enzymatischen Entschleimung von Pflanzenölen

5 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen

Entschleimung von Triglyceriden, insbesondere von rohen

Pflanzenölen, wobei die Phosphatide unverändert bleiben.

Ferner ist ein Verfahren zur Verringerung des Ölgehalts in Pflanzenölschleim bzw. die Gewinnung von Lecithin aus

L0 Pflanzenölen, insbesondere aus Raps- und Sojaöl, Gegenstand dieser Erfindung.

Rohe Pflanzenöle enthalten Phosphatide, eiweiß- und

kohlenhydrathaltige Stoffe, pflanzliche Schleimstoffe sowie kolloidale Verbindungen, die die Haltbarkeit des Öls stark L5 herabsetzen. Diese Stoffe müssen daher entfernt werden.

Bei der Raffination von Pflanzenölen werden die unerwünschten Begleitstoffe entfernt. Man unterscheidet zwischen chemischer und physikalischer Raffination. Die chemische Raffination besteht aus den Prozessen 1. Entschleimung, 2. Neutralisation,

20 3. Bleichung, 4. Desodorierung. Bei der Entschleimung werden Phospholipide („Schleimstoffe") und Metallionen aus dem Öl entfernt. Die Neutralisation dient zur Extraktion der

Fettsäuren. Bei der Bleichung werden die Farbstoffe, weitere Metallionen und restliche Schleimstoffe entfernt. Bei der

25 Desodorierung handelt es sich um eine Wasserdampfdestillation, bei der weitere Verbindungen entfernt werden, die den Geruch und den Geschmack des Öls beeinträchtigen. Bei der

physikalischen Raffination wird die Entsäuerung zusammen mit der Desodorierung am Ende des Raffinationsprozesses

30 durchgeführt.

Die Entschleimung der Öle kann durch Extraktion der

Phospholipide mit Wasser oder einer wässrigen Lösung, einer Säure erfolgen, die Ca ²⁺ - und Mg ²⁺ -Ionen komplexiert, wie z. B. Zitronensäure oder Phosphorsäure. Häufig führt man hierbei 35 zunächst eine wässrige, sogenannte Vorentschleimung durch, mit der die wasserlöslichen Phospholipide entfernt werden. Man spricht hierbei von hydratisierbaren Phospholipiden .

Die Thematik der hydratisierbaren und nicht-hydratisierbaren Phospholipide ist beispielsweise beschrieben in Nielsen, K., Composition of difficultly extractable soy bean Phosphatides, J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 und A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2010, 112, 1178-1189. Dabei handelt es sich insbesondere um Phosphatidyl- Cholin und Phosphatidyl-Inositol . Die Behandlung mit

verdünnten wässrigen Calcium- und Magnesium-komplexierenden

Säuren, wie z. B. Zitronensäure oder Phosphorsäure, führt nach dem Stand der Technik dazu, dass nicht-hydratisierbare

Phospholipide in hydratisierbare Phospholipide überführt werden. Eine weitere Variante stellt das sog. „Caustic

Refining" dar. Dieses Verfahren wird eingesetzt, um möglichst alle Phospholipide zusammen mit freien Fettsäuren aus dem Öl zu entfernen. Dieser Prozess ist beispielsweise in der WO 08/094847 beschrieben.

Ein weiterer Nachteil der konventionellen

Ölentschleimungsprozesse liegt darin, dass sowohl die wässrige Vorentschleimung als auch die Behandlung mit wässrigen Säuren zu Ölverlusten führen, die dadurch verursacht werden, dass die in das Wasser überführten Phospholipide Emulgatoren

darstellen, die einen geringen Teil des Pflanzenöls in der wässrigen Phase emulgieren, wodurch Pflanzenöl verloren geht.

Die sogenannte enzymatische Entschleimung vermeidet mehrere Nachteile der bestehenden Verfahren bzw. verbessert die

Extraktionsverfahren. Die enzymatische Entschleimung wird im Stand der Technik durch den Einsatz von Phospholipasen, insbesondere Phospholipase AI und A2, B oder Phospholipase C oder einer Kombination von Phospholipasen beschrieben.

Eine weitere Variante der enzymatischen Olentschleimung stellt die enzymatische Behandlung der abgetrennten Schleimphase dar, nachdem das Öl nach konventionellen Verfahren wie z.B. mit Wasser und/oder Zitronensäure entschleimt wurde. Hierbei können weitere wertvolle Rohstoffe wie beispielsweise Lecithin gewonnen werden.

Betrachtet man die Gewinnung von Lecithin für den Einsatz in Nahrungsmitteln oder in Tierfuttermitteln, so wird dieses aus der wässrigen Lösung gewonnen, welche aus der wässrigen

Vorentschleimung des Pflanzenöles erhalten wird. Hierbei wird über Dünnschichtverdampfer das Wasser entfernt.

Nach dem Stand der Technik wird die EntÖlung des Rohlecithins im Wesentlichen durch eine Acetonextraktion erzielt, wie sie beispielsweise in der WO 94/01004 beschrieben ist. Die

Entölung des rohen Lecithins ist für die meisten Anwendungen erforderlich, wenn das Lecithin als Emulgator eingesetzt werden soll, da das vorhandene Öl die Emulgierfähigkeit verringert und auch den Aktivgehalt des Lecithins herabsetzt. Auch beim Einsatz als Futtermittelkomponente ist es in einigen Fällen wünschenswert, das rohe Lecithin zu entölen.

Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die Entschleimung von Triglyceriden so zu verbessern, dass die Phospholipide in ihrer chemischen Struktur und folglich auch in ihrem Emulgierverhalten unverändert bleiben, aber

andererseits weniger Öl im abgetrennten Schleim verbleibt. Ein Ziel der Erfindung ist daher die Erhöhung der Ölausbeute.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von Lecithin aus Triglyceriden, insbesondere aus rohem Soja-, Sonnenblumen- oder Rapsöl, mit hoher Ausbeute und ohne chemische Veränderung des Lecithins, wobei der Gehalt an Öl im gewonnen Lecithin möglichst gering ist, oder mit anderen Worten, die Entölung des Lecithins bzw. die Verringerung des Ölgehalts im Pflanzenölschleim. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur enzymatischen

Entschleimung von Triglyceriden oder zur Verringerung des Ölgehaltes im Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung anfällt, gelöst, welches Verfahren die folgende Schritte umfasst : Zunächst wird das Triglycerid oder der Pflanzenölschleim, der bei der Ölentschleimung anfällt, in Schritt a) mit einer

Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die mindestens ein

Glykosid-spaltendes Enzym umfasst, wobei das mindestens eine Glykosid-spaltende Enzym keine Phospholipase- und keine

Acyltransferase-Aktivität aufweist und keine Phospholipase und keine Acyltransferase in der Zusammensetzung vorhanden sind.

Anschließend werden, wenn Triglyceride als Ausgangsmaterial verwendet werden, die Schleimstoffe in Schritt bl) von den Triglyceriden abgetrennt. Bevorzugt handelt es sich bei den Triglyceriden um rohes Pflanzenöl.

Alternativ kann anstelle der Triglyceride auch

Pflanzenölschleim eingesetzt werden, der bei Entschleimung von Pflanzenölen anfällt, sei es durch eine Entschleimung nach herkömmlichen oder dem erfindungsgemäßen Verfahren. Der

Pflanzenölschleim wird gemäß Schritt a) mit dem Glykosid- spaltenden Enzym in Kontakt gebracht und anschließend nach Schritt b2), der analog zu bl) durchgeführt wird, in eine wässrige, Lecithin-haltige Phase und eine Öl-haltige Phase getrennt. Die Schleimphase bzw. der Pflanzenölschleim wird insbesondere bei der Gewinnung von Lecithin eingesetzt.

„Enzymaktivität" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als eine chemische Reaktion definiert, die von einem oder mehreren katalytischen Proteinen (Enzymen) katalysiert wird. Dabei wird ein Enzymsubstrat zu einem oder mehreren Produkten umgesetzt. Bestimmte Enzyme oder Enzymzusammensetzungen besitzen eine oder sogar mehrere Enzymaktivitäten. Auch ein reines Enzym kann z. B. mehr als eine Reaktion katalysieren (Umsetzung von einem Substrat zu Produkt (en) ) , hat daher mehr als eine

Enzymaktivität. Diese Aktivitäten werden in eine sogenannte „Hauptaktivität" und sogenannte „Nebenaktivität" eingeteilt. Die Enzymaktivität steht im Zusammenhang mit der

Reaktionsgeschwindigkeit. Sie gibt an, wie viel aktives Enzym sich in einer Enzymzusammensetzung befindet. Die Einheiten der Enzymaktivität sind Unit (U) , wobei 1 U definiert ist als diejenige Menge Enzym, welche unter angegebenen Bedingungen ein Mikromol Substrat pro Minute umsetzt: 1 U = 1 pmol/min. Eine Phospholipid-spaltende Nebenaktivität ist in der vorliegenden Erfindung dadurch definiert, dass der Gehalt an freien Fettsäuren während einer Reaktionszeit von 4 h um nicht mehr als relativ 10 %, bevorzugt um nicht mehr als relativ 8 %, besonders bevorzugt um nicht mehr als 5% ansteigt. Diese Werte beziehen sich auf die relative Zunahme der Fettsäure- Konzentration, die als Anteil der freien Fettsäuren (FFA), ausgedrückt als Ölsäure, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, definiert ist. Die Bestimmung der freien Fettsäuren (FFA) ist im Abschnitt Methoden beschrieben.

Eine Phospholipid-spaltende Nebenaktivität unter 5% wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht als Nebenaktivität definiert, sondern liegt im Rahmen der üblichen

Messschwankung . Eine Phospholipid-spaltende Hauptaktivität ist in der

vorliegenden Erfindung dadurch definiert, dass der Gehalt an freien Fettsäuren während einer Reaktionszeit von 4 h um mehr als 10°%, bevorzugt um mehr als 12°%, ganz besonders bevorzugt um mehr als 15°% ansteigt. Diese Werte beziehen sich auf die relative Zunahme der Fettsäure-Konzentration, die als Anteil der freien Fettsäuren (FFA), ausgedrückt als Ölsäure, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, definiert ist.

Eine Phosphatase Nebenaktivität (Hydrolyse einer

Phosphorsäureesterbindung) ist in der vorliegenden Erfindung dadurch definiert, dass der Gehalt an freien Fettsäuren während einer Reaktionszeit von 4 h um nicht mehr als relativ 10 %, bevorzugt um nicht mehr als relativ 8 %, besonders bevorzugt um nicht mehr als 5% ansteigt. Diese Werte beziehen sich auf die relative Zunahme der Fettsäure-Konzentration, die als Anteil der freien Fettsäuren (FFA) , ausgedrückt als

Ölsäure, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, definiert ist. Die Bestimmung der freien Fettsäuren (FFA) ist im Abschnitt Methoden beschrieben.

Eine Phosphatase Nebenaktivität (Hydrolyse einer

Phosphorsäureesterbindung) unter 5% wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht als Nebenaktivität definiert, sondern liegt im Rahmen der üblichen Messschwankung.

Eine Phosphatase Hauptaktivität (Hydrolyse einer

Phosphorsäureesterbindung) ist in der vorliegenden Erfindung dadurch definiert, dass der Gehalt an freien Fettsäuren während einer Reaktionszeit von 4 h mehr als 10°%, bevorzugt mehr als 12°%, ganz besonders bevorzugt mehr als 15°%

ansteigt. Diese Werte beziehen sich auf die relative Zunahme der Fettsäure-Konzentration, die als Anteil der freien

Fettsäuren (FFA), ausgedrückt als Ölsäure, bezogen auf die gesamten Fettsäuren, definiert ist.

Unter dem Begriff „Triglyceride" werden dreifache Ester des Glycerins mit Fettsäuren verstanden, welche den Hauptbestandteil von natürlichen Fetten und Ölen darstellen, sei es pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Triglyceride umfassen pflanzliche oder tierische Fette und Öle, und deren Mischungen sowohl untereinander als auch mit synthetischen bzw.

modifizierten Fetten und Ölen.

Unter dem Begriff „Pflanzenöl" wird jedes Öl pflanzlichen Ursprungs verstanden. Bevorzugte Öle sind im Sinne der

vorliegenden Erfindung Sojaöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl,

Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl, Leindotteröl, oder

Baumwollsaatöl . Überdies umfasst das Pflanzenöl im Sinne der vorliegenden Erfindung Mischungen verschiedener Pflanzenöle untereinander, als auch die Mischung von Pflanzenöl mit tierischen und/oder synthetischen bzw. modifizierten Fetten und Ölen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Pflanzenöl" rohe Pflanzenöle, vorkonditionierte und vorentschleimte Pflanzenöle. Die Bezeichnung „roh" bezieht sich dabei darauf, dass das Öl noch keinem Entschleimungs-, Neutralisations-, Bleichungsund/oder Desodorierungsschritt unterzogen wurde. Es ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auch möglich, dass eine Mischung mehrerer Rohöle eingesetzt wird oder

vorbehandelte, z.B. vorentschleimte und/oder vorkonditionierte Öle mit den Enzymen behandelt werden. Unter „Lecithinphase" / „Schleimphase" / „Schleimstoffe" / „Pflanzenölschleim" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die gesamte Gruppe der Stoffe verstanden, die nach Behandlung mit einer säurehaltigen und/oder wässrigen Lösung aus dem Öl als schwere Phase ausfallen (Michael Bokisch: Fats and Oils Handbook, AOCS Press, Champaign, Illinois, 1998, Seite 428- 444. Die Begriffe werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Die Verwendung dieses Pflanzenölschleims als Einsatzmaterial ist insbesondere für die Gewinnung von Lecithin von Bedeutung, da Lecithin ein wesentlicher

Bestandteil des Pflanzenölschleims ist.

Unter dem Begriff „Verringerung des Ölgehalts im

Pflanzenölschleim" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Abtrennung des Öls aus dem eingesetzten Pflanzenölschleim verstanden, welcher dadurch „entölt" wird. Je nach

Betrachtungsweise, steht die Gewinnung von Öl und/oder die Gewinnung der Lecithin-haltigen Schleimphase im Vordergrund.

Unter dem Begriff "Vorentschleimung" bzw. "Naßentschleimung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Behandlung des Rohöls mit Wasser oder einer wässrigen Säurelösung verstanden, um wasserlösliche Phospholipide weitestgehend aus dem Öl zu entfernen. Beide Begriffe werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Auch kann im Rahmen einer Vorbzw. Naßentschleimung nach der Säurezugabe ggf. eine Zugabe von Alkali erfolgen, um die Säure zu neutralisieren. Vor der Enzymzugabe erfolgt die Abtrennung der wässrigen Phase. Nach einer Vorentschleimung wird der Phosphorgehalt im Rohöl von ca. 500-1500 ppm, z.B. für Soja und Raps auf unter 200 ppm im vorentschleimten Öl gesenkt. Durch die Vorentschleimung kann z.B. Lecithin aus der entstandenen Schleimphase gewonnen werden bzw. die Schleimphase als Futtermittel aufgearbeitet werden. Der Nachteil der Abtrennung der wässrigen Phase bzw. der Senkung des Phosphorgehaltes ist jedoch ein

Ausbeuteverlust bezüglich des Öls. Die in die wässrige Phase übergehenden Phosphatide wirken emulgierend und führen dazu, dass ein Teil des Öls in der wässrigen Phase emulgiert und mit dieser abgetrennt wird. Anschließend kann das Öl enzymatisch weiterbehandelt werden, wobei die Enzyme in einem weiteren Schritt abgetrennt werden müssen.

Unter dem Begriff "Vorkonditionierung" des Öls wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Zugabe von Wasser bzw. einer wässrigen Säurelösung zu dem rohen Öl verstanden. Anschließend wird durch Zugabe von Alkali, z. B. Natronlauge, ein pH-Wert eingestellt, bei dem die folgende enzymatische Reaktion stattfindet. Idealerweise wird der für die Enzymreaktion optimale pH-Wert eingestellt. Anschließend erfolgt jedoch keine Abtrennung der wässrigen Phase, sondern unmittelbar die Zugabe der Enzyme. Die vorhandenen Schleimstoffe verbleiben also vorerst im Öl bzw. in der Emulsion. Die Abtrennung der wässrigen Phase und damit der Enzyme erfolgt erst nach

Einwirkung der Enzyme auf das (ggf. vorkonditionierte) Rohöl. Ein Triglycerid im Sinne der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Pflanzenöl, besonders bevorzugt ein rohes Pflanzenöl, oder ein Gemisch aus einem pflanzlichen und einem tierischen Öl.

Insbesondere weist das mindestens eine Glykosid-spaltende Enzym eine Substratspezifität dergestalt auf, dass es

α (1- ) glykosidische, α ( 1-2 ) glykosidische, α ( 1-6) glykosidische, ß ( 1-2 ) glykosidische, ß ( 1-3) glykosidische, ß ( 1-4 ) glykosidische und/oder ß ( 1-6) glykosidische Bindungen spaltet. Bevorzugt werden α ( 1-4 ) glykosidische Bindungen gespalten. In einer Ausführungsform wird das mindestens eine Glykosid- spaltende Enzym aus Amylasen, Amyloglucosidasen, Isoamylasen, Glucoamylasen, Glucosidasen, Galactosidasen, Glucanasen,

Pullulanasen, Arabinasen, Laminaranasen, Pektolyasen,

Mannanasen, Dextranasen, Pectinasen, Cellulasen, Cellobiasen, und Xylanasen ausgewählt.

Insbesondere ist die Amylase eine alpha-Amylase und bevorzugt eine alpha-Amylase, welche spezifisch α ( 1- ) glykosidische Bindungen spaltet. Besonders bevorzugt stammt die alpha-Amylase aus folgenden Spezies: Bacillus sp. , Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus

amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas aeroginosus, Pseudomonas fluorescens, Aspergillus oryzae, oder Aspergillus niger, insbesondere auch Bacillus subtilis und Aspergillus oryzae.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird nur alpha-Amylase als Enzym eingesetzt, insbesondere alpha-Amylase aus Bacillus subtilis und/oder Aspergillus oryzae.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann das eine oder mehrere der eingesetzten Glykosid-spaltenden Enzyme in

geträgerter Form vorliegen.

Die bevorzugt eingesetzten Öle der vorliegenden Erfindung sind Sojaöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl, Reiskleieöl, Erdnussöl, Leindotteröl , oder Baumwollsaatöl, insbesondere Sojaöl, Rapsöl oder Sonnenblumenöl. Bevorzugt werden die genannten Öle im rohen Zustand (Rohöle) im

erfindungsgemäßen Verfahren gemäß den Schritten a) und bl) eingesetzt.

Alternativ kann - anstelle des Pflanzenöls selbst - auch ein Pflanzenölschleim in den Schritten a) und b2) eingesetzt werden, der durch Abtrennung aus den vorstehend genannten Ölen erhalten wurde. Dadurch kann das in der Schleimphase

enthaltene Öl zurückzugewonnen und überdies das im Schleim enthaltene Lecithin entölt werden.

Eine Ausführungsform betrifft die Verwendung eines Glykosid- spaltenden Enzyms zur Erhöhung der Ölausbeute bei der

Durchführung einer wässrigen Öl-Entschleimung, und ferner zur Verringerung des Ölgehaltes in der Lecithinphase und der

Entölung von Lecithin.

Bei den Enzymen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, handelt es sich um Enzyme, die keine

Phospholipid-spaltenden Enzyme darstellen. Bei einem „Phospholipid-spaltenden Enzym" kann es sich um eine Phospholipase handeln, die in der Lage ist, entweder einen Fettsäurerest oder einen Phosphatidylrest oder eine Kopfgruppe von einem Phospholipid abzuspalten. Beispiele sind die

Phospholipase AI, Phospholipase A2, Phospholipase C,

Phospholipase B, Phospholipase D oder Mischungen aus

Phospholipasen . Des Weiteren kann es sich auch um eine

sogenannte Acyltransferase handeln, bei der die Abspaltung des Fettsäurerests mit einer Übertragung dieses Restes, gefolgt von einer Esterbildung, mit einem freien Sterol in der Ölphase verbunden ist. „Phospholipid-spaltend" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes Enzym genannt, das

Phospholipaseaktivität und/oder Acyltransferaseaktivität als Haupt- oder Nebenaktivität aufweist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung kein Phospholipid-spaltendes Enzym.

Weiterhin ist es bevorzugt, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung keine Phosphatasen, d.h. Enzyme mit

Phosphataseaktivität als Hauptaktivität, bzw. keine weiteren Enzyme, insbesondere Glykosid-spaltenden Enzyme, mit

Phosphataseaktivität als Haupt- oder Nebenaktivität eingesetzt werden. Unter dem Begriff „Phosphataseaktivität" wird im

Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass das Enzym aus Phosphorsäureestern oder Polyphosphaten Phosphorsäure abspalten kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung kein Enzym, das Phosphataseaktivität aufweist.

Bezüglich der erfindungsgemäßen Glykosid-spaltenden Enzyme sind solche bevorzugt, die α ( 1- ) glykosidische,

α ( 1-2 ) glykosidische, α ( 1-6) glykosidische, ß ( 1-2 ) glykosidische, ß (1-3) glykosidische, ß ( 1-4 ) glykosidische und/oder

ß ( 1-6) glykosidische Bindungen spalten, z.B. Amylasen,

Amyloglucosidasen, Isoamylasen, Glucoamylasen, Glucosidasen, Galactosidasen, Glucanasen, Pullulanasen, Arabinasen,

Laminaranasen, Pektolyasen, Mannanasen, Dextranasen,

Pectinasen, Cellulasen, Cellobiasen, und Xylanasen. Dabei kann auch eine Kombination aus zwei oder mehr der vorgenannten

Glykosid-spaltenden Enzyme eingesetzt werden.

Die Enzyme können dabei von einem beliebigen Organismus (z.B. auch isoliert aus einem thermophilen Organismus) oder einer synthetischen Quelle stammen. Es ist im Rahmen der

vorliegenden Erfindung auch möglich, dass Enzyme gleicher Art eingesetzt werden, die jedoch aus unterschiedlichen Quellen bzw. Spezies stammen. Ebenso sind rekombinant hergestellte, chimäre Fusionsproteine aus zwei oder mehreren verschiedenen Spezies mit enzymatischer Aktivität umfasst.

Es sind ferner Amylasen, insbesondere oc-Amylasen, ß-Amylasen, γ-Amylasen und Isoamylasen, sowie Mannanasen bevorzugt.

Bezüglich der Amylasen und Mannanasen sind solche aus Bacillus bzw. Pseudomonas bzw. fungalen Spezies oder aus Pankreas

(Säugetier) bevorzugt, insbesondere solche aus Bacillus sp. , Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus

megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus

stearothermophilus, Pseudomonas aeroginosus, Pseudomonas fluorescens, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger oder

Trichoderma reesei. Im Falle der Mannanase ist eine solche aus Trichoderma reesei besonders bevorzugt.

Für die Entschleimung von Sojaöl ist insbesondere eine a- Amylase aus Bacillus-Species bevorzugt. Für die Entschleimung von Rapsöl ist insbesondere eine α-Amylase aus Bacillus-Spezies oder Aspergillus-Spezies bevorzugt, insbesondere Bacillus subtilis bzw. Aspergillus oryzae.

Es können Triglyceride, vorzugsweise rohe Pflanzenöle, als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, die mit dem Glykosid- spaltenden Enzym in Kontakt gebracht werden (Schritt a) und anschließend in Schleimstoffe und (entschleimte) Triglyceride getrennt werden; (Schritt bl) .

Alternativ zu den Triglyceriden kann ein Pflanzenölschleim, der z.B. durch ein herkömmliches Entschleimungs-Verfahren, wie z.B. durch Behandlung mit Wasser oder wässriger Säure, erhalten wurde, mit dem Glykosid-spaltenden Enzym in Kontakt gebracht werden (Schritt a) und anschließend in eine wässrige Lecithin-haltige Phase und eine Ölphase aufgetrennt werden; (Schritt b2) . In Fall der Abtrennung des Pflanzenölschleims nach einem herkömmlichen Verfahren, wird das Glykosid- spaltende Enzym nach der Abtrennung des Pflanzenölschleims diesem zugesetzt, da ein solcher Pflanzenölschleim noch nicht mit erfindungsgemäßen Enzymen in Kontakt gebracht worden ist. Mit dieser Vorgehensweise kann folglich aus Pflanzenölschleim sowohl weiteres Öl als auch entöltes Lecithin gewonnen werden.

Beiden Alternativen gemeinsam sind die Verfahrensschritte des in-Kontakt-Bringens der Ausgangsmaterialien mit dem Glykosid- spaltenden Enzym und die anschließende Trennung in eine wässrige und eine ölige Phase; oder verkürzt ausgedrückt: die Gewinnung von lecithinfreiem Öl und ölfreiem Lecithin durch Trennung mittels Enzymen.

Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt darin, dass weniger Öl in der Lecithinphase enthalten ist und daher für die weitere Aufarbeitung, insbesondere bei der anschließenden Entölung des Lecithins Kosten gespart werden. Gleichzeitig steigt die Ölausbeute für die Weiterverarbeitung des

Pflanzenöles, was wiederum zu einem Gewinn führt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die

Enzymaktivität der Glykosid- spaltenden Enzyme im Bereich von 0,01 bis 6 units/g Öl, bevorzugt 0,1 bis 3 units/g Öl und besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 2,5 units/g Öl gewählt und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 1 units/g Öl. (Unit: Internationale Einheit für Enzymaktivität; 1 Unit entspricht dem Substratumsatz von 1 mol/min) . Die Enzyme können dabei beispielsweise gefriergetrocknet und in Wasser oder entsprechendem Enzympuffer gelöst verwendet werden. Als Beispiel können Citratpuffer 0,01 - 0,25 M, pH 3,8-7,5, oder Acetatpuffer 0,01 - 0,25 M, pH 3,8-7,5

bevorzugt, genannt werden. In einer bevorzugten

Ausführungsform werden die Enzyme in Wasser oder Enzympuffer aufgenommen und dem Rohöl zugesetzt. Um eine bessere Löslichkeit der Enzyme - insbesondere in den Phospholipide enthaltenden Mischungen - zu erreichen, ist auch der Zusatz von organischen Lösungsmitteln möglich. Diese finden Anwendung z. B. in der Auftrennung der Phospholipide. Bevorzugt

verwendet werden unpolare organische Lösungsmittel wie z.B. Hexan oder Aceton oder Mischungen, bevorzugt in einer Menge von 1 bis 30 Gew.-% (Beispiele möglicher Lösungsmittel sind beschrieben in der EP 1531182 A2) .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden eines oder mehrere der verwendeten Enzyme in geträgerter Form eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte

Trägermaterialien sind anorganische Trägermaterialien wie z.B.

Kieselgele, Fällungskieselsäuren, Silikate oder Alumosilikate und organische Trägermaterialien wie z. B. Methacrylate oder Ionentauscherharze . Der Vorteil des geträgerten Enzyms liegt in der leichteren Abtrennbarkeit des Enzyms und/oder der iederverwertbarkeit des Enzyms.

Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäßen Glykosid-spaltenden Enzyme effektiv das Schleimvolumen und die Emulgierbarkeit von Pflanzenöl in wässrigen Phasen verringern. Dabei kann das erfindungsgemäße Verfahren besonders

vorteilhaft für die Entschleimung von rohem Pflanzenöl oder auch zur Aufbereitung der Schleimphase eingesetzt werden. Die Schleimphase kann dabei beispielsweise durch ein herkömmliches Entschleimungsverfahren oder durch das erfindungsgemäße

Verfahren, wenn es zur Entschleimung von rohem Pflanzenöl eingesetzt wird, erhalten werden.

Erstaunlicherweise wurde hierbei gefunden, dass es durch den Zusatz der Enzyme gelingt, die Reaktionsgeschwindigkeit bei der Entschleimung zu erhöhen, das Schleimvolumen zu

erniedrigen und/oder die Abtrennbarkeit der gebildeten

Schleimphase zu verbessern.

Das „in-Kontakt-Bringen" kann im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugte Arten des in-Kontakt-Bringens ist dabei ein Vermischen des Rohöls und des Glykosid-spaltenden Enzyms.

Nach dem Mischen des Rohöls mit dem Enzym wird die Mischung aus Rohöl und Enzym bevorzugt gerührt und somit werden die Bestandteile miteinander in Kontakt gebracht. Besonders bevorzugt wird mit einem Flügelrührer bei 200 bis 800 U/min, bevorzugt 250 bis 600 U/min und am meisten bevorzugt bei 300 bis 500 U/min gerührt.

Die Temperatur der Mischung liegt während des in-Kontakt- Bringens bevorzugt im Bereich von 15 bis 99 °C, bevorzugter im Bereich von 20 bis 95 °C, weiter bevorzugt von 30 bis 80 °C, ebenfalls bevorzugt von 35 bis 80 °C, und besonders bevorzugt 37 bis 78 °C. Dabei soll gemäß einer Ausführungsform die

Temperatur der Mischung immer so gewählt werden, dass die Denaturierungstemperatur der Enzyme nicht überschritten wird, bevorzugt liegt die Temperatur der Mischung mindestens 5 °C unter der Denaturierungstemperatur der Enzyme bzw. der

niedrigsten Denaturierungstemperatur der Enzyme. Wobei bei Einsatz von Enzymen, die aus thermophilen Organismen isoliert wurden, grundsätzlich höhere Temperaturen zu bevorzugen sind. Werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere thermostabile Enzyme eingesetzt, so liegt die

Prozesstemperatur bevorzugt im Bereich von 60 bis 120 °C, bevorzugter im Bereich von 80 bis 100 °C. Die Verwendung thermostabiler Enzyme hat den Vorteil, dass somit eine erhöhte Verfahrenstemperatur gewählt werden kann, wodurch die

Viskosität des Pflanzenöls verringert wird und das Verfahren insgesamt verkürzt werden kann - auch aufgrund einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit der Enzyme. Des Weiteren erübrigt sich im Falle einer Vorbehandlung, die vorteilhaft ebenfalls bei erhöhten Temperaturen durchgeführt wird, ein

anschließendes Abkühlen unterhalb einer niedrigeren

Denaturierungstemperatur der eingesetzten Enzyme. Insgesamt führt die Verwendung thermostabiler Enzyme damit zur einer Verfahrensverkürzung und Kostensenkung.

Je nach Anwendung des Lecithins ist es bevorzugt, das im abgetrennten Lecithin enthaltene Enzym zu denaturieren, beispielsweise durch Erhitzen des Lecithins für 0,5 bis 10 Minuten auf 80 bis 100 °C Grad, je nach eingesetztem Enzym. Im Falle der Verwendung von thermostabilen Enzymen ist darauf zu achten, dass das Lecithin durch den Denaturierungsvorgang thermisch nicht zu stark belastet wird, da es sonst

unansehnlich wird bzw. sich verfärbt und z.B. für

Lebensmittel-Anwendungen nicht mehr in Betracht kommt.

Die Dauer des in-Kontakt-Bringens liegt dabei bevorzugt im Bereich von 1 Minute bis 12 Stunden, bevorzugter von 5 Minuten bis 10 Stunden, weiter bevorzugt von 10 Minuten bis 3 Stunden.

Der pH Wert der Mischung liegt während des in-Kontakt-Bringens bevorzugt im Bereich von pH 3 bis pH 8, besonders bevorzugt im Bereich von pH 3,5 bis pH 7,5.

Das Abtrennen der Schleimstoffe gemäß Schritt b) des

erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung jedoch über Zentrifugation oder Filtration, wobei Zentrifugation bevorzugt ist. Bei der Zentrifugation erfolgt eine Phasentrennung der Mischung, sodass das behandelte Pflanzenöl, die Schleimstoffe und die Enzymzusammensetzung in separaten Phasen vorliegen, die leicht voneinander getrennt werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei die Phase enthaltend die Schleimstoffe sowie die Phase, welche das Enzym für das erfindungsgemäße Verfahren enthält, von dem

behandelten Öl abgetrennt. Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn gleichzeitig mit den Schleimstoffen das Enzym abgetrennt wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden

Erfindung betrifft zudem ein Verfahren wie vorstehend

beschrieben, weiter umfassend den Schritt c) erneutes in-Kontakt-Bringen der Triglyceride gemäß

Schritt bl) mit der Enzymkomponente. Das in-Kontakt-Bringen erfolgt dabei bevorzugt unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend für Schritt a) des

erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Dabei werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die Enzyme vor dem erneuten in-Kontakt-Bringen einer Regeneration oder Reinigung unterzogen .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das rohe Pflanzenöl vor dem in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Wasser und/oder Säure in Kontakt gebracht. Bevorzugte Säuren sind dabei Calcium- und Magnesium-komplexierende Säuren allein oder in Kombination, wie z. B. Zitronensäure und Phosphorsäure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des

erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor Schritt a) des

Verfahrens eine sogenannte Vorkonditionierung durchgeführt indem das rohe Öl in einem eigenen Verfahrensschritt mit einer Menge von 200 - 2000 ppm an organischer Säure, bevorzugt

Zitronensäure, vermischt wird. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 35 bis 90 °C eingestellt, besonders bevorzugt 48°C oder 80°C. Nach einer Reaktionszeit von 5

Minuten bis 2 Stunden, bevorzugt 15 Minuten bis 1 Stunde wird die Mischung durch Zugabe einer stöchiometrischen Menge Lauge, bevorzugt Natronlauge in einer Menge von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/1, besonders bevorzugt 1 Mol/1 auf einen pH von 4-5 eingestellt. Die wässrige Phase bzw. die Salzlösung werden nicht von der Ölphase abgetrennt, sondern es folgt die

Ausführung des Schrittes a) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vor Schritt a) ein in-Kontakt-Bringen des Rohöles mit Wasser bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 5 bis 240 Minuten, bevorzugt 10 bis 60 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 90 °C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 90 °C besonders bevorzugt ist. In einer weiteren möglichen Ausführungsform wird die Temperatur vor Zugabe des Enzyms auf eine Temperatur gebracht, die optimal für das eingesetzte Enzym ist. Temperaturen zwischen 35 bis 80 °C, besser zwischen 40 bis 78 °C sind geeignet, wobei durch Einsatz von Enzymen aus thermophilen Organismen, also besonders temperaturstabilen Enzymen, ein Einsatz bei 80 bis 100 °C möglich ist, so dass zwischen dem in-Kontakt-Bringen des rohen Pflanzenöls mit Wasser und dem in-Kontakt-Bringen mit dem Enzym des erfindungsgemäßen Verfahrens keine

Temperaturabsenkung erfolgen muss. In einer weiteren möglichen Ausführungsform wird anschließend die wässrige Phase, z.B. durch Zentrifugation, abgetrennt.

Des Weiteren wird in einer bevorzugten Ausführungsform das Rohöl vorentschleimt . Das in-Kontakt-Bringen des rohen

Pflanzenöles mit Wasser oder wässriger Säure, insbesondere Zitronensäure oder Phosphorsäure, erfolgt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 5 bis 240 Minuten, bevorzugt 10 bis 120 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 90 °C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 90 °C besonders bevorzugt ist. In einer weiteren möglichen Ausführungsform wird anschließend die säurehaltige oder wässrige Phase z. B. durch

Zentrifugation abgetrennt. In einer bevorzugten

Ausführungsform wird nach der Säurebehandlung ein

Neutralisationsschritt mit einer entsprechenden Base erfolgen, um einen pH-Wert von 3,5 bis 8,0, bevorzugt von 4 bis 7 zu erreichen. Anschließend kann das Öl von den erhaltenen

Schleimstoffen durch z. B. Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden.

Vor Zusatz der Enzyme wird die Reaktionstemperatur

vorzugsweise so eingestellt, dass sie den optimalen

Temperaturbereich des Enzyms nicht übersteigt, um ein

Denaturieren des Enzyms zu verhindern. Temperaturen zwischen 35 bis 80 °C, besser zwischen 40 bis 78 °C sind geeignet, wobei durch Einsatz von Enzymen aus thermophilen Organismen, also besonders temperaturstabilen Enzymen, ein Einsatz bei 80 bis 100 °C möglich ist, so dass zwischen dem in-Kontakt- Bringen des rohen Pflanzenöls mit Wasser und/oder Säure und dem in-Kontakt-Bringen mit dem Glykosid-spaltenden Enzym keine Temperaturabsenkung erfolgen muss. Eine Erhöhung der

Temperaturstabilität kann auch durch eine Immobilisierung der Enzyme der Enzymkomponenten erreicht werden. Da viele Enzyme eine gewisse Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln aufweisen (Faber, K. , Biotransformations in Organic Chemistry (2001), Springer-Verlag, Heidelberg), können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch dementsprechend vorbehandelte Öle oder Schleime mit den Enzymen behandelt werden.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen, die den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken, umfasst das Verfahren zur enzymatischen Entschleimung von

Triglyceriden der vorliegenden Erfindung die Schritte Allgemeine Ausführungsform 1) a) in-Kontakt-Bringen der Triglyceride, vorzugsweise

ausgewählt aus rohem Sojaöl und/oder rohem Rapsöl und/oder rohem Palmöl, mit einer Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Glykosid-spaltendes Enzym, vorzugsweise einem Enzym, das alpha-glykosidische

Bindungen spaltet, insbesondere einem Enzym, das alpha ( 1-4 ) -glykosidische Bindungen spaltet, wobei das mindestens eine Glykosid-spaltende Enzym keine Phospholipase- und keine Acyltransferase-Aktivität aufweist und keine Phospholipase und keine

Acyltransferase in der Zusammensetzung vorhanden sind; b) Abtrennen der Schleimstoffe von den Triglyceriden durch Zentrifugation .

Dabei ist es insbesondere bevorzugt, dass die Zusammensetzung kein Phospholipid-spaltendes Enzym umfasst, wobei es am

meisten bevorzugt ist, dass die Zusammensetzung zudem kein Enzym mit Phosphataseaktivität umfasst.

Allgemeine Ausführungsform 2)

Gemäß der allgemeinen Ausführungsform 2) wird - anstelle des rohen Pflanzenöls - die durch ein herkömmliches

Entschleimungs-Verfahren oder durch das erfindungsgemäße

Verfahren abgetrennte Schleimphase mit dem Glykosid-spaltenden Enzym „in-Kontakt-gebracht" . Das Verfahren erfolgt bevorzugt gemäß der Ausführungsform 1) . Dieses Verfahren ermöglicht beispielsweise die Rückgewinnung von Öl aus der Schleimphase, welches in der Schleimphase enthalten war und von dieser abgetrennt wurde; es führt damit zu einer Erhöhung der

Ölausbeute.

Wenn die Gewinnung des Pflanzenölschleims nach einem

herkömmlichen Verfahren, z.B. mit Wasser oder mit wässriger Säurelösung, erfolgt ist, kann das erfindungsgemäße Enzym nach Abtrennung der (Lecithin-haltigen) Schleimphase zu dem

Pflanzenölschleim gegeben werden, um weiteres Öl aus dem

Pflanzenölschleim zu extrahieren. In diesem Fall bezieht sich der Ausdruck „nach Abtrennung der (Lecithin-haltigen)

Schleimphase" nicht auf den Schritt b2) des erfindungsgemäßen Verfahrens . Im Gegensatz zur allgemeinen Ausführungsform 2) wird in der allgemeinen Ausführungsform 1) das erfindungsgemäße Enzym vor der Abtrennung der Schleimphase vom Öl (Schritt bl) zugegeben. Dieser Umstand ist durch die Reihenfolge der Schritte a) und bl) festgelegt. Die Verfahrensschritte in den Ausführungsformen 1) und 2) sind identisch: nämlich a) Kontaktieren des Ausgangsmaterials, seien es (rohe) Triglyceride oder (unvollständig entölter) Pflanzenölschleim, mit dem erfindungsgemäßen Enzym, und

Trennen der Mischung in eine wässrige Schleimphase und eine Triglycerid-haltige Ölphase im Falle von Triglyceriden nach Schritt bl) bzw. Trennen in eine wässrige (Lecithin-haltige) Phase und eine Ölphase im Falle von Pflanzenölschleim aus Ausgangsmaterial nach Schritt b2 ) . Ebenso erfolgt die

Durchführung des Verfahrens nach beiden Ausführungsformen 1) und 2) mit den gleichen Vorrichtungen und nach den gleichen Prinzipien. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es

möglich, das Schleimvolumen des Öls abzusenken, ohne dass Phospholipid-spaltende Enzyme eingesetzt werden. Methoden

Bestimmung der Ölausbeute, des Ölgehalts in der Schleimphase und des Schleimvolumens

Die Bestimmung der Ölausbeute, des Ölgehalts in der

Schleimphase und des Schleimvolumens sind durch die Bestimmung des Schleimvolumens nach standardisiertem Verfahren, wie sie auch in PCT/EP 2013/053 199 beschrieben sind, detektierbar . Weiterhin kann durch Soxhlet-Extraktion des isolierten

Schleims der ölgehalt des Schleims separat gemäß DIN ISO 659 bestimmt werden.

Bestimmung der Phospholipase-Aktivität

Um eine Phospholipase- oder Acyltransferase-Aktivität bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auszuschließen, wurde der Gehalt an freien Fettsäuren während des Entschleimungsverfahrens im Öl untersucht. Dies erfolgt nach Modifikation der

Referenzmethode N.G.D. C10, der American Oil Chemistry Society (AOCS) Ca 5a-40. Zur Bestimmung der freien Fettsäuren wird ein Foodlab-Gerät der Firma cdR (Italien) verwendet, das ein selbstständiges, kompaktes Analysengerät mit einem eingebauten

Spektralphotometer darstellt; es besteht aus einem

temperierten Inkubationsblock mit 12 Zellen für Küvetten und 3 unabhängigen Messzellen mit jeweils 2 Lichtstrahlen von unterschiedlicher Wellenlänge.

Nach dem Einschalten des Foodlab-Geräts zur Photometrischen Bestimmung des Anteils freier Fettsäuren (FFA) , werden die gebrauchsfertigen Messküvetten der Firma CDR auf 37 °C

vorgewärmt, dann erfolgen die Auswahl der Methode zur FFA- Bestimmung im Menü und die Bestimmung des Blindwerts der

Küvette. Anschließend wird das erforderliche Volumen

Pflanzenöl in die Lösung der Messküvette, bestehend aus einem Mix diverser Alkohole, KOH und Phenolphthalein-Derivaten, einpipettiert. Je nach FFA-Gehalt werden für Sojaöl

üblicherweise 2,5 pL und für Rapsöl 1 pL Probe verwendet. Das aus der Pflanzenölprobe aufgenommene Volumen wird ein Mal verworfen um die Pipette zu spülen, dann wird erneut Probe aufgenommen und in die fertige Messlösung pipettiert. Die

Pipette wird danach exakt zehnmal mit der Messlösung gespült, um das Volumen der Ölprobe so wenig wie möglich zu

verfälschen. Daraufhin wird die Küvette zehnmal per Hand geschwenkt. Die Fettsäuren in der Probe (bei pH <7,0)

reagieren mit einem chromogenen Anteil und bilden einen

Farbkomplex, dessen Intensität anschließend bei 630 nm in der Messzelle des Geräts bestimmt wird. Er wird vom Gerät in

Prozent von Ölsäure angezeigt und ist proportional der

Gesamtsäurekonzentration in der Probe. Während der enzymatischen Entschleimung über 4 Stunden beträgt im Allgemeinen die (relative) Steigerung der Konzentration der freien Fettsäuren, ausgedrückt als Ölsäure und bezogen auf die Gesamtmenge der gesamten Fettsäuren, nicht mehr als 10 %, vorzugsweise nicht mehr als 8 %. Die Bestimmung wird nach der Modifikation der Referenzmethode N.G.D. C10, AOCS Ca 5a-40 durchgeführt .

Die Erhöhung der Konzentration an freien Fettsäuren beträgt während der enzymatischen Entschleimung z. B. für ein Sojaöl nicht mehr als eine Steigerung von z. B. 0,22 Gew.-% freie Fettsäuren auf 0,24 Gew.-% freie Fettsäuren, bestimmt als freie Ölsäure und bezogen auf die Gesamtmasse der Fettsäuren, bei einem pH-Wert < 7 und bestimmt nach Modifikation der

Referenzmethode N.G.D. C10, AOCS Ca 5a-40; (siehe Tabelle 1)

Im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Enzymen ist die

Steigerung der Konzentration der freien Fettsäuren, gemessen nach derselben Methode, bei Zugabe eines Phospholipid- spaltenden Enzyms, wie z.B. der Phospholipase AI (PLA 1), in Tabelle 1 dargestellt. Im Laufe der Reaktion erhöht sich die Konzentration der FFA von 0,15 Gew.-% nach 10 min

Reaktionszeit auf 0,34 Gew.-% nach 240 min Reaktionszeit, so dass eine relative Zunahme der FFA-Konzentration um 126 % vorliegt . Ähnliche Verhältnisse liegen bei der enzymatischen

Entschleimung von z.B. einem Rapsöl vor (siehe Tabelle 2). Die erfindungsgemäße Amylase aus Aspergillus erhöht die

Konzentration an freien Fettsäuren von 1,69 Gew.-% nach 10 min auf 1,71 Gew.-% nach 240 min nur um relativ 1,2 %. Ebenso steigert die Amylase PET die Konzentration an freien

Fettsäuren von 1,76 Gew.-% nach 10 min auf 1,79 Gew.-% nach 180 min, so dass eine relative Zunahme der FFA-Konzentration von 1,7 % vorliegt. Im Gegensatz dazu steigert das Phospholipid-spaltende Enzym PLA 1 die Konzentration an freien Fettsäuren von z.B. 1,76 Gew.-% nach 10 min auf 2,22 Gew.-% nach 240 min, so dass eine relative Zunahme der FFA-Konzentration um 26 % vorliegt.

Tabelle 1: Sojaöl: Ergebnisse der FFA-Messungen in Gew.-% während der enzymatischen Olentschleimung und Vergleich mit einem Glykosid-spaltenden Enzym - Phospholipase A 1 (PLA 1)

Tabelle 2: Rapsöl: Ergebnisse der FFA-Messungen in Gew.-% während der enzymatischen Olentschleimung und Vergleich mit einem Glykosid-spaltenden Enzym - Phospholipase A 1 (PLA 1)

FFA [%]α- 1,76 1,79 1,73

Amylase PET

FFA [%] PLA 1 1,76 1, 99 2,22

Tabelle 3

Sojaöl: Ergebnisse der FFA-Messungen in Gew.-% während der enzymatischen Olentschleimung und Vergleich mit einem

Glykosid-spaltenden Enzym - Phospholipase A 1 (PLA 1)

Die Einheiten der Werte in den Tabellen 1 und 2 stellen Gew.-% dar und geben den Anteil der freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, im Verhältnis zu den gesamten Fettsäuren an. Die Werte werden nach der Modifikation der Referenzmethode N.G.D. C10, AOCS Ca 5a-40 bestimmt.

Bestimmung des Calcium-, Magnesium- und Phosphorgehaltes in den Pflanzenölen

Die Bestimmung von Phosphor erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22. Variante 1:

Die zu behandelnde Menge Rohöl 400 bis 600 g, wird in einen Duran Reaktor DN120 1000 mL eingefüllt und Proben für die Analytik werden abgenommen. Das Öl im Duranreaktor wird mithilfe einer Heizplatte auf eine Temperatur von

35 bis 90 °C, insbesondere 48 °C oder insbesondere 80°C, aufgeheizt. Nachdem die Temperatur erreicht ist, wird mit der Vorkonditionierung begonnen. Dafür wird eine definierte, von der Ölmenge abhängige Menge verdünnter Zitronensäure (z. B. 450 ppm, 1,372 mL) , zum Öl zudosiert. Anschließend wird die Mischung mit einem Ultraturrax für 1 Minute durchmischt. Als Alternative wird unter Rühren bei etwa 600 rpm, 1 Stunde inkubiert um die Reaktion der Säure abzuwarten. Anschließend wird eine definierte Menge Natronlauge (4 Mol/L, Restmenge zu 3 % v/v, abzüglich Wasser aus Säurezugabe und Enzymzugabe) zugegeben und es wird weitere 10 Minuten unter Rühren

inkubiert. Bei der Vorbehandlung bei 80 °C wird vor Zugabe des Enzyms die Mischung auf z. B 50 °C heruntergekühlt. Dann erfolgt die Zugabe des Enzyms, der Enzym-Mischung oder des Immobilisats , vorzugsweise gelöst in Puffer. Das Enzym wird untergerührt, wofür die Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (1 Minute auf 900 rpm), anschließend wird bei niedrigerer Drehzahl weitergerührt. Am Ende der Reaktion wird die Ölphase von der Schleimphase durch Zentrifugation

getrennt, und der Restölgehalt der Schleimphase nach Soxhlet- Extraktion bestimmt.

Variante 2 ;

In einer weiteren Durchführung werden Glykosid-spaltenden Enzyme alleine oder in einer geeigneten Kombination als freie Enzyme oder immobilisierte Enzyme zusammen mit einer wässrigen Phase 0,05 bis 5 % w/v, dem Rohöl zugesetzt. Die Emulsion, bestehend aus Wasser, Enzym, eventuell Enzymträgern und Öl, wird durchmischt. Idealerweise wird die Reaktion temperiert zwischen 30 bis 80 °C, besser zwischen 40 bis 78 °C

durchgeführt. Anschließend wird die Phasentrennung abgewartet, die Feststoffe setzen sich ab oder können nach einem dem

Fachmann bekannten Standardverfahren z. B. über Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Als Nachbehandlung kann das Öl mit verdünnter Säure (z. B. Zitronensäure) oder Lauge nach einem dem Fachmann als „Degumming" bekannten Verfahren

restentschleimt werden. Variante 3:

In einer weiteren Durchführung wird Ölschleim mit Enzymen behandelt. Dem Ölschleim, welcher nach einem dem Fachmann als „degumming" bekannten Verfahren erhalten wird, werden

Glykosid-spaltende Enzyme zugesetzt. Diese können sich gelöst in einer wässrigen Phase oder suspendiert in einem organischen Lösungsmittel befinden. Der Ansatz wird idealerweise auf eine Temperatur zwischen 20 bis 70 °C temperiert, besser auf eine Temperatur zwischen 35 bis 60 °C. Der Ansatz wird durchmischt bis der Prozess abgeschlossen ist. Dies kann durch

Viskositätsmessungen überprüft werden oder visuell, durch Auflösen der ansonsten festen Schleimphase. Durch

Zentrifugation lässt sich eine Phasenseparation erreichen, die einzelnen Phasen können abgetrennt werden. In der Regel besteht die obere Phase aus dem gewonnenen Öl, die mittlere Phase aus den Phospholipiden und die untere Phase ist eine wässrige Phase und enthält die Enzyme. Durch Wiederverwendung der wässrigen Phase lassen sich die Enzyme recyceln und wiederverwenden. Je nach Gehalt zweiwertiger Ionen rauss das Öl oder die das Enzym enthaltende Wasserphase durch Zusatz von Komplexierungsmitteln vor der weiteren Verwendung von den Ionen bereinigt werden.

Variante :

In einer weiteren Durchführung wird das Rohöl auf eine hohe Temperatur gebracht, vornehmlich 70 bis 100 °C, genauer 75 bis 85 °C. Das Rohöl wird nach dem oben beschriebenen Verfahren mit Säure und Lauge konditioniert, die Temperatur wird

beibehalten und es werden thermostabile Enzyme zusetzt. Im Weiteren wird wie bereits beschrieben fortgefahren. Das Enzym wird untergerührt, wofür die Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (z. B. 1 Minute auf 900 rpm) , anschließend wird bei 600 rpm weitergerührt, bis die Reaktion beendet ist. Die Abtrennung des Ölschleims kann wie vorhergehend beschrieben erfolgen .

Variante 5:

In einer weiteren Durchführung wird das Rohöl auf eine hohe Temperatur gebracht, vornehmlich 70 bis 100 °C, genauer 75 bis 85 °C. Es werden thermostabile Glykosid-spaltenden Enzyme alleine oder in einer geeigneten Kombination als freie Enzyme oder immobilisierte Enzyme zusammen mit einer wässrigen Phase 0,05 bis 5 % w/v, dem Rohöl zugesetzt. Die Emulsion, bestehend aus Wasser, Enzym, eventuell Enzymträgern und Öl, wird

durchmischt. Im Weiteren wird wie bereits beschrieben

fortgefahren. Das Enzym wird untergerührt, wofür die

Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (z. B. 1 Minute auf 900 rpm) , anschließend wird bei 600 rpm weitergerührt, bis die Reaktion beendet ist. Die Abtrennung des Ölschleims kann wie vorhergehend beschrieben erfolgen.

Beispiele :

Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Beispielen näher erläutert. Es wird hierbei betont, dass die Beispiele

lediglich veranschaulichenden Charakter besitzen und besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Die Beispiele beschränken den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht.

Beispiel 1: Rohes Sojaöl (mit Vorkonditionierung)

Gemäß Reaktionsvariante 1 wurde ein Sojaöl einer

Vorkonditionierung mit Hilfe von wässriger Zitronensäure

(1000 ppm) und wässriger Natronlauge (4 Mol/L) unterzogen (Gesamtwassergehalt der Reaktion: 3%). Als Vergleich wurde eben diese Vorkonditionierung mit Zugabe eines Enzyms, alpha Amylase aus dem Organismus aus dem Organismus Bacillus spec. (Sigma-Aldrich) durchgeführt (siehe Tabelle 1) .

Tabelle 3: Sojaöl: Gesamtölausbeute der Reaktionen aus

Beispiel 1 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase

Beispiel 2:

Rohes Rapsöl (mit Vorkonditionierung)

Gemäß Reaktionsvariante 1 wurde ein Rapsöl einer

Vorkonditionierung mit Hilfe von wässriger Zitronensäure

(1000 ppm) und wässriger Natronlauge (4 Mol/L) unterzogen

(Gesamtwassergehalt der Reaktion: 3%) . Als Vergleich wurde eben diese Vorkonditionierung mit Zugabe eines Enzyms Amylase PET aus dem Organismus Bacillus subtilis (ASA Spezialenzyme GmbH) oder einer α-Amylase aus Aspergillus oryzae (Sigma- Aldrich) durchgeführt (siehe Tabelle 2). Tabelle 4: Rapsöl: Gesamtölausbeute der Reaktionen aus

Beispiel 2 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase

In den Tabellen 1 und 2 ist die Gesamtölausbeute der

Reaktionen aus Beispiel 1 und 2 nach Soxhlet-Extraktion der Schleimphase dargestellt. Hierbei ist ersichtlich, dass die eingesetzten Glykosid-spaltenden Enzyme die Ölausbeute im Vergleich zum Standardprozess mit Zitronensäure erheblich steigern . Es werden weltweit 43 Mio Tonnen Sojaöl hergestellt. Die

Ausbeutesteigerung der Ölmenge von 97,1% beim Standardprozess auf 97,9% durch eine alpha-Amylase Bac. spec. würde bedeuten, dass 0,35 Mio Tonnen mehr Sojaöl hergestellt werden könnten.

Von Rapsöl werden weltweit ca. 23,5 Mio Tonnen hergestellt. Hier bedeutet die Ausbeutesteigerung der Ölmenge von 96,2% beim Standardprozess auf 97,4% durch die Amylase PET, dass ca. 0,3 Mio Tonnen mehr Rapsöl hergestellt werden könnten.

Beispiel 3

Rohes Sojaöl (mit Wasserentschleimung - Lecithingewinnung) Gemäß Reaktionsvariante 2 wurde ein rohes Sojaöl mit einer

Gesamtwassermenge von 2 % versetzt. In dem Wasser wurden je in Einzelexperimenten 1 U/g Öl folgender Enzyme gelöst: alpha Amylase aus Bacillus spec. (Sigma-Aldrich) , Muramylodextranase M 719L, Amylase AD11P, (alle von der Firma Biocatalysts Ltd) . Die Suspension wurde unter Rühren für eine Stunde bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden die Phasen durch Zentrifugation separiert und der Ölgehalt der Lecithinphase bestimmt. Tabelle 5: Ölgehalt der Lecithinphase nach der Reaktion aus Beispiel 3 gemessen nach Soxhlet-Extraktion

In Tabelle 5 ist der Ölgehalt der Lecithinphase nach Reaktion des Sojaöles mit verschiedenen Glykosid-spaltenden Enzymen im Vergleich zum Standardprozess (Wasser) dargestellt. In alles

Fällen wurde die Ölmenge im Lecithin verringert, was bedeutet, dass eine verbesserte Entölung des Lecithins stattgefunden hat und damit gleichzeitig die Ölausbeute erhöht wurde.

Dass der geringere Ölgehalt in der Lecithinfraktion nicht durch eine geringere Ausbeute zustande gekommen ist wird in Tabelle 6 gezeigt. In der Tabelle 6 sind die Ionenwerte des Öles nach der Reaktion dargestellt. Die Konzentration an

Calcium, Magnesium und Phosphor ist in allen Reaktionen vergleichbar. Daher wurde eine ähnliche Ausbeute an Lecithin erzielt.

Tabelle 6: Sojaöl: Konzentration an Calcium, Magnesium und Phosphor, nach Reaktion aus Beispiel 3 Ionen Wasser Alpha Muramylodextranase Amylase

Amylase M719 L AD IIP aus

Bacillus

spec

Calcium 100 112 107 110 [ppm]

Magnesium 46 47 45 45

[ppm]

Phosphor 180 215 194 185 [ppm]

Tabelle 7:

Verwendete Enzyme