以下、実施例によって本発明を具体的に� ��明する。当業者は本明細書の記載に基づい� ��容易に本発明に修飾、変更を加えることが� ��き、それらは本発明の技術的範囲に含まれ� ��。

 ここで、本発明のGCAハイブリッド種は、� ��下の方法で得た。

 まず、低カフェイン含有量のコーヒー原� ��(染色体数2n=22)のユージノイド(C.Eugenoides)種� ��カネフォラ(C.canephora)種を交配に用いた。こ れらの2種を用いて、GCハイブリッド種(染色� �数2n=22)を人工交配させて行う手法を採用し� �。カネフォラ種を雌株として使い、開花の� �から雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製� �袋を被せた。次の日にユージノイド種の開� �したばかりの花の葯をカネフォラ種の雌ず� �に丁寧に塗りつけることにより人工受粉さ� �た。交配用の袋は受粉後3-7日に取り除いた� �交配後、果実の成長を確認して7ヶ月後、成� ��した果実(果実の表皮が緑から赤に変わった 時点)を収穫した。37の交配種子(C1-C37)が得ら� ��た。

 次に、このようにして得られたGCハイブ� �ッド種の染色体数を倍化して4倍体GCハイブ� �ッド種を生産した。

 上述のようにして得られたGCハイブリッ� �種の染色体数を倍化して4倍体GCハイブリッ� �種を生産する方法として、コルヒチンによ� �染色体の倍化方法を用いた。2倍体GCハイブ� �ッドの幹をカットした部位に、コルヒチン1� ��量部、ラノリン50重量部、ココナッツウオ� �ター50重量部の配合割合のペーストを塗布し 、その後、約1週間から1ヶ月後に生育してき� ��4倍体の新しい葉を得た。これにより、100%� �はないが、GCハイブリッド種の中で2種を選� �しコルヒチンを用いて染色体数の倍化を行� �、アラビカ種と同じ染色体数(2n=44)の品種を� ��ることができた。

 次に、前記4倍体GCハイブリッド種とアラ� ��カ種を交配してGCAハイブリッド種を生産し� ��。

 前記4倍体GCハイブリッド種(GC(2n=44)種)と� �ラビカ種を交配する方法は、この両方の親� �使った人工交配によって行われた。より詳� �には、CG種を雌株として使い、開花の花から 雄ずいと葯を取り除き、交配用の紙製の袋を 被せた。次の日にアラビカ種の開花したばか りの花の葯をGC(2n=44)種ずいに丁寧に塗りつけ ることにより人工受粉させた。交配用の袋は 受粉後3-7日に取り除いた。交配後、果実の成 長を確認して9~12ヶ月後、成熟した果実(果実� ��表皮が緑から赤に変わった時点)を収穫した 。GCAハイブリッド種子は、この果実から得ら れた。

 具体的には、上記倍化を行った染色体数2 n=44のGCハイブリッド種とC.arabica種を掛け合わ せGCAハイブリッド種を得る手法を使った。

 GCAハイブリッド種の作出方法では、前記G CAハイブリッド種に、さらにアラビカ種また� ��前記GCAハイブリッド種を1回以上交配してGCA ハイブリッド種を生産する工程を随意取り入 れた。

 より具体的には、GCAハイブリッド種のF1(� ��種第1代目)よりF2(自家受粉およびGCAハイブ� �ッド種同士のかけあわせSib Cross)とBack Cross( 戻し交配)によってGCAハイブリッド種(GCA Proge ncy)を得た。

 また、上記F1同士をかけあわせたものをF2 、上記F2同士をかけあわせたものをF3とする� �き、GCAハイブリッド種のF2とF3の木から採取� ��れた葉と生豆(成熟した果実)のカフェイン� �含有量をHPLC法で測定して低カフェインGCAハ� ��ブリッド種を選別した。

 低カフェインGCAハイブリッド種グループ( カフェイン含有量<0.8%)より、さらにカフェ イン含有量の低い子孫を得るために、低いカ フェイン同士、アラビカとしてカフェインの 低い親と交配する手法を用いた。より具体的 には、上記交配を繰り返し1000本以上の遺伝� �型の違うGCAハイブリッド種を作成しその中� �ら選抜によってカフェイン含有量がごく少� �くアラビカタイプのコーヒーを選抜した。� �お、以下の実施例におけるGCAハイブリッド� �はいずれもF2である。

 〔実施例1〕
 GCAハイブリッド種の官能試験の結果を下記� ��1に示す。下表に示すような評価基準で、8� �目について行なった。なお、評価基準は、� �項目とも、良(5)~普通(3)~悪(1)とした。

 この味覚評価サンプルは、マダガスカル� �シャンバビ試験場より、2006年3月に日本に送 られたハイブリッド種サンプルで、それらの 収穫時期は、2005年8~10月の間であった。また� ��カフェイン含有量は、0.52%であった。

 〔実施例2〕
 実施例1と同様に、別タイプのハイブリッド 種の味覚評価の結果を下記表2に示す。なお� �各項目の評価基準は、先に示したとおりで� �る。

 この味覚評価サンプルも、マダガスカル� �シャンバビ試験場より、2006年3月に日本に送 られたハイブリッド種サンプルで、それらの 収穫時期は、2005年8~10月の間であった。また� ��カフェイン含有量は、上記実施例1のサンプ ル同様、0.52%であった。

 〔実施例3〕
 実施例1と同様に、別タイプのハイブリッド 種の味覚評価の結果を下記表3に示す。なお� �各項目の評価基準は、先に示したとおりで� �る。

 この味覚評価サンプルも、マダガスカル� �シャンバビ試験場より、2006年11月に日本に� �られたGCAハイブリッド種サンプルで、それ� �の収穫時期は、2006年8~10月の間であった。ま た、カフェイン含有量は、0.68%であった。さ� ��に、この味覚評価に用いた液のpHは、5.14で� ��った。

 〔実施例4〕
 実施例1と同様に、別タイプのハイブリッド 種の味覚評価の結果を下記表4に示す。なお� �各項目の評価基準は、先に示したとおりで� �る。

 この味覚評価サンプルも、マダガスカル� �シャンバビ試験場より、2006年11月に日本に� �られたハイブリッド種サンプルで、それら� �収穫時期は、2006年8~10月の間であった。また 、カフェイン含有量は、0.52%であった。さら� ��、この味覚評価に用いた液のpHは、5.23であ� ��た。

 〔実施例5〕
 実施例1と同様に、別タイプのハイブリッド 種の味覚評価の結果を下記表5に示す。なお� �各項目の評価基準は、先に示したとおりで� �る。

 この味覚評価サンプルも、マダガスカル� �イラカ試験場より、2006年11月に日本に送ら� �たハイブリッド種サンプルで、それらの収� �時期は、2006年8~10月の間であった。また、カ フェイン含有量は、0.45%であった。さらに、� ��の味覚評価に用いた液のpHは、5.15であった� ��

 〔比較例1〕
 アラビカ種と交配する前の段階のGCを構成� �るそれぞれ(ユージノイド種とカネフォラ種) について、味覚評価を行なった結果を下記表 6に示す。なお、各項目の評価基準は、先に� �したとおりである。

 この味覚評価サンプルについて、ユージ� ��イドとしては「A16 C.Eugenoides」(2006年 7月 4 日 Madagascar Kianjavato試験場にて、パーチメン トを入手、現地でハリングしたサンプリング )を、カネフォラ種としては「インドネシア  AP-1」(ロット:15/1126/97C)を用いた。

 〔比較例2〕
 アラビカ種と交配する前の段階の2倍体GCに� ��いて、味覚評価を行なった結果を下記表7に 示す。なお、各項目の評価基準は、先に示し たとおりである。

 味覚評価サンプルとしては、2006年11月に� ��Madagascar Kianjavato試験場から入手したサンプ ルを用いた。さらに、この味覚評価に用いた 液のpHは、5.65であった。

 〔比較例3〕
 エチオピア産のコーヒーの味覚評価を行な� ��た結果を下記表8に示す。なお、各項目の評 価基準は、先に示したとおりである。

 〔比較例4〕
 グアテマラ産のコーヒーの味覚評価を行な� ��た結果を下記表9に示す。なお、各項目の評 価基準は、先に示したとおりである。

 〔比較例5〕
 コロンビア産のコーヒーの味覚評価を行な� ��た結果を下記表10に示す。なお、各項目の� �価基準は、先に示したとおりである。

 さらに、この味覚評価に用いた液のpHは� �5.03であった。

 上記味覚評価の結果、アラビカ種との交� ��前のGC種や、GC種を構成するユージノイド種 、カネフォラ種との比較において、アラビカ 種交配後の実施例1~5は、いずれにおいても味 覚の向上が認められた。

 また、実施例1~5は、通常のアラビカタイ� ��3種と比較した場合、2種のアラビカ種より� �、高い評価を得た。すなわち、アラビカ種� �味覚にも、評価の高低において、いくつか� �タイプがあるが、全タイプではないが、ア� �ビカ種並の味覚水準まで大幅に向上してい� �ことを確認した。特に、数値化は難しいが� �アラビカ種交配後の実施例1~5は、ロブスタ� �特有の香り、味覚がなくなっていることが� �認できており、低カフェインでかつ飲料と� �ての味覚や風味を兼ね備えたGCAハイブリッ� �種が得られることがわかる。

 さらに、上記実施例・比較例で用いたサ� ��プルの液性の分析(液性試験)結果を以下、� �11に示す。

 なお、上記液性試験の各項目の詳細は以� ��のとおりである。なお、中細挽焙煎コーヒ� ��8gに対し、熱湯155gを加えて、15分浸漬した� �の上澄み液を分析用試料とした。なお、カ� �ピングに用いたものと同様の方法での抽出� �ある。

 (Brix:示度)
 溶液中に合まれでいるコーヒーの可溶性固� ��分(濃度)を測定した値である。結晶性の物� �が溶液中で光を屈折する性質を利用し、そ� �屈折率によりその合量を測定した。使用し� �装置は、ATAGO社製RX-5000である。なお、Brixの� ��が大きいことは、抽出溶液中に多くの可溶� ��固形分が含まれることを意味し、コーヒー� ��濃厚感が強い(濃い)ことを表す指標になる� �

 (pH)
 一般的に酸味を持つ成成分(無機酸、有機酸 、酸性塩など)は、水中で解離して水素イオ� �を生じる。コーヒー抽出液のpHは7以下とな� �酸性を示すが、コーヒー抽出液のpHを測定す ることで酸味を測る指標となる。測定は、HOR IBA社製F-54を用いて行った。なお、pH値が低い ことは酸味が強いことを示す。

 (酸度:citric.w/v%)
 一般に滴定酸度といわれるが、食品中の遊� ��酸の含有量を測定した値である。0.1N水酸化 ナトリウム水溶液で滴定し、中和に要した添 加量より計算した。コーヒーの酸味の指標と なる。酸度は、KEM社製ATF-500を用いて行った� �

 (濁度:O.D.at720nm)
 コーヒー抽出液の濁りの程度を測定した値� ��ある。分光光度計(SHIMADZU社製UV-1200)を用い� �、特定波長(720nm)の光のエネルギーを試料(コ ーヒー抽出液)が吸収する強度を測定した。� �た、濁度の測定においては、もともとの試� �の色度の影響を考慮して、720nmの波長に設定 している。なお、濁度(O.D.at720nm)の値が大き� �ことは、コーヒー抽出液の濁りの度合いが� �いことを意味する。

 (吸光度:O.D.at420nm)
 コーヒー抽出液の褐色の強さを測定した値� ��ある。濁度と同様に、分光光度計(SHIMADZU � �製UV-1200)を用いて、特定波長(420nm)の光のエ� �ルギーを試料(コーヒー抽出液)が吸収する強 度を測定した。なお、吸光度(O.D.at420nm)の値� �大きいことは、コーヒー抽出液の褐色度が� �くなることを意味する。

 上記液性試験の結果、アラビカ種との交� ��後の、SB163、SB204およびIE1229は、それぞれpH� ��、5.23、5.14、5.15を示しており、前述のGC種� �値より低くなっており、この3タイプの味覚� ��カネフォラ特有の味覚(いわゆるロブスタ臭 )がない傾向と合致していた。

 〔実施例6〕
 GCAハイブリッド種のカフェイン代謝実験を� ��記のような方法で行った。

 具体的には、2006年12月にマダガスカル � �ラカ試験場で栽培されたGCAハイブリッド種� �らびにその親のアラビカ種、ユージノイド� �、カネフォラ種それぞれの、葉および若い� �実を採集し、室温にて輸送し、48時間後に代 謝実験を開始した。なお、用いたサンプルは 下記表12に示す。

 (実験方法)
 Koshiro et al.(Yukiko Koshiro、Chifumi Nagai、Hirosh i Ashiharaら:Plant Science 171、242~250(2006))の方法 に基づいて ¹⁴ Cで標識したアデノシンを18時間投与し、 ¹⁴ Cのテオブロミン、カフェインへのとりこみ� �から、プリンアルカロイドの生合成能を算� �した。

 標識化合物、[8- ¹⁴ C]アデノシンは、市販(Moravek Biochemical社製)の ものを用いた。また、メタノール可溶性物質 を濃縮後、薄層クロマトグラフィーにより分 離後、バイオイメージアナライザー(富士フ� �ルム社製)で放射活性を定量化した。

 コーヒーのカフェイン生合成経路を図1に 示した。

 カフェインの生合成の主要経路は、AMP(ア デノシン-リン酸)から開始するが、ここでは� ��AMPの前駆体であるアデノシンを投与した。� ��デノシンはコーヒーの細胞内で、AMPに変換� ��れ、テオブロミンを経由してカフェインに� ��る。

 (結果)
 葉のカフェイン合成能を示す相対的生合成� ��性を比較すると、表13に示す通り、アラビ� �種とカネフォラ種の葉でカフェインの生合� �が見られたが、ユージノイド種では、見ら� �なかった。また、低カフェインのGCAハイブ� �ッド5検体では、それぞれ少量の合成能しか� ��められなかった。

 薄層クロマトグラフィーによる分離の後の� ��量値の相対的生合成活性は、アラビカ種が� ��20.3%、カネフォラ種が、12.6%、ユージノイド 種が0.0%であった。
低カフェインのGCAハイブリッド種(IE37-a)からG CAハイブリッド種(IE37-e)が、それぞれ3.6%、8.3% 、11.4%、2.8%、3.4%であった。GCAハイブリッド� �5検体の平均は、5.90%、標準誤差(SE)は、1.691� �あった。

 アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそ� ��ぞれ1であるが、GCAハイブリッド5検体の平� �値のばらつきを考慮(95%の確率で、平均値は2 .518~9.282%の幅の中にある)しても、GCAハイブリ ッド種5検体の方が、アラビカ種、カネフォ� �種と比較した場合、低カフェイン合成能で� �った。

 カフェインの代謝データの中で、分解能� ��調査したが、その結果は、いずれのサンプ� ��も、分解能が認められなかった。つまり、� ��サンプルの最終的なカフェイン含有量は、� ��回の実験データから、合成能に依存してい� ��と考えられる。最終的なカフェイン含有量� ��少ないのは。合成能が低いことと相関があ� ��ことがわかる。

 〔実施例7〕
 実施例6のようにして行った若い果実でのカ フェイン合成能の比較においても、表13に示� ��通り、傾向は、同じであった。アラビカ種� ��は、26.7%のカフェイン合成能が認められた� �、GCA(IE37-a)からGCA(IE37-d)においては、それぞ� ��、6.3%、12.2%、8.9%、4.9%であった。また、GCA� �イブリッド種4検体の平均は、8.08%、標準誤� �(SE)は、1.604であった。

 アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそ� ��ぞれ1であるが、GCAハイブリッド種5検体の� �均値のばらつきを考慮(95%の確率で、平均値� ��4.872~11.288%の幅の中にある。)すると、GCA4検� ��の方が、アラビカ種と比較した場合、低カ� ��ェイン合成能であった。

 〔実施例8〕
 表13に示す通り、採集した葉でのカフェイ� �とテオブロミンの相対的生合成の活性の定� �値は、アラビカ種とカネフォラ種のそれぞ� �で、合計36.6%、27.0%なのに比べ、低カフェイ� ��のGCAハイブリッド種5検体では、GCA(IE37-a)か� ��GCA(IE37-e)で、それぞれ7.6%、17.5%、20.7%、8.0%� �6.6%であった。GCAハイブリッド種5検体の平均 は、12.08%、標準誤差(SE)は、2.919であった。

 アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそ� ��ぞれ1であるが、GCAハイブリッド種5検体の� �均値のばらつきを考慮(95%の確率で、平均値� ��6.242~17.918%の幅の中にある。)しても、GCAハ� �ブリッド種5検体の方が、アラビカ種、カネ� ��ォラ種と比較した場合、カフェインとテオ� ��ロミンの合計の定量値は低かった。

 低カフェインのGCAハイブリッド種5検体は 、95%の確率の分布幅があるが、平均値で比較 すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞ れ、約33%、約45%のカフェイン、テオブロミン 合成能しか見られなかった。

 〔実施例9〕
 表13に示す通り、採集した若い果実での、� �フェイン、テオブロミンの相対的活性の定� �値は、アラビカ種、カネフォラ種がそれぞ� �、43.2%、42.6%なのに比べて、低カフェインのG CAハイブリッド種4検体では、GCA(IE37-a)からGCA( IE37-d)で、それぞれ16.0%、31.8%、27.5%、19.5%であ った。GCA4検体の平均は、23.70%、標準誤差(SE)� ��、3.621であった。

 アラビカ種、カネフォラ種の検体数はそ� ��ぞれ1であるが、GCA5検体の平均値のばらつ� �を考慮(95%の確率で、平均値は16.458~30.942%の� �の中にある。)しても、GCAハイブリッド種4検 体の方が、アラビカ種、カネフォラ種と比較 した場合、カフェインとテオブロミンの合計 の定量値は低かった。

 低カフェインのGCAハイブリッド種全体で� ��、アラビカ種、カネフォラ種と比較して、� ��60%のカフェイン、テオブロミン合成能しか� ��られなかった。

 低カフェインのGCAハイブリッド種4検体は 、95%の確率の分布幅があるが、平均値で比較 すると、アラビカ種、カネフォラ種のそれぞ れ、約55%約56%のカフェイン、テオブロミン合 成能しか見られなかった。

 (作出例)
 このカフェイン含有量の分布の内訳を以下� ��示す。2001年から2007年にかけて総数2670本のG CAが低カフェインGCAの選抜に使われた。この� ��ち、581本、22%(=581í2670)の木より収穫して得� ��生豆(種子)に含まれるカフェイン含有量を� �析した結果、平均は0,96%のカフェイン含有量 (乾物重量%)で、最低値のそれは、0.275%、最高 値のそれは1.97%であった。

 以下、表14~16とグラフ(図4)で、カフェイ� �の含有量と検体数の関係を示す。

 カフェイン含有量0.6%以下のGCAが得られた 確率は、5.7%(=0.17+0.52+2.1+2.7%)で、その他の多� �のGCAは、目標の低い値のカフェイン含有量� �はなく、その割合は、全体の約94.3%であった 。

 また、次の2つの表15および16に、カフェ� �ン分析を行ったGCA300本のカフェイン含有量� �示した。(これらの表は、GCAの世代とカフェ� ��ン含量の分布状況を示す。)この表で示す300 本のカフェイン含量のデータは、先に述べた 581本の木のうち、Generationが、はっきりして� �る木が300本あり、その木からのカフェイン� �量のデータである。

 これらの表から、カフェイン含有量0.6%以下 のGCAの選択率は、F2において17.2%~40%であるが� ��F3、F4では、6.1~9.1%とであった。