MéTODO PARA MEJORAR LA TOLERANCIA A LA SALINIDAD

CAMPO DE LA INVENCIóN

El campo de Ia presente invención se encuentra dentro del área de Ia biología molecular, y en particular en Ia implicación de genes de plantas en los procesos de detoxificación de sodio, el uso de organismos transformados expresando de forma constitutiva o inducida estos genes, y métodos de biorremediación para Ia recuperación de medios. Así, Ia presente invención se refiere a Ia puesta a punto de una herramienta y un método específico para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad de organismos vivos y eliminar el sodio (Na ⁺ ) de aguas, suelos, lodos y cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo del gen de Ia fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

La salinización del suelo es uno de los problemas más importantes que tiene Ia agricultura para su desarrollo. El cambio climático global produce un incremento en el estrés hídrico, factor cosustancial del estrés salino, ya que el déficit hídrico es también Ia causa del incremento de las concentraciones de sal en los suelos.

Es sabido que Ia concentración de sal en el interior de Ia célula de muchos organismos se mantiene alrededor de 50-150 mM, Io que beneficia a Ia estructura proteica, por ejemplo, debido a las fuerzas electrostáticas. Sin embargo, una concentración de 300-500 mM inhibe las reacciones metabólicas alterando el balance entre las fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas (Serrano R (1996) Int Rev of Cyt 165:1-52.).

La respuesta de las células al cloruro sódico (NaCI) se articula por un grupo de diversos mecanismos:

El Na ⁺ puede entrar en Ia célula a través de varios tipos de canales, "voltage-dependent catión channels" y "voltage-independent catión channels" (VIC). Los VIC son Ia principal ruta de entrada de Na ⁺ a las células de las plantas (Xiong L et al. (2002) in SaIt Tolerance. The Arabidopsis Book (American Society of Plant Biologists, pp 1-22). Debido a Ia similitud entre Na ⁺ y K ⁺ , los transportadores de K ⁺ dependientes de voltaje pueden facilitar Ia entrada de Na ⁺ ; Por ejemplo, AtHKTI de Arabidopsis (transportador de sodio con homología de secuencia a los transportadores de potasio de Ia familia HKT), está implicado en Ia conducción de Na ⁺ de tallos a raíces. Esta recirculación parece jugar un importante papel en Ia tolerancia de las plantas al estrés salino {Berthomieu P et al. (2003) EMBOjournal 22:2004-2014).

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La variación en el potencial de membrana (valores < 130 mV) facilita Ia entrada de Na ⁺ La hiperpolaπzación en Ia membrana plasmática de levadura es producida por Ia ausencia del gen PMP3 {SNA1) Los homólogos en A thaliana son RCI2A y RCI2B (BLT101 en trigo) La sobreexpresión de RCI2A puede aliviar Ia supresión del crecimiento y los daños foto-oxidativos reduciendo Ia entrada de Na ⁺ en las raices (Mitsuya S et al (2006) Physiologia Plaπtarum 12895-102)

El papel que el Ca ²⁺ juega en el intrincado grupo de respuestas a NaCI ha sido clarificado recientemente en vanos aspectos La sobre-expresión de ACA4 (Ca ²⁺ ATPasa vacuolar de Arabidopsis thaliana) en levadura aumenta Ia tolerancia a sal {Geisler M et al (2000) Plant Physiol 124 1814-1827)

El Na ⁺ es evacuado fuera de Ia células por medio de antiportadores Na ⁴ VH ⁺ , localizados en Ia membrana plasmática De acuerdo con esto, Ia sobre-expresión del gen SOS1 de A thaliana, que codifica para el antiportador de Na ⁺ /H ⁺ de membrana plasmática SOS1, mejora Ia tolerancia a salinidad (Shi H et al (2003) Nat biotechnol 21 81-85) Además de Ia extrusión de iones Na ⁺ , una de las causas más importantes de Ia tolerancia a salinidad es su compartimentalización en Ia vacuola El gradiente de protones que facilita el antiporte se produce por H ⁺ -ATPasas y H ⁺ -pιrofosfatasas (PPasas) vacuolares Las plantas transgénicas que sobreexpresan AVP1, H ⁺ -PPasa vacuolar, muestran una tolerancia salina que está correlacionada con el aumento del contenido iónico dentro de las plantas {Yamaguchi Tet al (2005) Trends Plant Sci 10615-620) Asimismo, plantas que sobreexpresan AtNHXI (antiportador vacuolar Na ⁺ /H ⁺ de Arabidopsis thaliana) fueron capaces de crecer, florecer y producir semillas en presencia de 20OmM NaCI en plantas transgénicas de Brassica napus {Zhang H-X Et al (2001) Proc Nati Acad Sa USA 98 12832-12836) y tomate transgénico (Zhang H-X et al (2001) Nat biotechnol 19 765-768) La sobreexpresión de AgNHXI (procedente de Ia planta halófita Atrφlex gmelmi), BnNHXI (Brassica napus), HbNHXI {Hordeum brevisubculatum) y GhNHXI (Gossipyum hirsutum) también juegan el mismo papel (Yamaguchi T et al (2005) Trends Plant Sc/ 10 615-620) La expresión heteróloga de TsVP (H ⁺ -PPasa clonada de Thellungiella halophila) en Ia levadura mutante enal (bomba que elimina Na ⁺ fuera de Ia célula) suprime Ia hipersensibilidad a Na ⁺ La planta de Tabaco transgénica que sobre-expresa TsVP consigue un 60% más de peso seco que el tipo salvaje cuando se expone a 300 mM NaCI (Gao F et al (2006) J Exp Bot 573259-3270)

Los osmolitos también juegan un papel relevante en Ia tolerancia a salinidad Protegen contra Ia pérdida de agua y cambios en Ia estructura de Ia membrana plasmática como consecuencia de eliminar los efectos tóxicos de los ROS ("Reactive Oxygen Species") generados por el estrés salmo Prolina, glicina, betaina, trehalosa, manitol y sorbitol, producidos de manera

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abundante y acumulados en células tratadas con sal, representan un componente importante en las respuestas a estrés salino (Sahia C. et al. (2006) Physiol Plant 127:1-9). La sobreexpresión de enzimas implicadas en Ia ruta de detoxificaciόn de ROS (SOD ₁ CAT, GST, APX, GPX) resulta en un incremento de Ia tolerancia a estrés salino (Xiong L, Zhu J-K (2002)). Semillas de tabaco transgénico que sobre-expresan un cDNA que codifica para un enzima con actividad glutatión S-transferasa (GST) y glutatión peroxidasa (GPX), crecen más rápido que las semillas control cuando son expuestas a bajas temperaturas y estrés salino (Roxas V-P, Smith R-K, Jr, Alien E-R, Alien R-D (1997) Nat biotechnol 15:988-991). Las enzimas glioxalasa I (g'y I) y glioxalasa Il (gly II) son necesarias para Ia detoxificación de metilglioxal y confieren tolerancia a salinidad en plantas transgénicas de tabaco (Singla-Pareek S-L, Reddy M-K, Sopory S-K (2003) Proc Nati Acad Sci USA 100:14672-14677).

Hay una clara conexión entre el estrés oxidativo y el osmótico a través de las llamadas " Mitogen-Activated Protein Kinase" (MAPK). El gen EhHOG, que codifica una MAPK que tiene un papel esencial en Ia ruta de osmoregulación de levadura y otros eucariotas, fue aislado de Eurotium herbariorum del mar muerto. Cuando EhHOG fue sobreexpresado en el mutante hog1 de S. cerevisiae, el crecimiento y Ia morfología aberrante de hog1 fueron restaurados en condiciones de alto estrés osmótico (Jin Y, Weining S, Nevo E (2005) Proc Nati Acad Sci USA 102:18992-18997).

Varios genes inducidos por estrés salino pertenecen a Ia familia LEA. Son conocidos diversos tipos de LEA de Arabidopsis; RD {"Responsive to Dehydration"), COR ("COId-Regu/afecí"), LTI ("Low Temperature-lnduced"), KIN {"cold indυced'). Todos estos tipos son inducidos por estrés salino, hídrico, bajas temperaturas y ABA. El arroz transgénico que sobre-expresa SNAC1 (" STRESS-RESPONSIVE NAC 1") es más sensible a ABA y pierde agua más lentamente por el cierre de los estomas, SNAC 1 puede mejorar Ia tolerancia a Ia sequía y a Ia salinidad en arroz. (Hu H. et al. (2006) Proc Nati Acad Sci USA 103:12987-12992).

La sensibilidad de las plantas a Ia presencia de sodio no es, por tanto, una característica inherente a las mismas, ya que se conocen diversas adaptaciones, tanto en tierra como en mar, a altas concentraciones salinas, como es el caso de las plantas halófitas. Esto indica que Ia tolerancia puede ser resuelta por transferencia génica. Hasta Ia fecha, los genes descritos en Ia defensa contra el estrés salino estaban implicados en transporte, extrusión, osmoprotección, antiportadores vacuolares, factores de transcripción, etc.

En las últimas décadas se han desarrollado plantas que contienen diversos grupos de moléculas que sirven para aliviar los efectos de Ia salinidad. Por ejemplo, los osmoprotectantes, que son solutos compatibles como prolina (aminoácidos), glicina-betaina, dehidrina y azúcares (manitol, trehalosa, etc) que funcionan como osmolitos y protegen las

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células de Ia deshidrataαón, y por tanto de Ia pérdida de turgor, mejoran el mantenimiento de las raíces y se disparan en respuesta al déficit de agua

En Agosto de 1999 Eduardo Blumwald, científico argentino que trabajaba en Toronto, publica Ia utilización de un antiportador vacuolar de Arabidopsis thahana que expulsa H ⁺ al citoplasma mientras acepta iones Na ⁺ (patente n° CA2323756 y posteriormente patente US6936750) Esto permite que las plantas que Io sobreexpresan puedan vivir en ambientes salinos altos

En Agosto de 2001 el mismo investigador, ahora en Davis, Universidad de California, hace publica Ia obtención de una planta de tomate genéticamente modificada que crece y se desarrolla en agua de irrigación salada Es importante subrayar que aunque a Io largo del siglo pasado un buen número de investigadores ha estado tratando de desarrollar variedades de cosecha tolerantes a sal usando técnicas de mejora clásica, ninguno de los esfuerzos dio los resultados esperados

En 2001 se hace pública Ia demostración de que AtHKTI es un transportador de Na ⁺ al interior de Ia raíz de Arabidopsis thahana {Rus et al, Plant Physiology 1362500-2511 (2001) Por tanto, teóricamente, Ia sobre-expresión de este gen en una planta permitiría una mayor entrada de Na ⁺ por las raíces de los individuos modificados con dicho gen

En Ia solicitud de patente española n° 2173019, publicada en 2002, se define el empleo del gen de Ia ATPasa de sodio de Neurospora crassa en Ia mejora de Ia tolerancia a Ia salinidad

Ahora, los autores de Ia presente invención han desarrollado un método para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad basado, por primera vez, en el empleo de moléculas capaces de unirse directamente al sodio para bloquear su acción tóxica dentro de Ia célula

Estas moléculas son las fitoquelatinas (PCs) Las PCs son péptidos ricos en cistelna que no están codificados genéticamente Su síntesis se inicia o induce por Ia presencia de metales pesados, como el cadmio, con el concurso de Ia enzima fitoquelatma sintasa (PCS) que utiliza GSH como sustrato para formar el péptido [γ-Glu-Cys]n=2-11-Gly (PCs) (Steffens, J C (1990) The heavy metal-binding pβptides of plants Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 41,533- 575)

El gen de Ia PCS de diferentes especies ha sido utilizado para mejorar Ia tolerancia y acumulación de metales pesados en diversas especies vegetales como solución al problema de contaminación de suelos por estos contaminantes, es decir, se ha dotado a las plantas elegidas de una mayor capacidad de tolerar y, Io que es más interesante, acumular, mediante fitoextracción, metales pesados Así, Ia PCS parece desempeñar un papel esencial en Ia

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regulación del equilibrio celular de iones de metales pesados ' libres" y complejados mediante un mecanismo sencillo y eficaz (Erwm G et al (1989) Proc Nati Acad Sa USA 86 6838-6842) Además, muchos autores sugirieron anteriormente que las PC pueden desempeñar un papel en Ia detoxificación de metales pesados (Cobbett C (2002) Annu Rev Plant Biol 53 159-182) Esto ha dado como resultado patentes de genes que codifican para fitoquelatinas sintasas (US6489537 y US 6844485), pero, en ningún caso se han empleado para combatir Ia salinidad, de modo que Ia propuesta que aquí se plantea genera un nuevo método para afrontar Ia contaminación por sales o salinización

Por otro lado, existen en el estado de Ia técnica métodos no biológicos empleados para Ia restauración de suelos salmo-sódicos que suelen consistir en Ia adición de sulfato de calcio (yeso) para facilitar el intercambio catiónico y esperar diversos lavados por Ia lluvia de los cationes sustituidos Sm embargo, Ia migración a horizontes más profundos de las sales no es Ia solución al problema puesto que podría ascender de nuevo por capilandad o contaminar acuiferos

A este respecto, Ia presente invención también proporciona un procedimiento para reducir o eliminar sodio de un medio cualquiera (sólido, liquido o gaseoso) que contiene dicho metal alcalino, que consiste en utilizar PCSs en un organismo vivo cuya capacidad de combatir los efectos de Ia salinidad es limitada, y sustraerlo de un medio concreto por medio de su acumulación en éste

Además de emplear en este método secuencias ya conocidas que codifican para PCSs de diferentes especies, los autores de Ia presente invención han secuenciado por primera vez el gen de Ia PCS de Nicotiana glauca, el cual puede expresarse de forma constitutiva o inducida en N glauca o en cualquier otro organismo vivo con tolerancia a Ia salinidad limitada

El método objeto de Ia presente invención presenta ventajas significativas respecto a los procedimientos desarrollados en el estado de Ia técnica para combatir Ia salinidad Por una parte, es un método de aplicación sencilla y de gran utilidad, ya que permite Ia aplicación directa al medio contaminado, Io que supone, en el caso de suelos salimzados, evitar Ia pérdida de suelo por lavado superficial de las aguas de escorrentía de aquellos suelos que no permiten el crecimiento de plantas silvestres Además, presenta ventajas de tipo económico ya que aprovecha Ia capacidad de los organismos vivos para disminuir Ia erosión y/o acumular las sales

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BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Comparación entre NgPCSI y PCSs conocidas. A. Alineamientos CLUSTAL W de Ia secuencia de aminoácidos de PCS1 de Nicotiana glauca (NgPCSI), N. Tabacum (NtPCSI), A. thaliana (AtPCSI) y T. aestivum (TaPCSI). Los aminoácidos idénticos están en negro En gris tríada catalítica formada por Cys 56, Hys162 y Asp180 similar a papaína (papain-like) indispensable para Ia catálisis B. Perfil de hidropatía de Kyte-doolittle de NgPCSL Los valores próximos a 2 indican aquellas zonas de Ia enzima que están probablemente insertas en Ia membrana C. Análisis filogenético de PCSs de diferentes especies. árbol sin raíz construido con el método neighbour-jommg (Clustal W) Las barras representan Ia distancia genética (0 1 sustituciones por sitio) A continuación se detallan las secuencias codificantes de genes PCS, las especies y el numero de acceso están entre paréntesis AhPCSI (Arabidopsis hallen, AAS45236 1), AtPCSI (Arabidopsis thaliana, AAD16046 1), AtPCS2 (Arabidopsis thaliana, AAK94671 1), AsPCS (Allium sativum, AA013809 1), AyPCS (Athyπυm yokoscense, BAB64932 1), BjPCSI (Brassica júncea, BAB85602 1), BnPCS (Brassica napus, CAK24968 1), CdPCS {Cyonodon dactylon, AAO13810 2), CePCS (Caenorhabditis elegans, NP_4964575 3), GmhPCS (homo- phytochelatm synthase, Glycm max, AAL78384 1), NgPCSI (Nicotiana glauca), NtPCSI (Nicotiana tabacum, AAO74500 1), LsPCSI (Lactuca sativa, AAU93349 1), QPCS1 (Lotus japomcus, AAQ01752 1), LjPCS2 (Lotus japomcus AAT80341 1), LjPCS3 (Lotus japomcus, AAY81940), OsPCS (Onza sativa, AAO13349 2), PvPCS (Ptens vittata, AAT11885 1), SpPCS (Schizosaccharomyces pombe, Q10075), SrPCS (Sesbama rostrata, AAY83876 1), StPCS (Solanum tuberosum, CAD68109 1), TcPCSI (Thlaspi caerulescens, AAT07467 1), TjPCS (Thlaspi japomcum, BAB93119 1), TaPCS (Tnticum aestivum, AAD50592 1) and TIPCS (Thypha latifolia, AAG22095 3)

Figura 2. Crecimiento comparativo en Cd ²⁺ y NaCI. A. Expresión de NgPCSI en levadura en un medio que contiene Cd ²⁺ y Na ⁺ . Test de goteo Células (DO a 600 nm de aproximadamente 1 4) en fase de crecimiento estacionaria se depositaran en diluciones senadas en un medio mínimo SD (1% de sacarosa/1% de galactosa) suplementado con los aminoácidos apropiados y NaCI 0, 06, 0 7, 1 M y CdCI ₂ 100μM, respectivamente Las figuras muestran el crecimiento de diluciones 1 20 tras 3 días (4 días para Ia concentración 1 M) B. Crecimiento de células de levadura expresando NgPCSI en un medio con NaCI 0.6 y 0.7 M. La figura muestra Ia comparación de ratios de crecimiento vector pYES2NgPCS1l vector pYES2 vacío en células sin NaCI y en células con NaCI frente a tiempo de incubación (en horas) Las células fueron crecidas a una DO de 1 a 600 nm, e inoculadas a una concentración de 10 ⁶ células por mi en un medio líquido sin NaCI o con NaCI 0 6 M, 0 7 M, y 1 4 M C. Comparación de ratios de crecimiento vector pYES2NgPCS1 ¡vector pYES2 vacío en células sin NaCI y con NaCI 1.4 M. Los ratios han sido empleados para minimizar aquellas

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diferencias de crecimiento que no son debidas a los tipos de estrés específicamente estudiados ya que Ia sola presencia del vector pYES2NgPCS1 en levaduras produce diferencias D. Comparación de Ia densidad óptica entre células sin NaCI y con NaCI 1.4 M. Modelo de crecimiento en medio mínimo representado por DO frente al tiempo en horas medido durante un periodo de 4 días de crecimiento Las diferencias en valor absoluto de crecimiento se observan para los 4 tiempos elegidos E. Contenido relativo de concentración intracelular de Na+. La comparación de Ia concentración intracelular de Na+ en células que contienen el vector pVES2 vacío y células que contienen pYES2INgPCS1 Las células de levadura fueron crecidas a una DO de 0 6 a 600 nm El NaCI fue añadido a una concentración final de 1 4 M Los valores en células con pYES2 vacío fueron tomados como el 100%

Figura 3. Expresión de TaPCSI en medios hidropónicos y suelos. A. Crecimiento de Ia planta en condiciones hidropónicas. WT fenotipo salvaje (wild type), TaPCSI plantas que sobreexpresan TaPCSI B. crecimiento en macetas L1, L2, y L3 son tres líneas diferentes que contienen TaPCSI sobreexpresado C. Microscopía confocal de tejidos radiculares. Se empleo DHE como informador de estrés oxidativo Control sin NaCl Las líneas modificadas L1 y L3 fueron elegidas como representantes de 4 repeticiones

Figura 4: Esquema del ADN de transferencia (tDNA). LB extremo izquierdo, LR extremo derecho, P promotor, G gen de interés, T terminador, GRA gen de resistencia a antibiótico

OBJETO DE LA INVENCIóN

En primer lugar, es objeto de Ia invención el gen NgPCSI que codifica Ia fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca con secuencia SEQ ID NO 1

Es también objeto de Ia invención el empleo del gen NgPCSI en un método para mejorar Ia tolerancia a salinidad y acumulación de sodio de cualquier organismo vivo

Otro objeto de Ia invención es el empleo del gen NgPCSI en un método para recuperar un medio salmeado mediante organismos modificados que expresen una fitoquelatma sintasa codificada por SEQ ID NO 1 o secuencias que tengan al menos un 35% de similaπdad con SEQ ID NO 1

Finalmente, es objeto de Ia invención el empleo de las fitoquelatinas obtenidas m vivo o m vitro por reacción enzimática mediada por Ia fitoquelatma smtasa codificada por Ia SEQ ID NO 1 , o secuencias con al menos un 35% de similaπdad, como quelantes de sodio

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

En un aspecto principal, Ia invención se refiere a una secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para Ia fitoquelatma sintasa de Nicotiana glauca (NgPCSI), caracterizada por Ia SEQ ID NO 1

El término "codifica' se refiere a Ia propiedad inherente de secuencias especificas de nucleótidos en un polinucleótido tal como gen, cDNA o mRNA que sirve como molde para Ia síntesis de polímeros y macromoléculas en procesos biológicos o en procesos llevados a cabo m vitro

En otra realización principal de Ia invención se contempla un vector que comprende Ia SEQ ID NO 1 De forma preferida, dicho vector es un plásmido

Otra realización principal de Ia invención, se refiere a un organismo transgenico estable (célula u organismo modificado genéticamente) que comprende Ia secuencia SEQ ID NO 1

La fitoquelatma sintasa de Nicotiana glauca (NgPCSI), localizada en el citoplasma, es el enzima que media Ia producción de fitoquelatinas (PCs), utilizando glutatión (GSH) como sustrato La sobreexpresión de NgPCSI tiene como resultado un aumento de Ia tolerancia a Na ⁺ , además de Ia tolerancia a metales pesados ya observada en otras PCSs El mecanismo por el cual se produce una mejora de Ia tolerancia es Ia quelación, por medio de las PCs, de iones Na ⁺ y Ia posterior reclusión en vacuolas de los complejos PC-Na ⁺

Asi pues, otro aspecto principal de Ia invención se refiere al empleo de Ia secuencia SEQ ID NO 1 para mejorar Ia tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio (Na ⁺ ) en un organismo vivo (animal, vegetal o microorganismo)

Esto ha permitido a los autores de Ia presente invención el desarrollo de un método para mejorar Ia tolerancia a Ia salinidad y/o acumulación de Na ⁺ en un organismo vivo que comprende las siguientes etapas

transformación del organismo vivo con Ia SEQ ID NO 1, o una secuencia con al menos un 35% de similandad con Ia SEQ ID NO 1, y - expresión de Ia secuencia (SEQ ID NO 1 , o Ia secuencia con al menos un 35% de similandad con Ia SEQ ID NO 1), controlada por secuencias regulatonas funcionales en el organismo vivo

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

Las secuencias con al menos un 35% de similandad de Ia SEQ ID NO 1 abarcan aquellos genes que tengan función fitoquelatina sintasa, es decir, desde eucaπotas como el gusano Caenorhabditis elegans y bacterias hasta plantas (que tienen una similaπdad más alta)

La fase de transformación se lleva a cabo por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de Ia técnica En una realización particular, en una primera etapa se lleva a cabo Ia construcción de un vector que comprenda Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaπdad con Ia SEQ ID NO 1 y, posteriormente, se introduce dicho vector en el organismo vivo

Para mejorar Ia tolerancia a sodio en un organismo vivo es necesario que éste exprese el gen de Ia secuencia introducida bajo el control transcπpcional de una secuencia regulatona que puede ser constitutiva (siempre facilitando Ia expresión) o inducida (facilitando Ia expresión sólo si hay sodio)

En Ia presente invención, el término "funcionales" hace referencia a que las secuencias regulatoπas tengan efecto sobre Ia funcionalidad del gen en Io que se refiere a Ia transcripción (comienzo y terminación) y traducción (inicio y terminación) del RNA mensajero y otras no descritas

Entre las secuencias regulatoπas contempladas en Ia presente invención están los promotores y otras menos comunes como determinados intrones, las secuencias de término de Ia transcripción y las secuencias de inicio y término para Ia traducción posterior del RNA mensajero

La fitoquelatina sintasa de Ia especie Nicotiana glauca puede expresarse por tanto de forma constitutiva o inducida en N glauca o en cualquier otro organismo vivo cuya capacidad de combatir los efectos de Ia salinidad es limitada

La expresión constitutiva de Ia PCS produce una mejora en el crecimiento de levaduras y plantas de modo que puede utilizarse para resolver vanos problemas (a) el cultivo de numerosas plantas en suelos salinizados o en aguas con contaminación salina, que puede generar dos beneficios directos, Ia revalonzación de tierras abandonadas por Ia salinización gracias a Ia producción de biomasa así como Ia restauración de las mismas para volver a ser cultivadas y (b) el cultivo de microorganismos modificados en medios con contaminación salina para reducir el contenido en sales de dichos medios

En una realización particular, el organismo vivo empleado en el método de Ia presente invención es una levadura, de forma preferida Saccharomyces cerevisiae

HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

En otra realización particular, el organismo vivo es una planta, preferiblemente Nicotiana glauca

En otro aspecto principal de Ia invención, se contempla el empleo de Ia secuencia SEQ ID No1 para reducir o eliminar sodio de un medio liquido, sólido o gaseoso

Esta aplicación ha permitido el desarrollo de un método para reducir o eliminar Na ⁺ de un medio liquido, sólido o gaseoso basado en las siguientes etapas

i transformar organismos vivos con Ia SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaπdad con Ia SEQ ID NO 1,

Ii identificar los organismos transformados en i) mediante selección con antibiótico, ni sembrar el medio sahnizado con los organismos identificados en n), iv cultivar los organismos durante un periodo de tiempo adecuado, y v recolectar los organismos

De forma preferida, el proceso de transformación genética se lleva a cabo por electroporación Con ello se consiguen células huésped de Eschenchia coli o Agrobacteπum tumefaαens que portan un vector con el inserto deseado (después de ser seleccionadas con el antibiótico correspondiente) Como se ha aclarado anteriormente, estas células también se consideran en Ia presente invención como organismos transgénicos aunque no se empleen directamente en Ia unión de sodio en un medio salinizado sino que sirven como medio amplificador en el caso de E coli y como instrumento de infección en el caso de A tumefaciens

Para llevar a cabo el proceso de eliminación de sodio es necesario tener Ia segundad de que los organismos empleados contienen el transgén insertado en su genoma o bien Io expresen por mediación de vectores Asi, para conseguir organismos que expresen Ia secuencia SEQ ID NO 1, o una secuencia similar en al menos un 35%, es necesario llevar a cabo una fase de selección La selección se lleva a cabo con antibióticos, ya que el organismo transgénico incorpora a través del vector un gen de resistencia a antibióticos (GRA) éste se encuentra localizado junto al gen de SEQ ID NO 1 , entre los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que definen las regiones flanqueantes del ADN de transferencia (tDNA) (figura 4)

En el caso de emplear microorganismos que expresen el gen para eliminar las sales de un medio salimzado, Ia recolección de los organismos se hará por floculación, precipitación, centrifugación o cualquier otro método que permita separar los microorganismos que han acumulado las sales del medio

HQJA DE REEMPLAZO (Regla 26)

En el caso de emplear plantas que expresen el gen para eliminar las sales de un medio salinizado, se recolectará Ia planta, se triturará antes o después de ser secada y los restos serán vertidos a un vertedero de residuos conforme a Ia legislación

Finalmente, en otra realización principal de Ia invención, se contempla el uso de fitoquelatinas (PCs), obtenidas m vivo o m vitro por reacción enzimática mediada por Ia fitoquelatina sintasa codificada por Ia SEQ ID NO 1, o secuencias con al menos un 35% de similandad, como quelantes de sodio

Ejemplos

Ejemplo 1. La fitoquelatina sintasa de N. glauca es muy similar al homólogo de N. tabacum

El diseño de cebadores en zonas conservadas de Ia región codificante del gen de PCS de N tabacum condujo a Ia amplificación de un fragmento de PCR de un tamaño esperado (1 ,5 Kb) El marco de lectura abierto codificó una proteína (NgPCSI) con una masa molecular de 55,14 kD, 501 residuos de aminoácidos y un pl de 6,32 El perfil de hidropatía se correlacionó con una proteína citoplasmática (figura 1B) La nueva proteina se comparó con Ia PCS de A thahana (número de acceso AAD16046 1), N tabacum (número de acceso AY235426) y T aestivum (número de acceso AAD50592 1), dando como resultado el siguiente porcentaje de identidad el 96% en relación con NtPCSI, el 64% en comparación con AtPCSI y el 59% con TaPCSI Esta alta identidad entre las secuencias de PCSs de plantas que pertenecen a diferentes familias, tales como Brassicaceae, Poaceae y Solanaceae, indicó una elevada conservación y, por tanto, un importante papel de estas proteínas en el remo vegetal El porcentaje de identidad entre las secuencias de proteínas de Ia PCS más investigada de T aestivum (TaPCSI) y Ia PCS de A thaliana (AtPCSI) fue de un 58%, similar al porcentaje encontrado para Ia nueva PCS notificada de N glauca y Ia PCS de T aestivum (59%) De manera coherente, Cys ⁵⁶ , Hys ¹⁶² y Asp ¹⁸⁰ descritas como una tríada catalítica similar a papaína (papain-like) indispensable para Ia catálisis (Rea P-A (2006) Proc Nati Acad Sci USA 103507- 508), también estaban conservadas en NgPCSI (figura 1A) Se obtuvo un árbol sin raíz con 24 secuencias de PCSs relacionadas con Ia estructura primaria prevista de NgPCSI (Blastp de Ia base de datos NCBI, figura 1C) Se identificaron las siguientes entre las agrupaciones ("clusters") separadas Ia familia de Ia agrupación de Brassicaceae formada por los géneros Arabidopsis, Brassica y Thlaspi, y los géneros Nicotiana y Solanum que pertenecen a Ia familia de la agrupación de Solanaceae

Ejemplo 2. La sobreexpresión de NgPCSI en levaduras conduce a una tolerancia al Cd ^2* y a una acumulación y tolerancia al Na ⁴ .

HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26)

La clonación e investigación de diferentes PCSs condujo a Ia conclusión de que estos genes pueden conferir acumulación y tolerancia al Cd ²⁺ {Clemens S ef al (1999) EMBO J 18 3325-

3333 27) Tal como se esperaba, NgPCSI también puede conferir tolerancia al Cd ²⁺ Esto es especialmente evidente en este trabajo a partir de los experimentos llevados a cabo a una concentración de 100 μM (figura 2A) Este hecho está completamente de acuerdo con los resultados anteriores obtenidos en los que se producía Ia sobreexpresión de TaPCSI en levaduras en condiciones similares de concentración de Cd ²⁺ y usando el mismo vector

(Clemens S ef al (1999)), Io que establece una función homologa de ambos genes TaPCSI y NgPCSI junto con una similitud estructural

NgPCSI confirió tolerancia al Na ⁺ cuando se sobreexpresó en levaduras a concentraciones de NaCI que oscilaban desde 0,6 hasta 1 M (figura 2A), Io que indicó una función relevante para este tipo de enzima en Ia tolerancia al estrés salmo más allá del papel bien conocido desempeñado en Ia acumulación de metales pesados También se investigo el crecimiento mediado por NgPCSI con tratamiento de estrés salino analizando Ia cinética de las proporciones de crecimiento a concentraciones de NaCI de 0,6 y 0,7 M (figura 2B) A ambas concentraciones, las células que contenían pYES2NgPCS1 mostraron una clara desventaja de crecimiento inicial en comparación con el vector vacío pYES2 Sin embargo, tras 22 horas de tratamiento, las células expuestas a una concentración 0,6 M primero y a OJ M después, demostraron un mejor crecimiento que las células control Finalmente, Ia concentración 0,7 IvI produjo una mayor diferencia de crecimiento que 0,6 M ₁ y por tanto concentraciones más elevadas de NaCI produjeron una mejora superior del crecimiento mediado por NgPCSI En consecuencia, con NaCI 1,4 M se mejoró el crecimiento de células de levadura mediante Ia presencia de NgPCSI en dichas células (figura 2C) Tal como se observo a concentraciones 0,6 M y 0,7 M, aunque no hubo una diferencia perceptible en las proporciones de crecimiento durante las primeras 22 horas, el efecto producido por pYES2NgPCS1 aumentó con el tiempo, Io que condujo a una mayor diferencia al final de las mediciones, Io que constató una respuesta tardía mediada por NgPCSI en Ia tolerancia al Na ⁺ Las condiciones de crecimiento experimental llevadas a cabo en este trabajo, que favorecen el crecimiento lento (medio mínimo sintético, sin glucosa libre), permitieron una mejor evaluación de los factores que estimulan el crecimiento en condiciones de estrés salino Hubo un aumento en Ia diferencia de DO600 a favor de las células que contenían pYES2NgPCS1, que se apreció claramente tras 39 horas de tratamiento y que aumentó espectacularmente a las 97 horas (figura 2D), Io que indicó que NgPCSI mejoraba drásticamente Ia tolerancia a Ia salinidad Sm embargo, Ia toxicidad del NaCI puede dividirse en dos componentes estrés hidnco y daño por Na ⁺ Por tanto, surgió Ia siguiente pregunta ¿,NgPCS1 mejora Ia tolerancia al NaCI, por ejemplo, aumentando sólo Ia retención de agua, pero no Ia acumulación de NaCP ¿O mejora Ia tolerancia y Ia acumulación? Con el fin de responder a esta pregunta, se analizó Ia

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acumulación de Na ⁺ en el citoplasma de células de levaduras con o sin NgPCSI, demostrándose que NgPCSI conduce a una mayor acumulación de Na ⁺ dentro de las células de levadura que contienen el vector pYES2NgPCS1 (figura 2E)

Ejemplo 3. Las fitoquelatinas confieren tolerancia al Na ^* en plantas y atenúan el estrés oxidativo.

Con el fin de probar Ia capacidad de Ia PCS para mejorar Ia tolerancia al Na ⁺ en plantas, se hicieron crecer especímenes de N glauca que sobreexpresaban una PCS de trigo (TaPCSI) probada previamente para determinar Ia acumulación de metales pesados (Gisbert C et al (2003) Biochem Biophys Res Commun 303440-445) (Martínez M et al J (2006) Chemosphere 64478-48524)

El vector binario pBI121 (Clontech) fue usado para Ia transformación El gen GUS del vector binario fue sustituido por el DNA codificante de Ia fitoquelatina sintasa de trigo TaPCSI mediante los sitios de restricción SamHI y ECL136II A continuación, se llevó a cabo Ia introducción del plásmido obtenido, conteniendo el cDNA TaPCSI, en Agrobacterium tumefaαeπs C58C1RιfR y posteriormente se realizo la transferencia mediante infección a plantas de N glauca La nueva construcción fue electroporada en células de Agrobacterium tumefaciens Los transformantes se seleccionaron en placas de LB con kanamicina y se pusieron en contacto con discos de 1 cm de diámetro durante 10 minutos con una suspensión de A tumefaciens conteniendo Ia construcción deseada Tras generar plantas adultas por medio del programa de regeneración in vitro de explantes de N glauca resistentes a kanamicina, se recolectaron las semillas de las diferentes líneas transgénicas conseguidas y se seleccionaron aquellas que contenían una o vanas integraciones en el genoma de Ia planta, recuperando aquellas que eran capaces de crecer en presencia del antibiótico kanamicina El último paso consistió en comprobar si Ia integración del cDNA de TaPCSI al genoma de Nicotiana glauca mejoraba apreciablemente Ia tolerancia a Na ⁺ de Ia planta El estudio de Ia tolerancia a Na ⁺ fue llevado a cabo germinando las semillas transgénicas en un sustrato con vermiculita y dolomita asi como en condiciones hidropónicas, aplicando a las 7 y 2 semanas respectivamente NaCI, hasta una concentración final de 200, 300 y 500 mM

Se hicieron evidentes dos aspectos En primer lugar, ambos tipos de especímenes, los de tipo silvestre y los que sobreexpresaban PCS, siguieron exactamente el mismo patrón de crecimiento en relación con las concentraciones de NaCI probadas, Io que indicó un efecto neto de PCS en Ia tolerancia al NaCI (figura 3A) En segundo lugar, los especímenes de W glauca necesitaban NaCI para mejorar el crecimiento, al menos en las condiciones hidropónicas probadas en este trabajo Ambos tipos de plantas siguieron el mismo patrón, pero las OMG (Organismo Modificado Genéticamente) mostraron un mejor crecimiento en todos los casos

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Esta similitud en los patrones de crecimiento sólo difirió en un factor de mejora indicando que Ia sobreexpresión de TaPCSI en N glauca con NaCI es transparente en el sentido de que el gen no cambia el equilibrio interno dentro de Ia célula y sólo mejora Ia cantidad de sal metabolizada Cuando se analizo Ia halotolerancia en medios sólidos, las plantas también mostraron el patrón típico observado en las condiciones hidropónicas (figura 3B) Tal como se determinó en los cultivos hidropónicos, Ia presencia de NaCI mejoró el crecimiento y confirmó que 200 mM es Ia concentración de NaCI óptima para todas las plantas utilizadas en el experimento, incluso mejor que en ausencia de NaCI Sm embargo, el crecimiento a 350 mM y 500 mM fue anómalamente alto considerando Ia magnitud de Ia superficie foliar En relación con el papel desempeñado por Ia PCS, Ia tolerancia observada en NaCI 500 mM fue especialmente evidente puesto que los especímenes de tipo silvestre no pudieron sobrevivir

El estrés oxidativo resultó atenuado por Ia PCS (L1 y L3, figura 3C) La PCS sólo aumentó Ia tendencia natural de N glauca cuantitativamente para lograr un crecimiento mejorado con NaCI

Materiales y métodos empleados

Cultivos, transformación y ensayos de crecimiento de levaduras

En este estudio se utilizó Ia cepa de Saccharomyces cerevisiae, YPH499 (MATa ura3-52 leu2δi Iys2-8O1 Ade2-101 trp1δ63, hιs3-D200) Para los ensayos de crecimiento en medios sólidos y líquidos, se hicieron crecer las células de S cerevisiae en medio mínimo sintético (SD) con o sin un 2% de agar bacto, respectivamente, que contenia un 1% de sacarosa, un 1% de galactosa, un 0 7% de base nitrogenada para levaduras sin aminoácidos y con sulfato amónico (Pronadisa) y MES-Tns 50 mM (pH 6,0) El medio SD se complementó con adenina (30 μg/ml), histidina (30 μg/ml), leucina (100 μg/ml), lisina (100 μg/ml) y tπptófano (80 μg/ml) La transformación mediante el procedimiento con acetato de litio y Ia selección de los transformantes en levaduras se llevó a cabo tal como se ha descrito (Ito H, Fukuda Y ₁ Murata K ₁ Kimura A (1983) J Bactenol 153 163-168), y utilizando el marcador URA3 para Ia selección en levaduras Las células de levaduras que llevan el vector vacio pY£S2 se utilizaron como control negativo Para investigar Ia cinética del estrés salino, se hicieron crecer las células hasta una DO a 600 nm de 1, aproximadamente, y se inocularon a una concentración de 10 ⁶ células por mi en medio líquido sin NaCI o conteniendo 0,6 M, 0,7 M y 1,4 M de NaCI Para los ensayos de goteo, se hicieron crecer las células hasta Ia saturación en SD diluido con agua (1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/100, 1/1 000 y 1/10 000), y se distribuyeron mediante réplica plater 8 x 6 array (Sigma-Aldπch) en placas que contenían 0,6 M, 0 7 M y 1 M de NaCI y CdCI ₂ 100 μM

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Materiales vegetales

Para el experimento en invernadero, se esterilizaron semillas de N glauca (tipo silvestre) y tres lineas transgénicas de F3 diferentes (TaP12, TaP17 y TaP18, líneas Ll ₁ L2 y L3, respectivamente) de Ia siguiente forma se sumergieron las semillas en lejía comercial al 30%, más un 0,01% de detergente Tritón X-100 durante 7 minutos para evitar el crecimiento fύngico y bacteriano, después se llevó a cabo un segundo lavado utilizando una disolución de etanol al 70% en agua con un 0,01% de Tritón X-100 Finalmente, se lavaron las semillas durante cinco repeticiones consecutivas con agua desionizada durando cada una 5 minutos para eliminar cualquier resto de disolución desinfectante Las semillas sumergidas se colocaron en placas Petπ con un medio preparado con agar 6 g/litro, sales de MS {Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Plaπt 15473-497), y sacarosa 10 g/litro a pH 5,7 tamponado con MES (ácido 2-[N- morfolιno]etanosulfónιco) 0,25 g/litro A los diez días (cuando se habían desarrollado las primeras hojas), se transplantaron tres plántulas por linea y tratamiento a macetas que contenían vermiculita y dolomita en las mismas proporciones y se cubrieron con película durante algunos días para obtener mejores condiciones aclimatadas Las plantas de seis semanas se colocaron en una bandeja diferente para cada tratamiento y se regaron una vez a Ia semana con o sin NaCI 200, 350 ó 500 mM durante 2 semanas Para el experimento m vitro, se colocaron tres plántulas para WT (tipo silvestre) y cada línea de N glauca, que crecían en condiciones estériles tal como se describió en (Gisbert C et al (2003) Biochem Biophys Res Commun 303 440-445), en tubos Falcon de 50 mi que contenían agua MiIIiQ con o sin NaCI 200, 350 y 500 mM a temperatura ambiente en un agitador suave (25 rpm en un agitador ELMI S4) durante 7 días

Clonación de NgPCSI

El ADN codificante fue sintetizado a partir de 2 μg del ARN total aislado de hojas de N glauca mediante Ia transcnptasa reversa de M-MuLV (virus de Ia leucemia muπna de Moloney) con cebador de olιgo(dT) ₁₈ (kit Fermentas de síntesis del ADN codificante de Ia primera hebra) según los procedimientos recomendados en el kit Un microlitro del ADN codificante producido se utilizó como molde en una reacción de PCR convencional de 50 μL Diseño de los cebadores para Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) se observó el dominio conservado en el extremo N-terminal para NtPCSI, AtPCSI, TaPCSI, B]PCSI y OsPCSI Se diseñaron dos cebadores diferentes en el extremo 5 ^' , FW1 (SEQ ID NO 2) y FW2 (SEQ ID NO 3) Las secuencias codificantes en Ia región C-terminal analizadas para este gen están menos conservadas que las del extremo N-termmal Por tanto, se usó Ia secuencia de ARN mensajero de NtPCSI y se diseñaron tres cebadores diferentes RV1 (SEQ ID NO 4), RV2 (SEQ ID NO 5) y RV3 (SEQ ID NO 6)

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Tras llevar a cabo los experimentos de PCR usando diferentes combinaciones, sólo se obtuvieron dos bandas con el tamaño esperado de 1,5 Kb, correspondiendo en ambos casos a los cebadores FW1/RV1 y FW2/RV2 Utilizando un gel de agarosa con tampón TAE al 1%, se llevaron a cabo las reacciones de PCR y se extrajeron mediante congelación-presión de Ia banda cortada y precipitación del ADN mediante 1/50 volúmenes de NaCI 5 M y 2 volúmenes de EtOH absoluto Tras medir Ia concentración de ADN en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega, Southampton, RU)

Se utilizó E coh DH5α como huésped Tras seleccionar los transformantes correctos y aislar el ADN plasmídico (Marligen bioscience, sistema rápido de aislamiento de plásmidos), se secuenciaron los fragmentos clonados en un secuenciador de ADN ABI Pnsm (Perkin-Elmer) usando los sitios T7 y SP6 localizados en el vector Ambas secuencias completas de los fragmentos de 1,5 Kb se alinearon con NtPCSI usando el programa LALIGN de William Pearson y se observó una identidad del 93% en Ia secuencia del fragmento FW1/RV1 La secuencia del segundo fragmento, FW2/RV2, reveló una identidad del 91% entre los nucleótidos 592 y 1501 de Ia secuencia codificante de NtPCSI La alineación de ambos fragmentos de secuencia dio como resultado Ia misma composición de nucleótidos entre Ia posición 592 y el codón de terminación La secuencia C-terminal correcta que corresponde al cebador RV1 se probó utilizando el segundo fragmento secuenciado NgPCSI se subclonó direccionalmente en los sitios Kpn\ /SamHI del vector de expresión pYES2 mediante una nueva amplificación por PCR con los cebadores FW2 y RV2 y con las secuencias adicionales Kpn\ y βamHI, respectivamente pYES2 incluye el gen Amp ^r de E coli, el marcador de levaduras seleccionable URA3 y el promotor inducible GAL1 para Ia expresión en células de levaduras E co/; se transformó mediante electroporación y los transformantes se seleccionaron para Amp ^r El ADN plasmídico del clon correcto que contenía NgPCSI en pYES2 se transformó en Ia cepa de levadura YPH499 y se seleccionó tal como se describió anteriormente Las secuencias de NgPCSI, NtPCSI, AtPCSI y TaPCSI se alinearon con el programa CLUSTAL W (Thompson J-D, Higgms D-G, Gibson T-J (1994) Nucleic Aαds Res 22 4673-4680) Se construyó un perfil de hidropatía de Kyte-Doolittle para conocer el carácter hidropático de NgPCSI [Kyte J, Dooltttle R (1982) J Mol Biol 157 105-132)

Medición de las concentraciones intracelulares de Na ^*

Se crecieron células de levadura en 20 mi de SD con los aminoácidos apropiados a una absorbancia a 600 nm de 0,6 Entonces, se añadió NaCI hasta una concentración final de NaCI 1,4 M y se incubó a 28 ⁰ C con agitación (150 rpm) durante 3 horas, se centrifugó durante 5

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minutos a 7 000 rpm (rotor Beckman JA-20, 4 ⁰ C), y se lavó cuatro veces con 10 mi de una disolución que contenía MgCI ₂ 20 mM y sorbitol 1,5 M Finalmente, se extrajo el contenido intracelular mediante incubación con 0,5 mi de MgCI ₂ 20 mM durante 12 minutos a 95 ⁰ C Tras Ia centrifugación durante 2 minutos a Ia velocidad máxima, se analizaron alícuotas del sobrenadante con un espectrómetro de absorción atómica (Vanan) en el modo de emisión de llama

Determinación de O?

Se detectó el anión superóxido O ₂ ^" , tal como describe Yamamoto Y βt al (2002) Plant Physiol 12863-72, usando dihidroetidio (DHE), una forma reducida de bromuro de etidio, que no es fluorescente y puede atravesar pasivamente Ia membrana de las células vivas Una vez en Ia célula, se oxida para dar un colorante fluorescente que se une al ADN cercano Se observó producción de O ₂ ^" en las raíces de N glauca tras Ia tinción de las raíces con DHE 10 μM en CaCI ₂ 100 μM, a pH 4,75 durante 13 3O h Se obtuvieron imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal invertido Leica TCS SL Para Ia detección del DHE, se excitaron muestras a 488 nm usando un láser de argón y se recogió Ia emisión entre 550 y 620 nm Se repitieron los experimentos con microscopía confocal y fluorescencia al menos cinco veces con resultados similares Se hicieron crecer semillas de N glauca durante un periodo de seis semanas en medio MS tal como se describió en los materiales vegetales El DHE se suministró tras nueve días de adaptación a las condiciones hidropónicas

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