Campo de la técnica

La presente invención se refiere a una construcción genética que codifica un nuevo gen que confiere resistencia a estreses abióticos. La presente invención también se refiere a un método para desarrollar organismos resistentes a estreses abióticos mediante el uso de la construcción genética de la presente invención.

Estado de la técnica anterior

Las levaduras son microorganismos eucariotas, algunas de las cuales son usadas en procesos industriales como en la elaboración de vino, cerveza, en la industria panadera, así como en la producción de una extensa variedad de compuestos bioquímicos.

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ha sido clásicamente una levadura que despierta gran interés y sobre la que se han concentrado una gran parte de los esfuerzos y recursos de investigación. Sin embargo, existe un creciente número de alternativas a dicha levadura que hoy día se encuentran en estudio por sus diversas propiedades. Algunas de ellas ofrecen características que les confieren una ventaja significativa frente a S. cerevisiae para su uso en procesos industriales; de hecho, la utilización de las llamadas levaduras "no convencionales", viene siendo una constante para procesos como la producción a gran escala de polisacáridos, aditivos alimentarios, combustibles, sustancias químicas y proteínas de interés farmacéutico y terapéutico (Wolf 1996; Domínguez et al., 1998).

Debaryomyces hansenü (D. hansenü) es una levadura osmo-, halo- y xerotolerante (Breuer y Harms, 2006) presente en multitud de ambientes salinos y/o con baja actividad hídrica, como el agua de mar, salinas y diversos alimentos curados, bien como especie alterante (Fleet, 1992; Casas et al., 2004) o bien debido a su capacidad para metabolizar los ácidos láctico y cítrico (Fleet, 1990; Seiler y Busse, 1990; Guerzoni et al, 1993). Existen pocos estudios relacionados con la resistencia de D. hansenü ante un estrés oxidativo. Una oxidasa alternativa resistente a cianuro fue inducida en presencia de peróxido de hidrógeno y menadiona (Veiga, 2002).

Desde un punto de vista industrial, D. hansenü se emplea en la elaboración de quesos y salchichón, donde es beneficiosa por su actividad proteolítica y lipolítica, por su capacidad de metabolizar ácido láctico y de inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes, además de por su tolerancia a cambios en las condiciones de salinidad (Kurita y Yamazaki, 2002). S. cerevisiae y otras especies de levadura como Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe son muy importantes para la producción de química fina, productos alimentarios, bioquímicos, terapéuticos, etc. Esto también es pertinente para especies de bacterias como Escherichia coli y Bacillus subtilis. S. cerevisiae, P. pastoris, S. pombe, E. coli y B. subtilis son especies de microorganismos que han sido extensamente estudiados y nuestro conocimiento sobre estas especies también las hacen las más manipulables y flexibles. Por eso es importante mejorar el rango operativo de estas y las demás especies de microorganismos que se usan para procesos comerciales.

En general, la concentración intracelular de potasio es más alta que la concentración extracelular y la concentración intracelular de sodio es más baja que la concentración extracelular. La célula mantiene esta homeostasis gracias a transportadores en la membrana. Por ejemplo, la expulsión de sodio en S. cerevisiae depende en gran medida del gen ENA1. La deleción de este gen produce una levadura con una sensibilidad al sodio (García de Blas, 1993). En D. hansenü se han identificado homólogos de los transportadores involucrados en la expulsión de sodio en S. cerevisiae (Almagro 2001, Gunde-Cimerman 2009, Ariño 2010).

Otro método para mejorar la resistencia al sodio de S. cerevisiae ha sido la expresión heteróloga de DhHOGl, un gen homologo a HOG1, en una cepa de S. cerevisiae que carecía del gen HOG1. La expresión de DhHOGl complementó la capacidad de acumulación de glicerol que regula el efecto osmótico. Aunque la resistencia al sodio fue mejorada, no fue mejorada al nivel de D. hansenü y esto indica que la halotolerancia de D. hansenü está relacionada con otros efectos además de la osmorregulación (Bansal y Mondal, 2000).

Existe por lo tanto una necesidad de nuevos métodos para mejorar la resistencia en microorganismos a estreses abióticos, con el fin de poder emplearlos por ejemplo en una mayor cantidad de procesos industriales. El objeto de la presente invención es el uso de una construcción genética para mejorar la resistencia de organismos a estreses abióticos. Aquí se incluye el caso, por ejemplo, de las plantas de interés agrícola, como por ejemplo la judía (Phaseolus vulgar is) o el girasol (Helianthus annuus), muy sensibles al exceso de sales, en su gran mayoría. También forma parte del objeto de la invención método para mejorar la tolerancia a estreses abióticos en un organismo.

Referencias

-Almagro A, Prista C, Benito B, Loureiro-Dias MC, Ramos J. (2001). "Cloning and expression of two genes coding for sodium pumps in the salt-tolerant yeast Debaryomyces hansenii." J Bacterio.. 183 :3251-5.

-Ariño, J., Ramos, J., Sychrová, H. (2010). "Alkali metal catión transport and homeostasis in yeasts". Microbiol Mol Biol Rev. 74: 95-120.

-Bansal, PK., Mondal, AK. (2000). "Yeast sequencing report. Isolation and sequence of the HOGl homologue from Debaryomyces hansenii by complementation of the hoglA strain of Saccharomyces cerevisiae". Yeast. 16: 81-88.

-Breuer, U., Harms, H. (2006). "Debaryomyces hansenii~an extremophilic yeast with biotechnological potential". Yeast. 23 : 415-37.

-Casas, E., De Ancos, B., Valderrama, M.J., Cano, P., Peinado, J.M. (2004). "Pentadiene production from potassium sórbate by osmotolerant yeasts". Int. J. Food Microbiol. 1 : 93-6. -Domínguez, JM. (1998). "Xylitol production by free and immobilized Debaryomyces hansenii". Biotechnol Lett. 20: 53-56.

-Fleet, G.H. (1990). "Yeast in dairy products". J.Appl.Bacteriol. 68: 199-211.

-Fleet, GH. (1992). "Spoilage yeasts". Crit. Rev. Biotechnol. 12: 1-44.

-García de Blas B., Rubio F.J., Bañuelos M.A., Haro R., Rodríguez-Navarro A. (1993) "Diferencial expresión of two genes encoding isoforms of the ATPase envolved in sodium efflux in Saccharomyces cerevisiae". Mol. Gen. Genet. 236: 363-368.

-Guerzoni, M.E., Lanciotti, R., Marchetti, R. (1993). "Survey of the physiological properties of the most frequent yeasts associated with commercial chilled foods". Int J Food Microbiol. 17: 329-341.

Gunde-Cimerman, N., Ramos, J., Plemenitas, A. (2009). "Halotolerant and halophilic fungí". Mycol Res. 113 : 1231-41.

-Kurita, O., Yamazaki, E. (2002). "Growth under alkaline conditions of the salttolerant yeast Debaryomyces hansenii IFO10939". Curr Microbiol. 45: 277-80.

-Seiler, H., Busse, M. (1990). "The yeasts of cheese brines". Int J Food Microbiol. 11 : 289-304. -Veiga, A., Arrabac, J.D., Loureiro-Dias, M.C. (2002). "Stress situations induce cyanide resistant respiration in spoilage yeast". Journal of Applied Microbiology. 95: 364-371. -Wolf, K. (1996). "Non-conventional yeasts in biotechnology". A handbook. Springer-Verlag, Germany.

Breve descripción de la invención

La presente invención se dirige a una construcción genética para mejorar la resistencia a estreses abióticos en un organismo, tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras y/o bacterias) y plantas.

Específicamente, la presente invención se dirige a una construcción genética que comprende la secuencia SEQ ID NO. : 1 o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. : 1. Además, es objeto de la presente invención un vector que comprende la construcción genética de la presente invención, así como un organismo que comprende la construcción genética y/o el vector de la presente invención.

Es también objeto de la presente invención el uso de la construcción genética o el vector de la presente invención para mejorar la tolerancia a estreses abióticos en un organismo.

La presente invención proporciona además un método para mejorar la tolerancia a estreses abióticos en un organismo que comprende la etapas de expresar el producto de la secuencia SEQ ID NO. : 1 o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con SEQ ID NO.: 1 en un microorganismo por encima de niveles de expresión endógena de dicho producto.

Descripción de las figuras

Figura 1: Primera etapa en la selección de clones con mayor tolerancia a NaCl.

Figura 2: Los transformantes de S. cerevisiae con genes de D. hansenii más toelrantes.

Figura 3: Alineamiento parcial de las proteínas codificadas por los genes DEHA2F27434g, DEHA2D19448g, DEHA2B00132g, DEHA2E00198g y DEHA2D00682g. El alineamiento se realizó mediante el programa CLC free Workbench. El grado de conservación en cada posición se indica mediante la longitud de las barras de color rosa (de 0-100%).

Figura 4: Los clones portadores del gen SEQ ID NO. : 1 (pSUPl) presentan mayor tolerancia a sodio que el control (pWS93 2).

Figura 5: Curvas de crecimiento de cepas CC02 (control) y CG05 (pSUP) en distintas concentraciones de NaCl. A partir de una suspensión de células se inocularon medios líquidos, con concentraciones de NaCl que se muestran en la Figura, a una D.O. inicial de 0.04. Se Siguió el crecimiento durante diferentes intervalos de tiempo hasta un máximo de 52 horas.

Figura 6: El clon pSUPl, que contiene del gen SEQ ID NO.: 1 de D. hansenii, es más tolerante al H ₂ 0 ₂ que el control (pWS93 2).

Figura 7: Verificación de la implicación del gen SEQ ID NO.: 1 en la tolerancia al estrés salino mediante el estudio de los efectos de la curación del plásmido. Los dos primeros clones (de izquierda a derecha) han perdido el plásmido y se comparan con dos que no lo han hecho.

Figura 8: Número de veces con respecto a la actina en la que se ha amplificado el ARN suplementado o no 0.5 M NaCl durante 30 minutos. Se extrajo el ARN de D. hansenii crecida en presencia o no de NaCl, se retrotranscribió y se amplificó el ADNc con los cebadores correspondientes a los genes de estudio por RT-qPCR. La gráfica muestra por una parte, el número de veces con respecto a la actina que se han amplificado los genes de estudio, representándose en color más claro las células de D. hansenii, crecidas sin tratamiento y en colores más oscuros aquellas que sí lo recibieron. Por otro lado, se expone cuanta expresión posee las células tratadas con respecto las no tratadas para cada gen, indicado entre paréntesis. Estos datos se comprobaron con la realización del test t-student para una cola y se indica con * si son resultados significativos (p < 0.01) o ** si son muy significativos (p < 0.0095).

Figura 9: Número de veces con respecto a la actina en la que se ha amplificado el ARN procedente de células tratadas o no con 50 μΜ de H ₂ O ₂ durante 30 minutos. Se extrajo el ARN de D. hansenii tratada o no con H ₂ O ₂ . Tras comprobar que el ARN no estaba contaminado con ADN genómico, se retrotranscribió y se amplificó el ADNc con los cebadores correspondientes a los genes de estudio por RT-qPCR. Se representó de la misma forma que en la Figura 8.

Descripción detallada de la invención

Construcción genética de la presente invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción genética que comprende la SEQ ID NO. : l, o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO. : 1, tal y como un 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO. : 1.

SEQ ID NO.: 1 se corresponde con la secuencia de ADN de DEHA2B00132:

ATGAGTTGTGTTTTCTGTCAATATTTAACCCTGCATTTTTGCAACAAAATGGAAGCA CACGGCATACGTATTGTTGAGATTGATGGAGTTTCTATTTTAACACACGACGGAAAT ATTCTTAATCCGTTTTCCGAGAGATTTACGCAGAGATATTTAGCGAATGTTGTAGGT TGTTCCAGCGTCCGTGAAGATATTCTATCAACAATTAATAACCACTTTGATAACCAC TCAAAAAGCCATTATGTGCGCAAAAGTGTTGTATCTACCGATCACGCATCGGAAATA GCAGGAGTCAAAGAATCTAAGCTAAATGTTTGCAAGCTTTGCTTCAATCATGCCTCG AAGACTCACCTTAATCTTCATCTTAGAACAGAACACAGGGTCAATAGTAATTTCCAA CAGCACGTCTTCAGAACAACCGGGTATGCAATTCCCAACCAAAAGTGCGGCTTTTCC TATTTATACCGCGAAAAAGAAGACACCAAGCCACCCACTTCAATGACAACCATGGA AGGCCCGCATACACATCTCCGGCACGAGGACAAGTTCCTCCGCACAATCAACGCCA ACCTATATTATGGAAAGGGATACCCGCAGTACTTACACAGCGAAAACAAGGAAGAA AGTATACCGGTGTTTGAGGCCGTCAAGAAGTATATTCTCCAGGACAGGCCACATTTG AAGGGCACGCATCCCATTTACAATCGGATGTTGCGAGAGGGCATATTGAAGGTTCC CGTTCTCTTTACGACCCAGGTGATCTATGCAAACTATGCCAGCCGTTTTTTCTACACG TTTGCCAAGGTATGCGGTAACCGAATCATCGAGGAAGTGGTGACCAATCCCACCGA CGAAGTGGTGAAGCGGGCGGTGATGGAGACGATCGAGAAGTATATTGTGGTGGAAG AAGACACGACTGGAATGTTTATGAGAGCCGTGATTATCTCGTTGATGCTTCCCGATG ACAGGTTTGCGCAGTCGAAGGTGCGAGCCAGAATCCTCGATGGCATCAACTATTTCT TGAAGTTGGCTATAGCAGACTATATGTTGATGAGAAACAACGCCAATGGGATTCTTT GA

El grado de identidad existente entre dos secuencias se puede determinar por métodos convencionales, por ejemplo, por medio de algoritmos estándar de alineamiento de secuencias que son conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST (Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10).

Por ejemplo, los genes denominados DEHA2F27434g (SEQ ID NO. : 2), DEHA2D19448g (SEQ ID NO.: 3), DEHA2D00682g (SEQ ID NO.: 4) y DEHA2E00198g (SEQ ID NO.: 5), poseen un porcentaje de identidad del 92%, 91%, 91% y 89% respectivamente, con respecto al gen denominado DEHA2B00132g (SEQ ID NO.: 1).

Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la construcción genética de la presente invención comprende una secuencia que tiene al menos un 92% de identidad con la SEQ ID NO: l; preferiblemente, esta secuencia es SEQ ID NO. : 2.

Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la construcción genética de la presente invención comprende una secuencia que tiene al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: l; preferiblemente, esta secuencia es SEQ ID NO. : 3. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la construcción genética de la presente invención comprende una secuencia que tiene al menos un 91% de identidad con la SEQ ID NO: l; preferiblemente, esta secuencia es SEQ ID NO. : 4. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, la construcción genética de la presente invención comprende una secuencia que tiene al menos un 89% de identidad con la SEQ ID NO: l; preferiblemente, esta secuencia es SEQ ID NO. : 5.

En una realización preferida, la construcción genética de la presente invención comprende la SEQ ID NO.: 2, o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO. : 2, tal y como un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO. : 2.

SEQ ID NO.: 2 se corresponde con la secuencia de ADN de DEHA2F27434g:

ATGCATTTAACGCGTGCACGAATGGAATCTCGACGACAGATGAGCTGTCCTTTTTTG AAAATATTGAACCCTGCATCTTTTGCAACAAAAATGGAAGCAATACGCATTGTTGAG ATTGATGGGGTTTCTGTTTTAACACATGACAGAAACATTCTTAACCCTTTTTCCGAGA GATTTAACAAGAGATATTTAGTGAATGCCATGGATTGTTCCATTGTCCGTGATGACA TTCTATCAACAATTCATAACCACTTCGATAACCACTCAAAAGACCATTATGTGCGAA AAAGGGTTGTTCCCATCAATTACTACTCTGAAATAGCGGGAGTCAAGGAATCTAAA CTCAATGTTTGCAAGATTTGTTTTAACCATTGCGCGCTGAACTACATTAATCAACATC TCAAGAAAGAGCATGGCGTTAAGAGAAAATTCCAACGGCACGTCTTCAGAACAACC GGGTATGCAATTCCCAACCAAAAGTGCGGCTTTTCCTATTTATACGGCGAAAAAGAA GACACCAAACCGCCCACTTCAATGACAACCATCGAAGGCCCGCTTACCCATCTCCGG TACGAGGACAAGTTCCTCCGCACAATCAACGCCAACCTATATTACGGAAAGGGATA CCCGCAGTACTTACACAGCGAAAACAAGGAAGAAAGTATACCGGTGTTTGAGGCCG TCAAGAAGTATATTCTCCAGGACAGGCCACATTTGAAGGGCACGCATCCCATTTACA ATCGGATGTTGCGAGAAGGCATATTGAAGGTTCCCGTTCTCTTTACGACCCAGGTTA TCTATGCAAACTATGCCAGCCGCTTTTTCTACACGTTTGCCAAGTTATGCGATAACC GAATCATCGAGGAAGTGGTGACCAATCCCACCGACGAAGTGGTGAAGCGGGCGGTG ATGGAGACGATCGAAAGGTATATTGTGGTGGAAGAAGACACGACTGAAACGTTTAT CAAAGCCGTGATTATCTCGTTGATGCTTCCTGATGACCGGTTTGCGCAGTCAAAGGT GCGAGCCAAAATCTTTGACGGGATCAACTATTTCTTGAAGTTGGCCATAGCAGACTA TATGTTGATGAGAAACAACGCCAAGGAGATTATCAAAAACTGGGAACATCTAGCAT ACCAGGCATTTGAGTCCACACGGTCATACAACCATAAATTCAATAGGACGTTGCCG GCTTTCCAGACGATAGTCGACCAGCAGGATAACCGAAAGGTGATGATCGGGTCGGT CAGATTCAGTACGCCGGACCTCGGCAAGTTGGTTAGATGCTTGGTCCGGGAGTACCA TACCACGGTTCGAAACTTGCTACCGGACGGGATGTTGATGGTGGACGAGCTATACG AGGAGTTTCGAAAGCACGCCAAAGATATGTTCAGCTGCACGGATTTAGGATATAGT GTTTTCTACGGAACAGACGAACTCAACAAGCTTTCTTATCAGCAGCGACGCACGTAC GAGGAAGCCGTCGGCGATAAATGGAAGAATCAAAAGTATATGAGAAGCATGTTTGA CCAGTTTACCAGGCTCAACTTGAATATCTTTGTATGCATCTTGATCACCTGTGGCAGT CCATTTCGGGTGACGGAGTTGCTCACGTTGACGTTTGCCAACCCGACAGATTTGGTG CGCACGATGTATTATTCCAACGAGCATATTCAGATTAACCTTCTCTATAATAAGAAT ACGCATAGCAGCATGCGATATTCGAACCATACCAAGATGTTGCCCATTGAGGTTTCC AAAATAGTCATCCATTACGTGTCAATTATCAAATATTTGGAGGTTGCAATCGTGGAA GAGCACGGGTGGGCCAAGTCCAAAAGCGATATGAGCGTGGCAGACGATTGGGAAG ACGACGAAGAGTTTGACGAGCTGGACGGAAATGATCTGGAAGATGGGGCTAGCTTG TTAGCGTCCAAGGCGCTTTCCAAGAGAGATGAAATAAAGACGCTCTTGTTCATGTAT AAGCTCGGCCCGAGAAATGGGGGCCAGGTGTTCAAGTATTTGGAGCTGGTGAGTGA AAAGTATATCAGGGAGAAGTATACGCCCAGGATTTTACGGCAGGCATTAGTCTATTT TACGCGGACGCTCTTGGAAGAAGCAAAGTATCAAGGAGTGGGGATTCTCAATCGAA TTGATTCCATTGCAGGTCATAGGTCAGAGACCGCCGATTTGCAGTACGGAGTTACGC ATAGCAATATGTATGCAAACCTATATGATGGATAA En otra realización preferida, la construcción genética de la presente invención comprende la SEQ ID NO.: 3, o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO. : 3, tal y como un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO. : 3.

SEQ ID NO.: 3 se corresponde con la secuencia de ADN de DEHA2D19448g:

ATGGAAGCAATACGCATTGTTGAGATTGATGGGGTTTCTGTTTTAACACATGACAGA AACACTCTTAACCCTTTTTCCGAGAGATTTAACAAGAGATATTTAGTGAATGCCATG GATTGTTCCATTATCCGTGATGACATTCTATCAACAATTCATAACCACTTCGATAACC ACTCAAAAGACCATTATGTGCGAAAAAGGGTTGTTCCCATCAATTACTACTCTGAAA TAGCGGGAGTCAAGGAATCTAAACTCAATGTTTGCAAGATTTGTTTTAACCATTGCG CGCTGAACTACATTAATCAACATCTCAAGAAAGAGCATAGCGTTAAGAGAAATTTC CAACGGCACGTCTTCAGAACAACCGGGTATGCAATTCCCAACCAAAAGTGCGGCTT TTCCTATTTATACCGCGAAAAAGAAGACACCAAACCGCCCACTTCAATGACAACCAT CGAAGGCCCGCTTACCCATCTCCGGCACGAGGACAAGTTCCTCCGCACAATCAACG CCAACCTATATTACGGAAAGGGATACCCGCAGTACCTACACAGCGAAAACAAGGAA GAAAGCATACCGATGTTTGAGGCCGTCAAGAAGTATATTCTCCAGGACATACCACA TTTGAAGGGCACGCATCCCATTTACAATCGGATGTTGCGAGAGGGCATATTGAAGGT TCCCGTTCTCTTTACGACCCAGGTGATCTATGCAAACTATGCCAGCCGTTTTTTCTAC ACGTTTGCCAAGTTATGCGATAACCGAATCATCGAGGAAGTGGTGACCAGTCCCAC CGACGAAGTGGTGAAGCGAGCGGTGATGGAGACGATCGAGAAGTATATTGTGGCGG AAGAAGACACGACTGAAATGTTTATGAAAGTCGTGATTATCTCGTTGATGCTTCCCG ATGACCGGTTTGCGCAGTCGAAGGTGCGAGCCAAAATCTTTGACGGCATCAACTATT TCTTGAAGTTGGCTATAGCAGACTATATGTTGATGAGAAACAACGCCAAGGAGATT ATCAAAAAACTGGGAGAATCTAGCATACCAGGCATTTGA En otra realización preferida, la construcción genética de la presente invención comprende la SEQ ID NO.: 4, o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO. : 4, tal y como un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO.: 4.

SEQ ID NO.: 4 se corresponde con la secuencia de ADN de DEHA2D00682g:

ATGGTAAGCTGCGAGATAAGTGTCGCATGGCAAACTATTTGCGGCAAATTGCCAAT GCGAGTCAAAGAATCTAAGCTAAATGTTTGCAAGCTTTGCTTCAATCATGCCTCAAA GTCACACATTAATCATCATCTTAGAACAGAACACAGGGTCAATTGTAACTTCCAACG GCACGTCTTCAGAACAACCGGATATGCAATTCCCAACCAAAAGTGCGGCTTTTCCTA TTTATACCGCGAAAAAGAATACACCAAACCGCCCACTTCAATGACAACCATCGAAG GCCCGCATACCCATCTTCGACACGAGAACGAGTTCCTCCGCACAATCAACACCAACC TATATTACGGAAAGAGATACCCGCAGTACCTACACAGCGAAAACAAGGAAGAAAG CATACCAGTGTTTGAGGCCGTCAAGAAGTATATTCTCCAGGACAGACCACATTTGAA GGGCACGCATCCCATTTACAACCGGATGTTGCGAGAGGGAATATTGAAGGTGCCGG CTCTCTTTACGACCCAGGTGATATATGCAAACTACGCCGGCCGCTTTTTCTGTACGTT TGCCAAGTTATGCAATAACCGAATCATCGAGGAAGTGGTGACCAATCCCACCGACG AAGTGGTGAAGCGAGCGGTGATGGAGACGATCGAGAAGTATATTGTGGTGGAAGA AGACACGACTGAAATGTTTATGAAAGCCGTGATTATCTCGTTGATGCTTCCCGATGA CCGGTTTGCGCAGTCGAAGGTGCGAGCCAAAATCTTTGACGGCATCAACTATTTCTT GAAGTTGGCTATAGCAGACTATATGTTGATGAGAAACAACGCCAAGGAGATTATCA AAAAACTGGGAGAATCTAGCATACCATGCATTTGA

En otra realización preferida, la construcción genética de la presente invención comprende la SEQ ID NO.: 5, o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO. : 5, tal y como un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad con la SEQ ID NO. : 5. SEO ID NO.: 5 se corresponde con la secuencia de ADN de DEHA2E00198g:

ATGGAGTCGCACGAATTACGTATTAGAGAAGTCGGGGGAGTGTCTATTTTAGTGCAC AAGGACAAAATAGTAAATCCTTTGGCTGAGAAATTTGCAAATAAATATCTACCACG TCTTATCGAAAGTAGTGAAATCCGCAGTACTATATTGTCGGAAATTAAAAGTTACTA CCAGGAACATTCCAAACAGCATTATTTATTGAAGCAGATAATTGCTGTTACAGATGA CTCCGAGGTACCAGGAGTCAAAGAATCTAAGCTAAATGTTTGCAAGCTTTGCTTCAA TCATGCCTCAAAGTCACACATTAATCATCATCTTAGAACAGAACACAGAGTCAATTG CAACTTCCAACGGCACGTCTTCAGAACAACCGGGTATGCAATTCCCAACCAAAAGT GCGGCTTTTCCTATATATACCGCGAAAAAGAAGACACCAAACCGCCCACTTCAATG ACAACCATCGAAGGCCCGCATACCCATCTCCGGCACGAGGACAAGTTCCTCCGCAC AATCAACGCCAACCTATATTACGGAAAGGGATACCCGCAGTATCTACACAGCGAAA ACAAGGAAGAGAGCATACCGGTGTTTGAGGCCGTCAAGAAGTATATTCTCCAGGAC AGGCCACATTTGAAAGGCACGCATCCCATTTACAACCGGATGTTGCGAGAGGGAAT ATTGAAGGTGCCGGTTCTCTTTACGACGCAGGTGATATATGCAAATTACGCCGGCCG CTTTTTCTACACGTTTGCCAAGTTATGCGATAACCGAATCATCGAGGAGGTGGTGAC CAATCCCACCGACGAAGTGGTGAAGCGAGCGGTGATGGAGACGATCGAGAAGTATA TTGTGGTGGAAGAAGACACGACTGAAACGTTTATGAAAGCCGTGATTATCTCGTTGA TGCTTCCCGATGACCGGTTTGCGCAGTCGAAGGTGCGAGCCAAAATCTTTGACGGCA TCAACTATTTCTTGAAGTTGGCCATAGCAGACTAA

Las secuencias de ácido nucleico como por ejemplo las secuencias representadas en SEQ ID NO. : 1-5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%, o un 92%, o un 95%), o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias, pueden estar operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos que codifica un promotor, tal y como una persona experta en la materia puede comprender.

El término "operativamente unida", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que la proteína o proteínas es (son) expresada(s) en el marco de lectura correcto bajo el control del promotor y las secuencias de control o reguladoras de expresión.

Opcionalmente, además de una secuencia que funciona como un promotor, la construcción genética de la presente invención puede incorporar otras secuencias de control o secuencias reguladoras de la expresión. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción de la proteína de interés. Además de promotores, incluyen secuencias que codifican reguladores transcripcionales, secuencias de unión a ribosomas (RBS) y/o secuencias terminadoras de transcripción. Dichas secuencias de control de expresión pueden ser funcionales en células y organismos procariotas y/o en células y organismos eucariotas. Ventajosamente, dicha construcción genética puede además comprender un marcador o gen que codifica para un motivo o fenotipo que permite la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción genética. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en la construcción genética de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar las células transformadas genéticamente.

Vector de la presente invención

La construcción genética de la presente invención puede estar comprendida en un vector apropiado. Por lo tanto, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende la construcción genética de la presente invención. El vector puede ser cualquier tipo de vector, como un vector de clonación, un vector de expresión o un plásmido.

El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier vector adecuado para clonar, lo que generalmente supone la presencia de sitios de restricción, un origen de replicación para su propagación en bacterias y un marcador de selección.

El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier vector adecuado para expresar la(s) proteína(s) codificada(s) por la(s) SEQ ID NO. : 1- 5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%, o un 92%, o un 95%, o un 97%), o un 99%, de identidad con dichas secuencias.

La presente invención también se refiere al uso de los vectores de la presente invención para transformar, transfectar o transducir microorganismos, preferiblemente levaduras y/o bacterias, más preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, D. hansenii, Schwanniomyces occidentalis Pichia, Kluyveromyces y bacterias como E. coli.

La presente invención también se refiere al uso de los vectores de la presente invención para transformar, transfectar o transducir células de organismos superiores, preferiblemente células de plantas, más preferiblemente de la planta modelo Arabidopsis thaliana o de cualquier planta de interés agrícola como la judía (Phaseolus vulgaris) y/o el girasol (Helianthus annuus).

El término "transformación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la introducción de material genético externo en células procariotas o eucariotas mediante plásmidos, vectores virales (en ocasiones también referido como transducción) u otras herramientas para la transferencia.

El término "transducción", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere al proceso por el cual se introduce material genético exógeno en una célula procariota o eucariota utilizando un virus como vector.

El término "transfección", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la introducción de material genético externo en células eucariotas u organismos mediante plásmidos, vectores virales u otras herramientas para la transferencia.

Organismos de la presente invención

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un organismo que comprende la construcción genética o el vector de la presente invención. El organismo de la presente invención puede ser un microorganismo, tal y como una bacteria o una levadura, o un organismo superior, tal y como una planta.

El término "microorganismo" , tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un ser vivo o un sistema biológico que solo puede visualizarse con el microscopio. El término "microorganismo" también se refiere a un organismo unicelular o pluricelular que puede ser eucariota o procariota y que solo puede visualizarse con el microscopio.

En una realización preferida, el microorganismo es una levadura. El término "levadura", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a un organismo eucariota, clasificado como hongo ya sean ascomicetos o basidiomicetos microscópicos, con forma unicelular predominante en su ciclo de vida, generalmente caracterizado por dividirse asexualmente por gemación o fisión binaria y tiene estados sexuales que no están adjuntos a un esporocarpo.

Preferiblemente, la levadura es Saccharomyces cerevisiae, Pichia, Kluyveromyces, D. hansenii y/o Schwanniomyces occidentalis. En otra realización preferida, el microorganismo es una bacteria, preferiblemente E. coli.

En otra realización preferida, el organismo es una planta. Preferiblemente, la planta es Arabidopsis thaliana y/o plantas de interés agrícola como la judía (Phaseolus vulgaris) o el girasol Helianthus annuus).

Usos de la presente invención

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de la construcción genética de la presente invención y/o del vector de la presente invención para mejorar la tolerancia a estreses abióticos en un organismo.

El término "estrés abiótico", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere al impacto negativo causado por factores inertes a un organismo. Por ejemplo, pero sin limitarse, la temperatura, la salinidad, agente oxidante, agente tóxico, efectos mecánicos, el pH, la osmolaridad y la radiación son factores inertes que pueden causar un impacto negativo a un organismo, como por ejemplo un microorganismo tal y como levaduras o bacterias, o una planta.

En una realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejora la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta, al estrés inducido por una temperatura elevada, una temperatura baja y/o una temperatura variable. El término "temperatura elevada", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una temperatura que está por encima de la temperatura óptima de un organismo. El término "temperatura baja", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una temperatura que está por debajo de la temperatura óptima de un organismo. El término "temperatura variable", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una temperatura que fluctúa por encima y/o por debajo de la temperatura óptima de dicho organismo. El término "temperatura óptima", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la temperatura donde se maximiza el crecimiento y la replicación de un organismo.

El término "salinidad', tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a la concentración de sal en el ambiente en donde se encuentra el organismo, tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta. En una realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejora la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por una alta concentración de sal, una concentración baja de sal y/o una concentración de sal que fluctúa por encima y/o por debajo de la concentración óptima de sal. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de sodio (como, por ejemplo, cloruro de sodio, NaCl, o fosfatos de sodio) de al menos entre 0.2 M a 2.4 M, tal y como 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de litio (como por ejemplo, cloruro de litio, LiCl, o fosfatos de litio) de al menos entre 0.05 y 0.8 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M o 0.8 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de potasio (como, por ejemplo, cloruro de potasio, KC1, o fosfatos de potasio) de al menos entre 0.2 M a 2.4 M, tal y como 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de cesio (como, por ejemplo, cloruro de cesio, CsCl, o fosfatos de cesio) de al menos entre 0.05 M a 2.0 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M o 2.0 M.

El término "alta salinidad", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una concentración de sal que está por encima de la concentración óptima de sal de un organismo. El término "baja salinidad', tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una concentración de sal que está por debajo de la concentración óptima de sal de un organismo. El término "concentración óptima de sal" ,, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una concentración donde se maximiza el crecimiento y la replicación de un organismo. El término "estrés oxidativo", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al impacto negativo causado por un agente oxidante a un organismo, tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta. El término "agente oxidante ^' " , tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a compuestos o moléculas que oxidan otras sustancias en reacciones electroquímicas o de reducción-oxidación, por ejemplo, pero sin limitarse, hipoclorito y otros hipohalitos, yodo y otros halógenos, clorito/clorato/perclorato y otros compuestos halógenos análogos, sales de permanganato, compuestos relacionados con el cerio, compuestos cromados hexavalentes, peróxidos (peróxido de hidrógeno), reactivo de Tollens, sulfóxidos, ácido persulfúrico, ozono, tetróxido de osmio, dióxido de plomo, oxígeno, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido peroxidosulfúrico, perborato de sodio, óxido de nitrógeno y nitrato de potasio son agentes oxidantes. En una realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por un agente oxidante. En otra realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por el peróxido de hidrógeno.

El término "agente tóxico", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a compuestos o moléculas que tienen una capacidad de producir efectos perjudiciales sobre un ser vivo, al entrar en contacto con él. Έη una realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por un agente tóxico. En otra realización preferida, la construcción genética y/o el vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por el sodio. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un microorganismo a una concentración de sodio de al menos 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de litio de al menos entre 0.05 y 0.8 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M o 0.8 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de potasio de al menos entre 0.2 M a 2.4 M, tal y como 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M. En otra realización preferida, la construcción genética mejora la tolerancia en un organismo a una concentración de cesio de al menos entre 0.05 M a 2.0 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M o 2.0 M.

El término "efecto mecánico ^' ", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al daño causado a organismos tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta por factores físicos como vibraciones, colisiones y la extensión, contracción y/o ruptura de la pared celular y/o la membrana celular. En una realización preferida, la construcción genética y/o vector de la presente invención mejoran la tolerancia de un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por un efecto mecánico. En otra realización preferida, la construcción genética y/o vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por un pH elevado, un pH bajo y/o un pH variable. El término "pH elevado", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un pH que está por encima del pH óptimo de un organismo. El término "pH bajo", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un pH que está por debajo del pH óptimo de un organismo. El término "pH variable", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un pH que fluctúa por encima y/o por debajo del pH óptimo. El término "pH óptimo", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere al pH donde se maximiza el crecimiento y la replicación de un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta.

En otra realización preferida, la construcción genética y/o vector de la presente invención mejoran la tolerancia en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por una osmolaridad elevada, una osmolaridad baja y/o una osmolaridad variable. El término "osmolaridad elevada", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una osmolaridad que está por encima de la osmolaridad óptima de un organismo. El término "osmolaridad baja", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una osmolaridad que está por debajo de la osmolaridad óptima de un organismo. El término "osmolaridad variable", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una osmolaridad que fluctúa por encima y/o por debajo de la osmolaridad óptima. El término "osmolaridad óptima", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la osmolaridad donde se maximiza el crecimiento y la replicación de un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta. En otra realización preferida, la construcción genética y/o vector de la presente invención mejoran la tolerancia de un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta al estrés inducido por la radiación.

En una realización preferida, la construcción genética y/o vector de la presente invención confieren un incremento en la tolerancia a la sal, preferiblemente al sodio, al litio, al cesio y/o al potasio, en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta. En una realización preferida alternativa, la construcción genética y/o el vector de la presente invención confieren un incremento en la resistencia al estrés oxidativo en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta. Método para mejorar la tolerancia a estreses abióticos

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método para mejorar la tolerancia a estreses abióticos en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta, que comprende expresar el (los) producto(s) de la SEQ ID NO. : 1 o una secuencia que tiene al menos un 75% de identidad con la SEQ ID NO.: 1, tal y como un 75%, 80%, 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, o 99% de identidad con la SEQ ID NO.: 1 en un microorganismo por encima de los niveles de expresión endógenos de dicho(s) producto(s).

En otra realización preferida, pero sin limitarse, el método comprende expresar el(los) producto(s) de la(s) secuencia(s) representadas en SEQ ID NO.: 1-5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%, o un 92%, o un 95%, o un 97%, o un 99%), de identidad con dichas secuencias en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta, por encima de los niveles de expresión endógenos de dicho(s) producto(s).

En una realización preferida, el método se caracteriza por que la sobreexpresión del(los) producto(s) de la(s) secuencia(s) representadas en SEQ ID NO.: 1-5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%, o un 92%, o un 95%, o un 97%, o un 99%), de identidad con dichas secuencias en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta, por encima de niveles de expresión endógena de dicho producto. El término "por encima de niveles de expresión endógena", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a la expresión del(los) producto(s) de la(s) secuencia(s) representadas en SEQ ID NO.: 1-5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%), o un 92%, o un 95%, o un 97%, o un 99%, de identidad con dichas secuencias a un(os) nivel(es) más alto(s) que los niveles que se encuentra(n) normalmente en el organismo hospedador.

En una realización preferida, el método también comprende, pero sin limitarse, una etapa donde se selecciona una cepa de organismo resistente al estrés abiótico tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta, mediante la exposición de múltiples células a un estrés abiótico y posteriormente escogiendo las células que crecen y se replican mejor. La etapa de selección debe cumplirse después de la etapa (a) donde se sobreexpresa el(los) producto(s) de la(s) secuencia(s) representadas en SEQ ID NO.: 1-5, sus secuencias complementarias o una variante de cualquiera de las secuencias anteriores que posee al menos un 75%, o un 80%, o un 85%, o un 89%, o un 90%, o un 91%, o un 92%, o un 95%, o un 97%, o un 99%), de identidad con dichas secuencias en un organismo tal y como un microorganismo (por ejemplo, levaduras o bacterias), o una planta por encima de niveles de expresión endógena de dicho(s) producto(s). En una realización preferida, la temperatura usada para la selección es una temperatura entre 4 a 90 °C, preferiblemente entre 10 a 60 °C y aún más preferible entre 15 a 40 °C. En una realización preferida, el pH usado para la selección es entre 4 a 10, preferiblemente entre 5 a 9 y aún más preferible entre 6 a 8. En una realización preferida, se usa un agente oxidante para la selección. En otra realización preferida, se usa peróxido de hidrógeno a una concentración de al menos entre 5 μΜ a 50 mM, tal y como al menos 5 μΜ, 50 μΜ, 0.1 mM, 0.5 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM o 50 mM o más para la selección. En una realización preferida, se usa una concentración de sodio de entre 0.2 M a 2.4 M, tal y como al menos 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M para la selección. En otra realización preferida, se usa una concentración de litio de al menos entre 0.05 M y 0.8 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M o 0.8 M. En otra realización preferida, se usa una concentración de potasio de al menos entre 0.2 M a 2.4 M, tal y como 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.6 M, 1.8 M, 2.0 M, 2.2 M o 2.4 M. En otra realización preferida, se usa una concentración de cesio de al menos entre 0.05 M a 2.0 M, tal y como 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M, 1.0 M, 1.2 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.8 M o 2.0 M.

Si no se menciona específicamente a lo contrario, el término "comprende" se utiliza, en el contexto de esta solicitud, para indicar que la lista de componentes puede incluir aspectos opcionales mencionados o no mencionados. El término "comprende ^' " también puede incluir el concepto "consiste erí" .

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación del gen DEHA2B00132g (SEQ ID NO.: 1)

Los ensayos de este trabajo se han realizado mayoritariamente con la cepa silvestre de la levadura Saccharomyces cerevisiae BY4741. Para los ensayos de transformación se utilizó la bacteria Escherichia coli DH5a. En algunos ensayos se utilizó la cepa silvestre de Debaryomyces hansenü con número de depósito CBS 767, de acceso público en la colección del Centraalbureau voor Schimmel cultures (CBS), Holanda. En los primeros experimentos se hizo uso de una genoteca de Debaryomyces hansenü PYCC2968 contenida en el plásmido YEp352 en E. coli DH5a y se transformó la cepa silvestre de S. cerevisiae. Después se ensayó la tolerancia a la salinidad en las diferentes cepas tal y como se describe en Ejemplo 3. Tras transformar Saccharomyces cerevisiae con la genoteca de Debaryomyces hansenü se obtuvieron clones que se sometieron a un primer estudio de tolerancia a NaCl (Figura 1). En la Figura 2 se muestra el crecimiento de algunos clones ya seleccionados. Las secuencias de los dos transformantes que presentaban mayor resistencia correspondían a SEQ ID NO.: 1. Ejemplo 2: Análisis informático

Método usado para el análisis informático.

El alineamiento parcial de las proteínas codificadas por los genes DEHA2F27434g, DEHA2D19448g, DEHA2B00132g, DEHA2E00198g y DEHA2D00682g se realizó mediante el programa CLC firee Workbench.

El resultado del análisis informático concluyó sorprendentemente en que no se presentaban homologías en otros organismos, sino que esta se encontraba en cuatro genes pertenecientes al propio genoma de D. hansenü denominados DEHA2F27434g (cromosoma 2F, SEQ ID NO. : 2), DEHA2D19448g (cromosoma 2D, SEQ ID NO. : 3), DEHA2D00682g (cromosoma 2D, SEQ ID NO. : 4) y DEHA2E00198g (cromosoma 2E, SEQ ID NO. : 5), con un porcentaje de identidad del 92%, 91%, 91% y 89% respectivamente, con respecto al gen DEHA2B00132g (cromosoma 2B, SEQ ID NO. : 1) (Figura 3). Todas las cepas silvestres, aisladas de alimentos, de D. hansenü que se han estudiado, poseen estos genes. Ejemplo 3: Clonación del gen SEQ ID NO.: 1

Para clonar el gen, se amplificó un fragmento de ADN genómico de D. hansenü (1196 pb), que contenía la secuencia codificante completa del gen SEQ ID NO. : 1 mediante PCR usando los cebadores Dh2B00132fw (SEQ ID NO. : 6, GAATTCACGACAGATGAGTTGTGTTTTCTG) y Dh2B00132rv (SEQ ID NO. : 7, ACCAGACCGAACCTATCATACC) y la enzima de alta afinidad BIO-X-ACTTM Short. Tras la amplificación del gen, se realizó una ligación del producto obtenido en el plásmido de clonaciónón comercial pSPARK® (Cavax), que posee un origen de replicación para bacterias tipo pUC, el gen de resistencia a la ampicilina (β-lactamasa) y el gen de la β-galactosidasa (LacZ). Este plásmido presenta un sitio múltiple de clonación, abierto, dentro del gen LacZ, flanqueado por la secuencia de los cebadores comerciales T7 y SP6 para secuenciar el inserto. Con el plásmido resultante de la ligación se transformó E. coli.

Las bacterias transformadas se sembraron en superficie en placas de LB con ampicilina y X-gal. Se obtuvieron colonias azules y blancas. Las bacterias portadoras del plásmido sin el inserto, presentaban actividad β-galactosidasa dando lugar a colonias de color azul, esto se debe a que la expresión el gen LacZ, da lugar a la hidrólisis del X-gal a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3- hidroxindol, este último tras un proceso de oxidación da lugar a un compuesto azul. Sin embargo las bacterias que si portaron el plásmido con el inserto formaron colonias de color blanco.

Se seleccionaron 5 colonias blancas y se realizó una extracción de los plásmidos correspondientes, que se llevaron a secuenciar, usando los cebadores comerciales T7 y SP6, al servicio de secuenciación del Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Córdoba. Una vez obtenidas las secuencias, se seleccionaron aquellos plásmidos que no presentaban mutaciones en la fase abierta de lectura del gen DEHA2B00132g (SEQ ID NO.: 1). De los 5 plásmidos analizados, 3 presentaban la secuencia correcta.

A continuación se realizaron digestiones con las enzimas de restricción EcoRI y Salí tanto a los plásmidos pSPARK® que tenían la secuencia correcta, para liberar el inserto, como al plásmido de expresión pWS93 para linealizarlo. Ambas digestiones se purificaron en gel de agarosa y se llevó a cabo una nueva ligación entre ambas, el inserto y el plásmido pWS93 abierto. El plásmido resultante de la ligación se denominó pSUP.

Con la mezcla de ligación, se transformó E. coli. El producto de la transformación se plaqueó en medio solido LB con ampicilina y se seleccionaron 8 transformantes con los que se realizó una PCR de colonias para seleccionar las que contenían al pSUP. Los resultados obtenidos con la PCR mostraron que 6 transformantes seleccionados portaban el plásmido con el gen clonado. A partir de uno de ellos se extrajo el plásmido pSUP. Finalmente se transformó la cepa de laboratorio BY4741 de S. cerevisiae, por una parte con el plásmido pSUP, portador del gen de estudio, y por otra, con el plásmido pWS93 a modo de control. Esta cepa de S. cerevisiae se caracteriza por ser ura3 ^~ y dado que el plásmido de expresión utilizado es URA3, nos sirvió para poder discriminar los transformantes portadores de los plásmidos tanto con el inserto como sin él.

Ejemplo 4: Sensibilidad a sal y peróxido de hidrógeno

El efecto de la salinidad se realizó de la siguiente manera:

Las cepas se preinocularon en 20 mi de YNB (ura-) y se dejaron crecer durante 24 h a 28 °C y 200 rpm. Posteriormente se ajustó la concentración de células a una D.O.óOOnm = 1, a partir de esta se realizaron diluciones seriales en agua estéril (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000). La inoculación en las placas se hizo mediante gotas, realizadas tomando 4μ1 de las distintas suspensiones celulares siguiendo un orden de mayor a menor concentración. La sensibilidad a sal se estudió suplementando las placas (o medio líquido) con NaCl a las concentraciones adecuadas.

En la Figura 4 se observa que la cepa que expresa SEQ ID NO. : 1 (clon pSUP) muestra mayor tolerancia a NaCl comparada con la cepa control (clon pWS93) y resultados similares se obtuvieron en medio líquido (Figura 5).

El efecto del estrés oxidativo se realizó de la siguiente manera:

Se realizó un inoculo en 25 mi de YPD líquido para las cepas pWS93 (control) y pSUPl (clon portador del gen DEHA2B00132, (SEQ ID NO. : 1). Este inoculo fue incubado a 28°C hasta obtenerse una absorbancia a 600 nm de 0.5 (D.O.600 nm = 0.5). Alcanzada la concentración celular requerida, se trasvasó 1 mL de cultivo a un eppendorff, el cual se centrifugó durante 2 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante fue desechado y el pellet celular resultante resuspendido en 1 mL de tampón PBS. Por último, se añadió a cada uno de los eppendorff el volumen de H ₂ O ₂ requerido para alcanzar las concentraciones de estudio (5 mM; 10 mM; 15 mM). Un preparado de cada cepa quedó libre de peróxido para ser utilizado a modo de control.

El efecto del sometimiento de las levaduras a este tipo de estrés oxidativo se analizó mediante la realización de un test de goteo. Para ello se inocularon 5μL de preparado en placas de YPD a diferentes tiempos (minuto 0, minuto 5, minuto 10, minuto 20, minuto 30 y minuto 40), a contar desde la adición del H ₂ O ₂ . Estas placas fueron incubadas en la estufa a 28 °C durante 24-72 horas.

En la Figura 6 se observa que la cepa que expresa el gen DEHA2B00132 (SEQ ID NO. : 1) (clon pSUP) muestra mayor tolerancia a un tratamiento con peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) comparada con la cepa control (clon pWS93).

Ejemplo 5: Verificación de la implicación del gen DEHA00132g (SEQ ID NO.:l) en la tolerancia al estrés salino

Al crecer el clon con el gen de interés en medio sin presión selectiva (con Ura) durante varias generaciones pierden el plásmido y, por tanto deberían perder el carácter adquirido. Aquellas colonias que presentaban crecimiento en YPD pero no en el medio sin Ura y que, por tanto, habían expulsado el plásmido, fueron seleccionadas para la verificación de la implicación del mismo en la tolerancia a sal.

La verificación de la implicación del gen DEHA00132g (SEQ ID NO.: 1) en la tolerancia a estrés salino se llevó a cabo mediante un test de goteo a diversas concentraciones de NaCl en placas de YPD, donde se comparó el crecimiento de las colonias obtenidas con el de las cepas transformadas.

La pérdida del plásmido (con el gen de interés) llevó implícita la pérdida del carácter de tolerancia a sal (Figura 7).

Ejemplo 6: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR)

Las células se trataron durante 30 minutos con NaCl (0.5 M) o con peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) (50 μΜ). Se extrajo ARN celular, que se trató con ADNasa, se cuantificó, se retrotranscribió y las PCR se realizaron usando el termociclador MJMini Personal Thermal Cycler de Bio-Rad. Los cebadores utilizados se pueden encontrar en la Tabla 1. Tabla 1

Los resultados del primer experimento se pueden ver en la Figura 8, donde se observa que sólo dos de los genes se ven afectados cuantitativamente cuando se someten al tratamiento con NaCl (0.5 M), observándose una represión muy significativa en el caso del gen 132 (2.5 veces) y una inducción significativa en el caso del gen 19448 (1.9 veces) al sufrir el tratamiento. El tratamiento usando KCl en lugar de NaCl no produjo respuestas significativas en la expresión de los genes, lo que indica que no tratamos de un tema exclusivamente osmótico sino de respuestas a toxicidad por sal (resultados no mostrados). La Figura 9 muestra que existe una diferencia muy significativa para el gen 27434, y una diferencia significativa para el gen 19448 tras un tratamiento inductor de estrés oxidativo.