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Title:
METHOD FOR IMPROVING XYLOSE CONSUMPTION RATE OF CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2013/159710
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided is a method for improving the xylose consumption rate of Clostridium beijerinckii.By knocking out a transcription regulation factor xylR of Clostridium beijerinckii, knocking out araR of Clostridium beijerinckii and/or enhancing the activity of xylose transport protein, a higher concentration of xylose and/or arabinose in a culture medium can be used up by Clostridium beijerinckii, with a higher concentration of products being produced, such as ethanol, acetone and butanol.

Inventors:
YANG SHENG (CN)
XIAO HAN (CN)
GU YANG (CN)
LI ZHILIN (CN)
JIANG YU (CN)
CHEN JUN (CN)
DONG FENG (CN)
JIANG WEIHONG (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/074670
Publication Date:
October 31, 2013
Filing Date:
April 25, 2013
Export Citation:
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Assignee:
SHANGHAI INST BIOL SCIENCES (CN)
SHANGHAI RES AND DEV CT OF IND BIOTECHNOLOGY (CN)
International Classes:
C12N1/21; C12N15/31; C12P7/06; C12P7/16; C12P7/28; C12P7/36; C12R1/145
Foreign References:
JP2007312794A2007-12-06
CN1661014A2005-08-31
CN102041267A2011-05-04
Other References:
YANG, MING ET AL.: "Genetic features and modification of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii for acetone butanol and ethanol fermentation", CHINA BIOTECHNOLOGY, vol. 29, no. 10, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 109 - 114
COPELAND, A. ET AL.: "ROK family protein (Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)", GENBANK ACCESSION NO.: YP_001309501.1, 29 June 2007 (2007-06-29)
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI PATENT & TRADEMARK LAW OFFICE, LLC (CN)
上海专利商标事务所有限公司 (CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1. 一种重组拜氏梭菌, 其与野生型拜氏梭菌相比, xylR基因表达和 /或 xylR 蛋白的活性被抑制, arar基因表达和 /或 arar蛋白的活性被抑制, 和 /或木糖转运蛋 白的活力和 /或其编码基因的表达提高。

2. 如权利要求 1所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 所述重组拜氏羧菌通过 选自下组一种或多种的基因工程化处理获得的: 在拜氏梭菌基因组的 xylR基因中 插入外源 DNA片段、 通过同源重组敲除全部或部分所述 xylR基因、 和采用反义 核酸技术抑制 xylR基因的表达; 在拜氏梭菌基因组的 araR基因中插入外源 DNA 片段、通过同源重组敲除全部或部分所述 araR基因、和采用反义核酸技术抑制 araR 基因的表达;在拜氏梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、引入提高木糖转运蛋 白的表达或活力的突变、 或提供表达木糖转运蛋白的表达载体。

3. 如权利要求 2所述的重组拜氏羧菌, 其特征在于, 所述拜氏梭菌基因组中 xyl 基因第 1位到第 798位碱基之间插入外源 DNA片段。

4. 如权利要求 3所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 所述 xylR基因的第 1 位到第 171位碱基之间插入了外源 DNA片段, 或在所述 xylR基因的第 240和第 798位之间插入了外源 DNA片段。

5. 如权利要求 3所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 在所述 xylR基因的第 787和第 788位之间插入了外源 DNA片段。

6. 如权利要求 2所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 在所述拜氏梭菌基因组 中 araR基因第 1位到第 1074位碱基之间插入外源 DNA片段。

7. 如权利要求 6所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 所述 araR基因的第 15 位到第 219位碱基之间插入了外源 DNA片段, 或在所述 araR基因的第 252和第 1005位之间插入了外源 DNA片段。

8. 如权利要求 2所述的重组拜氏羧菌, 其特征在于, 所述拜氏梭菌导入了过 表达木糖转运蛋白的重组质粒载体。

9. 如权利要求 8所述的重组拜氏梭菌, 其特征在于, 所述过表达重组质粒载 体含有来源于丙酮丁醇梭菌 ATCC824 ptb基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT 基因, 或含有来源于丙酮丁醇梭菌 ATCC824 thl 基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基因。

10. 保藏号为 CCTCC NO: M 2012014的重组拜氏梭菌。

11. 一种方法, 所述方法选自下组的一种或多种:

(1) 提高拜氏梭菌发酵中木糖和 /或阿拉伯糖的消耗率和 /或利用率;

(2) 提高拜氏梭菌产生溶剂的能力;

(3) 提高拜氏梭菌发酵生产溶剂的效率;

其特征在于, 包括步骤: 抑制拜氏梭菌 xylR蛋白的活性和 /或其编码基因的表 达, 抑制拜氏梭菌 araR蛋白的活性和 /或其编码基因的表达, 和 /或提高木糖转运蛋 白的活力和 /或其编码基因的表达。

12. 如权利要求 11所述的方法, 其特征在于, 通过选自下组的方式抑制拜氏 梭菌 xylR基因表达: 在所述拜氏梭菌基因组的 xylR基因中插入外源 DNA片段、 通过同源重组敲除全部或部分所述 xylR基因、和采用反义核酸技术抑制 xylR基因 的表达; 通过选自下组的方式抑制拜氏梭菌 araR基因表达: 在所述拜氏梭菌基因 组的 araR基因中插入外源 DNA片段、 通过同源重组敲除全部或部分所述 araR基 因、 和采用反义核酸技术抑制 araR基因的表达; 通过选自下组的方式提高拜氏羧 菌木糖转运蛋白的表达:在拜氏梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、引入提高 木糖转运蛋白的表达或活力的突变、 和提供表达木糖转运蛋白的表达载体。

13.如权利要求 12所述的方法,其特征在于,通过以下方式抑制拜氏梭菌 xylR 基因表达: 在所述拜氏梭菌基因组中 xylR基因第 1位到第 798位碱基之间插入外 源 DNA片段。

14. 如权利要求 13所述的方法, 其特征在于, 在 xylR基因第 1位到第 171 位碱基之间插入外源 DNA片段,或在第 240和第 798位之间插入外源 DNA片段。

15. 如权利要求 14所述的方法, 其特征在于, 在 xylR基因的第 787和第 788 位之间插入外源 DNA片段。

16.如权利要求 12所述的方法,其特征在于,通过以下方式抑制拜氏梭菌 araR 基因表达:在所述拜氏梭菌基因组中 araR基因第 1位到第 1074位碱基之间插入外 源 DNA片段。

17. 如权利要求 16所述的方法, 其特征在于, 在所述 araR基因的第 15位到 第 219位碱基之间插入了外源 DNA片段, 或在所述 araR基因的第 252和第 1005 位之间插入了外源 DNA片段。

18. 如权利要求 12所述的方法, 其特征在于, 使用过表达重组质粒载体携带 木糖转运蛋白基因转入菌种进行表达, 实现木糖转运蛋白基因的过表达。

19. 如权利要求 18所述的方法, 其特征在于, 所述过表达重组质粒载体含有 来源于丙酮丁醇梭菌 ATCC824 ptb基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基 因, 或含有来源于丙酮丁醇梭菌 ATCC824 thl基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基因。

20. 采用权利要求 11一 19中任一项所述的方法制备得到的重组拜氏梭菌。

21. 权利要求 1-10和 20中任一项所述拜氏梭菌的用途, 其特征在于, 它被用 于生产有机溶剂; 较佳地, 所述的溶剂选自下组: 乙醇, 丙酮, 丁醇, 或其组合。

22. 一种生产有机溶剂的方法, 所述的有机溶剂为: 乙醇, 丙酮, 丁醇, 或 其组合, 其特征在于, 包括步骤:

(A) 在适合的条件下, 培养权利要求 1-10和 20中任一项所述的拜氏梭菌, 获 得含有所述有机溶剂的培养物; 和

(B) 从所述的培养物中分离和 /或纯化所述的有机溶剂。

23. 如权利要求 22所述方法, 其特征在于, 所述适合条件包括, 使权利要求 1一 10和 20中任一项所述的重组拜氏梭菌与含有木糖和 /或阿拉伯糖的物料接触, 和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行发酵。

24. 如权利要求 23所述的方法, 所述包含木糖和 /或阿拉伯糖的原料选自: 纤 维素或半纤维素的水解液、 粮食和棉花。

Description:
一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方法 技术领域

本发明属于基因工程技术领域, 具体地说, 涉及一种提高拜氏梭菌木糖和 /或 阿拉伯糖消耗率的方法。 背景技术

由于石油资源的有限性以及国际原油价格的波 动性, 利用可再生资源制造生 物能源已受到世界各国的普遍重视。丁醇由于 其优良的燃烧特性及较乙醇更优的储 存运输特性, 有望在将来成为新一代生物燃料。 自二战以来随着石油工业的发展, 生物丁醇发酵由于其较高的原料成本,其大规 模发酵一直处于停滞状态,而且随着 近年来粮食价格的不断上涨及国家相关粮食安 全战略的制定,采用粮食发酵生产燃 料丁醇已受到严格限制。

拜氏梭菌 ( Clostridium beijerinckii ) 是能够发酵产生丁醇的四种梭菌之一 [ 1 ], 在发酵过程中产生丁醇、 丙酮、 乙醇以及少量的乙酸和丁酸 [2]。 拜氏梭菌除了能 利用葡萄糖外, 还能利用木糖、 果糖、 半乳糖、 葡萄糖醇等多种碳源 [3]。 由于葡 萄糖和木糖分别是纤维素和半纤维素水解后的 主要成分,因而拜氏梭菌可以利用纤 维素和半纤维素水解液为原料进行生物丁醇发 酵。纤维素和半纤维素在自然界中占 到植物界碳素的 50%以上, 利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发 酵, 有 望大大降低原料成本。和其它很多细菌不一样 的是,拜氏梭菌在葡萄糖存在条件下, 仍能顺利代谢木糖等五碳糖, 说明该菌不存在碳代谢物阻遏效应(carbon catabolite repression, CCR)。 但是无论是葡萄糖还是木糖发酵, 该菌均存在糖消耗率低的问 题 [4], 在木糖发酵中这一现象尤为明显。 因此, 提高木糖消耗率成为木质纤维素 原料应用于拜氏梭菌丙酮丁醇发酵的关键技术 之一。

拜氏梭菌属于革兰氏阳性菌, GC含量 30%, 2007年完成全基因组测序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000721 ),其中含有预测可能的木糖转录调 控蛋白的 xylR基因, 该基因在 NCBI核酸数据库查询号为 gi: 149903712。 在革兰氏 阳性菌中, XylR对木糖代谢基因进行转录负调控 [5, 6]。 有报道在低浓度木糖存在 下, 敲除 xylR能增强突变株中木糖代谢相关基因的酶活 [7], 但是当木糖浓度较高 时, xylR缺失株的木糖代谢相关基因的酶活和野生 处于相当水平, xylR的转录负 调控可被彻底解除 [8, 9]。 例如, 在另一种产溶剂梭菌一丙酮丁醇梭菌 C/^tr w acetobMty/i'oim ATCC 824中, 敲除 xylR(CAC3673)并未提高该菌在较高木糖浓度下 的木糖的消耗率, 说明 XylR在该菌的木糖代谢途径改造中不具备研究 值。 微生 物中经由木糖异构酶催化的木糖代谢主要包括 : 1 ) 木糖通过转运蛋白从胞外向胞 内运输; 2 ) 胞内木糖通过两步 (木糖异构酶和木酮糖激酶) 催化反应生成 5-磷酸- 木酮糖; 3 ) 5-磷酸 -木酮糖进入磷酸戊糖途径 (pentose phosphate pathway) 进行代 谢, 最后的代谢流则进入糖酵解途径。在拜氏梭菌 中, 尚没有木糖或阿拉伯糖代谢 途径以及调控基因的相关研究。 发明内容

本发明的目的在于提供一种提高拜氏梭菌木糖 和 /或阿拉伯糖消耗率的方法, 从而能高效利用水解液中的葡萄糖 -木糖或葡萄糖-木糖-阿拉伯糖发酵生产丁醇、 丙 酮和乙醇。

本发明通过抑制拜氏梭菌 xylR基因表达, 抑制 araR基因表达和 /或增强木糖 转运蛋白的活力实现。

根据本发明的一个优选实施例, 通过在拜氏梭菌 xylR基因中插入外源 DNA 片段以使 xylR基因表达被抑制, 在拜氏梭菌 araR基因中插入外源 DNA片段以使 araR基因表达被抑制, 和 /或过表达 xylT基因 (例如导入 pIMPl-ptb-xylT ) 可实现 本发明。

本发明还有一个目的在于, 提供其 xylR基因表达被抑制, araR基因表达被抑 制和 /或其 xylT基因过表达的拜氏梭菌 C. beijerincki ) 重组菌株。

根据本发明的一个优选实施例, 本发明提供的拜式梭菌重组菌株的基因组中 xyl 基因中已插入外源 DNA片段, ara 基因中已插入外源 DNA片段和 /或过表达 xylT基因。

本发明还有一个目的在于, 提供该重组菌株用于高效利用葡萄糖 -木糖或葡萄 糖 -木糖 -阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、 丙酮和乙醇的应用。 本发明还有一个目的在于,提供一种提高拜氏 梭菌利用葡萄糖 -木糖或葡萄糖- 木糖 -阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、 丙酮和乙醇能力的方法, 该方法通过抑制拜 氏梭菌 xylR基因表达, 抑制 araR基因表达和 /或过表达 xylT基因实现。

本发明还提供一种消耗木糖和 /或阿拉伯糖的方法, 该方法包括在含有木糖和 / 或阿拉伯糖的物质中加入本文所述的拜氏梭菌 重组菌株,并在适合所述菌株发酵的 条件下进行发酵, 从而使所述物质中的木糖和 /或阿拉伯糖被消耗。

因此, 本发明提供一种提高拜氏梭菌木糖和 /或阿拉伯糖消耗率的方法, 该方 法包括抑制拜氏梭菌 xylR蛋白的活性和 /或其编码基因的表达,抑制拜氏梭菌 araR 蛋白的活性和 /或其编码基因的表达和 /或提高木糖转运蛋白(例如 xylT蛋白)的活 力和 /或其编码基因的表达, 从而提高所述拜氏梭菌的木糖和 /或阿拉伯糖消耗率。

本发明提供一种制备木糖和 /或阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法, 所述 方法包括抑制拜氏梭菌 xylR 蛋白的活性和 /或其编码基因的表达, 抑制拜氏羧菌 araR蛋白的活性和 /或其编码基因的表达和 /或提高木糖转运蛋白 (例如 xylT蛋白) 的活力和 /或其编码基因的表达, 从而制备得到木糖和 /或阿拉伯糖消耗率提高的拜 氏梭菌。

本发明的提高拜氏梭菌木糖和 /或阿拉伯糖消耗率的方法或制备木糖和 /或阿 拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法包括对拜 氏梭菌进行基因工程化改造的步骤, 以相对于野生型拜氏梭菌而言抑制拜氏梭菌 xylR基因表达和 /或 xylR蛋白的活性, 抑制拜氏梭菌 araR基因表达和 /或 araR蛋白的活性,和 /或过表达木糖转运基因(例 如 xylT基因) 和 /或提高木糖转运蛋白 (例如 xylT蛋白) 的表达或活力。

在本发明的提高拜氏梭菌木糖和 /或阿拉伯糖消耗率的方法或制备木糖和 /或 阿拉伯糖消耗率提高的拜氏梭菌的方法中,通 过选自下组的一种或多种方式抑制拜 氏梭菌 xylR基因表达:在所述拜氏梭菌基因组的 xylR基因中插入外源 DNA片段、 通过同源重组敲除全部或部分所述 xylR基因、和采用反义核酸技术抑制 xylR基因 的表达; 通过选自下组的一种或多种方式抑制拜氏梭菌 araR基因表达: 在所述拜 氏梭菌基因组的 araR基因中插入外源 DNA片段、 通过同源重组敲除全部或部分 所述 araR基因、 和采用反义核酸技术抑制 araR基因的表达

在另外一种实施方式中, 可通过引入 xylR基因表达抑制剂来实现拜氏梭菌 xylR基因表达的抑制。 在另外一种实施方式中, 可通过引入 araR基因表达抑制剂来实现拜氏梭菌 araR基因表达的抑制。

在一具体实施例中,所述 xylT基因的序列如 SEQ ID NO:3所示,或与 SEQ ID NO:3 的序列具有 90%以上 (例如 95 %、 97%、 98%或以上) 同源性的分子。

提高木糖转运蛋白(例如 xylT蛋白)的活力和 /或其编码基因的表达可通过选 自下组的一种或多种方式实现:在拜氏梭菌基 因组中导入额外的木糖转运蛋白、引 入提高木糖转运蛋白的表达或活力的突变;或 供瞬时表达木糖转运蛋白的表达载 体。

在一具体实施例中, 采用 targetron技术将外源 DNA片段插入 xylR基因中。 在一具体实施例中, 所插入的外源 DNA片段长度为 lOObp到 1000bp。

在一具体实施例中, 使用质粒 pWJl-xylR插入外源 DNA片段。

在一具体实施例中, 采用 targetron技术将外源 DNA片段插入 araR基因中。 在一具体实施例中, 所插入的外源 DNA片段长度为 lOObp到 1000bp。

在一具体实施例中, 使用质粒 pWJl-araR插入外源 DNA片段。

在一具体实施例中, 使用过表达重组质粒载体携带 xylT基因转入菌种进行表 达, 实现 xylT基因的过表达。

本发明中, 所述 xylT基因编码如 SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。 在一具 体实施例中, xylT基因含有 SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成。

本发明中, 所述 xylR基因编码如 SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。 在一具 体实施例中, xylR基因含有 SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成。

在一具体实施例中, 所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇 梭菌 ATCC824 ptb基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基因。

在一具体实施例中, 所述过表达重组质粒载体是 pIMPl- xylT ptb

在一具体实施例中, 所述木糖转运蛋白是来自于可利用木糖的生物 体的、 用 于木糖转运的蛋白或其生物活性片段,或是所 述蛋白或其生物活性片段经过一个或 多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成仍具有转运木糖功能的氨基 酸序列。

在一具体实施例中, 所述木糖转运蛋白由 xylT基因编码。

在一具体实施例中,所述 xylT基因的序列如 SEQ ID NO:4所示,或与 SEQ ID NO:4的序列具有 90%以上 (例如 95 %、 97%、 98%或以上) 同源性的分子。 在一具体实施例中, 使用一种或多种下述质粒转化所述拜氏梭菌: pWJl-xylR ( SEQ ID NO: 1 )、 pIMP 1 -ptb-xylT ( SEQ ID NO :2 ) 和 pIMP 1 -xylT thl ( SEQ ID NO: 39), 对其进行基因工程化改造。

在一具体实施例中, 所述拜氏梭菌是 NCIMB 8052。

本发明提供采用本发明所述的方法制备得到的 重组拜氏梭菌。

在一具体实施例中,本发明的重组拜氏梭菌与 野生型拜氏梭梭菌相比,其 xylR 基因表达和 /或 xylR蛋白的活性被抑制, araR基因表达和 /或 araR蛋白的活性被抑 制和 /或木糖转运基因 (例如 xylT基因) 过表达和 /或木糖转运蛋白 (例如 xylT蛋 白) 的表达或活力提高。

在一具体实施例中, 所述重组拜氏梭菌是对 NCIMB 8052进行基因工程化改 造得到的。

在一具体实施例中, 所述重组拜氏梭菌选自: 拜氏梭菌 8052xylR、 8052xylR-xylT ptb 、 8052xylR-xylT thl 、 8052xyl ara , 8052xyl -xylTptb-ara .

在一具体实施例中, 所述拜氏梭菌基因组中 xylR基因中插入了长 lOObp 到 lOOObp的外源 DNA片段。

在一具体实施例中, 所述拜氏梭菌基因组中 xylR基因第 1位到第 798位碱基 之间插入了外源 DNA片段。

在一具体实施例中, 所述拜氏梭菌基因组中 xylR基因第 1位到第 171位碱基 之间插入了外源 DNA片段, 或在第 240和第 798位之间插入了外源 DNA片段。 在一具体实施例中,所述拜氏梭菌基因组中 xylR基因第 30位到第 171位碱基之间 插入了外源 DNA片段, 或在第 787和第 788位之间插入了外源 DNA片段。

在另一优选例中, 所述方法包括步骤: 在 araR基因第 1位到第 1074位碱基 之间插入外源 DNA片段; 较佳地, 在 araR基因第 15位到第 219位碱基之间, 或 第 252位到第 1005位碱基之间插入外源 DNA片段。

在一具体实施例中, 所述重组拜氏梭菌导入了用于过表达 xylT基因的重组质 粒载体。

在一具体实施例中, 所述过表达重组质粒载体含有来源于丙酮丁醇 梭菌 ATCC824 ptb基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基因。

在一具体实施例中, 所述过表达重组质粒载体是 pIMPl - xylT ptb 。 在一具体实施例中, 所述重组拜氏梭菌导入了一种或多种下述质粒 转化所述 拜氏梭菌: pWJl -xylR ( SEQ ID NO: l )、 pIMP l - xylT ptb ( SEQ ID NO :2 ) 和 pIMP 1 -xylT thl ( SEQ ID NO: 39 )。

本发明包括保藏号为 CCTCC M 2012014的重组拜氏梭菌。

本发明还提供一种消耗木糖和 /或阿拉伯糖的方法, 所述方法包括, 使本发明 的重组拜氏梭菌与含有木糖和 /或阿拉伯糖的物料接触, 和在适合所述重组拜氏梭 菌发酵的条件下进行发酵, 从而消耗物料中的木糖和 /或阿拉伯糖。

本发明还提供一种丁醇制备方法, 所述方法包括, 使本发明重组拜氏梭菌与 含有木糖和 /或阿拉伯糖的物料接触, 和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进 行发酵, 从而消耗物料中的木糖和 /或阿拉伯糖, 产生丁醇。

本发明还提供一种丙酮乙醇丁醇发酵方法, 所述方法包括, 使本发明重组拜 氏梭菌与含有木糖和 /或阿拉伯糖的物料接触, 和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的 条件下进行发酵。

在一具体实施例中, 所述物料还含有葡萄糖。

在一具体实施例中, 所述物料是直接使用木糖配制获得的木糖物料 , 或是发 酵或水解高分子化合物获得的含木糖物料。

在一具体实施例中, 所述包含木糖的原料选自: 纤维素或半纤维素的水解液、 粮食、 棉花等。

本发明还包括本发明基因工程化拜氏梭菌在丁 醇、 丙酮和 /或乙醇的生产中的 用途。 附图说明

图 1 A所示为 3%葡萄糖 :3%木糖 XHP2发酵 0-72hr的拜氏梭菌 NCIMB8052的 残糖含量检测结果; 图 1 B所示为 3%木糖 XHP2发酵 0-72hr的拜氏梭菌 NCIMB8052的残糖含量检测结果。

图 2为 xylR中断菌株的菌落 PCR鉴定的凝胶电泳检测结果, 其中, WT所用 的模板为 C. beijerinckii NCIMB 8052基因组, xylR突变体的模板分别为转化子 8052Axyl l -2 , 标记为 lkb DNA ladder。

图 3为 8052xylR和 8052在中性碳源培养下木糖代谢各基因的转录 析。 图 4为 6%木糖 XHP2发酵 0-8 lhr的 8052xylR和 8052的发酵各项指标。 A: 残糖; B: 生长曲线; C: pH曲线; D: 丁醇和 ABE浓度曲线。

图 5为 6%木糖 XHP2发酵 96hr的 8052xylT, 8052-xylT thl 和 8052的木糖消耗 量检测结果。

图 6 为 6%木糖 XHP2 发酵 96hr 的 8052, 8052xyl , 8052xyl -xylT ptb

8052xyl -xylT thl 的木糖消耗量检测结果。

图 7 为 5.5%木糖母液 XHP2发酵 0-72hr的 8052和 8052xylR- X ylT ptb 的发酵 各项指标。 A: 残糖; B: 生长曲线; C: pH曲线; D: 丁醇和 ABE浓度曲线。

图 8为插入内含子的 xylR基因测序结果。

图 9显示二类内含子的结构, 在该内含子的 IV结构域处可插入任何 DNA片 段。

图 10显示了 xylRaraR中断菌株的菌落 PCR鉴定结果, 其中, 泳道 2所用的 模板为 C. beijerinckii NCIMB 8052基因组, 泳道 3-6的模板为的 xylRaraR突变体, 泳道 1为 lkb DNA ladder

图 11显示了使用 Sigma- Aldrich的 TargetronTM Gene Knockout

System(TAOlOO)试剂盒进行 PCR扩增 araR-targetron片段的结果。

图 12显示了构建的 pWJl-araR重组质粒载体大肠杆菌转化子的菌落 PCR鉴定结果。 泳道 Marker为 lkb DNA ladder, 泳道 1_9为待鉴定的 pWJl_araR重组质粒载体转化子。

图 13显示了 araR中断菌株的菌落 PCR鉴定结果, 其中, 泳道 C所用的模板 为 C. beijerinckii NCIMB 8052基因组, 泳道 1-12的模板为的 araR突变体基因组, 泳道 M为 lkb DNA ladder。 具体实施方式

本申请中, "xylR蛋白"指拜氏梭菌中与 NCIMB 8052的 xylR蛋白 (SEQ ID NO:40) 相对应的蛋白。 "xylR基因"指拜氏梭菌基因组中与拜氏梭菌 NCIMB 8052 的 xylR基因 (NCBI核酸数据库查询号为 gi:149903712, 也见 SEQ ID NO:3 )相对 应的基因(包括基因组中所处位置以及相应的 序列);或与 xylR基因具有 90%以上、 95%以上、 97%以上、或 98%以上同源性的分子。 "xylT蛋白"指拜氏梭菌中与 NCIMB 8052的 xylT蛋白 (SEQ ID NO:41 )相对应的蛋白。 "xylT基因"指拜氏梭菌基因组 中与拜氏梭菌 NCIMB 8052的 xylT基因(NCBI核酸数据库查询号为 gi: 149901466, 也见 SEQ ID NO:4 ) 相对应的基因 (包括基因组中所处位置以及相应的序列), 或 与 xylT基因具有 90%以上、 95%以上、 97%以上、 或 98%以上同源性的分子。 应 理解, 不同的拜氏梭菌菌株中的 xylR基因和 xylT基因可能会存在些许不同, 但这 些 xylR基因和 xylT基因应都在本申请的 "xylR基因"和 "xylT基因"的范围之内;同 样,不同的拜氏梭菌中 xylR蛋白和 xylT蛋白可能也会存在些许不同,但这些 xylR 蛋白和 xylR蛋白也够包括在本发明的 "xylR蛋白"和 "xylT蛋白"的范围之内。

本申请中, "抑制拜氏梭菌 xylR基因表达", 既可以是降低拜氏梭菌 xylR基因 表达量, 也可以是使拜氏梭菌 xylR基因不表达或不能表达出正确的蛋白质。

根据本发明的一个实施方式,通过中断拜氏 梭菌 xylR基因表达的实现所述 "抑制"。 这种中断能提高拜氏梭菌混糖消耗率。在另一 种实施方式中,采用反义核酸技术抑 制 xylR基因的表达, 将 xylR表达量下调。

"中断拜氏梭菌 xylR基因表达"可通过在 xylR基因中插入外源 DNA序列或通 过同源重组敲除部分或全部 xylR基因来实现。 可采用二类内含子插入技术在该基 因内部的任何位点插入外源 DNA而实现拜氏梭菌 xylR基因的中断。 "外源 DNA" 或"外源 DNA片段"在本文中指并非是拜氏梭菌自身存在 产生的 DNA片段, 该 外源 DNA片段需要从拜氏梭菌外部导入。 作为阐述性的例子, targetron技术是基 于乳酸乳球菌的二类内含子(Ll .ltrB )发展而来的。 LI . ltrB RNA具有核酶的功能, 可以通过反向剪切, 直接插入到目标 DNA 位点, 然后再由内含子编码蛋白 (Intron-encoded protein, IEP)将这一段内含子 RNA反转录成 cDNA, 产生的 cDNA 内含子可通过宿主的同源重组或修复酶机制使 它完全整合到基因组 DNA。 可参见 Lambowitz, A.M., G. Mohr, and S. Zimmerly, eds. Group II intron homing endonucleases: Ribonucleoprotein complexes with programmable target specificity. Homing endonucleases and inteins. Nucleac acids and molecular biolgyed. M. Belfort. Vol. 16. 2005, Springer-Verlag: Heidelbeerg. 121-145。

本申请不仅限于二类内含子。 图 9显示了二类内含子的结构, 在该内含子的 IV结构域中可插入任何 DNA片段。 优选地, 该片段为 100bp到 lkb, 例如, 该片 段长度可为 100-300bp、 300-1000bp, 500- 1000bp, 300-500bp不等。 在本发明的一 个具体实施例中, 所插入的片段如图 8第 173-1087位碱基所示。 通过该二类内含 子, 可将所述 DNA片段插入到 xylR的任何位点中。

用于中断 xylR基因的插入片段可在 xylR基因中的任意位点插入, 只需要能 使 xylR基因表达被中断或抑制即可。

XylR蛋白是通过与木糖代谢相关基因启动子区 结合来实现转录调控的功能 的, 因此如果破坏了该蛋白与 DNA结合的区域, 就会导致 xylR不能正常行使调 控功能。 对于很多革兰氏阳性菌假定的 xylR蛋白, N端有螺旋一转角一螺旋的结 构, C端有亮氨酸拉链基序, 这些基序都是与 DNA结合有关的 [7]。

对于拜氏梭菌的 xylR蛋白结构预测显示, 在第 10到 57个氨基酸 (对应的碱 基数是 SEQ ID NO:3的 30bp到 171bp)处是螺旋一转角一螺旋的结构, 第 80位到 第 266位氨基酸 (对应的碱基数是 SEQ ID NO:3的 240bp到 798bp) 处属于 ROK (Repressor, Open reading fram, Kinase) 家族保守结构域。 因此, 在本发明的优选 实施例中, 在 SEQ ID NO:3的第 l-798bp插入外源 DNA片段。 在本发明的另一优 选实施例中, 在第 1位到第 171位碱基之间插入外源 DNA片段, 或在第 240和第 798位之间插入外源 DNA片段。 在本发明的一个具体实施例中, 在 SEQ ID NO:3 的第 787/788位之间插入 DNA片段。 在其它实施方式中, 在 SEQ ID NO: 3的第 30-798bp之间插入外源 DNA片段, 更进一步地, 在第 37-171位碱基之间插入外 源 DNA片段。

在本发明的一个具体实施例中,使用重组质粒 载体 pWJl-xylR实现 DNA片段 的插入, 该质粒中使用的 xylR-targetron片段是在 IBS、 EBS2、 EBSld位点碱基经 修改后用于敲除 xylR基因的片段, 该片段属于 Ll.LtrB 内含子一部分, 所述的 Ll.LtrB二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。 但应理解, 在重复本 发明的试验时,可以选取其他插入位点进行试 验,甚至还可以不使用重组质粒载体 进行试验, 只要能在 xylR基因中插入核酸片段以中断 xylR基因的表达即可。

也可通过同源重组来中断 xylR基因。 同源重组中断 xylR基因包括通过同源 重组敲除 xylR部分或全部序列,使得 xylR基因的表达被中断或被抑制或表达出不 完整 XylR蛋白。 同源重组方法中使用到的"重组敲除质粒载体" 括用于敲除 xylR 基因的重组质粒载体, 该载体具有与 xylR基因的特定序列进行特异配对位点, 以 及用于对 xylR基因进行特异性敲除的片段。

上述方法用于将 xylR基因失活。除此之外还可以采用反义核酸 术抑制 xylR 基因的表达, 将 xylR表达量下调。 实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人 员所熟知, 例如, 可参见 Tummala, S. Β·, N. E. Welker等, (2003). J Bacteriol 185(6): 1923-1934; Sambrook等人《分子克隆:实验室指南》 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989》。

根据本发明的一个优选实施例, 过表达 xylT, 能提高拜氏梭菌木糖消耗率。 过表达 xylT基因的方法包括但不限于,用游离的过表 重组质粒载体携带 xylT基 因转入菌种进行表达。

根据本发明, "过表达重组质粒载体"包括用于过表达 xylT基因的重组质粒载 体。在具体的实施例中,本发明的过表达重组 质粒载体可含有来源于丙酮丁醇梭菌 ATCC824 ptb基因的启动子和拜氏梭菌 NCIMB 8052 xylT基因。 在一具体实施例 中, 本发明使用的过表达重组质粒载体是 pIMPl- xylT ptb

因此, 本申请提供一种提高拜氏梭菌木糖消耗率的方 法, 该方法包括采用上 述方法抑制拜氏梭菌 xylR基因表达和 /或过表达 xylT基因。

本申请也提供一种改造拜氏梭菌、 以提高其木糖消耗率的方法, 该方法包括 采用上述方法抑制拜氏梭菌 xylR基因表达和 /或过表达 xylT基因。

采用上述方法制备或改造后, 可采用本领域常规的技术手段验证所得菌株的 xylR基因表达是否已被抑制和 /或 xylT基因是否过表达。 例如, 可通过 PCR和 /或 测序方法验证外源 DNA片段是否已插入 xylR基因中 (示范性的例子可参见本申 请实施例 3的第 3.2和 3.3节),也可通过 PCR验证过表达 xylT的重组质粒是否已 转入菌株中 (示范性的例子可参见实施例 8)。

本申请因而包括采用上述方法制备或改造得到 的重组拜氏梭菌 (即经基因工 程化改造的拜氏梭菌)。 在具体的实施方式中, 本发明的重组拜氏梭菌因被改造而 在其基因组 xylR基因中插入了外源 DNA片段、 xylR基因部分或全部缺失、 和 /或 xylT 基因过表达。 此外, 所述重组拜氏梭菌也可通过反义核酸技术改造 而具有降 低的 xylR基因表达的特征。

应理解, 本申请中, 拜氏梭菌 xylR基因表达量降低、 不表达或不能表达出正 确的 xylR蛋白以及 xylT基因过表达是改造后的拜氏梭菌与改造之 的拜氏梭菌相 比较而言的。改造之前其 xylR基因和 xylT基因均为野生型基因的任何拜氏梭菌都 在本发明的改造对象之列,由此改造得到的拜 氏梭菌也都包括在本发明的重组拜氏 梭菌的范围之内。 又一方面, 本发明提供了拜氏梭菌在混糖发酵中阿拉伯糖 消耗率和有机溶剂 生产的负调控基因: araR 基因。 araR 基因在 NCBI 核酸数据库查询号为 gi: 150019267c 优选地, 所述 AraR多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO:53所示。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括: DNA、基 因组 DNA或人工合成的 DNA, DNA可以是单链的或是双链的。 本发明还涉及上 述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同 的氨基酸序列的多肽的片段、类似物 和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发 生的等位变异体或非天然发生的变异 体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失 变异体和插入变异体。如本领域所知 的, 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式, 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入, 但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

根据本文所述的核苷酸序列, 本技术领域人员可方便地用各种通用方法制得 本发明的编码核酸。 这些方法例如但不限于: PCR, DNA人工合成等, 具体的方 法可参见 J. 萨姆布鲁克, 《分子克隆实验指南》。 作为本发明的一种实施方式, 可 通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸 PCR的方法来构建本发明的编码核酸序 列。

应理解, 本发明的编码序列优选获自拜氏梭菌, 获自其它菌或生物、 与获自 拜氏梭菌的编码序列高度同源 (如具有 50%以上, 优选 55%以上、 60%以上、 65% 以上、 70%以上、 75%以上、 80%以上, 更优选 85%以上如 85%、 90%、 95%、 甚 至 98%序列相同性)的其它编码序列也在本发明优 考虑的等同范围之内。 比对序 列相同性的方法和工具也是本领域周知的, 如 BLAST。

本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽。 本发明的多肽可以是 天然纯化的产物, 或是化学合成的产物, 或使用重组技术从原核或真核宿主 (例如, 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据重组生产方案所用的 宿主, 本发明的多肽可以是糖基化的, 或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包 括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括具有 AraR和 XylR多肽活性的蛋白片段及其类似物。 如本文所 用, 术语 "片段"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然 AraR和 XylR多肽 相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是: (i)有一个或多个保守或非保守 性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽, 而这样的取代的氨基酸残基 可以是也可以不是由遗传密码编码的; 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代 基团的多肽; 或 (iii)成熟多肽与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物, 例如 聚乙二醇)融合所形成的多肽; 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形 的 多肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的 列或蛋白原序列, 或融合蛋 白)。 根据本文的定义这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知 的 范围。

如本文所用, 术语 "基因转移"是指将外源的遗传物质由供体菌导 到受体 菌内的过程, 其可以通过转化、 接合转移、 转导、 细胞融合等手段来实现。

如本文所用, 术语 "接合转移"是指细菌通过性菌毛相互连接沟通 将遗传 物质 (主要是质粒 DNA)从供体菌转移给受体菌。

如本文所用, 术语 "基因失活"是指降低目的基因的活性或表达、 或降低目 的基因编码多肽的产生和分泌, 基因失活的方法包括 (但不限于): 基因中断、 基因 敲除、 RNA干扰、 基于同源重组的基因缺失、 基于二类内含子或转座子的基因插 入失活, 基于 siRNA或 shRNA的 RNA干扰、 miRNA等。

在本方面中, 与野生型拜氏梭菌相比, 所述基因的 mRNA表达水平降低 10% 以上 (更佳地降低 20%以上, 更佳地降低 40%以上, 更佳地降低 60%以上, 更佳地 降低 80%以上, 最佳地完全没有所述基因的表达); 或所述多肽的活性降低 10%以 上 (更佳地降低 20%以上, 更佳地降低 40%以上, 更佳地降低 60%以上, 更佳地降 低 80%以上, 最佳地完全没有所述多肽的活性)。

如本文所用, 术语 "转化率"是指生成物的产量比投入原料量的百 比。 在 本文中, 指乙醇、 丁醇和 /或丙酮的生成量比原料中投入总糖的量的百 比, 其中 总糖指原料中包含的所有的糖,包括但不限于 原料中的葡萄糖、木糖、和阿拉伯糖。

如本文所用, 术语 "利用率"是指拜氏梭菌消耗的原料的量比投入 料的量 的百分比。

如本文所用, 术语"提高转化率", 或"提高利用率"是相对野生型菌株而言, 具体是指比野生型菌株具有更高的产率或更高 的利用率。 如本文所用, 术语 "抑制拜氏梭菌 araR基因的表达", 既可以是降低拜氏梭 菌 araR基因的表达水平, 也可以是使拜氏梭菌 araR基因完全不表达, 或不能表达 出正确的有活性的功能蛋白。

本领域的一般技术人员可以使用常规方法实现 上述目的, 包括但不限于: 基 因中断、 基因敲除、 RNA干扰、 基于同源重组的基因缺失、 基于二类内含子或转 座子的基因插入失活, 基于 siRNA或 shRNA的 RNA干扰、 miRNA等。 可以参考 《分子克隆: 实验室指南》 等, 在此不具体描述。

在本发明的另一个优选实施例中, 所提供的拜氏梭菌重组菌株的基因组中 araR基因表达被抑制, 不能表达出具有完整结构的 araR蛋白。

根据本发明, 拜氏梭菌 araR基因的中断, 可采用二类内含子插入技术在该基 因内部的任何位点插入 DNA (例如内含子或大小不超过 lkb的抗性基因,如 pIMPl 载体骨架上的红霉素抗性基因)实现; 也可通过同源重组中断 araR基因, 用于中断 ara 基因的插入片段可在 araR基因中的任意位点插入,只需要能使 araR基因表达 被中断或抑制即可; 还可以通过同源重组敲除 araR部分或全部序列实现, 只要能 使得 araR基因的表达被中断或被抑制或表达出不完 araR蛋白即可。上述方法可 用于将 araR基因失活。

拜氏梭菌的 AraR蛋白结构预测显示, 在第 5到 73个氨基酸 (对应的碱基数是 15bp到 219bp)处是螺旋-转角-螺旋的结构,第 84位到第 335位氨基酸 (对应的碱基 数是 252bp到 1005bp)处是 Lacl家族的糖结合区域, 它们属于 GntR家族保守结构 域。 因此, 在本发明的一个优选实施例中, 在 araR的第 l-1074bp插入外源 DNA 片段; 较佳地, 在第 30位到第 171位碱基之间插入外源 DNA片段, 或在第 440 和第 873位之间插入外源 DNA片段;也可以在 araR的第 540/541位之间插入 DNA 片段。 在其它实施方式中, 在 araR第 15-219bp之间插入外源 DNA片段, 更佳地, 在第 252-1005位碱基之间插入外源 DNA片段。

除此之外, 还可以采用反义核酸技术等本领域常规用于抑 制特定基因表达的 方法来抑制 araR基因的表达, 将 araR表达量下调。 实现上述目的的方法在本领域 中为一般技术人员所熟知 (例如但不限于 Tummala, S. B., N. E. Welker等 (2003).J Bacteriol 185(6): 1923-1934; Sambrook等人《分子克隆: 实验室指南》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), 因此在此不具体描述。 "重组敲除质粒载体 pWJl-araR"指的是用于敲除 araR基因的重组质粒载体, 该载体应理解为具有与 araR基因的特定序列进行特异配对位点的重组 粒载体, 在上述重组质粒载体中包括用于对 araR基因进行特异性敲除的片段。

本发明的优选实施例中, 所使用的重组敲除质粒载体 pWJl-araR指的是: 基 于大肠杆菌和拜氏梭菌穿梭质粒 pWJl (其在拜氏梭菌中表达红霉素抗性基因,序列 如 SEQ ID NO.: 1所示)构建的,用于敲除 araR基因的重组质粒载体。在该载体中, 使用的 araR-targetron片段指的是在 IBS, EBS2, EBSld位点碱基经修改后, 用于 敲除 araR基因的片段, 该片段属于 Ll.LtrB内含子一部分, 所述的 Ll.LtrB二类内 含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。 然而, 本领域普通技术人员在实践 本发明的方法时,可以选取其它插入位点进行 试验,甚至还可以不使用重组质粒载 体进行试验, 只要能在 araR基因中插入核酸片段以中断 araR基因的表达即可。

应理解, 除了可从基因水平对 araR基因的表达进行抑制以外, 为了实现本发 明的目的, 还可对 araR蛋白的活性进行抑制。

再一方面, 本发明还涉及同时抑制 xylR基因和 araR基因的表达或多肽活性。 在本发明中,优选在抑制 araR基因的表达或蛋白活性的同时,抑制 xylR基因 的表达或蛋白活性。

可采用本领域中常规的方法, 实现上述优选方案。 例如, 可同时或先后采用 多种质粒对拜氏梭菌进行转化, 例如先采用 pWJl-xylR转化、 再采用 pWJl-araR 进行转化。

在本发明的一个优选例中, 拜氏梭菌 xylRaraR 是指用重组敲除质粒载体 pWJl-xyl 中断了 xylR基因以抑制该基因表达,并用重组敲除质 载体 pWJl-araR 中断了 araR基因以抑制该基因表达而构建的重组拜氏 菌菌株。 根据本发明的一 个优选实施例, 在 8052xylR中敲除 araR基因, 能进一步提高拜氏梭菌混合糖发酵 中的阿拉伯糖的利用率。

根据本发明, 使用的重组菌株, 既可以是本发明提供的抑制拜氏梭菌 xylR基 因表达和抑制拜氏梭菌 araR基因表达的菌株, 也可以是根据本发明的教导和现有 技术,制备的其它的抑制拜氏梭菌 xylR基因表达和抑制拜氏梭菌 araR基因的菌株, 如采用反义核酸技术降低 xylR表达量或的菌株。 本发明因此提供采用上述方法制备得到的重组 菌株, 该重组菌株提高了木糖 的消耗率, 能高效利用木糖和 /或阿拉伯糖进行发酵。 本发明方法和菌株对发酵原 料中的木糖和 /或阿拉伯糖的利用率显著提高,同时转化生 的 ABE浓度相应提高, 因此可用于丙酮、 丁醇、 乙醇的发酵生产。 并且, 本发明构建的工程菌株提高了混 合糖中阿拉伯糖的消耗率, 能高效利用葡萄糖-木糖-阿拉伯糖进行发酵, 因此这些 菌株能够提高木质纤维素水解液进行丙酮丁醇 发酵的能力。

因此, 本申请包括利用本申请的重组拜氏梭菌消耗木 糖、 制备丁醇以及进行 丙酮丁醇发酵的方法,这些方法包括,使本申 请的重组拜氏梭菌与含有木糖的物料 接触, 和在适合所述重组拜氏梭菌发酵的条件下进行 发酵。

本申请中, 术语"发酵"是指采用本申请的重组拜氏梭菌, 由含木糖物料通过 生物转化生产丙酮、丁醇、 乙醇等产物的过程。该过程可采用本领域中常 规使用的 发酵设备和工艺进行,本领域普通技术人员可 根据实际需要和条件对设备和工艺进 行选择。本发明中,可采用常规的拜氏梭菌发 酵条件来实现本发明重组拜氏梭菌的 发酵。 例如, 本申请实实施例一中的施例 1、 4和 5等给出了使用本发明重组拜氏 梭菌发酵的示例性条件,本领域技术人员可根 据实际的生产条件、生产规模对所述 发酵条件做出适当的修改。

含有木糖的物料还可以含有其它成分, 例如葡萄糖和 /或阿拉伯糖等。 含木糖 的物料既可以是直接使用木糖等成分配制获得 的物料,也可以是发酵或水解高分子 化合物(如水解纤维素或半纤维素等)获得的 物料。含木糖物料可获自传统的粮食, 但更优选地获自非粮原料, 例如廉价的木质纤维素资源或农林废弃物, 如秸秆、稻 草等。

用于本发明发酵生产的原料可为单一糖或混合 糖, 例如木糖 -阿拉伯糖、 葡萄 糖 -木糖 -阿拉伯糖。 使用的含糖原料既可以是直接使用葡萄糖、 木糖和阿拉伯糖配 制获得的单一糖或混合糖 (如葡萄糖-木糖-阿拉伯糖), 也可以是发酵或水解高分子 化合物 (如水解纤维素或半纤维素等),获得的混合糖 含糖原料可获自传统的粮食, 但更优选地获自非粮原料, 例如廉价的木质纤维素资源或农林废弃物, 如秸秆、稻 草等。混合糖中各种糖的浓度可为 2-5%葡萄糖: 0.3-2%木糖: 0.05%-5%阿拉伯糖, 优选可为 2-5%葡萄糖:0.3-2%木糖:0.05%-0.5%阿拉伯糖,更 选 3.9%葡萄糖 : 1.5% 木糖: 0.3%阿拉伯糖 (所示百分比为 w/v)(Aristidou, A. and M. Penttila (2000). Curr Opin Biotechnol 1 1 (2): 187- 198)。 在本发明的一个实施例中,

含木糖的物料是含有木糖和葡萄糖的物料。 在一个实施例中, 物料中木糖的 含量可以是 0.1— 70g/L。在还含有葡萄糖的情况下,葡萄糖的含 可以是 0.1 -70g/L。 下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明。 应理解, 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法,通 常按照常规条件如 Sambrook等人《分子克隆: 实验室指南》 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989)中所述的条件, 或按照制造厂商所建议的条件。 除 非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。 发酵液或糖溶液中糖的浓度为质量体 积比 w/v% (请核实是否准确)。 此外, 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料 皆可应用于本发明中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 实施例一

本发明的下述实施例中, 使用的菌株 C/aytr wm beijerinckii NCIMB 8052的 xylR基因是通过本实验鉴定确定的, 其在 NCBI核酸数据库查询号为 gi: 149903712 ; 使用的菌株 C/aytr wm beijerinckii NCIMB 8052的 xylT基因是通过本实验鉴定确定 的, 其在 NCBI核酸数据库查询号为 gi: 149901466。

本发明的下述实施例中, ABE为丙酮 +丁醇 +乙醇(Acetone-butanol-ethanol ) 的简称, ABE浓度指的是溶液中丙酮、 丁醇、 乙醇的总浓度。

本发明的下述实施例中, 重组质粒载体 pIMP l -P ptb 指表达 xylT基因的重组质 粒载体, ptb启动子是来源于 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ptb基因的启动 子。

本发明的下述实施例中, 重组质粒载体 pIMP l -P thl 指表达 xylT基因的重组质 粒载体, thl启动子是来源于 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 thl基因的启动子。

重组敲除质粒载体 pWJl -xylR指的是用于在 xylR基因中插入外源 DNA片段 的重组质粒载体, 其中, 使用的 xylR-targetron片段指的是在 IBS , EBS2 , EBS l d 位点碱基经修改后, 用于插入 xylR基因的片段, 该片段属于 Ll .LtrB内含子一部 分, 所述的 Ll .LtrB二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。 本发明使用的菌株和质粒分别为:

质粒 pWJl-xylR是敲除 xylR基因所用质粒, 为 E.coli和 Clostridium的穿梭质 粒, 在 C. beijerinckii中表达红霉素抗性基因, 该质粒的序列见 SEQ ID NO.: 1。

质粒 pIMPl-xylTptb是过表达 y/r基因所用质粒,为 和 Clostridium的穿 梭质粒, 在 C. ηίϋ'中表达红霉素抗性基因, 该质粒的序列见 SEQ ID NO.: 2。

拜氏梭菌 y/R基因的序列, 见 SEQIDNO.: 3。

拜氏梭菌 基因的序列, 见 SEQIDNO.: 4。 本发明中使用的 PCR纯化和 DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品 有限公司, Targetron™ Gene Knockout System (TA0100) Kit购自 Sigma-Aldrich公 司, 基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限 公司。 在本发明的下述实施例中, 使用的培养基和缓冲液如下:

CGM培养基酉己方如下 (Joseph W. oos et al, Biotechnology and Bioengineering,

P681-694, Vol 557, 1985): 2g (NH 4 ) 2 SO 4 , lg Κ 2 ΗΡΟ 4 ·3Η 2 Ο, 0.5g KH 2 PO 4 , O.lg MgSO 4 -7H 2 O, 0.015g FeSO 4 -7H 2 O, 0.01gCaCl 2 , O.Olg MnSO 4 -H 2 O, 0.002gCoCl 2 , 0.002g ZnSO 4 , 2g Tryptone, lg Yeast Extraction, 50g Glucose, 2%琼脂溶于 1L水 中。

XHP2培养基的配制方法如下:

溶液 1: 40gD-葡萄糖, 20gD-木糖或 50gD-木糖, 加 H 2 O定溶至 850mL; 溶液 2: KAC 7.85g, NH 4 C12.14g, Κ 2 ΗΡΟ 4 ·3Η 2 Ο 0.5g, KH 2 PO 4 0.5g, 力卩 H 2 O 定溶至 lOOmL;

溶液 3: 2.0g MgSO 4 «7H 2 O, O.lg MnSO 4 «H 2 O, O.lgNaCl, O.lg FeSO 4 «7H 2 O; 溶液 4: 100ml蒸馏水中加入 lOOmg氨基苯酸 (p-aminobenzoic acid), lOOmg 维生素 Bl (thiamine), lmg生物素 (biotin);

溶液 1和溶液 2高温湿热灭菌, 溶液 3和溶液 4过滤除菌, 溶液 1和溶液 2 冷却后混合均匀, 再加入 10mL溶液 3和 lmL溶液 4, 混匀后分装成 95mL/瓶, 用 过滤除菌的 N 2 排除瓶中的空气。 ETM缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4 , lOmM MgCl

ET缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4 。 本发明使用的限制性内切酶, TaqDNA聚合酶, T4 DNA连接酶和小牛碱性 磷酸酶 (CIAP) 均购自 TaKaRa公司, KOD plus DNA聚合酶购自 Toyobo公司。

其他常规试剂均为国产或进口分装。 本发明通过 PCR 扩增用于表达 xylT 基因的片段和 /或中断 xylR 基因的 targetron片断, 然后经双酶切并与经同样酶切的 pIMPl-ptb和 /或 pWJl载体连接, 得到质粒 pIMPl-ptb-xylT禾口 /或 pWJl-xylR, 电转 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, 然后经菌落 PCR鉴定出有外源基因片段的存在和 /或内含子插入到基因组中 的重组菌, 经发酵验证确定重组菌木糖消耗率提高, 具体如下述实施例所示。 序列表说明

表 1: 细菌菌株及质粒

菌株或质粒 相关特征 a 来源

菌株

C. acetobutylicum ATCC 野生型 ATCC

824

C. beijerinckii NCIMB 野生型 NCIMB

8052

8052xyl xyl ::intron/pWJl-xyl 本申请

8052xyl -P 8052xylR/pIMPl-P ptb 本申请

8052xyl -X 8052xylR/pIMP 1 -xyl xy i R 本申请

8052xylT xylT::intron/pWJl-xylT 本申请

8052WT-P 8052WT/pIMPl-P ptb 本申请

8052WT-xylT 8052WT/pIMPl-xylT thl 本申请

8052xyl -xylT ptb 8052xylR/pIMPl-xylT ptb 本申请 8052xyl -xylT thl 8052χγ1Κ/ρΙΜΡ1-χγ1Τ, 本申请

8052xyl -lacZ ptb 8052xylR/pIMPl-lacZj 本申请

8052xyl -lacZ thl 8052xylR/pIMPl-lacZ t 本申请

E.coli DH5a 常用克隆宿主菌株 Takara

质粒

pWJl 二类内含子, ItrA [10]

pWJl-xyl 衍生自 pWJl, 可将内含子插入 本申请

xyl 基因的 787/788nt位 xylR

pWJl-xylT 衍生自 pWJl, 可将内含子插入 本申请

xylT基因的 852/853nt

pIMPl -P ptb ColEl ORI, Amp r , pIM13 ORI, Papoutsakis E.T.

MLS r , C. acetobutylicum ATCC 教授提供 见 824的 ptb (cac3076)启动子 SEQ ID NO: ! ) pIMPl -P thl ColEl ORI, Amp r , pIM13 ORI, [10]

MLS r , C. acetobutylicum ATCC

824的 thl (cac2873)启动子

pIMPl -xylT ptb 衍生自 pIMPl-P ptb , 加入了 xylT 本申请

基因 (cbei0109)的表达盒

P IMPl -xylT thl 衍生自 pIMPl-P thl , 加入了 xylT 本申请

基因 (cbei0109) 的表达盒

placZFT Amp r , 来 自 Papoutsakis E.T.

Thermoanaerobacterium 教授提供 thermosulfuro genes EMI 的 lacZ a xylR, 木糖代谢的转录调节子; xylT, 木糖转运蛋白; Itrk, LtrA蛋白, 反向剪 切所需; ColEl ORI, 复制的 ColEl起点; Αη¾, 氨卞青霉素抗性; pIM13 ORI, 复制 的革兰氏阳性起点; ML 红霉素抗性; ptb, 磷酸转丁酰基酶; thl, 硫解酶。 表 2: 本申请所用的引物引物 引物 序列编号 描述 xyl 787|788s-IBS AAAACTCGAGATAATTATCCTTAC xylR Targetron 引物

ATACCCATCTAGTGCGCCCAGATA

GGGTG (SEQ IDNO:5)

xyl 787|788s-EBSld CAGATTGTACAAATGTGGTGATA xylR Targetron 引物

ACAGATAAGTCCATCTATGTAACT

TACCTTTCTTTGT ( SEQ ID NO:6 )

xyl 787|788s-EBS2 TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGG xylR Targetron 引物

TTGTATGTCGATAGAGGAAAGTG

TCT (SEQIDNO:7)

xylR— 569-588 ATTTATCTGCTTACTACGAG ( SEQ xylR 内部的正向引

IDNO:8) 物, 从第 569 到第

588 碱基

xyl _918-937 AATTCGATAGACCTAAAGAC xylR 内部的反向引

(SEQ IDNO:9) 物, 从第 918 到都

937 碱基

xyl -up AAAACTGCAGATATATTAAAGAT xylR 启动子正向引

AGAAATCAATCATCTTAG (SEQ ID 物

NO:10)

xyl -dn CGGGGTACCTTATTTAATTTCTAA xylR 反向引物

GAATTCTTCTATAGGC ( SEQ ID

NO:ll)

xylT852|853s-IBS AAAACTCGAGATAATTATCCTTAG Targetron 引物

CTTTCCTCGCTGTGCGCCCAGAT AGGGTG (SEQ ID NO: 12)

xylT852|853s-EBSl d CAGATTGTACAAATGTGGTGATA xylT Targetron 弓 |物

ACAGATAAGTCCTCGCTCATAAC TTACCTTTCTTTGT ( SEQ ID

NO:13) xylT852|853s-EBS2 TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGA xylT Targetron 弓 |物

TTAAAGCTCGATAGAGGAAAGTG TCT (SEQ ID NO: 14)

xylT— 579-596 AGATGGACGAGCAGATGA ( SEQ xylT 内部的正向引

IDNO:15) 物, 从第 579 到第

596 碱基

xylT_ 1006- 1023 GATTGAGGCAACGAAAGA ( SEQ xylT 内部的反向引

IDNO:16) 物, 从第 1006到第

1023 碱基

xylT-up ACGCGTCGACATGAAAATAAAAA xylT正向引物

TTAGTAACTCTG ( SEQ ID NO: 17 )

xylT-dn CGGGGTACCCTAAGCCTTAGTTG xylT反向引物

TAGCATCTTGAGTG ( SEQ ID

NO:18)

dpIMPl-fw GCAAGAGGCAAATGAAATAG 位于质粒 pIMPl 骨

(SEQIDNO:19) 架上的正向引物 dpIMP 1 -rev TGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG 位于质粒 pIMPl 骨

(SEQ ID NO :20) 架上的反向引物 dxyl -dn TCGGTGTTAGTGCGACTCC (SEQ xylR 内部的反向引

IDNO:21) 物

dpIMP 1 -P ptb -up TAAATGAGCACGTTAATC ( SEQ ID 质粒 pIMPl-P ptb

NO:22) ptb 启动子内部的正 向引物

dpIMP 1 -P thl -up TTAGGGATAAACTATGGAAC ( SEQ 质粒 pIMPl-P thl

ID NO :23) thl 启动子内部的正 向引物

dxylT-dn CAGCCGATGTAAGAATTAGC inside xylT 内的反

(SEQ ID NO :24) 向引物

rxylF-up ACTAATCCATATTGGCTTGA (SEQ xylF 的 正 向 ID NO :25) RT-PC 引物

TATGCCACTCACCTTTGC (SEQ ID xylF的反向 RT-PCR NO:26) 引物

GGTGGACGTGAAGGATAT ( SEQ xyM/的正向 RT-PCR ID NO :27) 引物

TATTGGTGCTTTGTTGGT (SEQID xyM/的反向 RT-PCR NO:28) 引物

TCTTAGCTTGTAATGCGCCT (SEQ xylAII 的 正 向 ID NO :29) RT-PC 引物

ATGCTAGCTATAACGTCTGG (SEQ xylAII 的 反 向 IDNO:30) RT-PC 引物

GCGGCAACTGATACACCT ( SEQ xylB的正向 RT-PCR IDNO:31) 引物

CTCGCTTTCTTCAACTTCTTTA xylB的反向 RT-PCR

(SEQIDNO:32) 引物

ATAGAAGCAGCAAAAGCAGGC to/的正向 RT-PCR引

(SEQIDNO:33) 物

GCTGCTGCCCAGTCTGCTTTA to/的反向 RT-PCR引

(SEQIDNO:34) 物

AGATGGACGAGCAGATGA ( SEQ 的正向 RT和荧 IDNO:35) 光定量 PCR引物

AACCAAAGCCTATGACTA ( SEQ 的反向 RT和荧 IDNO:36) 光定量 PCR引物

CGCACAAGCAGCGGAGCAT (SEQ cbeirOOOl 的正向 RT IDNO:37) 和荧光定量 PCR 引 物

AACCCAACATCTCACGACACGA cbeirOOOl 的正向 RT (SEQIDNO:38) 和荧光定量 PCR 引 物 a 根据在线工具设计 (www.clostron.com) 实施例 1. 8052菌株在 3%w/v葡萄糖: 3%w/v木糖以及 3%w/v单木糖的合成培 养基中的发酵

从 CGM平板上挑取单菌接入 5mL CGM液体培养基中, 过夜培养, 以 5%接 种量接入 95mL 6%w/v木糖的 XHP2培养基中, 培养 12hr, 使菌浓 OD 6(K) 达到 0.5 一 1.0, 以 5%接入 95ml XHP2培养基中培养发酵, 取发酵液检测残糖含量 (使用 WATERS公司的 sugar-park柱经 Agela 1200 HPLC测定, 结果如图 1所示), 其中 测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理 : 发酵液经离心后, 分别取上清 液, 以 H 2 O经 20倍稀释后用于残糖测定。

结果显示: 8052能同时利用葡萄糖和木糖, 其碳代谢阻遏效应不明显。 无论 是 3%w/v葡萄糖: 3%w/v木糖发酵还是 3%w/v单木糖发酵,该菌 72小时内都不能 完全消耗培养基中的木糖, 说明 8052木糖代谢途径天然存在问题。 因此, 需要寻 求一种可改善该代谢途径的新方法。 实施例 2.构建 pWJl-xylR质粒载体

通过 PCR扩增 xylR targetron片断,然后使用 X/wI和 ^rG I进行双酶切, 并与 同样经 X/wI和 I酶切的 pWJl载体连接, 得到中断质粒 pWJl -xylR, 其中, PC 扩增 xylR targetron的模板及引物设计方法来源于 Sigma- Aldrich公司的 Targetron™ Gene Knockout System(TA0100)试剂盒, 具体步骤如下:

2.1 PCR扩增引物

参考 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒提供的方法,分别设计 引物 xylR787|788s-IBS、 xyl 787|788s-EBSld 和 xylR787|788s-EBS2, 用于构建 pWJl-xylR质粒载体。

PCR扩增需要的 EBS通用引物 (EBS universal)由 Targetron™ Gene Knockout System(TAO lOO)试剂盒自带。

2.2 PCR扩增 使用 Sigma- Aldrich的 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒进 行 PCR扩增 (PCR反应条件: 94°C30s, 94°C30s、 55°C30s、 72°C30s 30个循环, 72°C2min, 4°C保存), 扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供, 将 PCR产物进行 琼脂糖凝胶电泳, 然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收 350bp处的条带。

2.3 构建 pWJl-xylR重组质粒载体

使用 X/w I及 ^rGI分别酶切载体 pWJl和 xylR-targetron片段, 然后使用华舜 公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。

将酶切后的 xylR-targetron片段与酶切后的载体片段使用 T4DN A连接酶连 接, 该连接反应在 16°C水浴锅中进行 10hr, 将获得的连接产物以 CaCl 2 热休克法 转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞: 42°C 热击 90sec, 然后添加 4°C LB液体培养基 复苏 lhr, 然后将细胞以 4500rpm离心 5min, 涂布到含有 lOO g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基平板上培养 16-18hr。

对获得的菌落进行菌落 PCR (反应试剂由 Sigma-Aldrich的 Targetron TM Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒提供、 条件: 95°C5min, 94°C30s、 55°C30s、 72°C30s 30个循环, 72°C2min, 4°C保存), 以检测 350bp的 targetron片段是否连 接入 pWJl载体中, PCR扩增引物为 IBS和 EBSld。

PCR检测结果显示, 菌落 PCR可以扩增出 350bp特异性条带。 随即挑取 PCR 呈阳性的菌落以 LB液体培养基扩培, 提取质粒。 然后, 以 dpIMPl-fw作为引物, 提取的质粒作为模板进行测序, 结果如预期: targetron片段确已连接入 pWJl载 体)。 实施例 3. 拜氏梭菌; cWR突变株的构建、 检测与敲除质粒的丢失

将 pWJl-xylR质粒电转拜氏梭菌 NCIMB8052, 复苏过夜后, 取 200μ1细胞液 涂布于加有 lO g/mL红霉素的 CGM平板上, 在厌氧箱内 37°C培养 48-72小时后, 挑取单菌进行菌落 PCR验证, 具体过程如下:

3.1 pWJl-xylR质粒电转入拜氏梭菌 8052

将拜氏梭菌 NCIMB8052于 CGM培养基平板上划线培养 48hr后,挑取单菌落 接入 5mL CGM液体培养基中培养 16hr,再按 1%接种量接入 50mL CGM液体培养 基中培养, 当培养菌体的 OD 6(K) 达到 0.6-0.7之间时取出培养菌, 用于制备电转感 受态细胞。 取 30mL菌液, 于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加入 30mL 4°C 的 ETM缓冲液悬浮, 再于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加入 lmL 4°C的 ET 缓冲液, 获得悬浮菌液。

取上述悬浮菌液 190 L, 加入 lO L (约 l〜3 g)pWJl-xylR质粒 (冰上操作), 混匀后转入电转杯中(2mm直径), 使用 Bio-Rad MicroPulser™电转仪电转, 电压 1.8kV, 其余参考使用手册, 电击后迅速加入常温的 CGM培养基 lmL, 于 37°C 培养 8hr后, 取 200 L细胞液涂布于加有 lO g/mL红霉素的 CGM平板上, 于厌氧 箱内 37°C培养约 2〜3天。

3.2 菌落的 PCR验证

pWJl-xylR质粒转化入拜氏梭菌 NCIMB8052中后, 可能会将二类内含子的 部分序列插入到基因组的 xylR基因中, 是否有内含子插入可以使用插入位点上 下游的引物, 通过菌落 PCR加以验证 (未插入内含子的野生型菌将扩增出 400bp 的条带, 插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为 1.3Kb条带), 因此, 随机 挑取两个转化子进行验证, 其中, 以拜氏梭菌 NCIMB 8052基因组为阴性对照, 具体过程如下:

PCR反应使用的弓 I物为 xylR— 569-588和 xylR— 918-937;

PCR反应体系: 体系 ΙΟΟμΙ; 10x Taq Buffer ΙΟμΙ; dNTP(2 mM) ΙΟμΙ; MgCl 2 (25mM) ΙΟμΙ; Taq酶 Ιμΐ; 正向引物 (lOOmM) 2μ1; 反向引物(lOOmM) 2μ1; 菌落 (牙签占取微量) ; 水 65μ1。

PCR反应条件: 95 °C 5min; 95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1.5min, 30个循环; 72 °C 5min。

将 PCR反应获得的产物, 进行琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 2所示。 根据图 2的结果, 得到的两个转化子均为插入了内含子的突变体 。

3.3 测序验证阳性转化子

随机挑取步骤 3.2中对应于图 2中标记为 3的阳性转化子, 以加有 lO g/mL红 霉素的 CGM液体培养基培养后, 抽提基因组。 以抽提的基因组为模板, 以 xylR- —569-588和 xylR— 918-937为引物对进行 PCR扩增, 回收扩增获得的 1.3kb DNA条 带并测序, 结果如图 8所示。 测序结果显示, 该序列的位点的 173-1087DNA为 插入的内含子序列, 即内含子序列精确地插入到预计的 787|788位点之间。 3.4 8052/pWJl-xylR敲除质粒的丢失

将 3μ1生长至对数生长期的转化子分别转接至 5ml CGM无抗和含有红霉素 (20 g/ml)的试管中, 12〜15 小时转接一次, 直至抗性试管不再生长为止, 此过程 需约 2天, 将此时对应的无抗试管菌液涂板, 菌落 PCR、 测序验证 (同 3.2、 3.3)保 证内含子的插入, 将丢失敲除质粒的突变株命名为 8052xylR, 用于后续的代谢工 程改造。 实施例 4. RT-PCR检测 8052和 8052xylR中木糖代谢相关基因的转录

从 CGM平板上挑取 8052xylR单菌接入 5mL CGM液体培养基中, 过夜培养 至 OD 6(X) = 0.8〜1.0, 以 2%接种量接入 50mL CGM培养基中, 培养 8〜10hr, 使菌浓 OD 6Q() 达到 0.5— 1.0, 接入 500ml SP2 (30 g/L甘油作为碳源,在 XHP2的基础上加 0.1 g/L L-半胱氨酸和 6 g/1 酵母提取物) 培养基中发酵, 并以 8052作为对照, 当 OD 600 =0.5时, 4°C, 6000rpm, lOmin离心收集 250ml菌体并用液氮速冻。细胞 RNA 的提取和 cDNA的制备同文献 [11]。

结果表明(图 3 ): 和对照 8052相比, xylT、 xylAK xylAII和 xylB在 8052xylR 中转录都有明显上调, xylF和 tal基因转录变化不明显, 说明敲除 xylR基因后, 木 糖代谢的大多数基因都转录上调。 实施例 5. 8052x V lR突变株在合成培养基中的发酵

取实施例 3步骤 3.4中的中断了 xylR基因的拜氏梭菌菌株 8052xylR在 XHP2 培养基中发酵, 并检测发酵液, 具体过程如下:

从 CGM平板上挑取单菌接入 5mL CGM液体培养基中, 过夜培养, 以 5%接 种量接入 95mL 6%w/v木糖的 XHP2培养基中, 培养 12hr, 使菌浓 OD 6(K) 达到 0.5 一 1.0, 以 5%接入 95ml 6%w/v木糖 XHP2培养基中培养发酵, 取发酵液检测残糖 含量 (使用 WATERS公司的 sugar-park柱经 Agela 1200 HPLC测定, 结果如图 4A 所示) 以及丙酮、 丁醇和乙醇含量 (使用 Agela 7890A气相色谱仪测定, 结果如 图 4D所示)、 OD600和 pH, 并以 8052作为对照, 其中, 测定发酵液中的残糖含 量和丙酮、 丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理:

发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮 、 丁醇、 乙醇:

上清液以 ¾0经 20倍稀释后用于残糖测定; 取 400 L上清液与 lOO L内标混 合均匀测定丙酮、 丁醇和乙醇(内标配方为: 25g异丁醇, 5g异丁酸, 50mL 37% 浓盐酸, 加水定容至 1L)。

结果显示: 在发酵终点 72小时, xylR基因经插入失活后, 木糖的利用率为 76%, 在相同的时间野生型只能利用 54%的木糖。 相应的, 8052xylR的生长、 丁醇及 ABE的生产量都优于野生型 (图 4), xylR基因中断后, 提高了菌体的木糖 利用率。 实施例 6. 8052xyl 突变株的互补

构建互补质粒 pIMPl-xylR xylR , 连同对照质粒 pIMPl-P ptb —起电转 8052xylR, 经基因型鉴定获得阳性克隆后,发酵考察互补 菌株木糖利用及溶剂生产的表型。其 中, PCR、 酶切、 连接转化、 菌落 PCR方法同实施例 2, 具体工程实施如下: 6.1 构建质粒 pIMP 1 -xyl xylR

以拜氏梭菌 NCIMB8052基因组为模板, 以 xylR-up和 xylR-dn为引物扩增出 xylR片段。 使用 ¾1和 Acc65I分别酶切载体 pIMPl-Pp nxylR片段, 二者连接、 转化 DH5(后用同样的引物鉴定, 将有阳性条带的菌落抽提质粒,测序验证正确 后保菌。

6.2 质粒 pIMPl-P ptb 电转 8052xylR

同 3·1

6.3菌落的 PCR验证

PCR体系、 方法、 DNA琼脂糖电泳验证同 3.2, 阳性对照为各自构建正确的 质粒, 阴性对照为 8052xylR菌落。

6.3.1拜氏梭菌 8052xylR (pIMP 1 -P ptb )的鉴定 引物为 dpIMP 1 -P ptb -up和 dpIMP 1 -rev; 获得的阳性菌落简称为 8052xylR-P。

6.3.2拜氏梭菌 8052xylR (pIMPl-xylR xylR )的鉴定

引物为 dpIMP 1 -fw和 dxylR-dn; 获得的阳性菌落简称为 8052xylR-X。

6.4 互补菌株的发酵

同实施例 5

结果如表 3所示, 互补菌株 8052xylR-X在木糖消耗、 丁醇和 ABE溶剂生产 等指标均回复到野生型水平,说明 8052xylR木糖利用提高的表型是由于 xylR基因 的中断造成的。

表 3: 基因 xylR (cbei2385)在菌株 8052xylR中的互补

菌株 a 木糖消耗 (g/L) 丁醇 (g/L) ABE (g/L)

8052WT 34.26 ± 0.64 7.51 ±0.30 9.01 ±0.48

8052xyl 44.40 ± 3.70 9.68 ± 1.25 11.35 ±0.78

8052xyl -P 43.90 ± 1.62 9.79 ± 0.43 12.47 ±0.83

8052xyl -X 35.17 ± 1.00 7.17 ±0.74 9.53 ± 1.85

a8052WT: C. beijerinckii NCIMB 8052 野生型菌株; 8052xyl : xylR中断的菌株; 8052xyl -P: xy/R中断的菌株, 携带有空白质粒对照 pIMPl-P ptb ; 8052xyl -X: xylR 中断的菌株, 携带有 pIMPl-xylR xylR 。 在含 60克 D-木糖 /升的 XHP2培养基中进行 发酵。 96小时后取样。 发酵设三个平行。 实施例 7. 确定 cbei0109为木糖转运蛋白的候选基因

将 8052基因组中 14个注释为糖转运蛋白的氨基酸序列与一个在 824中被鉴 定为木糖转运蛋白的氨基酸序列进行同源比对 (BioEdit软件完成) , 结果如表 4所示, cbei0109与已知蛋白的氨基酸序列相似性最高, 为 37%, 故将之确定为 木糖转运蛋白的候选基因。 表 4: C. beijerinckii中 14个预测的糖转运蛋白和 C. acetobutylicum 中 XylT (cac!345) 的氨基酸相同性比较

cbei0109 cbei0232 cbei0770 cbei0771 cbeil835 cbei2377 cbei2380 cbei3764 cbei4125 cbei4443 cbei4448 cbei4461 cbei4545 cbei4588 XylT(cac cbei0109 0.07 0.08 0.06 0.09 0.05 0.05 0.12 0.10 0.06 0.09 0.08 0.35 0.08 0.3 cbei0232 0.12 0.32 0.06 0.05 0.04 0.07 0.07 0.24 0.05 0.05 0.07 0.05 0.05 cbei0770 0.10 0.03 0.07 0.04 0.06 0.06 0.1 1 0.04 0.06 0.05 0.05 0.05 cbei0771 0.04 0.07 0.06 0.05 0.05 0.22 0.06 0.06 0.06 0.06 0.05 cbeil 835 0.05 0.05 0.21 0.26 0.04 0.08 0.07 0.10 0.10 0.10 cbei2377 0.13 0.06 0.08 0.05 0.06 0.05 0.06 0.04 0.06 cbei2380 0.07 0.07 0.05 0.06 0.05 0.05 0.07 0.05 cbei3764 0.31 0.05 0.06 0.06 0.1 1 0.13 0.10 cbei4125 0.04 0.08 0.06 0.10 0.1 1 0.1 1 cbei4443 0.05 0.03 0.07 0.08 0.06 cbei4448 0.07 0.09 0.08 0.07 cbei4461 0.09 0.07 0.07

实施例 8. 在 8052中敲除和过表达基因 cbei0109

构建敲除质粒 pWJl -xylT和过表达质粒 pIMPl-xylT thl ,电转 8052后获得阳性 克隆并发酵考察木糖利用表型。 具体实施过程如下:

8.1 构建敲除质粒 pWJl -xylT

方法同实施例 2, 只是构建时使用的引物不同, 分别是: xylT852|853s-IBS, xylT852|853s— EBSl d和 xylT852|853s— EBS2。

8.2 构建过表达质粒 pIMPl -xylT thl

以拜氏梭菌 NCIMB8052基因组为模板, 以 xylT-up和 xylT-dn为引物扩增出 基因 cbeiO 109的片段。 使用 Sa/I和 Acc(55I分别酶切载体 pIMP 1 -Ρ Λ ^Π cbeiO 109片 段,二者连接、转化 DH5a后用同样的引物鉴定,将有阳性条带的菌 抽提质粒, 测序验证正确后保菌。

8.3质粒 pWJl-xylT和 pIMP 1 -xylT thl 电转 8052

同 3.1

8.4菌落的 PCR验证

PCR体系、 方法、 DNA琼脂糖电泳验证同 3.2, 阳性对照各自构建正确的质 粒, 阴性对照为 8052菌落。

8.4.1 拜氏梭菌 8052 (pWJl-xylT)的鉴定

引物为 xylT— 579-596和 xylT— 1006-1023 ; 获得的阳性菌落简称为 8052xylT。 8.4.2 拜氏梭菌 8052 (pIMPl-xylT thl )的鉴定

引物为 dpIMP 1 -P thl -up和 dxylT-dn; 获得的阳性菌落简称为 8052-xylT thl 。 8.5 工程菌株在合成培养基中的发酵

同实施例 5

和野生型相比, 过表达基因 cbei0109导致该基因的转录量提高。 如图 5所示, 野生型里敲除基因 cbei0109导致木糖利用率降低 45%, 过表达基因 cbei0109导致 木糖利用率提高 33%。 如表 5所示, 在野生型过表达基因 cbei0109导致木糖消耗 量提高 32%, 同时丁醇和总溶剂的产量也有相应的提高, 分别比野生型高 44%和 53 % , 说明基因 cbei0109是主要负责 8052木糖转运的蛋白, 下文中命名为 x;y/r。 表 5 : 菌株 8052WT和 8052 11 ¾1 在 6%XHP2发酵 96小时的发酵参数

产物 (g/L)

菌株 木糖消耗量 (g/L) 丙酮 乙醇 丁醇 ABE

8052WT 32.14±0.38 1.27±0.05 1.47±0.10 5.36±0.05 8.09±0.13

8052xylT th i 47.08±1.32 3.03±0.25 1.59±0.07 7.71±0.29 12.34±0.45

实施例 9.质粒 pIMP 1 -xvlT^的构建

9.1 质粒 pIMPl-xylTptb的构建

以拜氏梭菌 NCIMB8052基因组为模板, 以 xylT-up和 xylT-dn为引物扩增出 基因 cbei0109的片段。 使用 Sa/I和 Acc65I分别酶切 cbei0109片段, 分别与同样双 酶切的 pIMP l-P ptb 连接, 转化 DH5(后用同样的引物鉴定, 将有阳性条带的菌落 抽提质粒, 测序验证正确后保菌。 实施例 10. 拜氏梭菌 SOSSxylR/pIMPl-xylT^ 禾口 SOSSxylR/pIMP l-xylT^) 突变株的构建与检测

将实施例 8、 9中构建正确的 pIMP 1 -xylT ptb 和 pIMP 1 -xylT thl 电转进入

8052xyl , 具体过程如下:

10.1 各质粒的电转

方法同 3.1 10.2 各个工程菌的菌落 PCR验证

PCR体系、 方法、 DNA琼脂糖电泳验证同 3.2, 阳性对照为各自构建正确的 质粒, 阴性对照为 8052xylR。

10.2.1 拜氏梭菌 8052xylR (pIMP l-xylT ptb )的鉴定

引 物 为 dpIMPl-P ptb -up和 dxylT-dn ; 获 得 的 阳 性 菌 落 简 称 为 8052xylR-xylT ptb 。 10.2.2 拜氏梭菌 8052xylR (pIMPl-xylT thl )的鉴定

引物为 dpIMP 1 -P thl -up和 dxylT-dn;获得的阳性菌落简称为 8052xylR-xylT thl 。 上述构建所得的 8052xylR (pIMPl-xylT^)已于 2012年 2月 15日保藏于中国 典型培养物保藏中心 (武汉市武昌珞珈山, 邮编: 430072 ) , 保藏号为 CCTCC 实施例 1 1. 拜氏梭菌 8052、 8052xyl 、 8052xyl (pIMP 1 -xy!T^ 和 SOSSxylRipIMPl-xylT^)在合成培养基中的发酵

方法同实施例 5。

结果如图 6所示,以不同启动子强度携带基因 xylT过表达在 8052xylR中, ptb 启动子携带 xylT过表达的工程菌和 8052xylR相比木糖利用有明显提高, 提高了 23%, thl启动子携带 xylT过表达和 8052xylR相比, 木糖利用提高 1.7g/L。 即菌株 8052xylR- X ylT ptb 是目前在合成培养基中木糖利用率最高的 菌株。 实施例 12. 定量 PCR检测 8052xylR、 8052xylR-xylT ^和 8052XV1R-XV1T 中 xylT的转录

从 CGM平板上挑取单菌接入含有 lO g/ml红霉素的 5mLCGM液体培养基 中, 过夜培养至 OD 6(K) = 0.8〜1.0, 以 5%接种量接入 95mL 6%w/v木糖的 XHP2培 养基中, 培养 12hr, 使菌浓 OD 6 oo达到 0.5-1.0, 接 25ml入 475mlXHP2(以 6%w/v 木糖为碳源)培养基中培养发酵, 并以 8052xylR作为对照, 当 OD 6(K) =0.6和 2.5时, 4°C, 6000rpm, lOmin离心收集 250ml菌体并用液氮速冻。 细胞 RNA的提取和 cDNA的制备同文献 [11]。

每 20μ1实时 PCR反应体系包括: ΙΟμΙ iQ SYB Green Supermix (Bio-Rad), 200 nM引物, l l cDNA模板。 实时 PCR在实时 PCR检测仪 (Bio-Rad)中进行, PCR程序 为: 95 °C 3min; 95 °C 20s, 55 °C 20s, 72 °C 20s, 40个循环; 65-95°C进行溶解曲 线分析。 所有样品都进行了三次平行实验, 取平均值进行分析。 为了计算相对 表达水平, cDNA稀释了 200倍进行分析,参见文献 [12]。采用 16S作为内参基因, 引物为 r 16S-up和 r 16S-dn。 实时 PCR的 xylT引物为 rxylT-up和 rxylT-dn。 结果如表 6所示, 和对照 8052xylR相比, xylT在 8052xylR- X ylT ptb 中产酸期、 产溶剂期转录都有上调, 表达策略成功。

表 6: 菌株 8052xvlR-xvlT^P 8052xlyR-xylT ptb 中 xylT转录倍数变化(以菌 株 8052xylR为对照) 转录水平 (平均倍数变化± SD)

菌株

产酸期 产溶剂期

8052xly -xylT thl 2.38 ± 0.39 3.27 ± 0.34

8052xly -xylT ptb 4.53 ± 0.69 2.20 ± 0.37 a 产酸期和产溶剂期获取的 OD 6Q() 分别为 0.6 和 2.5 左右。 使用 16S r NA ( cbeirOOO l ) 作为内参基因。 在含 60g/L木糖的 XHP2培养基中进行发酵。

实施例 13. 拜氏梭菌 8052和 8052xylR(pIMP l -xylT E ^在的木糖母液发酵 从 CGM平板上挑取单菌接入含有 l O g/ml红霉素的 5mLCGM液体培养基 中, 过夜培养至 OD 6(K) = 0.8〜1 .0, 以 5%接种量接入 95mL 6%w/v木糖的 XHP2培 养基中, 培养 12hr, 使菌浓 OD 6(K) 达到 0.5- 1 .0, 将 5ml培养液接入 95mlXHP2(以 5.5%w/v木糖母液为碳源)培养基中培养发酵, 并以 8052作为对照, 取样测定残 糖含量; 丙酮、 丁醇和乙醇含量; OD600和 pH。 方法同实施例 5。

如图 7所示, 8052xylR- X ylT ptt ^61小时内能较为彻底地利用木糖母液中的 各种糖分, 体现出生长优势并最终在 61小时内生产 16.91 g/L的 ABE, 溶剂得率 为 0.3 1 g/g, 均比野生型高 35%。

实施例二

本实施例所用术语、 材料和方法如下所述- 菌株拜氏梭菌: Clostridium beijerinckii 8052, 购于 NCIMB公司。 菌株拜氏梭菌中的 cy/R和 araR基因是现有技术已知的,其在 NCBI核酸数据 库中基因组内的序号分别是: cbei2385和 cbei4456。

"8052xylR"是指基于拜氏梭菌 NCIMB 8052构建的、 xy/R基因表达受抑制甚 至不表达的菌株。

"8052xylRaraR"是指基于拜氏梭菌 8052xylR构建的、 xy/R基因和 araR基因 的表达同时受抑制甚至不表达的菌株。

"重组敲除质粒载体 pWJl-xylR"是指用于敲除基因 cy/R的重组质粒载体,其 中, 使用的 xy/R-targetron片段指的是在 IBS, EBS2, EBSld位点碱基经修改后, 用于敲除 cy/R基因的片段, 该片段属于 LLLtrB内含子一部分, 所述的 LLLtrB 二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。

"重组敲除质粒载体 pWJl-araR"是指用于敲除基因 a R的重组质粒载体, 其中, 使用的 araR-targetron片段指的是在 IBS, EBS2, EBSld位点碱基经修改 后, 用于敲除 a R基因的片段, 该片段属于 Ll.LtrB内含子一部分, 所述的 Ll.LtrB二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。

质粒 pWJl为大肠杆菌和拜氏梭菌的穿梭质粒(将来 于丁酸梭菌

DSM10702的复制子 pCB102替换掉 pSY6的复制子 pIM13),在拜氏梭菌中表达红 霉素抗性基因, 该质粒的全部序列见 SEQ ID NO.: 1。 本领域的普通技术人员 可以使用常规方法构建所述质粒, 并对所述质粒金子能够分子生物学操作。

本发明使用的 PCR纯化和 DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品 有限公司, Targetron™ Gene Knockout System(TA0100)Kit购自 Sigma-Aldrich公 司, 基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限 公司。

CGM培养基酉己方如下 (Joseph W. Roos等, Biotechnology and Bioengineering, P681-694, Vol 557, 1985): 2g(NH 4 ) 2 SO 4 , lg Κ 2 ΗΡΟ 4 ·3Η 2 Ο, 0.5gKH 2 PO 4 , O.lg MgSO 4 -7H 2 O, 0.015g FeSO 4 -7H 2 O, O.Olg CaCl 2 , O.Olg MnSO 4 -H 2 O, 0.002g CoCl 2 , 0.002g ZnSO 4 , 2g 胰蛋白胨, lg 酵母提取物 (Yeast Extraction), 50g 葡 萄糖, 2%琼脂溶于 1L水中。

E-JL培养基 (每升)的配制方法如下:

溶液 1: ll.BgD-葡萄糖: 19.51gD-木糖: 8.94gL-阿拉伯糖, 加 H 2 O定溶 至 850mL;

溶液 2: (NH 4 ) 2 SO 4 2g, Na 2 SO 4 5.24g, NaAC2.89g, 加 H 2 O定溶至 lOOmL; 溶液 3: 2.0g MgSO 4 -7H 2 O, O.lg MnSO 4 -H 2 O, O.lgNaCl, O.lg FeSO 4 -7H 2 O; 试剂 4: 5gCaCO 3

溶液 1、 溶液 2和试剂 4高温湿热灭菌, 溶液 3过滤除菌, 溶液 1和溶液 2冷却 后混合均匀, 再加入 10mL溶液 3, 与试剂 4混匀后放厌氧箱脱氧。 ETM缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4 , l OmM MgCl

ET缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4 。 本发明使用的限制性内切酶, Taq DNA聚合酶和 T 4 DNA连接酶均购自 TaKaRa公司, KOD plus DNA聚合酶购自 Toyobo公司。

其它常规试剂均为国产或进口分装。

表 1提供了本申请所需的菌株及质粒的信息。

表 1

菌株或质粒 相关特征

菌株

C. beijerinckii 野生型 NCIMB

NCIMB 8052

8052xyl xylR:: intron/pWJ 1 -xylR 本申请

8052xyl ara 8052xylR/pWJl-ara 本申请

E.coli DH5a 常用克隆宿主菌株 Takara

质粒

pWJl 二类内含子, ItrA 该质粒的全

SEQ ID NO.:

pWJl-xyl 衍生自 pWJl,可将内含 本申请

子插入 xylR 基因的

787/788nt位 xylR

pWJl-ara 衍生自 pWJl,可将内含 本申请

子插入 araR 基因的

540/54 lnt

a xylR, 木糖代谢的转录调节子; araR, 阿拉伯糖代谢的转录调节子; ItrA, LtrA 蛋白, 反向剪切所需。

下表提供了本申请所用的引物。 引物 序列编号 描述 xylR787|788s— IBS AAAACTCGAGATAATTATCCTTAC xylR Targetron 弓 | ATACCCATCTAGTGCGCCCAGATA 物

GGGTG

SEQIDNO.: 42

xyl 787|788s-EBS CAGATTGTACAAATGTGGTGATA xylR Targetron 弓 | Id ACAGATAAGTCCATCTATGTAACT 物

TACCTTTCTTTGT SEQIDNO.: 43

xyl 787|788s-EBS TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGG xylR Targetron 弓 | 2 TTGTATGTCGATAGAGGAAAGTG 物

TCT

SEQIDNO.: 44

xylR— 569-588 ATTTATCTGCTTACTACGAG xylR 内部的正向

SEQIDNO.: 45 引物, 从第 569到 第 588 碱基 xyl _918-937 AATTCGATAGACCTAAAGAC xylR 内部的反向

SEQIDNO.: 46 引物,从第 918 到 都 937 碱基 ara 540|541s-IBS AAAACTCGAGATAATTATCCTTAA araR Targetron 弓 |

ATTCCGCATATGTGCGCCCAGATA 物

GGGTG

SEQIDNO.: 47

ara 540|541s-EBSl CAGATTGTACAAATGTGGTGATA araR Targetron 弓 | d ACAGATAAGTCGCATATATTAACT 物

TACCTTTCTTTGT SEQIDNO.: 48

ara 540|541s-EBS2 TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGG araR Targetron 弓 |

TTGAATTCCGATAGAGGAAAGTG 物

TCT SEQIDNO.: 49

ara _N 159 TTTAGTACAAGAAGGCTGGAT araR 内部的正向

SEQIDNO.: 50 引物,从第 159 碱 基开始

ara _983 CATTTGGCTGCTCTTATTCC araR 内部的反向

SEQIDNO.: 51 引物,从第 983 碱 基开始

dpIMPl-fw GCAAGAGGCAAATGAAATAG 位于质粒 pIMPl

SEQIDNO.: 52 骨架上的正向引 物

实施例概述

通过 PCR方法, 扩增用于中断 xy/R基因和 araR基因的 targetron片断, 然后经 双酶切、 与经同样酶切的 pWJl载体连接, 得到质粒 pWJl-xylR和 pWJl-araR, 电转化拜氏梭菌 NCIMB 8052和拜氏梭菌 8052xylR,然后经梭菌质粒 PCR鉴定出 有内含子插入到基因组中的重组菌, 经发酵验证确定重组菌在混合糖中木糖、 阿拉伯糖消耗率提高, 具体如下述实施例所示。 实施例 1

构建 pWJl-xylR质粒载体

通过 PCR扩增 xylRtargetron片断,然后使用 X/w nfisrG I进行双酶切, 并与 同样经 X/wI和 ^rGI酶切的 pWJl载体连接,得到中断质粒 pWJl-xylR,其中, PCR 扩增 xy/Rtargetron的模板及引物设计方法来源于 Sigma- Aldrich公司 的 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒, 具体步骤如下:

1.1 PCR扩增弓 I物

参考 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒提供的方法,分别设计 引物 xylR787|788s-IBS、 xyl 787|788s-EBSld 和 xylR787|788s-EBS2, 用于构建 pWJl-xyl 质粒载体。 PC 扩增需要的 EBS通用引物 (EBS universal)由 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒自带。

1.2 PCR扩增 使用 Sigma- Aldrich的 Targetron™ Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒进 行 PCR扩增 (PCR反应条件: 94°C30s, 94°C30s、 55 °C30s、 72°C 30s 30个循环, 72°C2min, 4°C保存), 扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供, 将 PCR产物进行 琼脂糖凝胶电泳, 然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收 350bp处的条带。

1.3 构建 pWJ l-xylR重组质粒载体

使用 X/w I及 ^rGI分别酶切载体 pWJl和 xylR-targetron片段, 然后使用华舜 公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。

将酶切后的 xylR-targetron片段与酶切后的载体片段使用 T4DN A连接酶连 接, 该连接反应在 16°C水浴锅中进行 10hr, 将获得的连接产物以 CaCl 2 热休克法 转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞: 42°C 热击 90sec, 然后添加 4°C LB液体培养基 复苏 lhr, 然后将细胞以 4500rpm离心 5min, 涂布到含有 lOO g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基平板上培养 16-18hr。

对获得的菌落进行菌落 PCR (反应试剂由 Sigma-Aldrich的 Targetron TM Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒提供、 条件: 95 °C 5min, 94°C 30s、 55°C 30s、 72°C30s 30个循环, 72°C2min, 4°C保存), 以检测 350bp的 targetron片段是否连 接入 pWJl载体中, PCR扩增引物为 IBS和 EBSld。

PCR检测结果 (图 1)显示, 菌落 PCR可以扩增出 350bp特异性条带。

随即挑取 PCR阳性的菌落以 LB液体培养基扩培, 提取质粒。 然后以 dpIMPl-fw作为引物, 提取的质粒作为模板进行测序, 结果表明, targetron片段 确已连接入 pWJl载体, 得到构建成功的 pWJl-xylR重组质粒载体。 实施例 2

拜氏梭菌 xylR突变株的构建、 检测与敲除质粒的丢失

将 pWJl-xylR质粒电转拜氏梭菌 NCIMB8052, 复苏过夜后, 取 200μ1细胞液 涂布于加有 lO g/mL红霉素的 CGM平板上, 在厌氧箱内 37°C培养 48-72小时后, 挑取单菌进行菌落 PCR验证, 具体过程如下:

2.1 pWJ l-xylR质粒电转入拜氏梭菌 8052

将拜氏梭菌 NCIMB8052于 CGM培养基平板上划线培养 48hr后,挑取单菌落 接入 5mL CGM液体培养基中培养 16hr,再按 1%接种量接入 50mL CGM液体培养 基中培养, 当培养菌体的 OD 6(K) 达到 0.6-0.7之间时取出培养菌, 用于制备电转感 受态细胞。 取 30mL菌液, 于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加入 30mL 4°C 的 ETM缓冲液悬浮, 再于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加入 lmL 4°C的 ET 缓冲液, 获得悬浮菌液。

取上述悬浮菌液 190 L, 加入 10 L (约 l〜3 g)pWJl-xylR质粒 (冰上操作), 混匀后转入电转杯中(2mm直径), 使用 Bio-Rad MicroPulser™电转仪电转, 电压 1.8kV, 其余参考使用手册, 电击后迅速加入常温的 CGM培养基 lmL, 于 37°C 培养 8hr后, 取 200 L细胞液涂布于加有 lO g/mL红霉素的 CGM平板上, 于厌氧 箱内 37°C培养约 2〜3天。

2.2 菌落的 PCR验证

pWJl-xylR质粒转化入拜氏梭菌 NCIMB8052中后, 可能会将二类内含子的 部分序列插入到基因组的 xylR基因中, 是否有内含子插入可以使用插入位点上 下游的引物, 通过菌落 PCR加以验证 (未插入内含子的野生型菌将扩增出 400bp 的条带, 插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为 1.3Kb条带), 因此, 随机 挑取两个转化子进行验证, 其中, 以拜氏梭菌 NCIMB 8052基因组为阴性对照, 具体过程如下:

PCR反应使用的弓 I物为 xylR— 569-588和 xylR— 918-937;

PCR反应体系: 体系 ΙΟΟμΙ; 10x Taq Buffer ΙΟμΙ; dNTP(2 mM) ΙΟμΙ; MgCl 2 (25mM) ΙΟμΙ; Taq酶 Ιμΐ; 正向引物(lOOmM) 2μ1; 反向引物(lOOmM) 2μ1; 菌落 (牙签占取微量); 水 65μ1。

PCR反应条件: 95 °C 5min; 95 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 1.5min, 30个循环; 72 °C 5min。

将 PCR反应获得的产物, 进行琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 2所示。 根据图 1的结果, 得到的两个转化子均为插入了内含子的突变体 。

2.3 8052/pWJ l-xylR敲除质粒的丢失

将 3μ1生长至对数生长期的转化子分别转接至 5ml CGM无抗和含有红霉素 (20 g/ml)的试管中, 12〜15小时转接一次, 直至抗性试管不再生长为止, 此过 程需约 2天, 将此时对应的无抗试管菌液涂板, 菌落 PCR、 测序验证保证内含子 的插入, 将丢失敲除质粒的突变株命名为 8052xylR, 用于后续的代谢工程改造。 实施例 3

构建 pWJ 1-araR质粒载体

构建方法同实施例 1, 只是构建时使用的引物不同, 分别是: ara 540|541 s-IBS, araR540|541s- EBSld禾口 araR540|541 s- EBS2。 实施例 4

拜氏梭菌 xylRaraR突变株的构建、 检测与敲除质粒的丢失

方法同实施例 2, 只是电转化的宿主是 8052xylR, 质粒是 pWJl-araR, 鉴定 的引物是 araR— N159和 araR— C983 , 根据图 2的结果, 得到的四个转化子均为插 入了内含子的突变体。 实施例 5

拜氏梭菌 xylR、 拜氏梭菌 xylRaraR在 E-JL中的发酵

从 CGM平板上挑取单菌接入 5mlCGM液体培养基中, 培养至对数期, 转接 lml接入 9ml E-JL培养基中培养发酵, 取发酵液检测残糖含量 (使用 WATERS公 司的 sugar-park柱经 Agela 1200 HPLC测定)和以及丙酮、 丁醇和乙醇含量 (使用 Agela 7890A气相色谱仪测定), 其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预 处理: 发酵液经离心后, 分别取上清液, 以 ¾0经 20倍稀释后用于残糖测定。 测定溶剂时, 取 400 L上清液与 lOO L内标混合均匀测定丙酮、 丁醇和乙醇(内 标配方为: 25g异丁醇, 5g异丁酸, 50mL 37%浓盐酸, 加水定容至 1L)。

结果如下表所示。

NCIMB 8052 13.64

0.00 0.00 0.00 0.28 0.34 xyl ara

根据表 3 的结果, 8052xylR突变菌株的阿拉伯糖消耗率、 生产效率、 转化率 均高于野生菌株, 而 8052xylRaraR在 8052xylR的基础上阿拉伯糖消耗率、 生产效 率、 转化率进一步提高。

因此, xy 基因经二类内含子插入失活后和 araR基因经二类内含子插入失活 后的菌株利用混合糖中阿拉伯糖的能力显著提 高, 同时转化生成的 ABE浓度相应 提尚。 实施例 6

重复实施例 1和 2, 所不同的是将 xylR基因替换为 araR基因, 按照实施例 5 的方法进行发酵检测。

结果表明, 单独失活 araR基因的突变菌株的阿拉伯糖消耗率、 生产效率、 转 化率均高于野生菌株。 实施例三

本实施例所用术语、 材料和方法如下所述- 菌株拜氏梭菌: Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, 购于 NCIMB公司。 菌株拜氏梭菌中的 cy/R和 araR基因是现有技术已知的,其在 NCBI核酸数据 库中基因组内的序号分别是: cbei2385和 cbei4456。

"8052xylR"是指基于拜氏梭菌 NCIMB 8052构建的、 xy/R基因表达受抑制甚 至不表达的菌株。

"8052xyl ara "是指基于拜氏梭菌 8052xylR构建的、 xy/R基因和 araR基因 的表达同时受抑制甚至不表达的菌株。

"重组敲除质粒载体 pWJl -xylR"是指用于敲除基因 cy/R的重组质粒载体,其 中, 使用的 xy/R-targetron片段指的是在 IBS , EBS2 , EBS l d位点碱基经修改后, 用于敲除 cy/R基因的片段, 该片段属于 L LLtrB内含子一部分, 所述的 LLLtrB 二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。 "重组敲除质粒载体 pWJl-araR"是指用于敲除基因 a R的重组质粒载体, 其中, 使用的 araR-targetron片段指的是在 IBS, EBS2, EBS Id位点碱基经修改 后, 用于敲除 a R基因的片段, 该片段属于 Ll.LtrB内含子一部分, 所述的 Ll.LtrB二类内含子为原核二类内含子, 其中包含 ltrA基因。

质粒 pWJl为大肠杆菌和拜氏梭菌的穿梭质粒(将来 于丁酸梭菌

DSM10702的复制子 pCB102替换掉 pSY6的复制子 pIM13),在拜氏梭菌中表达红 霉素抗性基因, 该质粒的全部序列见 SEQ ID NO.: 1。 本领域的普通技术人员 可以使用常规方法构建所述质粒, 并对所述质粒金子能够分子生物学操作。

本发明使用的 PCR纯化和 DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品 有限公司, Targetron™ Gene Knockout System(TA0100)Kit购自 Sigma-Aldrich公 司, 基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限 公司。

CGM培养基酉己方如下 (Joseph W. Roos等, Biotechnology and Bioengineering, P681-694, Vol 557, 1985): 2g(NH 4 ) 2 SO 4 , lg Κ 2 ΗΡΟ 4 ·3Η 2 Ο, 0.5gKH 2 PO 4 , O.lg MgSO 4 -7H 2 O, 0.015g FeSO 4 -7H 2 O, O.Olg CaCl 2 , O.Olg MnSO 4 -H 2 O, 0.002g CoCl 2 , 0.002g ZnSO 4 , 2g 胰蛋白胨, lg 酵母提取物 (Yeast Extraction), 50g 葡 萄糖, 2%琼脂溶于 1L水中。

E-JL培养基 (每升)的配制方法如下:

溶液 1: ll.BgD-葡萄糖: 19.51gD-木糖: 8.94gL-阿拉伯糖, 加 H 2 O定溶 至 850mL;

溶液 2: (NH 4 ) 2 SO 4 2g, Na 2 SO 4 5.24g, NaAC2.89g, 加 H 2 O定溶至 lOOmL; 溶液 3: 2.0g MgSO 4 -7H 2 O, O.lg MnSO 4 -H 2 O, O.lgNaCl, O.lg FeSO 4 -7H 2 O; 试剂 4: 5gCaCO 3

溶液 1、 溶液 2和试剂 4高温湿热灭菌, 溶液 3过滤除菌, 溶液 1和溶液 2冷却 后混合均匀, 再加入 10mL溶液 3, 与试剂 4混匀后放厌氧箱脱氧。

ETM缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4 , lOmM MgCl

ET缓冲液配方如下: 270mM蔗糖, 0.6mM Na 2 HPO 4 , 4.4mM NaH 2 PO 4

A-JL发酵培养基配方如下:

A—几― Glucose A-JL-GXA 总糖 60 g/L (葡萄糖) 60 g/L 混糖(Glu : Xyl : Ara=23. 06 : 15· 08 : 1· 85)

(NH 4 ) 2 S0 4 2 g/L 2 g/L

MgS0 4 . 7H 2 0 0. 2 g/L 0. 2 g/L

MnS0 4 . H 2 0 0. 01 g/L 0. 01 g/L

NaCl 0. 01 g/L 0. 01 g/L

FeS0 4 . 7H 2 0 0. 01 g/L 0. 01 g/L

CaC0 3 5. 0 g/L 5. 0 g/L

乙酸钾 3. 12 g/L 3. 12 g/L

无水硫酸钠 3. 85 g/L 3. 85 g/L 本发明使用的限制性内切酶, Taq DNA聚合酶和 T 4 DNA连接酶均购自 TaKaRa公司, KOD plus DNA聚合酶购自 Toyobo公司。

其它常规试剂均为国产或进口分装。

表 1提供了本申请所需的菌株及质粒的信息。

表 1

菌株或质粒 相关特征

菌株

MM1588 C. beijerinckii NCIMB 8052 NCIMB

野生型

8052/pIMPl-Pptb 8052/pIMPl-Pptb 本申请

MM 1643 8052xylR/pWJl-ara 本申请

CIBTS0795 8052xyl araR/pIMP 1 -xylTptb 本申请

E. coli DH5a 常用克隆宿主菌株 Takara

质粒

pWJl 二类内含子, ItrA 该质粒的全部序列见

SEQ ID NO. : 1

pWJl-ara 衍生自 pWJl, 可将内含子插 本申请

入 araR基因的 540/54 lnt

xylR, 木糖代谢的转录调节子; a R, 阿拉伯糖代谢的转录调节子。 下表提供了本申请所用的引物。

引物 序列编号 描述

ara 540|541s-IBS AAAACTCGAGATAATTATCCTTAA araR Targetron 弓 |

ATTCCGCATATGTGCGCCCAGATA 物

GGGTG

SEQIDNO.: 47

ara 540|541s-EBSl CAGATTGTACAAATGTGGTGATA araR Targetron 弓 | d ACAGATAAGTCGCATATATTAACT 物

TACCTTTCTTTGT SEQIDNO.: 48

ara 540|541s-EBS2 TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGG araR Targetron 弓 |

TTGAATTCCGATAGAGGAAAGTG 物

TCT

SEQIDNO.: 49

ara N159 TTTAGTACAAGAAGGCTGGAT araR 内部的正向

SEQIDNO.: 50 引物,从第 159 碱 基开始

ara C 983 CATTTGGCTGCTCTTATTCC araR 内部的反向

SEQIDNO.: 51 引物,从第 983 碱 基开女 ,厶 dpIMPl-fw GCAAGAGGCAAATGAAATAG 位于质粒 pIMPl

SEQIDNO.: 52 骨架上的正向引 物

实施例概述

通过 PCR方法, 扩增 araR基因的 targetron片断, 然后经双酶切、 与经同样 酶切的 pWJl 载体连接, 得到质粒 pWJl-araR, 电转化拜氏梭菌 8052::xylR/pIMPl-xylTptb, 然后经梭菌质粒 PCR鉴定出有内含子插入到基因组中 的重组菌 。 进行 NCIMB8052 8052/pIMPl-Pptb, 8052xylR/pIMP 1 -xylTptb, 8052xyl araR/pIMP 1 -xylTptb 的 4株转化子发酵比较试验。 具体如下述实施例所 不。

1 . 构建 pWJ l-araR质粒载体

通过 PCR扩增 araR targetron片断, 然后使用 Xhol和 BsrG I进行双酶切, 并 与同样经 Xhol和 BsrG I酶切的 pWJl载体连接, 得到中断质粒 pWJl-araR, 其 中, PCR扩增 araR targetron的模板及引物设计方法来源于 Sigma-Aldrich公司的 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒, 具体步骤如下:

1.1 PCR扩增引物

参考 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法, 分别设 计引物 araR-540|541s-IBS、 ara -540|541s-EBSld禾卩 araR-540|541s-EBS2, 用于构 建 pWJl-araR 质粒载体。 PCR 扩增需要的 EBS 通用引物 (EBS universal)由 TargetronTM Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒自带。 araR基因序列如 SEQ ID NO:54所示:

araR Targetron 弓 1物:

ara -540|541s-IBS primer:

LACTCGAGA]

( SEQ ID NO:55 )

ara -540|541s-EBSld primer:

rATTGTACAAATGTGC

CTTTGT ( SEQ ID NO:56 )

ara -540|541s-EBS2 primer:

ID NO:57 )

EBS universal primer: CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC ( SEQ ID NO:58 )

1.2 PCR扩增

使用 Sigma- Aldrich的 TargetronTM Gene Knockout System(TAOlOO)试剂盒进 行 PCR扩增 (PCR反应条件: 94 30s, 94 30s °C °C 、 55 30s °C 、 72 30s 30 °C 个循环, 72 2min V , 4°C保存), 扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供, 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 然后使用 Axygen公司的胶回收试剂盒纯化回收 350bp 处的条带。 结果见图 11。 1.3 构建 pWJl-araR重组质粒载体

使用 Xho I及 BsrGI分别酶切载体 pWJl 和 araR-targetron片段, 然后使用 Axygen公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物 。 将酶切后的 araR-targetron片 段与酶切后的载体片段使用 T4DNA连接酶连接,该连接反应在 16°C水浴锅中进行 10hr, 将获得的连接产物以 CaC12 热休克法转化大肠杆菌 DH5 α感受态细胞: 42 °C 热击 90sec, 然后添加 4 LB °C 液体培养基复苏 lhr, 然后将细胞以 4500rpm离心 5min, 涂布到含有 lOO g/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基平板上培 养 16-18hr。

对获得的菌落进行菌落 PCR (反应试剂由 Sigma- Aldrich的 TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供、条件: 95 5min, 94 °C 30s °C 、 55 30s °C 、 72 30s 30 个循环, 72 2min V , 4°C保存), 以检测 350bp的 targetron片段是 否连接入 pWJl载体中, PCR扩增引物为 IBS和 EBSld。 结果见图 12。

PCR检测结果显示, 菌落 PCR可以扩增出 350bp特异性条带。 随即挑取 PCR 呈阳性的菌落以 LB液体培养基扩培, 提取质粒。 然后, 以 dpIMPl-fw作为引物, 提取的质粒作为模板进行测序,结果如预期: targetron片段确已连接入 pWJl载体)。

2. 拜氏梭菌 araR突变株的构建、 检测与敲除质粒的丢失

将 pWJl-araR质粒电转拜氏梭菌 8052xylR/pIMPl-xylTptb (S卩 MM1643),复苏 过夜后, 取 200μ1细胞液涂布于加有 lO g/mL红霉素的 CGM平板上, 在厌氧箱内 37°C培养 48-72小时后, 挑取单菌进行菌落 PCR验证, 具体过程如下:

2.1 pWJl-ara 质粒电转入拜氏梭菌 8052

将拜氏梭菌 8052xylR/pIMPl-xylTptb于 CGM培养基平板上划线培养 48hr后, 挑取单菌落接入 5mL CGM液体培养基中培养 16hr, 再按 1%接种量接入 50mL CGM液体培养基中培养, 当培养菌体的 OD600达到 0.6-0.7之间时取出培养菌, 用于制备电转感受态细胞。 取 30mL菌液, 于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加入 30mL 4°C的 ETM缓冲液悬浮, 再于 4°C、 4500rpm离心 10min, 弃上清, 加 入 lmL 4°C的 ET缓冲液, 获得悬浮菌液。 取上述悬浮菌液 190 L, 加入 lO L (约 l〜3 g)pWJl-araR质粒 (冰上操作),混匀后转入电转杯中 (2mm直径),使用 Bio-Rad MicroPulser™电转仪电转, 电压 201.8kV, 其余参考使用手册, 电击后迅速加入常 温的 CGM培养基 lmL,于 37°C培养 8hr后,取 200 L细胞液涂布于加有 lO g/mL 红霉素的 CGM平板上, 于厌氧箱内 37°C培养约 2〜3天。

2.2 菌落的 PCR验证

pWJl-ara 质粒转化入拜氏梭菌 8052xylR/pIMPl-xylTptb中后,可能会将二类 内含子的部分序列插入到基因组的 araR基因中, 是否有内含子插入可以使用插入 位点上下游的引物, 通过菌落 PCR 加以验证 (未插入内含子的野生型菌将扩增出 825bp 的条带, 插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为 1.8Kb条带), 因此, 随机挑取两个转化子进行验证,其中,以拜氏 梭菌 NCIMB8052基因组为阴性对照, 具体过程如下:

PC 反应使用的引物为 araR-N159和 araR-C983;

ara -N159: TTTAGTACAAGAAGGCTGGAT (SEQ ID NO:59)

ara -C983 :CATTTGGCTGCTCTTATTCC ( SEQ ID NO:60)

PCR反应体系: 体系 100 μ ΐ; 10 X Taq Buffer 10 μ 1; dNTP(2 mM) 10 1; MgC12(25mM) 10 1; Taq酶 1 μ 1; 正向引物(lOOmM) 2 μ 1; 反向引物(lOOmM) 2 μ 1 ; 菌落 (牙签占取微量); 水 65 μ 1。

PCR反应条件: 95 5min °C ; 95 30s °C , 55 30s °C , 72 1.5min °C , 30个循环; 72 5min V 。

将 PCR反应获得的产物, 进行琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 13所示。 根 据图 13的结果, 得到的 7个转化子均为插入了内含子的突变体。

2.3 测序验证阳性转化子

随机挑取步骤 2.2中对应于图 2中的阳性转化子, 以加有 lO g/mL红霉素的 CGM液体培养基培养后, 抽提基因组。 以抽提的基因组为模板, 以 araR-N159和 araR-C983为引物对进行 PCR扩增, 回收扩增获得的 1.8kb DNA条带并测序。 测 序结果显示, 该序列的位点的 381-1295DNA为插入的内含子序列, 即内含子序列 精确地插入到预计的 540|541位点之间。 2.4 8052xyl araR/pIMP 1 -xylTptb /pWJl-ara 敲除质粒 pWJl -araR的丢失 将 3μ1 生长至对数生长期的转化子分别转接至 5ml CGM 无抗和含有红霉 素 (20 g/ml)的试管中, 12〜15 小时转接一次, 直至抗性试管不再生长为止, 此 过程需约 2 天, 将此时对应的无抗试管菌液涂板, 菌落 PCR、 测序验证 (同 2.2、 2.3)保 证 内 含 子 的 插 入 , 将 丢 失 敲 除 质 粒 的 突 变株命 名 为 8052xylRaraR/pIMPl-xylTptb (即 CIBTS0795 ), 用于后续的代谢工程改造。

3. NCIMB8052, 8052/pIMPl-Pptb, 8052xylR/pIMP 1 -xylTptb (MM 1643), 8052xyl araR/pIMP 1 -xylTptb(CIBTS0795)的发酵比较试验 对菌株 8052/pB!Pl- Pptb, NCIMB8052, 8052xylR/pIMPl-xylTptb (MM1643) ,

8052xylRaraR/pIMPl-xylTptb(CIBTS0795)分别划单菌, 株挑取 3个单菌至 0. 8毫 升 CGM培养基试管培养过夜后, 加 2毫升 CGM培养基, 3-6小时后, OD0. 6-1接种 10%到发酵培养基 A-JL中, 进行 48小时发酵。 发酵结果经过液相色谱分析得到如 下数据:

0小时培养基各组分含量 (克 /升)

48小时分析结果

从上表可得出结论, 8052xylRaraR/pIMPl-xylT较 8052xylR/pIMPl-xylT能显 著改善混糖培养基中阿拉伯糖的利用。

综上所述, 本发明提供的方法, 中断了拜氏梭菌中 xylR基因的表达和 /或增加 木糖转运蛋白的活力, 本发明提供的菌株中, xylR基因经二类内含子插入失活和 /或 xylT基因过量后的菌株利用木糖的能力显著提 , 同时转化生成的 ABE浓度 相应提高,在木质纤维素水解液发酵中也有类 似的表型, 因此该菌株有利用木质纤 维素水解液进行丙酮丁醇发酵的应用前景。 参考文献 1. Keis, S., . Shaheen, and D.T. Jones, Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp. no v. and Clostridium saccharobutylicum sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol, 2001. 51(Pt 6): p. 2095-103.

2. Parekh, Μ·, J. Formanek, and H.P. Blaschek, Development of a cost-effective glucose corn steep medium for production of butanol by Clostridium beijerinckii.

Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 1998. 21(4-5): p. 187-191.

3. Mitchell, W.J., Carbohydrate uptake and utilization by Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Anaerobe, 1996. 2(6): p. 379-384.

Lee, J. and H.P. Blaschek, Glucose uptake in Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 and the solvent-hyperproducing mutant BA101. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(11): p. 5025-31.

Stephens, C, et al, Regulation of D-xylose metabolism in Caulobacter crescentus by a Lacl-type repressor. J Bacteriol, 2007. 189(24): p. 8828-34.

Rodionov, D.A., A.A. Mironov, and M.S. Gelfand, Transcriptional regulation of pentose utilisation systems in the Bacillus/Clostridium group of bacteria. FEMS Microbiol Lett, 2001. 205(2): p. 305-14.

Heo, G.Y., et al., Deletion of xylR gene enhances expression of xylose isomerase in Streptomyces lividans TK24. J Microbiol Biotechnol, 2008. 18(5): p. 837-44.

Sizemore, C, et al" Regulation of Staphylococcus xylosus xylose utilization genes at the molecular level. J Bacteriol, 1992. 174(9): p. 3042-8.

Scheler, A., et al" Molecular cloning, structure, promoters and regulatory elements for transcription of the Bacillus licheniformis encoded regulon for xylose utilization. Arch Microbiol, 1991. 155(6): p. 526-34.

Xiao, Η·, et al., Confirmation and Elimination of Xylose Metabolism Bottlenecks in Glucose Phosphoenolpyruvate-Dependent Phosphotransferase System-Deficient Clostridium acetobutylicum for Simultaneous Utilization of Glucose, Xylose, and Arabinose. Appl Environ Microbiol, 2011. 77(22): p. 7886-95.

Ren, C, et al., Identification and inactivation of pleiotropic regulator CcpA to eliminate glucose repression of xylose utilization in Clostridium acetobutylicum. Metab Eng, 2010. 12(5): p. 446-54.

Pfaffl, M.W., A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res, 2001. 29(9): p. e45.