komponenten aus Desinfektionsreinigern und Hand-Desinfektionsmitteln Depositioning und Immobilisierung von Bioziden aus Mundspülungen, Zahnpasta und anderen Produkten für die Mundpflege

Depositioning und Immobilisierung von Bioziden aus Cremes, Shampoos, Duschgelen und anderen Produkten für die Kosmetik

Depositioning und Immobilisierung von Bioziden aus Hygienespülern und anderen antimikrobiellen Produkten für die Wäschehygiene

Im Folgenden ist die Zuordnung der Sequenznamen zu DNA- und Polypeptidsequenzen im Sequenzprotokoll aufgelistet.

Die Erfindung wird durch die beiliegenden Figuren Fig.1 bis Fig.8 sowie durch die nachfolgenden Beispiele verdeutlicht. Die graphische Darstellung in Fig. 1 zeigt schematisch die Wirkung der antimikrobiel- len Ausrüstung auf die Kolonisierung der Oberfläche eines Substrats durch Mikroorganismen. Auf der linken Seite (A) sieht man schematisch, dass die Oberfläche ohne antimikrobielle Ausrüstung durch Mikroorganismen stark kolonisiert wird (schwarze Punkte). Die Mikroorganismen bilden einen Biofilm, der fest auf der Oberfläche verankert ist. Auf der Rechten Seite (B) sieht man, dass nach antimikrobieller Ausrüstung der Oberfläche die Mikroorganismen, die versuchen die Oberfläche zu kolonisieren, abgetötet wurden. Die Anzahl der Mikroorganismen auf der mit der Erfindungsgemä- ßen Zusammensetzung ausgerüsteten Oberfläche (cfu/cm ^A 2) ist deutlich geringer als bei der unbehandelten Oberfläche. Idealerweise wird durch die antimikrobielle Ausrüstung die Kolonisierung vollständig verhindert. Im dargestellten schematischen Fall sind wenige lebenden Mikroorganismen auch noch auf der behandelten Oberfläche vorhanden.

Die graphische Darstellung in Fig. 2 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption des Wirkstoffs Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20).

Fig. 2A zeigt die Anzahl von Keimen (cfu/cm ² ) von Staphylococcus Epidermidis (DSM 1798); Fig. 2B zeigt E. coli; Fig. 2C zeigt C P. mirabilis. Gezeigt wird ohne Waschen, mit 1x Waschen und 3x Waschen, sowie 1 Stunde und 24 Stunden in PBS (phosphate based saline Solution).

Die graphische Darstellung in Fig. 3 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption von Reputex 20 mit Hilfe von Hydrophobin A.

Fig. 3A zeigt S. epidermidis, Fig.3B zeigt E. coli, Fig.3C zeigt P. mirabilis.

Die graphische Darstellung in Fig. 4 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption der Wirkstoff-Komponente PEI-P18-Konjugat.

Fig. 4A zeigt S. epidermidis, Fig. 4B zeigt E. coli.

Die graphische Darstellung in Fig. 5 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption der Wirkstoff-Komponente PEI-P18-Konjugat mit Hilfe von Hydrophobin. Fig. 5A zeigt S. epidermidis, Fig. 5B zeigt E. coli. Die graphische Darstellung in Fig. 6 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen gegen E. coli nach Adsorption und kovalenter Bindung des antimikrobiellen Peptids P18 mit Hilfe von Hydrophobin A. Fig. 6A zeigt die Anzahl der Keime nach 3x Waschen mit PBS vor dem Biofilmassay, Fig. 6B zeigt nach 10x Waschen mit PBS vor dem Biofilmassay. Kontrolleist eine Silikonoberfläche ohne antimikrobielle Ausrüstung für die normale Biofilmentwicklung. Weitere Kontrolle ist Adsorbiertes P18 ohne kova- lente Bindung. Die graphische Darstellung in Fig. 7 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen gegen S. epidermidis nach Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20) mit Hilfe von Hydrophobin B in einem Einschritt-Verfahren. Die Silikonoberflächen wurden mit einer wässrigen Lösung enthaltend 500 ppm Hydrophobin B und 2% Reputex 20 bei pH 4 inkubiert.

Die graphische Darstellung in Fig. 8 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen gegen S. epidermidis nach Adsorption von Reputex 20 mit Hilfe von Hydrophobin B im Einschritt-Verfahren. Die Silikonoberflächen wurden mit einer wässrigen Lösung enthaltend 100 ppm Hydrophobin B, 1 % Reputex 20 und 0,3 % Luviquat hold bei pH 6 inkubiert.

Beispiel 1 Testen der Wirkung der antimikrobiellen Ausrüstung

Die Wirkung der antimikrobiellen Ausrüstung der untersuchten Oberflächen wurde durch einen statischen Biofilm-Assay bestimmt. Dazu wurden die zu testenden Oberflächen in kreisrunde Scheiben geschnitten, die in die Löcher von 24-Well- Mikrotiterplatten passen. Um das Verrutschen der Oberflächen während des Assays zu verhindern, wurden die Oberflächen mit Hilfe von Schliff-Fett auf dem Boden der Mikrotiterplatten immobilisiert.

Die Bildung von Biofilmen erfolgte ausgehend von einer Vorkultur. Dazu wurden 20 ml des handelsüblichen TSBY-Medium (Difco Laboratories, MI, USA) mit Hilfe einer stationären Übernachkultur aus Staphylococcus epidermidis DSM 1798, Escherichia coli DSM 5698, Proteus mirabilis DSM 4479 oder Escherichia coli BL21 (DE3) mit einer optischen Dichte von 0, 1 angeimpft. Die Vorkultur wurde für 2 bis 4 Stunden unter Bewegung (bei 200 rpm) und 37 °C inkubiert bis eine optische Dichte von 2 bis 3 erreicht wurde. Um den Biofilm-Assay zu starten, wurde die Vorkultur auf eine optische Dichte von 0,0004 in 5 % TSBY in Saline (0,9 % NaCI) verdünnt (ca. 10E5 cfu/ml). Davon wurde 1 ml auf die Oberflächen in der 24-Well-Platte gegeben und im Anschluss bei 37 °C unter leichtem Schwenken bei 50 rpm (Umdrehungen pro Minute) inkubiert, so dass sich ein Biofilm auf der Oberfläche bilden konnte.

Der Biofilm auf den Oberflächen wurde nach einer Stunde (1 h) und nach 24 Stunden (24h) analysiert (bzw. 5 Stunden optional). Dazu wurden die planktonischen Zellen abgenommen. Die Oberflächen wurden im Anschluss aus der Mikrotiterplatte entnommen und kurz in Kochsalzlösung, Saline (0,9 % NaCI) gewaschen. Dann wurden die adhärenten Zellen im Biofilm durch eine Ultraschallbehandlung von der Oberfläche gelöst. Dazu wurden die Oberflächen in ein Falcon-Röhrchen (50 ml Volumen) mit 2 ml Saline transferiert und für fünf Minuten im Ultraschall-Wasserbad beschallt. Die resultierende Bakteriensuspension wurde verdünnt und auf TSBY-Agarplatten ausplattiert. Nach 18 Stunden bei 37 wurden die entstandenen Kolonien gezählt und auf die Anzahl der Zellen auf der Oberfläche zurückgerechnet.

Beispiel 2 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikon durch Adsorption von PHMB

Vor der Adsorption wurden die Silikonoberflächen (Scheiben mit 15 mm Durchmesser passend für 24-Well-Mikrotiterplatten) zweimal mit Hilfe einer SDS-Lösung (10 mg/ml in Reinstwasser) gewaschen. Im Anschluss wurde zweimal mit Reinst-Wasser gespült und die Oberflächen durch Eintauchen in Ethanol (70%ig in Reinst-Wasser) entfettet, sterilisiert und im Anschluss getrocknet. Die Adsorption des antimikrobiellen Wirkstoffs (W), hier des Wrkstoffs Polyhexamethylenbiguanid (auch PHMB bzw. Reputex 20 als 20 %ige Lösung) erfolgte nach Verdünnen auf 50 mg/ml in PBS (phosphate based saline Solution). Die zu beschichtenden Silikonoberflächen wurden 1 Stunde bei 400 rpm auf dem Eppendorf- Schüttler mit der Reputex 20-Lösung inkubiert. Im Anschluss wurden die Oberflächen getrocknet.

Um zu testen, wie permanent der kationische antimikrobielle Wrkstoff an die Oberfläche gebunden wurde, wurden die Oberflächen vor dem Biofilmassay nach verschiedenen Protokollen gewaschen. Die Oberflächen wurden jeweils einmal, dreimal und zehnmal mit 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflächen bei jedem Waschschritt für eine Minute im Eppendorfschüttler bei 400 rpm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt. Weiterhin wurden die antimikrobiell ausgerüsteten Oberflächen für eine Stunde und 24 Stunden in 500 ml PBS inkubiert.

Die Wirkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Durch die Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid können Silikon-Oberflächen antimikrobiell ausgerüstet werden. Die antimikrobielle Ausrüstung ist in der Lage, die Biofilmbildung durch Escherichia coli und Proteus mirabilis auch nach intensivem Waschen zu verhindern. Hier reicht der Wrkstoff, der nach dem Waschen auf der Oberfläche verbleibt, um die Biofilmbildung vollständig zu verhindern. Die Biofilmbildung durch Staphylococcus epidermidis lässt sich nach intensivem Waschen der Oberflächen nicht mehr vollständig unterdrücken. Hier ist die Menge an Wrkstoff, die auf der Oberfläche verbleibt, zu gering, um noch wirken zu können. Die Figur 2 zeigt graphisch die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen (Anzahl der Keime in cfu/cm ² nach Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid für drei Organismen (jeweils im Vergleich zur Kontrolle (ohne Wirkstoff):

A S. epidermidis,

B E. coli,

C P. mirabilis.

Die Immobilisierung des antimikrobiellen Wrkstoffs ist nicht ausreichend.

Beispiel 3 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikonoberflächen durch Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid mit Hilfe von Hydrophobin A im Zweischrittverfahren

Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikonoberflächen erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde als Hydrophobin-Komponente (H) das Hydrophobin A an Silikon gebunden. Dazu wurden die Oberflächen für mindestens 3 Stunden mit 0,5 mg/ml Hydrophobin A in Bindungspuffer (50 mM Tri-HCI, 1 mM CaCI ₂ bei pH 8,0) inkubiert. Bevorzugt wird hierbei das Hydrophobin yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20) (siehe WO 2006/082251) eingesetzt. Im Anschluss wurde zweimal mit Reinstwasser gewaschen und die Oberfläche getrocknet.

Im zweiten Schritt wurde Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20) an das Hydrophobin-Coating adsorbiert. Dazu wurden die Oberflächen mit jeweils 1 ml 50 mg/ml Reputex 20 in PBS überschichtet und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde einmal mit 1 ml Reinstwasser gewaschen.

Um zu testen, wie permanent der kationische antimikrobielle Wrkstoff an die Oberflä- che gebunden wurde, wurden die Oberflächen vor dem Biofilmassay nach verschiedenen Protokollen gewaschen. Die Oberflächen wurden jeweils einmal, dreimal und zehnmal mit 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflächen bei jedem Waschschritt für eine Minute im Eppendorf-Schüttler bei 400 rpm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt. Weiterhin wurden die antimikrobiell ausgerüsteten Oberflächen für eine Stunde und 24 Stunden in 500 ml PBS inkubiert.

Die Wirkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Im Unterschied zum Beispiel 2 wirkt die antimikrobielle Ausrüs- tung durch Adsorption des antimikrobiellen Wirkstoffs mit Hilfe von Hydrophobin A auch nach intensivem Waschen gegen die Biofilmbildung durch S. epidermidis. Durch das Hydrophobin-Coating wird Polyhexamethylenbiguanid besser auf der Oberfläche zurückgehalten, so dass auch nach intensivem Waschen genug Wirkstoff vorhanden ist, um die Biofilmbildung durch S. epidermidis zu verhindern. Die Figur 3 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid mit Hilfe von Hydrophobin A für verschiedene Mikroorganismen, wobei eine verbesserte Fixierung des Wirkstoffs beobachtet werden konnte.

A S. epidermidis,

B E. coli,

C P. mirabilis.

Beispiel 4 Synthese von PEI-P18-Konjugaten

Die Synthese der als kationischer Wrkstoff (W) eingesetzten Polyethylenimin-P18- Konjugate erfolgte durch Aktivierung von Polyethylenimin (PEI) mit Succinimidyl-4-[N- maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat (SMMC) und anschließendes Umsetzen mit P18cys. P18cys entspricht der Aminosäuresequenz von P18 mit einem zusätzlichen C- terminalem Cystein-Rest (KWKLFKKIPKFLHLAKKFC). P18cys wurde durch Synthese hergestellt (z.B. von Bachem AG, Bubendorf, Switzerland). SMCC ist ein hetero- bifunktionaler Crosslinker mit einer Amino-reaktiven und einer Thiol-reaktiven Komponente. Im ersten Schritt wurden die Aminofunktionen des PEI (Anbieter z.B. Sigma-Aldrich 408727; 25 KDa) mit SMCC aktiviert. Dazu wurde das PEI auf 100 mg/ml in PBS (Phosphate Buffered Saline: 10 mM Kaliumphosphat, 137 mM NaCI, pH 7,5) verdünnt, der pH mit 4 M HCl auf 7 bis 8 eingestellt und diese Lösung im Anschluss über Nacht gegen PBS dialysiert. Das so behandelte PEI wurde dann bei einer Konzentration von

10 mg/ml in einem Volumen von 1 ml PBS mit 45 mM SMCC für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurden entstandene Trübungen abzentrifugiert und eventuell nicht abreagierte amino-reaktive Funktionen des SMCC durch Zugabe von 180 mM Glycin gequencht. Der Überstand mit gelösten PEI-SMCC wurde mit P18cys umgesetzt. Dazu wurden 1 ,1 mg/ml PEI-SMCC in einem Volumen von 1 ml mit 5 mM P18cys über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.

Ungekuppeltes P18cys und niedermolekulare Substanzen wurden durch eine Dialyse gegen PBS entfernt. Die PEI-P18-Konjugate wurden durch SDS-Page-Verfahren ana- lysiert. Beispiel 5 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikonoberflächen durch Adsorption von PEI-P18-Konjugaten Die wie in Beispiel 4 synthetisierten PEI-P18-Konjugate wurden als Wirkstoff- Komponente an Silikonoberflächen adsorbiert. Vor der Adsorption wurden die Silikonoberflächen (Scheiben mit 15 mm Durchmesser passend für 24-Well-Mikrotiterplatten) zweimal mit Hilfe einer SDS-Lösung (10 mg/ml in Reinstwasser) gewaschen. Im An- schluss wurde zweimal mit Reinstwasser gespült und die Oberflächen durch Eintau- chen in Ethanol (70%ig in Reinstwasser) entfettet, sterilisiert und im Anschluss getrocknet. Die Adsorption der Konjugate erfolgte aus einer Lösung mit 10 mg/ml (P18- Äquivalente) in PBS. Die zu beschichtenden Silikonoberflächen wurden für eine Stunde bei 400 rpm auf dem Eppendorf-Schüttler mit der Lösung inkubiert. Im Anschluss wurden die Oberflächen getrocknet.

Um zu testen, wie permanent die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe an die Oberfläche gebunden wurden, wurden die Oberflächen vor dem Biofilmassay nach verschiedenen Protokollen gewaschen. Die Oberflächen wurden zehnmal mit 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflächen bei jedem Wasch-Schritt für eine Minute im Eppendorf-Schüttler bei 400 rpm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt. Weiterhin wurden die antimikrobiell ausgerüsteten Oberflächen für eine Stunde und 24 Stunden in 500 ml PBS inkubiert. Die Wirkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Durch die Adsorption von PEI-P18-Konjugaten können Silikonoberflächen antimikrobiell ausgerüstet werden. Die antimikrobielle Ausrüstung ist in der Lage, die Biofilmbildung durch S. epidermidis auch nach Waschen zu verhindern. Hier reicht der Wirkstoff, der nach dem Waschen auf der Oberfläche verbleibt, um die Bio- filmbildung zu verhindern. Die PEI-P18-Konjugate werden auf der Oberfläche jedoch nicht so stark zurückgehalten, dass nach intensivem Waschen genug Wirkstoff vorhanden ist, um die Biofilmbildung durch E. coli zu verhindern.

Die Figur 4 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption von antimikrobiellen PEI-P18-Konjugaten an:

A S. epidermidis,

B E. coli. Beispiel 6 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikonoberflächen durch Adsorption von PEI-P18-Konjugaten mit Hilfe von Hydrophobin

Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikonoberflächen erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurde Hydrophobin A an Silikon gebunden. Dazu wurden die Oberflächen für mindestens 3 Stunden mit 0,5 mg/ml Hydrophobin A in Bindungspuffer (50 mM Tri-HCI, 1 mM CaCI ₂ bei pH 8,0) inkubiert. Im Anschluss wurde zweimal mit Reinstwasser gewaschen und die Oberfläche getrocknet. Die Adsorption der Konjugate erfolgte im zweiten Schritt aus einer Lösung mit 10 mg/ml (P18-Äquivalente) in PBS. Die zu beschichtenden Silikonoberflächen wurden für eine Stunde bei 400 rpm auf dem Eppendorf-Schüttler mit der Lösung inkubiert. Im Anschluss wurden die Oberflächen getrocknet.

Um zu testen, wie permanent die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe an die Ober- fläche gebunden wurden, wurden die Oberflächen vor dem Biofilmassay nach verschiedenen Protokollen gewaschen. Die Oberflächen wurden zehnmal mit 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflächen bei jedem Waschschritt für eine Minute im Eppendorf-Schüttler bei 400 rpm geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt. Weiterhin wurden die antimikrobiell ausgerüsteten Oberflächen für eine Stunde und 24 Stunden in 500 ml PBS inkubiert.

Die Wirkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Im Unterschied zum Beispiel 5 wirkt die antimikrobielle Ausrüstung durch Adsorption der PEI-P18-Konjugate mit Hilfe von Hydrophobin A auch nach intensivem Waschen gegen die Biofilmbildung durch E. coli. Durch das Hydrophobin- Coating werden die PEI-P18-Konjugate so dauerhaft auf der Oberfläche zurückgehalten, so dass auch nach intensivem Waschen genug Wirkstoff vorhanden ist, um die Biofilmbildung durch E. coli zu verhindern. Die Figur 5 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen nach Adsorption von PEI-P18-Konjugaten mit Hilfe von Hydrophobin bei:

A S. epidermidis,

B E. coli.

Es wurde eine verbesserte Immobilisierung des Wrkstoffs auf der Oberfläche festgestellt.

Beispiel 7 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikon durch Adsorption und kovalen- te Verknüpfung mit dem antimikrobiellen Peptid P18 Das Peptid P18 wurde kovalent an ein bestehendes Hydrophobin-Coating auf Silikonoberflächen (Scheiben mit 15 mm Durchmesser passend für 24-Well-Mikrotiterplatten) gebunden. Dazu wurden die Aminofunktionen des Hydrophobins auf der Oberfläche durch EDC in Anwesenheit von NHS aktiviert. Die Aktivierung erfolgte durch Inkubieren des Hydrophobincoatings auf den Silikonoberflächen in 24-Well-Platten für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 760μΙ Reinstwasser, 40 μΙ MES-Puffer (20 mM, pH 6), 100 μΙ EDC (250 mM, pH 6 bis 6,8) und 100 μΙ NHS (250 mM, pH 7,0 bis 8,0). Im Anschluss wurden 100 μΙ P18-Lösung (10 mM P18 in 100 mM NaC0 ₃ , pH 8,5) zugegeben und für weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ende der Reaktion wurde mit Reinstwasser gewaschen.

Die Figur 6 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen gegen E. coli nach Adsorption und kovalenter Bindung des antimikrobiellen Peptids P18 mit Hilfe von Hydrophobin A:

A 3x Waschen mit PBS vor dem Biofilmassay,

B 10x Waschen mit PBS vor dem Biofilmassay.

Kontrolle = Silikonoberfläche ohne antimikrobielle Ausrüstung für die normale Biofilm- entwicklung. Weitere Kontrolle = Adsorbiertes P18 ohne kovalente Bindung.

Um zu testen, wie permanent die kationischen antimikrobiellen Wirkstoffe an die Oberfläche gebunden wurden, wurden die Oberflächen vor dem Biofilmassay dreimal und zehnmal mit jeweils 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflächen bei jedem Waschschritt für eine Minute im Eppendorf-Schüttler bei 400 rpm geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt.

Die Wirkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt (Fig. 6). Zusätzlich wurde die Biofilmbildung auch nach 5 Stunden gemessen. Während die Proben, an die das antimikrobielle Peptid ohne kovalente Bindung immobilisiert wurde, keine Wrkung nach dreimaligem und zehnmaligen Waschen mehr zeigen, erkennt man eine deutlich Reduzierung der Biofilmbildung von E. coli auf den Silikonoberflächen mit kovalent immobilisiertem P18.

Beispiel 8 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikonoberflächen im Ein-Schritt- Verfahren durch gleichzeitige Behandlung mit Polyhexamethylen- biguanid und Hydrophobin B Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikonoberflächen erfolgte im „Ein-Schritt- Verfahren. Es wurden zwei wässrige Zusammensetzungen hergestellt: a) die als Hydrophobin-Komponente (H) 500 ppm der Hydrophobin B (siehe WO 2006/082251) enthält sowie 2,0 Gew.-% Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20),

b) die als Hydrophobin-Komponente (H) 100 ppm der Hydrophobin B enthält sowie 1 ,0 Gew.-% Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20) und 0,3 Gew.- % eines Additivs (Ludiquat Hold).

Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikon-Oberflächen erfolgt in einem Schritt. Dazu wurden die Oberflächen für 1 h mit 1 ml einer Lösung aus 500 ppm Hydrophobin B und 2% Reputex 20 bei pH 4 inkubiert. Im Anschluss wurden die Oberflächen getrocknet.

Um zu testen, wie permanent der Wirkstoff (W) Polyhexamethylenbiguanid an die Oberfläche gebunden wurde, wurden die ausgerüsteten Oberflächen vor dem Biofilm- assay jeweils einmal und zehnmal mit 1 ml PBS gewaschen. Dazu wurden die Oberflä- chen bei jedem Waschritt für eine Minute im Eppendorf-Schüttler bei 400 rpm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Im Anschluss wurde die Waschlösung abgenommen, verworfen und durch neue ersetzt. Die Wrkung der antimikrobiell ausgestatteten Oberflächen wurde analog zu Beispiel 1 bestimmt (siehe Fig. 7). Fig 7 zeigt die Anti-Biofilm- Aktivität von Silikonoberflächen gegen S. epidermidis nach Adsorption von Reputex 20 mit Hilfe von Hydrophobin B im Einschrittverfahren. Die Silikonoberflächen wurden mit einer wässrigen Lösung enthaltend 500 ppm Hydrophobin B und 2% Reputex 20 bei pH 4 inkubiert.

Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikonoberflächen durch Adsorption von Reputex 20 mit Hilfe von Hydrophobin B im Einschrittverfahren zeigt eine ähnlich gute Wrkung wie die im Beispiel 3 beschriebene Adsorption mit Hilfe von Hydrophobin A im Zweischrittverfahren.

Auch nach intensivem Waschen kann die Biofilmbildung durch S. epidermidis noch vollständig verhindert werden. Auch mit Hydrophobin B kann im Einschritt-Verfahren ein Wirkstoff wie Polyhexamethylenbiguanid so gut adsorbiert werden, dass nach intensivem Waschen noch ausreichend Wirkstoff vorhanden ist, um die Biofilmbildung durch S. epidermidis vollständig zu verhindern.

Beispiel 9 Antimikrobielle Ausrüstung von Silikonoberflächen im Ein-Schritt- Verfahren durch gleichzeitige Behandlung mit Polyhexamethylenbiguanid, Hydrophobin B und einer Hilfskomponente (HK) Die antimikrobielle Ausrüstung der Silikonoberflächen erfolgte im „Ein-Schritt- Verfahren. Beim Einschritt-Verfahren können auch Hilfsstoffe wie z.B. kationische, zwitterionische oder nicht-ionische Tenside oder Polymere eingesetzt werden. So konnte durch Adsorption von Polyhexamethylenbiguanid (Reputex 20) aus einer wässrigen Lösung enthaltend 100 ppm Hydrophobin B, 1 % Reputex 20 und 0,3 % des tensids„Luviquat hold" bei pH 6 ebenfalls die Biofilmbildung durch S. epidermidis auf Silikonoberflächen vollständig verhindert werden. Dabei erfolgte die Adsorption wie im Beispiel 8 beschrieben. Wie in den Beispielen 8 und 3 konnte die Biofilmbildung auch nach intensivem Waschen vollständig verhindert werden (siehe Fig. 8). Fig. 8 zeigt die Anti-Biofilm-Aktivität von Silikonoberflächen gegen S. epidermidis nach Adsorption von Reputex 20 mit Hilfe von Hydrophobin B im Einschrittverfahren. Die Silikonoberflächen wurden mit einer Lösung von 100 ppm Hydrophobin B, 1 % Reputex 20 und 0,3 % Luviquat hold bei pH 6 inkubiert.