VIRUS

La présente invention s'inscrit dans le domaine de la lutte contre les infections des plantes par les virus à ARN. Plus particulièrement, elle concerne un procédé d'amélioration de la résistance de plantes aux virus à ARN.

Les maladies des plantes induites par les virus à ARN, et notamment par les potyvirus, entraînent des pertes économiques importantes pour de nombreuses cultures, par la réduction de leur rendement et/ou de leur qualité.

Il existe à ce jour peu de stratégies permettant de lutter contre ces infections. En particulier, il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement chimique ou biologique permettant de les prévenir, de les traiter ou même de les limiter. La méthode la plus efficace actuellement mise en œuvre est l'arrachage et la destruction des plantes infectées. Cette méthode nécessite de déployer des efforts importants, et elle n'est pas satisfaisante d'un point de vue économique. II a été proposé par l'art antérieur des stratégies de création de plantes transgéniques présentant des résistances accrues aux infections virales. Ces stratégies sont cependant spécifiques à certains virus et/ou à certaines plantes cultivées, et elles ne peuvent pas être généralisées à tous les virus et à toutes les plantes. Le contournement par les virus de ces résistances conférées est en outre possible, rendant inefficaces ces moyens de lutte.

La présente invention vise à proposer une solution au problème de l'infection des plantes par les virus à ARN, qui soit applicable à l'ensemble des organismes eucaryotes végétaux et qui ne soit pas spécifique d'un type particulier de virus. A cet effet, les présents inventeurs ont avantageusement su tirer profit de la découverte qu'ils ont réalisée que la protéine CSN5, sous-unité 5 du complexe COP9-signalosome des plantes, dit complexe CSN, jouait un rôle important dans les mécanismes de régulation des interactions plantes / virus pathogènes, plus particulièrement en ce qui concerne les virus à ARN. Le complexe COP9-signalosome est un complexe multi-protéique évolutivement conservé chez les eucaryotes, comportant huit sous-unités, et présentant un rôle central dans la voie ubiquitine-protéasome. Dans les plantes, ce complexe est décrit comme présentant pour fonction biologique principale une activité de déneddylation. Cette activité est médiée par la sous- unité 5 du complexe (CSN5) (Schwechheimer et al., 2010). Cette protéine CSN5 est fortement conservée chez tous les eucaryotes supérieurs.

Plus particulièrement, il a été découvert par les présents inventeurs qu'une diminution de l'activité de la protéine CSN5 des plantes conduisait à une résistance très accrue de ces plantes aux virus à ARN. II est ainsi proposé selon la présente invention un procédé d'amélioration de la résistance d'une plante aux virus à ARN, qui comprend une étape de modification du génome de la plante de sorte à inhiber au moins en partie l'activité d'une protéine CSN5 de la plante, en particulier son activité protéase, et plus particulièrement encore de sorte à réduire son activité isopeptidase.

Préférentiellement, ce procédé comprend en outre une étape de sélection, parmi les plantes mutantes ainsi obtenues, des plantes mutantes viables et fertiles, et dont la capacité de résistance aux virus est supérieure à celle de la plante sauvage. Cette étape de sélection des plantes mutantes présentant une résistance aux virus accrue est réalisée suivant les critères classiques de résistance aux virus, en particulier par inoculation avec le virus, le cas échéant fusionné à un marqueur fluorescent, et détection du virus. Cette détection peut par exemple être réalisée par les techniques classiques d'immuno-absorption enzymatique (ELISA), par transcription inverse suivie de réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR), ou encore par observation au microscope de la fluorescence produite par un inoculum viral exprimant un marqueur fluorescent, tel que la Green Fluorescent Protein (GFP).

Le procédé selon l'invention permet avantageusement, pour une plante donnée, d'obtenir des plantes mutantes dans lesquelles l'activité de la protéine CSN5 est diminuée ou supprimée et dont la résistance aux virus est améliorée par rapport à la plante sauvage.

Ce procédé est avantageusement applicable à diverses espèces de plantes, notamment, mais non limitativement, aux crucifères (ou Brassiceae) et à la tomate.

De façon générale, l'homme du métier saura aisément, en fonction de la plante visée, identifier la protéine CSN5 particulière correspondante, et en particulier le ou les gènes codant cette protéine, à partir des informations couramment disponibles dans les bases de données de séquence ADN ou de séquences protéiques. Plus particulièrement, il sera à même d'identifier dans les bases de données, pour une plante visée, par des recherches par analogie de séquence (BLAST), le ou les homologues aux protéines CSN5 de la tomate ou ô'Arabidopsis existant dans ces bases.

De manière générale, quelle que soit la plante visée, la protéine CSN5 présentera au moins 50 % d'identité, et même au moins 80 % d'identité, avec la séquence peptidique SEQ ID NO:13 ou la séquence peptidique SEQ ID NO:14. Ces séquences correspondent respectivement aux protéines nommées CSN5-1 et CSN5-2 de l'espèce Solarium lycopersicum (tomate).

Autrement, la protéine CSN5 présentera au moins 50 % d'identité, et même au moins 80 % d'identité, avec la séquence peptidique SEQ ID NO:15 ou la séquence peptidique SEQ ID NO:16. Ces séquences correspondent respectivement aux protéines nommées CSN5A et CSN5B de l'espèce Arabidopsis thaliana.

Les deux protéines CSN5 ô'Arabidopsis (CSN5A et CSN5B) présentent des pourcentages d'identité forts, supérieurs à 80 %, avec les deux protéines CSN5 de tomate, comme illustré sur la Figure 2, qui montre un alignement des séquences primaires des protéines CSN5 ô'Arabidopsis thaliana et de tomate {Solarium lycopersicum, également nommée Lycopersicon esculentum). Le procédé selon l'invention permet de conférer aux plantes auxquelles il est appliqué une résistance à différents types de virus, plus particulièrement aux virus à ARN, et en particulier aux potyvirus, par exemple au Plum Pox Virus (PPV), au Turnip Mosaic Virus (TuMV) ou encore au Lettuce Mosaic Virus (LMV). La modification du génome de la plante est de préférence réalisée de sorte à inhiber partiellement l'activité de la protéine CSN5, plus particulièrement son activité isopeptidase.

Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, la modification du génome de la plante est une mutation, pouvant être ponctuelle ou d'insertion, d'un gène de la plante codant la protéine CSN5, cette modification étant préférentiellement choisie pour induire soit une diminution de l'accumulation de la protéine CSN5, soit la synthèse d'une protéine CSN5 tronquée à activité isopeptidase réduite. Préférentiellement, une telle mutation sera choisie pour affecter directement le site actif de l'activité isopeptidase de la protéine CSN5, ou encore pour affecter un site intervenant dans l'interaction de la protéine CSN5 avec d'autres protéines impliquées dans son activité isopeptidase, par exemple avec d'autres constituants du complexe signalosome, avec une protéine cible de cette activité isopeptidase, ou avec une protéine avec laquelle la protéine CSN5 interagit pour se relocaliser dans la cellule.

De façon générale, les techniques de manipulation des plantes mises en œuvre dans le cadre de la présente invention sont classiques en elles- mêmes, et relèvent des connaissances générales de l'homme du métier.

En particulier, la mutation d'un gène codant la protéine CSN5 peut être réalisée par toute technique classique en elle-même. Par exemple, des mutants peuvent être obtenus par insertion d'ADN de transfert (ADN-T) dans le gène, et sélection parmi les mutants défectifs ainsi obtenus, pour lesquels on observe une diminution de l'expression du gène CSN5, ou encore donnant lieu à l'expression d'une protéine CSN5 tronquée non fonctionnelle, des mutants présentant une capacité de résistance aux virus supérieure à celle de la plante sauvage. Avantageusement, le procédé comprend en outre de préférence une étape supplémentaire de sélection, parmi les plantes mutantes à capacité de résistance aux virus améliorée identifiées, des plantes mutantes qui, en plus d'être viables et fertiles, présentent une capacité de croissance permettant leur mise en culture dans des conditions économiquement rentables. Ces mutants peuvent autrement être obtenus par mutagénèse aléatoire de l'ADN de la plante et sélectionnés après identification des mutants portant une mutation sur le gène codant la protéine CSN5, par application de la technique classique connue sous le nom de TILLING, pour l'anglais « Targeting Induced Local Lésions in Génome » (Mac Callum et al., 2002 ; Henikoff et al., 2004). Le TILLING est une technique de génétique inverse mettant à profit la capacité d'une endonucléase à détecter les mésappariements dans un double brin d'ADN et à réaliser une coupure au niveau des bases non appariées, pour détecter des points de mutation générés par le traitement d'une plante par un agent chimique mutagène. Cette technique est particulièrement adaptée à la mise en œuvre de procédés de criblage à haut débit permettant la sélection de plantes présentant dans un gène cible une mutation induite par mutagénèse chimique.

Ainsi, dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, le procédé d'amélioration de la résistance d'une plante aux virus à ARN comprend les étapes de génération d'une collection de plantes mutantes par mutagénèse chimique, et de sélection, dans la collection de plantes mutantes ainsi générée, des plantes viables possédant une mutation sur ledit gène de la plante codant ladite protéine CSN5 et dont la capacité de résistance aux virus à ARN est supérieure à celle de la plante sauvage. L'expression du gène CSN5 peut être vérifiée par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par transcription inverse suivie de réaction de polymérisation en chaîne quantitative (RT-PCR quantitative).

Selon l'invention, les mutants défectifs pour le gène codant la protéine CSN5 sont de préférence, mais non limitativement, homozygotes. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, la mutation du gène codant la protéine CSN5 est introduite dans un exon du gène. L'invention n'exclut pas pour autant que la mutation soit localisée dans un intron du gène, dans la mesure où cette mutation affecte l'activité de la protéine CSN5 codée par ce gène, dans le sens préconisé par l'invention. Préférentiellement, lorsque la plante est la tomate, l'inhibition de l'activité de la protéine CSN5 peut aussi bien être obtenue par mutation de l'un et/ou de l'autre des deux gènes codant une protéine CSN5 et identifiés sous les numéros d'accès Genbank respectifs AK328186.1 {Solarium lycopersicum, Gl : 225315036) et AF175964.1 {Solanum lycopersicum, Gl : 12002864). Chez l'espèce Arabidopsis thaliana, l'inhibition de l'activité de la protéine CSN5 est de préférence obtenue par une mutation du gène CSN5A de la plante. Ce gène, également nommé AJH1, est connu en lui-même et identifié par le numéro d'accès Genbank AT1 G22920.

Autrement, cette inhibition peut être obtenue par une mutation adéquate du gène CSN5B, également connu sous le nom de AJH2, et identifié par le numéro d'accès Genbank AT1 G71230.

Lorsque la plante est le pêcher (Prunus persica), le procédé selon l'invention d'amélioration de la résistance de la plante aux virus à ARN comprend la modification du génome de la plante par mutation du gène codant la protéine CSN5 de séquence peptidique SEQ ID N:19. Cette protéine présente par exemple 82 % d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO:15 et 83 % d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO:16, correspondant respectivement aux protéines CSN5A et CSN5B de l'espèce Arabidopsis thaliana. Dans d'autres modes de mise en œuvre préférés de l'invention, la modification du génome de la plante est choisie pour entraîner la surexpression d'un membre de la famille des protéines Mini Zinc Finger.

Les protéines Mini Zinc Finger (MIF), ou protéines à doigt de zinc, sont des protéines de petite taille, d'environ 100 acides aminés, caractérisées par un motif du type CXsHXnCX^eCXsCXCHXsH. Une famille de protéines MIF (nommées MIF1 , MIF2, MIF3) a notamment été caractérisée chez Arabidopsis (Hu et Ma, 2006). La protéine MIF1 a notamment été montrée comme impliquée dans de multiples régulations hormonales au cours du développement de la plante, agissant comme un inhibiteur de croissance de la plante.

Chez la tomate, il a été identifié le gène IMA, pour l'anglais « Inhibitor of Meristem Activity » (n ° d'accès GenBank : AM261628.1 , Gl : 1 18621 154, Solarium lycopersicum), qui code une protéine Mini Zinc Finger présentant 62 % d'identité avec la protéine MIF2 Arabidopsis (Sicard et ai, 2008), comme illustré sur la Figure 3. Cette protéine a notamment été montrée comme contrôlant le développement du méristème floral.

De façon tout à fait surprenante, il a été découvert par les présents inventeurs que les protéines MIF, et notamment la protéine MIF2 chez Arabidopsis (codée par le gène MIF2 identifié dans GenBank par le n ° d'accès NM_202644.1 , Gl : 42572554, Arabidopsis thaliana), interagit avec la protéine CSN5, et qu'une surexpression d'une protéine MIF induit au sein de la plante une diminution de l'activité de cette dernière, conduisant à une résistance accrue de la plante aux infections virales. Ainsi, les plantes sur-exprimant la protéine MIF, dont il a été observé par les présents inventeurs qu'elles phénocopient partiellement les mutants défectifs pour un gène CSN5, présentent un niveau de résistance aux virus à ARN plus élevé que les plantes sauvages.

Là encore, l'homme du métier saura aisément, en fonction de la plante visée, identifier la ou les protéine(s) membres de la famille des protéines MIF particulière(s) correspondante(s), et le cas échéant le ou les gène(s) codant cette ou ces protéine(s), à partir des informations couramment disponibles dans les bases de données de séquence ADN ou de séquences protéiques.

De façon générale, pour chaque plante visée, la protéine membre de la famille des protéines Mini Zinc Finger présente au moins 60 % d'identité avec la séquence peptidique SEQ ID NO:17 (correspondant à la protéine MIF2 û'Arabidopsis thaliana) ou la séquence peptidique SEQ ID NO:18 (correspondant à la protéine codée par le gène IMA de la tomate).

Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, lorsque la plante appartient à l'espèce Arabidopsis thaliana, l'inhibition de l'activité de la protéine CSN5 est réalisée par surexpression de la protéine MIF2 de séquence SEQ ID NO:17. Lorsque la plante est la tomate, la modification du génome de la plante est choisie pour entraîner la surexpression de la protéine codée par le gène IMA, de séquence SEQ ID NO:18, homologue fonctionnelle de la protéine MIF2 û'Arabidopsis.

Une telle modification du génome de la plante peut être réalisée par toute méthode classique en elle-même, notamment par introduction dans des cellules de la plante d'un vecteur d'expression permettant de sur-exprimer la protéine Mini Zinc Finger (Sicard et al., 2008).

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Les Figures 1 a et 1 b sont des diagrammes illustrant, pour les mutants û'Arabidopsis thaliana csn5a- 1, csn5a-2, MIF20E3, MIF20E4, MIF20E6, MIF20E7 et pour la lignée sauvage, l'expression d'un gène CSN5 mesurée par RT-PCR quantitative, CSN5A pour la Figure 1 a et CSN5B pour la Figure 1 b.

La Figure 2 montre un alignement des séquences primaires des protéines CSN5 û'Arabidopsis thaliana (protéines CSN5A et CSN5B) et de tomate {Solanum lycopersicum CSN5-1 et CSN5-2), le site actif hébergeant l'activité isopeptidase de la protéine étant délimité par un cadre.

La Figure 3 montre un alignement des séquences primaires des protéines Mini Zinc Finger 2 û'Arabidopsis thaliana (MIF2) et de tomate {Solanum lycopersicum MIF2/IMA), la séquence correspondant au doigt à zinc étant délimitée par un cadre.

L'invention sera maintenant plus précisément décrite dans le cadre des exemples ci-après, qui n'en sont nullement limitatifs.

EXPERIMENTATIONS

A/ Protocoles de tests de résistance aux potyvirus Plum Pox Virus (PPV), Turnip Mosaic Virus (TuMV) et Lettuce Mosaic Virus (LMV) chez Arabidopsis thaliana

1/ Virus et souches virales utilisées

Les isolats Rankovic (ou PPV-R, appartenant à la souche PPV-D appelée aussi Dideron) et PPV-NAT (Not Aphid transmissible, de la souche PPV-D), décrits dans les publications de Decroocq et al. (2006, 2009), sont utilisés.

L'isolât PPV-R existe sous forme de clone infectieux nommé pICPPV. Ce clone infectieux a été modifié afin d'insérer un gène codant la protéine fluorescente verte (GFP), pour donner le clone infectieux pICPPVnk-GFP (Fernândez-Fernândez et al., 2001 ).

La construction virale [promoteur CaMV35S-PPVnk-GFP-terminateur] de pICPPVnk-GFP a été transférée dans un plasmide binaire de type pBIN19, donnant lieu à un clone infectieux, agro-inoculable (c'est-à-dire inoculable chez les végétaux par transformation par Agrobacterium tumefasciens), appelé pBINPPVnk-GFP (cf Decroocq et al., 2009).

Les isolats TuMV-UK1 et CDN1 du Turnip Mosaic Virus ont été également utilisés (Jenner et al., 2000 ; Lehmann et al., 1997).

Enfin, l'isolât LMV-AF199 du Lettuce Mosaic Virus a été utilisé lors de cette étude (Krause-Sakate et al., 2002). 21 Techniques d'inoculation ό 'Arabidopsis

En parallèle des mutants testés, il a été utilisé pour chaque expérimentation comme contrôle positif l'accession Columbia, et comme contrôle négatif, résistant à l'infection par la plupart des potyvirus, dont le PPV, la plante E6 (mutant 'perte de fonction' obtenu par insertion de T-DNA dans le gène codant elFiso4E) (cf Decroocq et al., 2006 ; Duprat et al., 2002) :

Les tests de résistance ont été réalisés par inoculation mécanique et agro-inoculation pour le PPV, et par inoculation mécanique seulement, pour le TuMV et le LMV.

2-1 / Inoculation mécanique Des jeunes plants d'Arabidopsis âgés de 5 à 6 semaines post-semis sont inoculés mécaniquement par léger frottement des feuilles à l'aide d'un inoculum constitué d'un broyât de feuilles de Nicotiana benthamiana préalablement infecté par un isolât de PPV (isolats naturels après propagation mécanique, ou clones infectieux, après biolistique avec un ADNc infectieux). Des plants de Nicotiana benthanamia servent également de réservoirs pour l'isolât AF199 du LMV. Dans le cas du TuMV, les isolats utilisés (UK1 et CDN1 ) sont propagés préalablement sur navet.

Le broyage des feuilles s'effectue dans un mortier avec 3 volumes d'un tampon d'inoculation constitué de Na ₂ HP0 ₄ à 25 m M et de diéthyldithiocarbamate de sodium (DIECA) à 0,2 % (p/v), additionné d'un abrasif, le carborandum. Cet abrasif permet de blesser la feuille et de faire pénétrer la solution plus facilement. Les feuilles sont ensuite rincées à l'eau pour enlever l'excès et éviter les brûlures. Une seconde inoculation est effectuée deux jours plus tard. Afin d'étudier la propagation en systémie du virus, les jeunes hampes sont coupées juste avant inoculation.

2-2/ Inoculation par agro-infiltration

L'ADNc du génome viral PPV-R cloné dans le plasmide binaire pBIN19 a donné lieu au clone infectieux pBINPPVnk-GFP. Il est résistant à la kanamycine et possède une origine de réplication (ORI) compatible avec Agrobacterium tumefaciens (Jimenez et al., 2006). pBINPPVnk-GFP est maintenu en stock glycérol à une température de - 80°C dans une souche à'Agrobacterium C58C1 , lui conférant une résistance à la tétracycline.

Afin d'initier une nouvelle culture bactérienne pour l'inoculation de plantes avec le clone infectieux agro-inoculable, la souche bactérienne C58C1 :pBINPPVnk-GFP est reprise à partir du stock glycérol et étalée sur milieu LB solide (milieu Luria-Bertani, GIBCO-BRL: 2% bactotrypone, 0,5% d'extrait de levure, 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI), additionné des antibiotiques tétracycline 12,5 μ9/ιτιΙ et kanamycine 25 μ9/ΓηΙ. La souche bactérienne est mise à incuber 48 h à 28 °C. Le surlendemain, une colonie est prélevée et mise à incuber 48 h à 28°C dans 5 ml de milieu LB liquide, en présence des deux antibiotiques, de sorte à former une préculture. Enfin, les 5 ml de cette préculture sont transférés dans 45 ml de milieu LB liquide, additionné de 10 mM d'acide 2-(N-morpholino)-éthane sulfonique (MES), 20 μΜ d'acétosyringone, 25 μ9/ιτιΙ de kanamycine et 12,5 μ9/ΓηΙ de tétracycline. La culture bactérienne est replacée à 28 °C pendant 24 h dans une fiole erlenmeyer.

Après 24 h, les 50 ml de culture sont transférés dans des tubes Falcon® et centrifugés à 3900 tours/minute pendant 15 minutes. Le culot est rincé avec de l'eau distillée, re-suspendu et centrifugé de nouveau. Cette opération est répétée deux fois. Après les deux lavages, le culot est resuspendu dans une solution d'agro-infiltration comprenant 10 mM de MES à pH 6,3, 10 mM de MgCI ₂ et 150 μΜ d'acétosyringone. Pour finir, la densité optique à 600 nm (DOeoonm) de la solution est ajustée à 0,6.

Après incubation de la solution pendant 3 h à température ambiante, les plantes sont inoculées par scarification à l'aide d'un cure-dent préalablement imbibé de la solution bactérienne.

3/ Détection des virus

Le PPV est détecté par observations de la fluorescence produite par le virus, par tests d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) et transcription inverse et PCR (RT-PCR) comme décrit ci-après.

Le TuMV est détecté par symptomatologie et RT-PCR.

Le LMV est détecté par tests ELISA.

3-1 / Détection du virus par test d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) 100 μΙ d'une solution d'anticorps IgG dilués au 1 /1 000 dans du tampon carbonate 1 X (15 mM Na ₂ C0 ₃ , 30 mM NaHC0 ₃ ) sont adsorbés dans des plaques ELISA qui sont mises à incuber 3 h à 37°C. Les plaques sont ensuite rincées 3 fois pendant 3 minutes avec du tampon PBS-Tween® (136,9 mM NaCI, 1 ,47 mM KH ₂ P0 ₄ , 2,68 m M KCI, 8,1 m M Na ₂ HP0 ₄ , 0,05 % (v/v) Tween®20).

Les échantillons végétaux sont broyés dans du tampon PBS-Tween®- PVP 1 X (tampon PBS-Tween® additionné de 21 % (p/v) de polyvinylpyrrolydonedine (PVP) 25K), puis 100 μΙ de ce broyât sont déposés dans les puits des plaques. Celles-ci sont ensuite mises à incuber une nuit à 4°C. Les plaques sont de nouveau rincées 3 fois pendant 3 minutes avec du tampon PBS-Tween®. Un conjugué est ensuite dilué dans du tampon PBS- Tween®-PVP-Ovalbumine (0,2 % (p/v) d'ovalbumine), et 100 μΙ sont déposés dans chaque puits. Les plaques sont incubées durant 2 h à 37°C. Après 3 rinçages de 3 minutes, 100 μΙ de tampon substrat diéthanolamine (9,7 % (v/v) de diéthanolamine, pH 9,8) additionné d'une capsule de paranitrophénylphosphate (pNPP, SIGMA, 1 mg/ml), sont déposés sur les plaques. La densité optique à la longueur d'onde de 405 nm est mesurée avec un lecteur de microplaques SAFAS MP96.

3-2/ Détection du virus par PCR transcrite inverse (RT-PCR) Extraction des ARNs totaux

Les échantillons végétaux sont broyés dans un tampon d'extraction PBS-Tween®-PVP tel que décrit ci-dessus, selon un rapport poids/volume de 1 /5. Les broyats sont centrifugés pendant 10 minutes à 13000 tours/minute. 200 μΙ de surnageant sont transférés dans un autre tube Eppendorf contenant 20 μΙ de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 %, puis les tubes sont vortexés. Après une incubation de 15 minutes à 55 °C, 100 μΙ d'acétate de potassium à une concentration de 3 M sont ajoutés, et les tubes sont placés dans de la glace pendant 5 minutes. A nouveau, ces tubes sont centrifugés pendant 5 minutes à 13000 tours/minute, et le surnageant est transféré dans de nouveaux tubes Eppendorf. 700 μΙ de Nal à 6 M, puis 5 μΙ de silice, sont ajoutés. Les tubes sont conservés à température ambiante pendant 10 minutes, avant centrifugation de 30 secondes à 5000 tours/minute. Le culot est lavé deux fois avec 500 μΙ de solution de lavage contenant 20 mM de Tris- HCI à pH 7.5, 1 mM d'EDTA, 100 mM de NaCI, et 1 volume égal d'éthanol absolu. Les culots sont ensuite séchés dans un évaporateur sous vide pendant 10 minutes, puis repris dans 400 μΙ d'eau pure. Finalement, les tubes sont mis à incuber pendant 5 minutes à 55 °C, centrifugés pendant 5 minutes à 13000 tours/minute. 300 μΙ de surnageant sont transférés dans de nouveaux tubes et conservés à -20 °C.

RT-PCR

2,5 μΙ d'ARN extraits selon le protocole ci-dessus sont mis en présence d'un volume réactionnel final de 22,5μί contenant :

0,3 % (v/v) Triton 100X, Tampon 1 X PCR (MgCI ₂ 1 ,5 mM, TrisHCI pH 8,4 20 m M, KCI 50 m M), 0,25 M dNTPs (Fermentas), 1 μΜ par amorce (couple d'amorces universelles P1 /P2 pour le PPV, P4b/P3D pour PPV-D et P4b/P3m pour PPV-M), 1 ,5 unité de RTase (Abgene) et 0,1 unité de Taq polymérase (Biolabs).

Le programme de la RT-PCR est le suivant : (RT) - 15 minutes de transcription inverse à 42°C

- 5 minutes de dénaturation à 95 °C (PCR) 40 cycles de :

- dénaturation à 92 °C, 40 secondes

- hybridation à 56 °C, 40 secondes - élongation à 72 °C, 40 secondes

- élongation finale à 72 °C, 10 minutes

Le couple d'amorces P1 /P2 spécifiques à la détection du PPV amplifie un fragment de 243 pb de la région N-terminale de la protéine de capside du virus. Celui-ci est mis en évidence par migration sur un gel d'agarose à 2 %. Un ARN extrait précédemment et correspondant à l'isolât PPV-R est utilisé comme contrôle positif de la PCR.

Amorce P1 : séquence SEQ ID NO:1

Amorce P2: séquence SEQ ID NO:2 Pour le TuMV, les amorces CP1 F et CP1 R suivantes sont utilisées : Amorce CP1 F: séquence SEQ ID NO:3 Amorce CP1 R: séquence SEQ ID NO:4

3-3/ Observation des tissus infectés par le virus en stéréomicroscopie Lors d'inoculation avec les clones infectieux pICPPVnkGFP et pBINPPVnkGFP fusionnés à la protéine GFP, l'acquisition de la fluorescence est réalisée sous loupe binoculaire (Leica Microsystems, MZ FLIII, Suisse). Les filtres utilisés pour la visualisation de la fluorescence produite sont les suivants:

- GFP3 avec pour fenêtre d'excitation 450 à 490 nm et d'émission 500 à 550 nm.

- bleue avec pour fenêtre d'excitation 450 à 490 nm et émission à

515 nm.

B/ EXEMPLE 1 - Arabidopsis thaliana - mutants défectifs csn5a

Les mutants csn5a-1 et csn5a-2 d Arabidopsis thaliana, décrits dans la publication de Dohmann et al. (2005), obtenus à partir de l'accession Columbia, sont utilisés.

Ces mutants sont caractérisés par une inactivation du gène CSN5A (AJH1, N ° d'accès dans Genbank : At1 g22920), par insertion d'ADN-T dans le gène : csn5a- 1: lignée d'insertion SALK_063436 dans un exon du gène ; csn5a-2 lignée d'insertion SALK_027705 dans un intron du gène.

Ces mutants ont des phénotypes similaires. Ils présentent une croissance réduite, mais ils sont fertiles et peuvent être propagés sous forme de mutants homozygotes.

Le mutant csn5a- 1 se caractérise par la production d'une protéine CSN5A tronquée et inactive. Le mutant csn5a-2 se caractérise par une production diminuée de la protéine CSN5A.

1 / Mesure de l'expression des gènes CSN5A et CSN5B par RT-PCR quantitative

L'expression des gènes CSN5A et CSN5B chez chacun de ces mutants, est mesurée par RT-PCR quantitative, au moyen des amorces suivantes : Pour CSN5A :

Amorce QAJH1 FW1 : séquence SEQ ID NO:5

Amorce QAJH1 REV1 : séquence SEQ ID NO:6

Pour CSN5B :

Amorce QAJH2FW2 : séquence SEQ ID NO:7 Amorce QAJH2REV2 : séquence SEQ ID NO:8

Le gène EF1 codant pour le facteur d'élongation de la traduction EF1 cc sert de gène de ménage et de référence.

Les amorces utilisées pour EF1 sont les suivantes :

Amorce QAtEFI FW : séquence SEQ ID NO:1 1 Amorce QAtEFI REV : séquence SEQ ID NO:12

Protocole de la RT-PCR a. Extraction dARN et synthèse des ADNc

Les ARN totaux ont été extraits à partir de tissus foliaires (100 mg) en utilisant le Kit RNeasy® Mini (QIAGEN) en suivant les recommandations du fournisseur. Les contaminations dues à la présence d'ADN génomique (ADNg), sont éliminées par un traitement à la Turbo® DNAse suivant le protocole du fournisseur (Ambion). L'absence de contamination avec de l'ADNg est ensuite vérifié par PCR à l'aide du couple d'amorces spécifique du gène ACTINE suivant : Amorce Actine25 : SEQ ID NO:9

Amorce Actine23 : SEQ ID NO:10

La concentration des ARN extraits a été quantifiée en utilisant le NanoVue® (GE Healthcare). Leur qualité a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose 1 ,5 % (p/v).

Les ADNc sont synthétisés à partir de 500 ng d'ARN totaux dans un volume réactionnel de 20 μΙ en suivant les recommandations du fournisseur de la réverse transcriptase (iScript®, Bio-Rad). La qualité des ADNc obtenus a été vérifiée comme précédemment par PCR, en utilisant les amorces du gène ACTINE. b. RT-PCR quantitative

La RT-PCR quantitative (Q-RT-PCR) a été réalisée à l'aide du Kit GoTaq®qPCR Master Mix (Promega), en utilisant les ADNc précédemment obtenus et dilués au 1 /50 ^eme pour étudier l'expression des gènes CSN5A, CSN5B et EF1. Le mélange réactionnel de 25 μΙ final est constitué d'un master mix 2X (GoTaq® Hot Start polymérase, MgCI ₂ , dNTP, tampon, SyBrGreen), 5 μΙ d'ADNc et 10 μΜ de chaque amorce. L'amplification est réalisée dans un thermocycleur Bio-Rad iCycler. Les échantillons sont dénaturés 3 min à 95 °C puis l'amplification est effectuée durant 40 cycles de dénaturation à 95 °C, pendant 15 secondes, et d'amorçage/polymérisation à 60 °C, pendant 25 secondes. Pour finir, une étape de dissociation des amplicons de 60 °C à 95 °C permet de vérifier la présence d'une ou plusieurs espèces d'amplicons. La production des amplicons est suivie par incorporation de SyBrGreen dont l'excitation est mesurée à 493 nm. La mesure de la fluorescence émise est effectuée à 530 nm.

Cette Q-PCR ne permet pas de quantifier le nombre de molécules d'ARN cibles mais permet de comparer l'expression relative des gènes d'intérêt entre les plantes étudiées. Les résultats, par rapport à la lignée sauvage, sont montrés sur les Figures 1 a (CSN5A) et 1 b (CSN5B).

On y observe que l'expression du gène CSN5A est fortement réduite par rapport à la lignée sauvage, mais pas totalement inhibée. L'expression du gène CSN5B n'est quant à elle pas affectée. 21 Tests de résistance à l'infection par les virus PPV et TuMV

La résistance à l'infection de ces mutants csn5a-1 et csn5a-2 par les virus PPV et TuMV a été testée conformément au protocole décrit ci-avant. Pour le mutant cns5a-1, chaque test a été répété trois fois. Les témoins positif (Columbia) et négatif (E6) ont été testés simultanément, par le même protocole. Les résultats des tests effectués sont montrés sur le Tableau 1 ci- après.

Tableau 1 - Arabidopsis thaliana - Mutants csn5a- 1 et csn5a- 1 -

Résultat des tests d'infection par les virus PPV et TuMV

Où x/y exprime le nombre x de plantes infectées par rapport au nombre y de plantes testées.

Il ressort clairement des résultats ci-avant que tant les mutants défectifs csn5a-1 que les mutants défectifs csn5a-2 présentent une résistance aux virus PPV et TuMV fortement améliorée par rapport au témoin positif, qui correspond à la lignée sauvage.

Cl EXEMPLE 2 - Arabidopsis thaliana - mutants sur-exprimant MIF2

Pour l'obtention de plants ô'Arabidopsis thaliana sur-exprimant MIF2, la transformation des plantes ô'Arabidopsis est réalisée selon le protocole suivant. La souche GV3101 d'Agrobacterium tumefaciens est transformée, de manière classique en elle-même, par des plasmides recombinants contenant des constructions sens MIF2 surexpresseur sous la dépendance du promoteur 35S. Le plasmide pK2GW7 a été utilisé à cet effet. Il s'agit d'un vecteur binaire contenant les séquences du promoteur constitutif fort 35S et du terminateur du gène VI du CaMV entre lesquelles est insérée la séquence du gène MIF2 (N ° d'accès GenBank : NM_202644.1 ). Ce vecteur permet donc la surexpression du gène MIF2 et la sélection des plantes transformées s'effectue grâce au gène de sélection conférant la résistance à la kanamycine {Karf). Les bactéries en milieu de phase exponentielle de croissance

(DOeoonm = 0,6) sont centrifugées à 5000 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé et les bactéries sont reprises dans la solution de transformation (milieu MS (Murashige et Skoog) pH 5,7, diluée au demi, glucose 5 % (p/v), Silwet L-77® 0,05 % (v/v)) de façon à obtenir une suspension bactérienne de DOeoonm égale à 0,8.

Les plants à'Arabidopsis sont cultivés en terre jusqu'à l'obtention de hampes florales d'une dizaine de centimètres. Les plantes ainsi obtenues sont trempées pendant 30 secondes dans cette suspension bactérienne, puis gardées en atmosphère humide pendant 24 heures. Enfin, les plantes sont remises en chambre de culture jusqu'à l'obtention de graines.

Ces graines sont récoltées, décontaminées et gardées pendant 2 jours à 4°C dans de l'eau contenant de la kanamycine à 50 μ9.ιτι ¹ . Les graines sont ensuite reprises dans de l'agarose stérile tiède à 0,05 % (p/v) et étalées sur du milieu de culture (milieu MS pH 5,7, dilué au demi, gélosé, glucose 5 % (p/v)) additionné de kanamycine à 50 μ9.ιτι ¹ . Les plantules résistantes à la kanamycine, qui surexpriment MIF2, sont transférées en terre.

On a obtenu ainsi quatre lignées indépendantes surexprimant MIF2 {MIF20E3, MIF20E4, MIF20E6, MIF20E7).

M Mesure de l'expression des gènes CSN5A et CSN5B par RT-PCR quantitative L'expression des gènes CSN5A et CSN5B chez ces quatre lignées indépendantes surexprimant MI F2 {MIF20E3, MIF20E4, MIF20E6, MIF20E7), est mesurée par RT-PCR quantitative, selon le protocole décrit ci-avant dans l'Exemple 2. Les résultats, par rapport à la lignée sauvage, sont montrés sur les Figures 1 a {CSN5A) et 1 b {CSN5B).

On y observe que, pour tous les mutants, l'expression du gène CSN5A est peu ou pas affectée par rapport à la lignée sauvage. L'expression du gène CSN5B n'est quant à elle que peu ou pas diminuée par rapport à la lignée sauvage. 21 Tests de résistance à l'infection par les virus LMV et TuMV

La résistance des mutants MIF20E4 et MIF20E7 à l'infection par les virus LMV et TuMV a été testée conformément au protocole décrit ci-avant. Les témoins positif (Columbia) et négatif (E6) ont été testés simultanément, par le même protocole. Les résultats des tests effectués sont montrés dans le Tableau 2 ci-après.

Tableau 2 - Arabidopsis thaliana - Mutants sur-exprimant MIF2 -

Résultat des tests d'infection par les virus LMV et TuMV

Où x/y exprime le nombre x de plantes infectées par rapport au nombre y de plantes testées. Ces résultats montrent que les plantes sur-exprimant MIF2 présentent une amélioration de la résistance à l'infection par les virus LMV et TuMV, par rapport au témoin positif.

D/ EXEMPLE 3 - Tomate - mutants sur-exprimant IMA

La transformation des plants de tomate est réalisée selon le protocole suivant.

Les milieux de pré-culture, de co-culture et de régénération utilisés pour les cotylédons de tomate sont décrits dans le Tableau 3 suivant.

Tableau 3 - Composition des milieux utilisés pour l'obtention de mutants de tomate sur-exprimant IMA

Les graines de tomates Solanum lycopersicum sont semées et cultivées sur le milieu MS (Murashige et Skoog) pH 5,7, dilué au quart. Les cotylédons sont prélevés sur les plantules de 7 à 9 jours et découpés en 3 explants. Les explants sont cultivés pendant 2 jours sur le milieu de pré-culture, puis immergés pendant une trentaine de minutes dans une culture en phase exponentielle de croissance (D0 ₆ oonm = 0,6) ô'Agrobacterium tumefaciens transformées, de manière classique en elle-même, par un des plasmides recombinants contenant les constructions Pro35S:IMA décrits dans la publication de Sicard et al. (2008). L'excès de cellules bactériennes est éliminé entre deux feuilles de papier absorbant stérile.

Les explants sont ensuite cultivés en présence des agrobactéries pendant 48 heures sur milieu de co-culture gélosé. Les explants sont rincés 2 fois pendant 3 minutes dans du milieu MS liquide, additionné de Tween®20 à 0,05 % (v/v) (Sigma), puis mis en culture sur le milieu de régénération jusqu'à la formation de cals. Les plantules régénérées se développant à partir des cals sont repiquées sur milieu de régénération dépourvu d'AlA et de BAP. Les plantules résistantes à la kanamycine, qui surexpriment IMA, sont transférées en terre.

La description ci-avant illustre clairement que par ses différentes caractéristiques et leurs avantages, la présente invention fournit un procédé d'amélioration de la résistance des plantes aux virus, qui est applicable à tous les eucaryotes supérieurs végétaux, et qui permet d'obtenir des plantes à résistance améliorée à tous virus à ARN, en particulier aux potyvirus , compte- tenu du mécanisme cellulaire mis en jeu contrôlé par le complexe COP9- signalosome (CSN) et existant dans tous les organismes eucaryotes.

REFERENCES

Decroocq V., Sicard O., Alamillo J-M. , Lansac M., Eyquard J-P., Garcia J-A, Candresse T., Le Gall O., Revers F. (2006) Multiple résistance traits control PPV infection in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant Microbe Inter. 19: 541 -549.

Decroocq V., B. Salvador , O. Sicard, M. Glasa, Svanella L, Cosson P., F. Revers, J.A. Garcia, T. Candresse. (2009) The déterminant of potyviruses ability to overcome the RTM résistance of Arabidopsis thaliana maps to the N- terminal région of the coat protein. Molecular Plant-Microbe Interactions, 22, 1302-131 1 .

Dohmann E.M.N., Carola Kuhnle C, Claus Schwechheimer C. (2005) The Plant Cell, vol. 17, 1967-1978.

Duprat, A., Caranta, C, Revers, F., Menand, B., Browning, K.S. and Robaglia, C. (2002) The Arabidopsis eukaryotic initiation factor (iso)4E is dispensable for plant growth but required for susceptibility to potyviruses. Plant J. 32, 927-934.

Fernândez-Fernândez, M. R., Mourino, M., Rivera, J., Rodriguez, F., Plana- Durân, J., and Garcia, J. A. (2001 ) Protection of rabbits against rabbit hemorrhagic disease virus by immunization with the VP60 protein expressed in plants with a potyvirus-based vector. Virology 280:283-291 . Henikoff S, Till B.J., and Cornai L. (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiology 135: 630-636.

Hu W. et Ma H. (2006) The Plant Journal, 45, 399-422.

Jenner, CE., Sanchez, F., Nettleship, S.B., Foster, G.D., Ponz, F. and Walsh, J.A. (2000) The cylindrical inclusion gene of Turnip mosaic virus encodes a pathogenic déterminant to the Brassica résistance gene TuRBOL Mol. Plant- Microb. Interact. 13, 1 102-1 108.

Jimenez, I., Lopez, L., Alamillo, J.M., Valli, A. and Garcia, J.A. (2006) Identification of a plum pox virus Cl-interacting protein from chloroplast that has a négative effect in virus infection. Mol. Plant-Microb. Interact. 19, 350-358.

Krause-Sakate, R., Le Gall, O., Fakhfakh, H., Peypelut, M., Marrakchi, M., Varveri, C, Pavan, M. A., Souche, S., Lot, H., Zerbini, F. M., and Candresse, T. (2002) Molecular characterization of Lettuce mosaic virus field isolâtes reveals a distinct and widespread type of resistance-breaking isolate: LMV-Most. Phytopathology 92, 563-572.

Lehmann, P., Petrzik, K., Jenner, CE., Greenland, A.J., Spak, J., Kozubek, E. and Walsh, J.A. (1997) Nucleotide and amino acid variation in the coat protein coding région of turnip mosaic virus isolâtes and possible involvement in the interaction with the brassica résistance geneTuRBOL Physiol. Mol. Plant Pathol. 51 , 195-208.

Mac Callum et al., (2000) Plant Physiology, 123, 439-442.

Schwechheimer C, Isono E. (2010) European Journal of Cell Biology, 89, 157- 162.

Sicard A., Petit J., Mouras A., Chevalier C, Hernould M. (2008) The Plant Journal, 55, 415-427.