La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina. Específicamente se refiere a un método para la rápida proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente de células beta pancreáticas. También se refiere al medio de cultivo celular inductor de la prol iferación empleado en d icho método, a las células y poblaciones celulares obtenibles mediante el mismo y a los medicamentos que comprenden estas células o poblaciones celulares para su uso en terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tej idos derivados del endodermo, preferiblemente de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente de la diabetes mellitus.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El protocolo de Edmonton (Shapiro AMJ., et al., 2000, The New England Journal of Medicine, 343: 230-238) para el trasplante de islotes pancreáticos procedentes de donantes cadavéricos, ha demostrado ser una alternativa eficaz para el tratamiento de la diabetes mellitus, mediante terapia celular. Lamentablemente, el número de islotes pancreáticos que se aislan de los donantes cadavéricos es bajo y esto supone la necesidad de disponer de páncreas de 2-3 donantes cadavéricos para garantizar el éxito del trasplante de islotes. A pesar de que el número de donantes ha ido en aumento en los últimos años, su cantidad es claramente insuficiente para asegurar el trasplante de islotes a un número significativo de pacientes con diabetes. Una posible alternativa para superar este problema sería el desarrollo de protocolos que permitieran la proliferación de las células beta pancreáticas "in vitro" previamente a su trasplante. De esta manera, se aumentaría la masa de células beta a trasplantar.

Los protocolos que se han desarrollado hasta la fecha para aumentar la proliferación de las células beta se basan principalmente en modificar las condiciones de cultivo "in vitro". En este sentido, se modifican los factores de crecimiento o las matrices extracelulares que se añaden a los medios de cultivo (Beattie, GM., et al., 1997, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 82: 1852-1856). Sin embargo, estos procedimientos no han conseguido incrementar la proliferación de las células beta más allá de un 2% cada 24h. Además, muchos de estos protocolos conducen a una pérdida irrecuperable del fenotipo y la función de las células beta (Ouziel-Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 341 : 291 -298), lo que impide su posterior aplicación clínica.

Por otro lado, la desdiferenciación de las células epiteliales se ha asociado con un fenómeno denominado transición epitelio-mesénquima (EMT). Bajo ciertas condiciones de cultivo, las células beta pancreáticas pueden sufrir EMT, desdiferenciarse hacia células parecidas a fibroblastos, proliferar y finalmente ser rediferenciadas hacia células que expresan insulina y glucagón (Ouziel- Yahalom L, et al., 2006, Biochemical and Biophysical Research Communications, 341 : 291 -298; Gershengorn MC, et al., 2004, Science, 306: 2261 -2264). El EMT no induce propiedades multipotentes en las células beta pancreáticas desdiferenciadas, lo que indica que estas células retienen un potencial de diferenciación restringido y que, por tanto, son más susceptibles a rediferenciarse hacia células beta funcionales (Russ HA., et al., 2009, Píos One, 4: e6417).

Se ha comprobado que las señales enviadas por los vasos sanguíneos juegan un papel importante en la proliferación y la especificación de la identidad de las células hepáticas y pancreáticas (Lammert E., et al., 2001 , Science, 294: 564- 567). Esto en parte es debido a la secreción de factores de crecimiento y citoquinas por parte de las células del endotelio vascular (Johansson M., et al., 2006, Endocrinology, 147: 2315-2324), así como, por la matriz extracelular secretada por las mencionadas células (Nikolova G., et al., 2006, Developmental Cell, 10: 397-405). En resumen, aunque se han realizado esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de cultivo "in vitro" de las células beta pancreáticas, con el fin de conseguir un aumento en la densidad celular y disponer así de una cantidad suficiente de células para su transplante, dentro de los métodos de tratamiento basados en la terapia celular, continúa existiendo la necesidad de desarrollar métodos de cultivo "in vitro", que mejoren la proliferación de estas células. De esta manera se obtendrá una mayor masa celular en un menor periodo de tiempo, en relación a los métodos convencionales, y además, se evitará la pérdida del fenotipo y de la funcionalidad biológica de las células durante su expansión en cultivo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para la rápida proliferación "in vitro" de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente de células beta pancreáticas. También se refiere al medio de cultivo celular inductor de la proliferación empleado en dicho método, a las células y poblaciones celulares obtenibles mediante el mismo y a los medicamentos que comprenden estas células o poblaciones celulares para su uso en terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, preferiblemente de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente de la diabetes mellitus.

El método desarrollado en la invención consiste en el establecimiento de un cultivo enriquecido en células derivadas de tejidos de origen endodérmico, preferiblemente en células beta pancreáticas o hepatocitos, mediante el cultivo de las mismas en presencia de un medio de cultivo celular inductor de la proliferación, y su posterior cocultivo con células endoteliales inactivadas. Este método permite una rápida proliferación de las células endodérmicas "in vitro", evitando su desdiferenciación completa y, por ende, su pérdida de funcionalidad. Como se muestra en los ejemplos de la presente invención, las células obtenibles mediante este método de proliferación celular "in vitro" presentan un fenotipo de células precursoras endocrinas. La tasa de proliferación de las células beta pancreáticas adultas murinas es del 0,5-1 % y cuando se las fuerza a proliferar no se consigue un incremento mayor del 10% y a expensas de la pérdida de su fenotipo de células beta. Mediante este método de proliferación celular "in vitro" de la invención se ha conseguido pasar de un cultivo en condiciones control con un 69 ± 3% de células beta, a un cultivo con un 98 ± 2% de células beta en aproximadamente 14 días. Asimismo, el incremento de la proliferación celular observado para las células beta es de 4,02 ± 0,3 veces y de 2,8 ± 0,2 veces para los hepatocitos. Esto quiere decir que el método de proliferación celular "in vitro" de la invención permite expandir la masa de células beta pancreáticas, y en general, de células procedentes de tejidos de origen endodérmico, por encima de los protocolos existentes y además conservando su fenotipo, lo cual es de especial relevancia en terapia celular de enfermedades tales como la diabetes, donde el principal problema es la falta de células beta pancreáticas para transplantar. Por ello, un aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo celular DMEM, de ahora en adelante "medio de cultivo de la invención" o "medio de cultivo inductor de la proliferación", suplementado con: a. entre el 4% y el 10% de suero fetal de ternera o "calf serum" o "CF", b. entre 90 y 1 10 U/ml de penicilina y entre 80 y 120 g/ml de estreptomicina,

c. entre 0,5 y 2 mM de piruvato sódico,

d. entre 0,05 y 0,2 mM de 2-beta-mercaptoetanol,

e. entre 0,05 y 0,2 pg/ml de hidrocortisona,

f. entre 4 g-4 g-4 ng/ml y 6 g-6 g-6 ng/ml de insulina-transferrina- selenio,

g. entre 900 y 1 .100 U/ml de factor inhibidor de leucemia o "LIF", h. entre 1 y 2 mM de EGTA,

i. entre el 0,5% y el 2% de aminoácidos no esenciales, y

j. entre 9 y 1 1 ng/ml de factor de crecimiento epidermal o "EGF".

El medio "DMEM" o "Dulbecco's modified Eagle's médium" es un medio de cultivo celular para el crecimiento de células de mamífero cuya composición es conocida por un experto en la materia. En una realización preferida, este medio DMEM comprende entre 0,5 g/l y 1 ,5 g/l de glucosa. En una realización más preferida de este aspecto de la invención el medio DMEM comprende 1 g/l de glucosa, concentración que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se ha demostrado óptima para el cultivo de células beta pancreáticas.

Para el cultivo de otros tipos celulares procedentes de tejidos de origen endodérmico, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, de hepatocitos, la concentración de DMEM que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se ha demostrado óptima para el cultivo celular es de 4,5 g/l de glucosa. Por tanto, en otra realización preferida, el medio DMEM comprende 4,5 g/l de glucosa cuando va a ser empleado, por ejemplo pero sin limitarnos, para el cultivo de hepatocitos. En una realización más preferida, para dicho cultivo de hepatocitos se emplea DMEM 4,5 g/l de glucosa con glutamax (entre 2 y 4 mM), piruvato sódico (entre 0,1 y 1 mM) y hepes (entre 10 y 20 mM), suplementado con los elementos (a) a (h) del medio de cultivo de la invención. "Glutamax" es un medio de cultivo celular de composición conocida por un experto en la materia y formado por L-alanil-L-glutamina. El "piruvato" es el anión carboxilato del ácido pirúvico. El "hepes" es el ácido N-2- hidroxietilpiperacina-N'-2'-etanesulfónico.

El EGTA es el compuesto químico de número CAS 67-42-5. Los aminoácidos no esenciales que podrían ser empleados en el medio de cultivo de la invención son, preferiblemente, glicina, L-alanina, L-asparragina, L-ácido aspártico, L-ácido glutámico, L-prolina y L-serina.

En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende DMEM 1 g/l de glucosa suplementado con: un 5% de suero fetal de ternera, 100 U/ml-100 pg/ml de penicilina-estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, un 1 % de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de 2-beta-mercaptoetanol, 0,1 pg/ml de hidrocortisona, 5 g-5 g-5 ng/ml de insulina-transferrina-selenio, 1 .000 U/ml de factor inhibidor de leucemia, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidermal y 1 ,5 mM de EGTA, cantidades que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se han demostrado óptimas para el cultivo de células beta pancreáticas.

En otra realización preferida, el medio de cultivo de la invención comprende DMEM 4,5 g/l de glucosa, glutamax (2 mM), piruvato sódico (1 mM) y hepes (10 mM), suplementado con: un 10% de suero fetal de ternera, 100 U/ml-100 g/ml de penicilina-estreptomicina, 0,1 mM de 2-beta-mercaptoetanol, 0,1 g/ml de hidrocortisona, 5 g-5 g-5 ng/ml de insulina-transferrina-selenio, 1 .000 U/ml de factor inhibidor de leucemia y 1 ,5 mM de EGTA, cantidades que, como muestran los ejemplos de la presente invención, se han demostrado óptimas para el cultivo de hepatocitos.

Las cantidades óptimas de cada uno de los elementos con los que se suplementa el medio de cultivo de la invención pueden variar dentro de unos rangos experimentalmente razonables dependiendo del tipo celular a cultivar, por ello se ajustarán experimentalmente las cantidades de tales elementos, así como los parámetros físico-químicos del cultivo, en función del tipo celular derivado de un tejido de origen endodérmico a cultivar.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: a. aislar las células de una muestra biológica aislada de un tejido de origen endodérmico de un mamífero mediante un protocolo de digestión con colagenasa,

b. cultivar las células aisladas en el paso (a) en presencia del medio de cultivo de la invención durante 70-74 horas,

c. añadir al cultivo del paso (b) células endoteliales inactivadas, y d. cocultivar el cultivo del paso (b) y las células endoteliales inactivadas añadidas en el paso (c) durante 10-12 días.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la densidad de las células cultivadas en el paso (b) es de entre 90.000 y 1 10.000 células/cm ² al inicio del cultivo. En una realización más preferida, la densidad de las células cultivadas en el paso (b) es de 100.000 células/cm ² al inicio del cultivo. En otra realización preferida, la densidad de las células endoteliales inactivadas del paso (c) es de entre 50.000 y 70.000 células/cm ² en el momento de su adición al cultivo del paso (b). En una realización más preferida, la densidad de las células endoteliales inactivadas del paso (c) es de 60.000 células/cm ² en el momento de su adición al cultivo del paso (b).

En otra realización preferida, el tejido de origen endodérmico del paso (a) es tejido pancreático. En una realización más preferida, la muestra biológica aislada del paso (a) es un islote de Langerhans. En una realización aun más preferida, las células aisladas en el paso (a) son células beta pancreáticas. En otra realización preferida, las células endoteliales inactivadas del paso (c) proceden de la línea celular Mil Seven 1 .

En otra realización preferida, el tejido de origen endodérmico del paso (a) es tejido hepático. En una realización más preferida, las células aisladas en el paso (a) son hepatocitos. En una realización aun más preferida, las células endoteliales inactivadas del paso (c) proceden del hígado. En la presente invención se entiende por "tejidos de origen endodérmico" aquellos tejidos que forman parte de los órganos seleccionados de la lista que comprende: páncreas, tráquea, bronquios, pulmones, hígado, vejiga, aparato digestivo, tiroides, timo, cavidad timpánica, tubo auditivo, amígdalas o paratiroides. Una "célula procedente de un tejido de origen endodérmico" es cualquier célula comprendida en dichos tejidos endodérmicos.

Una muestra biológica aislada incluye, pero sin limitarnos a tejidos y/o fluidos biológicos procedentes de un tejido de origen endodérmico de un mamífero, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. Asimismo, la muestra biológica aislada puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, fresca o congelada. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un tejido de origen endodérmico de un mamífero procede de un humano, más preferiblemente de un cadáver de un humano.

El aislamiento de las células de la muestra biológica aislada del paso (a) se realiza mediante un protocolo de digestión con colagenasa. Los protocolos de digestión con colagenasa para el aislamiento de células son conocidos en el estado de la técnica. Así, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el caso de que el tejido de origen endodérmico del paso (a) del método de la invención sea tejido hepático, el protocolo de aislamiento de hepatocitos es el protocolo de Seglen (Seglen, P.O., 1976, Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 4: 29-83). En el caso de que el tejido de origen endodérmico del paso (a) del método de la invención sea tejido pancreático y la muestra biológica aislada procedente del mismo sean islotes de Langerhans, dicho protocolo de digestión con colagenasa para el aislamiento de islotes pancreáticos es, preferiblemente, el protocolo desarrollado por Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetología, 10: 431 -438) con las modificaciones que se explican a continuación. Así, en otra realización preferida, el protocolo de digestión con colagenasa del paso (a) del método de la invención, de ahora en adelante "protocolo de digestión de la invención", comprende: a. preparar una solución que comprende 1 15 mM NaCI, 5 mM KCI, 10 mM NAHCOs, 1 ,1 mM MgCI ₂ , 1 ,2 mM NaH ₂ PO ₄ , 1 mM CaCI ₂ , entre 0,5 y 1 mM de glucosa y entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, a 4 ^o C y pH 7,3, b. añadir entre 5 y 8 mg de colagenasa tipo V a entre 6 y 10 mi de la solución del paso (a), c. colocar el páncreas, previamente extraído de un mamífero al que se le han inyectado entre 2,5 y 5 mi de la solución del paso (b), en un recipiente con entre 5 y 9 mi de colagenasa,

d. incubar a 37 °C el recipiente del paso (c) y agitarlo durante 15 segundos en los minutos 5, 7 y 9,

e. detener la incubación del paso (d) en el minuto 10 mediante la adición de entre 3 y 6 mi de la solución del paso (a),

f. centrifugar dos veces la solución obtenida en el paso (e) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante en cada centrifugado,

g. aislar los islotes pancreáticos presentes en la solución obtenida en el paso (f), mediante pesca manual con una pipeta y bajo una lupa estereoscópica, y colocarlos en un recipiente con la solución del paso (a),

h. añadir al recipiente del paso (g) una solución tampón fosfato que comprende entre 0,5% y 3% de albúmina bovina, entre 1 y 3 mM glucosa y 1 ,1 mM MgCI ₂ ,

i. centrifugar la solución del paso (h) a 50 g durante entre 1 y 3 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante,

j. añadir a la solución obtenida en el paso (i) entre 2 y 4 mi de una solución de disociación de células no enzimática a 37° C,

k. incubar a 37° C durante 8 minutos la solución del paso (j) y dispersar mecánicamente los islotes pancreáticos de la solución mediante 10 pipéteos en los minutos 2, 4 y 6 de dicha incubación,

I . añadir entre 0,5 y 1 ,5 mi de una solución de tripsina-EDTA a la solución del paso (k) durante el último minuto de la incubación,

m. añadir entre 3 y 6 mi de medio de cultivo DMEM a la solución obtenida en el paso (I),

n. centrifugar la solución del paso (m) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante,

o. añadir a la solución obtenida en el paso (n) entre 1 y 2 mi del medio de cultivo del paso (m),

p. filtrar la solución obtenida en el paso (o) a través de una malla de 70 μηη,

q. centrifugar el filtrado obtenido en el paso (p) a 200 g durante entre 3 y 5 minutos a temperatura ambiente, y

r. sembrar las células obtenidas tras la centrifugación del paso (q). En el paso (a) del protocolo de digestión de la invención se prepara una solución de aislamiento de islotes, la cual debe estar, preferiblemente, a 4 ^o C. La composición del buffer de dicha solución es preferiblemente (en mM): 1 15 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCO ₃ , 1 ,1 MgCI ₂ , 1 ,2 NaH ₂ PO ₄ , 1 CaCI ₂ y entre 0,5 y 1 glucosa, preferiblemente 0,5 mM de glucosa. A esta solución se le añade entre un 0,5% y un 3% de albúmina bovina, preferiblemente un 0,5% de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, albúmina bovina Sigma, y se ajusta su pH a 7,3. Se toman entre 6 y 10 mi, preferiblemente 8 mi, de esa solución y se le añaden entre 5 y 8 mg, preferiblemente 6,3 mg, de colagenasa tipo V, por ejemplo, aunque sin limitarnos, de Sigma (actividad de la colagenasa 533 unidades/mg). Se inyectan entre 2,5 y 5 mi, preferiblemente 3 mi, de la solución fría de colagenasa (solución del paso (b) del protocolo de digestión de la invención) en el colédoco de un mamífero y tras hincharse el páncreas, lo más rápidamente posible se extrae el mismo, removiendo el tejido graso y el tejido conectivo. Posteriormente, en el paso (c) del protocolo de digestión de la invención, el páncreas se coloca en un recipiente, preferiblemente en un tubo, con entre 5 y 9 mi, preferiblemente 7 mi, de colagenasa. A continuación, en el paso (d) de este protocolo, el tubo con el páncreas se introduce en un baño de incubación a 37° C. El páncreas se agita vigorosamente con la mano, durante 15 segundos, en los minutos 5, 7 y 9. La incubación se detiene, en el paso (e) de este protocolo, en el minuto 10 mediante la adición de entre 3 y 6 mi, preferiblemente 5 mi, de solución de aislamiento a 4 ^o C, sin colagenasa (solución del paso (a) del protocolo de digestión de la invención). La solución resultante se centrifuga 2 veces a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente, en el paso (f) de este protocolo. En cada centrifugado, el sobrenadante se elimina. Finalmente, en el paso (g) del protocolo de digestión de la invención, los islotes pancreáticos presentes en la solución obtenida en el paso (f) se aislan mediante pesca manual usando una pipeta, bajo una lupa de disección estereoscópica, y se colocan en un recipiente, preferiblemente en una placa petri, con solución de aislamiento sin colagenasa fría (solución del paso (a) del protocolo de digestión de la invención). Los islotes pancreáticos que no estén com pletamente separados del tej ido exocri n o o e l tej i d o va sc u l a r se diseccionan manualmente, preferiblemente con dos jeringas de insulina. Tras el aislamiento de los islotes pancreáticos estos se lavan, en el paso (h) del protocolo de digestión de la invención, añadiendo una solución tampón fosfato, preferiblemente una solución tampón fosfato Dulbbeco, que comprende entre un 0,5% y un 3%, preferiblemente un 1 %, de albúmina bovina, entre 1 y 3 mM, preferiblemente 2,5 mM, de glucosa y 1 ,1 mM MgC , al recipiente del paso (g) comprendiendo los islotes. Los islotes en esta solución de lavado se centrifugan una vez a 50 g, durante entre 1 y 3 minutos, preferiblemente durante 1 minuto, a temperatura ambiente, en el paso (i) del protocolo de digestión de la invención, y se elimina el sobrenadante. Posteriormente, en el paso (j) de este protocolo, se añaden entre 2 y 4 mi, preferiblemente 3 mi, de una solución, a 37° C, de disociación de células no enzimática, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la solución de disociación de células no enzimática Sigma, n° de catálogo C5914. A continuación, la solución obtenida en el paso (j) se incuba durante 8 minutos en un baño de incubación a 37° C, en el paso (k) del protocolo de digestión de la invención. Durante el tiempo de incubación, los islotes se dispersan mecánicamente mediante pipeteo de 10 veces consecutivas, con una pipeta de preferiblemente 1 mi, en los minutos 2, 4 y 6 de dicha incubación. El pipeteo debe de ser suave y con cuidado de no ocasionar burbujas. Durante el último minuto de la incubación se añaden entre 0,5 y 1 ,5 mi, preferiblemente 1 mi, de una solución de tripsina-EDTA, como por ejemplo, aunque sin limitarnos la solución tripsina-EDTA (Gibco) 0,1 x y se continúa con la dispersión mecánica mediante el pipeteo, en el paso (I) del protocolo de digestión de la invención. Para detener el proceso de disociación de los islotes pancreáticos en células, en el paso (m) de este protocolo se añaden entre 3 y 6 mi, preferiblemente 5 mi, de medio de cultivo DMEM, por ejemplo aunque sin limitarnos, DMEM (Gibco), conteniendo 4,5 g/l de glucosa y su plementado con 1 0% de suero fetal bovino, por ejemplo, au nq ue sin limitarnos, suero fetal bovino (Hyclone). Posteriormente, en el paso (n) de este protocolo, la suspensión celular comprendida en la solución del paso (m) se centrifuga a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente, se elimina el sobrenadante y se añade, en el paso (o), entre 1 y 2 mi, preferiblemente 1 mi, del medio de cultivo anterior añadido también en el paso (m). Después, en el paso (p), la suspensión celular se filtra a través de una malla de 70 μιτι, por ejemplo, aunque sin limitarnos, una malla Becton Dickinson, preferiblemente usando una pipeta de 1 mi y a alta velocidad. Tras la filtración, la suspensión celular se centrifuga de nuevo, en el paso (q), a 200 g durante entre 3 y 5 minutos, preferiblemente durante 5 minutos, a temperatura ambiente y finalmente las células se siembran en el paso (r) del protocolo de digestión de la invención. Los tiempos y cantidades de productos comprendidos en el protocolo de digestión de la invención podrán variar dentro de unos rangos experimentalmente razonables, debido a las posibles variaciones inherentes a la puesta en práctica de dicho método.

Para llevar a cabo el cultivo del paso (b) del método de la invención, las células aisladas en el paso (a) se siembran, preferiblemente a una densidad celular de entre 90.000 y 1 10.000 células/cm ² , y más preferiblemente a una densidad celular de 100.000 células/cm ² , en un recipiente de cultivo, como por ejemplo pero sin limitarnos, en una placa de cultivo, preferiblemente, de bajo volumen y, más preferiblemente, con superficie de plástico adherente, y en presencia del medio de cultivo celular de la invención, durante 70-74 horas y preferiblemente durante 72 horas. Transcurrido este periodo de tiempo se añaden al cultivo del paso (b) células endoteliales inactivadas. Se entiende por "células endoteliales" las células aplanadas que recubren el interior de los vasos sanguíneos y sobre todo de los capilares, formando parte de su pared, cuyo núcleo presenta una morfología aplanada y aparece elíptico en los cortes visualizados al microscopio. Las "células endoteliales inactivadas" son aquellas células endoteliales que han perdido su capacidad mitótica. Las células endoteliales del paso (c) del método de la invención proceden, preferiblemente, de la l ínea celular Mil Seven 1 (MS 1 ), conocida por un experto en la materia y disponible, por ejemplo, aunque sin l imitarnos, en la American Type Culture Collection (número de catálogo CRL-2279), cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. Si las células aisladas en el paso (a) son hepatocitos, entonces las células endoteliales que se empleen procederán, por ejemplo, aunque sin limitarnos, del propio hígado. Células endoteliales inactivadas pueden obtenerse mediante, por ejemplo aunque sin limitarnos, el cultivo "in vitro" de las células endoteliales con mitomicina C, preferiblemente en una cantidad de entre 2 y 3 pg/ml , y más preferiblemente en una cantidad de 2,5 pg/ml, durante preferiblemente entre 2 y 3 horas, y más preferiblemente durante 2 horas.

Las células endoteliales inactivadas se añaden en el paso (c) del método de la invención al cultivo del paso (b), preferiblemente, a una densidad de entre 50.000 y 70.000 células/cm ² , y más preferiblemente a una densidad de 60.000 células/cm ² . Dicha densidad celular se puede alcanzar, para el caso de las células procedentes de la l ínea celular MS 1 , cultivando dichas células, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en un medio de cultivo DMEM 4,5 g/l glucosa suplementado con entre 3-6% de suero fetal bovino, preferiblemente con 5% de suero fetal bovino.

En el paso (d) del método de la invención, las células endoteliales inactivadas y las células cultivadas en el medio de cultivo de la invención en el paso (b) se cocultivan durante 10-12 días, preferiblemente, durante 1 1 días. Como muestran los ejemplos de la presente invención, tras este periodo de cocultivo se obtienen colonias celulares que proliferan con gran rapidez y que presentan marcadores de precursores endocrinos, lo que demuestra la viabilidad del método de la invención así como el hecho de que las células obtenidas no han perdido su fenotipo.

El término "páncreas" se refiere al órgano glandular ubicado en los sistemas digestivo y endocrino de los vertebrados. Es a la vez, una glándula endocrina (produce insulina, glucagón y somatostatina), y una glándula exocrina (segrega jugo pancreático que contiene enzimas digestivas que pasan al intestino delgado). Tiene forma cónica y en la especie humana, su longitud oscila entre 20 y 30 cm, tiene una anchura de aproximadamente unos 4 cm y un grosor de aproximadamente 5 cm; con un peso de aproximadamente 30 g. Un "tejido pancreático" es cualquier tejido que forme parte de este órgano.

Por "islote de Langerhans" o "islote pancreático" se entiende los acúmulos de células que se encargan de producir preferentemente hormonas como la insulina y el glucagón, con función netamente endocrina. También secretan otras hormonas y péptidos. Forman pequeños grupos celulares de unas 1 .500 a 3.000 células, dispersos por todo el páncreas. En los cortes teñidos con hematoxilina-eosina tienen el aspecto de islotes irregulares de color rosa pálido distribuidos extensamente entre los acinos exocrinos de color más oscuro.

Las "células beta pancreáticas" son un tipo de células del páncreas localizadas en los islotes de Langerhans que sintetizan y segregan insulina.

El método de la invención permite obtener una población celular expandida "in vitro" de células beta pancreáticas a partir de células beta pancreáticas aisladas de un islote de Langerhans o a partir de islotes de Langerhans aislados obtenidos a partir de un páncreas aislado o parcialmente aislado. Además de los pasos especificados anteriormente en el método de la invención, dicho método podría comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en relación al aislamiento de células del paso (a).

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante "célula endodérmica de la invención". En una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula endodérmica de la invención es una célula beta pancreática, de ahora en adelante "célula beta pancreática de la invención". En otra realización preferida, la célula endodérmica de la invención es un hepatocito, de ahora en adelante "hepatocito de la invención".

Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular obtenible mediante el método de la invención, de ahora en adelante "población celular endodérmica de la invención". En una realización preferida, la población celular endodérmica de la invención esta formada por células beta pancreáticas, de ahora en adelante "población celular beta pancreática de la invención". En otra realización preferida, la población celular endodérmica de la invención esta formada por hepatocitos, de ahora en adelante "población de hepatocitos de la invención".

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular endodérmicas de la invención, preferiblemente de la célula beta pancreática o de la población celular beta pancreática, del hepatocito o de la población de hepatocitos de la invención, para la elaboración de un medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular endodérmicas de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula o de la población celular beta pancreáticas de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades del páncreas. En una realización preferida de este aspecto de la invención la enfermedad del páncreas es la diabetes mellitus. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del hepatocito o de la población de hepatocitos de la invención para la elaboración de un medicamento para terapia celular somática de lesiones o enfermedades del hígado. La célula endodérmica de la invención es una célula beta pancreática cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. La población celular endodérmica de la invención esta formada por células beta pancreáticas cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son células beta pancreáticas. La célula endodérmica de la invención es un hepatocito cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son hepatocitos. La población celular endodérmica de la invención está formada por hepatocitos cuando las células aisladas en el paso (a) del método de la invención son hepatocitos. El término "medicamento", tal y como se usa en esta descripción, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el diagnóstico, el alivio, el tratamiento o la curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una preparación que comprenda, al menos, la célula o la población celular endodérmicas obtenibles mediante el método de la invención, la célula o la población celular beta pancreáticas obtenibles mediante el método de la invención o el hepatocito o la población de hepatocitos obtenibles mediante el método de la invención. El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención, supone combatir los efectos causados como consecuencia de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, preferiblemente, de lesiones o enfermedades del páncreas, más preferiblemente, de diabetes mellitus, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores.

Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas pueden haber sido alteradas como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades fu ncionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.

Las células, así como las poblaciones celulares, obtenibles mediante el método de la invención pueden ser empleadas para, por ejemplo, pero sin limitarnos, la prevención y/o regeneración de lesiones tisulares mediante su trasplante al órgano dañado, así como de enfermedades metabólicas o genéticas. Dichas células y poblaciones celulares pueden ser empleadas en terapia celular junto con uno o más compuestos, medicamentos o células útiles para la prevención o el tratamiento de lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo, de manera simultánea o secuencial.

En la presente invención se entiende por "lesiones o enfermedades de tejidos derivados del endodermo" todas aquellas lesiones o enfermedades metabólicas o genéticas que afecten o que se produzcan en tejidos derivados del endodermo.

Una de las "lesiones o enfermedades del páncreas" para la cual podrían ser útiles los medicamentos de la presente invención es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la diabetes mellitus.

El término "diabetes mellitus" se refiere al grupo de trastornos metabólicos que afecta a diferentes órganos y tejidos, dura toda la vida y se caracteriza por un aumento de los niveles de glucosa en la sangre: hiperglicemia. Es causada por varios trastornos, incluyendo la baja producción de la hormona insulina, secretada por las células beta pancreáticas, la ausencia o disminución significativa de la masa de células beta y/o por el aumento de la resistencia a la insulina. Los síntomas principales de la diabetes mellitus son: emisión excesiva de orina (poliuria), aumento anormal de la necesidad de comer (polifagia), incremento de la sed (polidipsia) y pérdida de peso sin razón aparente. Dentro de este término se incluyen los tipos de diabetes mellitus seleccionados de la lista que comprende: diabetes mellitus tipo 1 , diabetes mellitus tipo 2, diabetes gestacional u otros tipos de diabetes mellitus.

Las "lesiones o enfermedades del hígado" para las cuales podrían ser útiles los medicamentos de la presente invención son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cirrosis, hepatitis A, B o C, cáncer de hígado, hepatocarcinoma, carcinoma hepatocelular o hepatoma, hemocromatosis, isquemia hepática o hepatopatía o enfermedad hepática.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, de ahora en adelante "kit de la invención", que comprende el medio de cultivo celular de la invención. En una realización preferida, el kit de la invención además comprende células endoteliales inactivadas. En una realización más preferida el kit de la invención además comprende todos los elementos necesarios para llevar a cabo el protocolo de digestión de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico.

Dicho kit puede comprender, sin ningún tipo de limitación, medios de cultivo, sueros, factores que favorezcan el crecimiento de células en cultivo, como aminoácidos, antibióticos, citoquinas, etc., tampones, reactivos, agentes para prevenir la contaminación. Puede comprender, además, cebadores, sondas, polimerasas, anticuerpos, reactivos, etc. y, en general, los medios necesarios para llevar a cabo la caracterización celular. Por otro lado el kit puede incluir métodos y medios necesarios para llevar a cabo la extracción, purificación, etc. de ácidos nucleicos y/o proteínas. También podría incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el kit contendrá elementos necesarios para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico, por la técnica que se ha descrito anteriormente. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Muestra el enriquecimiento en el cultivo de células beta pancreáticas en presencia del medio inductor de la proliferación. Las células que aparecen en la figura son positivas para insulina. A: islotes pancreáticos murinos cultivados 72h en medio de cultivo control. B: cultivo enriquecido de células beta, cultivados 72h en el medio de cultivo inductor de la proliferación. C: gráfica mostrando el porcentaje de células alfa y beta de los cultivos para las condiciones A y B. Los controles se refieren a la condición A y el protocolo a la condición B. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. ^* p< 0,001 control vs protocolo. Barra= 500 μιτι.

Fig. 2. Muestra la formación de colonias de rápido crecimiento de células beta a distintos días de cultivo, tras el co-cultivo con las células endoteliales inactivadas. Se trata de una imagen de contraste de fase. A: formación de colonias tras 6 días de cultivo. B: formación de colonias tras 10 días de cultivo. C: gráfica mostrando el incremento de la proliferación en las colonias a los 6 y 10 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. ^* p< 0,001 6 días vs 10 días. Barra= 50 μηη.

Fig. 3. Muestra la formación de colonias de rápido crecimiento de hepatocitos a distintos días de cultivo, tras el co-cultivo con las células endoteliales inactivadas. Se trata de una imagen de contraste de fase. A: formación de colonias tras 6 días de cultivo. B: formación de colonias tras 10 días de cultivo. C: gráfica mostrando el incremento de la proliferación en las colonias a los 6 y 10 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0,001 6 días vs 10 días. Barra= 50 μιτι.

Fig. 4. Muestra la incorporación de BrdU en islotes cultivados en medio de cultivo control (control) y en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 10 días. A: Las células que se replican incorporan BrdU. Se trata de una colonia tras 10 días de cultivo. En esta imagen hay una superposición de una imagen de fluorescencia con una en contraste de fase. B: Gráfica mostrando el nivel de incorporación de BrdU en islotes cultivados en medio de cultivo control (control) y en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 10 días. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 10 realizados. *p< 0.001 control vs protocolo. Barra= 50 μιτι. Fig. 5. Muestra una imagen de inmunofluorescencia en islotes cultivados en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 14 días. En la imagen se ven células positivas para insulina y células positivas para citoqueratina 19. Los núcleos aparecen marcados con DAPI. Se trata de una colonia tras 14 días de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 3 realizados. Barra= 50 μιτι.

Fig. 6. Muestra una imagen de inmunofluorescencia en islotes cultivados en el medio inductor de la proliferación (protocolo), durante 14 días. En la imagen se ven células positivas para neurogenina 3 y células positivas para citoqueratina 19. Los núcleos aparecen marcados con DAPI. Se trata de una colonia tras 14 d ías de cultivo. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 3 realizados. Barra= 50 μιτι.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método para la obtención de células a partir de tejidos aislados de origen endodérmico desarrollado en la invención. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1. Proliferación "in vitro" de células beta procedentes de islotes pancreáticos.

Se aislaron islotes pancreáticos mediante el protocolo de aislamiento de islotes desarrollado por Lernmark (Lernmark A., 1974, Diabetología, 10: 431 -438) con una modificación, mediante digestión con colagenasa, de la cepa de ratón OF1 , machos de 8-12 semanas de edad y de 35-40 g. En primer lugar se preparó una solución de aislamiento de islotes. Esta solución estaba a 4 ^o C. La composición del buffer de la solución era (en mM): 1 15 NaCI, 5 KCI, 10 NAHCOs, 1 ,1 MgCI ₂ , 1 ,2 NaH ₂ PO ₄ , 1 CaCI ₂ y 0,5 glucosa. A esta solución se le añadió un 0,5% albúmina bovina (Sigma) y se ajustó su pH a 7,3. Se tomaron 8 mi de esa solución y se le añadieron 6,3 mg de colagenasa tipo V de Sigma (actividad de la colagenasa 533 unidades/mg). Se inyectaron 3 mi de la solución fría de colagenasa en el colédoco del animal y tras hincharse el páncreas, lo más rápidamente posible se extrajo el mismo, removiendo el tejido graso y el tejido conectivo. Posteriormente, el páncreas se colocó en un tubo con 7 mi de colagenasa. A continuación, el tubo con el páncreas se introdujo en un baño de incubación a 37° C. El páncreas se agitó vigorosamente con la mano, durante 15 segundos, en los minutos 5, 7 y 9. La incubación se detuvo en el minuto 10 mediante la adición de 5 mi de solución de aislamiento a 4 ^o C, sin colagenasa. La suspensión resultante se centrifugó 2 veces a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente. En cada centrifugado, el sobrenadante se eliminó. Finalmente, usando una pipeta, los islotes se pescaron manualmente bajo una lupa de disección y se colocaron en una placa petri, con solución de aislamiento sin colagenasa fría. Los islotes que no estaban completamente sepa rados d e l tej ido exocri no o d el tejido vascular se diseccionaron manualmente con dos jeringas de insulina. Tras el aislamiento de los islotes estos se lavaron en una solución tampón fosfato Dulbbeco que contenía 1 % de albúmina bovina, 2,5 mM glucosa y 1 ,1 mM MgCI ₂ . Los islotes en esta solución de lavado se centrifugaron una vez a 50 g, durante 1 minuto, a temperatura ambiente. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 3 mi de una solución, a 37° C, de disociación de células no enzimática (Sigma, n° de catálogo C5914). A continuación, los islotes fueron incubados durante 8 minutos en un baño de incubación a 37° C. Durante el tiempo de incubación, los islotes se dispersaron mecánicamente mediante pipeteo de 10 veces consecutivas, con una pipeta de 1 mi, en los minutos 2, 4 y 6. El pipeteo debe de ser suave y con cuidado de no ocasionar burbujas. Durante el último minuto de la digestión se añadió 1 mi de una solución de tripsina-EDTA (Gibco) 0,1 x y se continuó con la dispersión mecánica mediante el pipeteo. Para detener el proceso de disociación de los islotes pancreáticos en células, se añadieron 5 mi de med io de cultivo DM EM (G ibco), conten iendo 4 ,5 g/l de gl ucosa y suplementado con 1 0% de suero fetal bovino (Hyclone). Posteriormente, la suspensión celular se centrifugó a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y se añadió 1 mi del medio de cultivo anterior. Después, la suspensión celular se filtró a través de una malla de 70 μιτι (Becton Dickinson) usando una pipeta de 1 mi y a alta velocidad. Tras la filtración, la suspensión celular se centrifugó de nuevo a 200 g durante 5 minutos, a temperatura ambiente. Finalmente, las células se sembraron en placas de cultivo de bajo volumen, con superficie de plástico adherente (Greiner, n° de catálogo 627170). Las células se sembraron en 60 μΙ por pocilio, a una densidad de 100.000 células/cm ² .

Los islotes y las células disociadas se cultivaron en presencia de distintos medios, durante 72h. Los islotes se cultivaron en medio control (Figura 1 A), el cual consistía en DMEM 1 g/l glucosa (Gibco), suero fetal de ternera 5% (Hyclone), penicilina-estreptomicina 100 U/ml-100 g/ml (Gibco). Las células disociadas se cultivaron en el medio inductor de la proliferación (Figura 1 B). Este medio llevaba DMEM 1 g/l glucosa (Gibco), suero fetal de ternera 5% (Hyclone), penicilina-estreptomicina 100 U/ml-100 g/ml (Gibco), piruvato sódico 1 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales 1 % (Gibco), 2-beta- mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco), hidrocortisona 0,1 g/ml (Sigma), insulina- transferrina-selenio 5 g-5 g-5 ng/ml (Roche), factor inhibidor de leucemia recombinante de ratón 1 .000 U/ml (Chemicon), factor de crecimiento epidermal 10 ng/ml (Sigma) y EGTA 1 mM (Sigma). Tras 72h de cultivo se realizó una inmunofluorescencia para detectar células positivas para insulina. Como anticuerpo primario se usó anti-insulina monoclonal (Sigma, número de catálogo 12018), a una dilución 1/400. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1 /400. Los datos mostraron cómo el empleo del método de cultivo mediante el medio inductor de la proliferación aquí descrito o protocolo, permite obtener un cultivo prácticamente puro en células beta pancreáticas (Figura 1 C). Se consiguió pasar así de un cultivo en condiciones controles con un 69 ± 3% de células beta, a un cultivo en el protocolo de la invención con un 98 ± 2% de células beta (n= 10, p<0,001 ). Con respecto a las células alfa se consiguió pasar de un cultivo en condiciones control de 23 ± 3% de células alfa, a un cultivo en el protocolo de la invención con un 2 ± 1 % de células alfa (n= 10, p<0,001 ).

Posteriormente, al cultivo celular enriquecido en células beta, tras 3 días de cultivo en el medio inductor de la proliferación, se le añadieron 60.000 células/cm ² de la línea celular Mil Seven 1 (MS 1 ). Se trata de una l ínea celular de endotelio capilar que se adquirió a la American Type Culture Collection (número de catálogo CRL-2279). Previamente, esta l ínea celular se inactivo cultivándola con 2,5 g/ml de mitomicina C (Sigma) durante 2h. El medio de cultivo de la l ínea era DMEM 4,5 g/l glucosa (Gibco) suplementado con 5% suero fetal bovino (Gibco).

A continuación el cocultivo de las células beta y de las células MS 1 del endotelio capilar se mantuvo durante 1 1 días más en presencia del medio inductor de la proliferación. Se observó que a partir del día 6 de cultivo (Figura 2A) se comenzaron a formar unas colonias de células que proliferaban (n= 10). En el día 10 de cultivo (Figura 2B) aparecían numerosas colonias de unas 2.000 células que proliferaban rápidamente (n= 10). El incremento en la proliferación celular observado fue de 4,02 ± 0,3 (n= 10, p< 0,001 ) veces (Figura 2C). Además, los tres días en cultivo en el medio inductor de la proliferación produjeron una proliferación significativa de las células positivas a insulina, cuando se comparó con los islotes cultivados en el medio control (Figura 1 B, n= 10, p< 0,001 ).

Ejemplo 2. Proliferación "in vitro" de hepatocitos procedentes de tejido hepático.

Para probar este método de proliferación celular "in vitro" en otro tejido de origen endodérmico se desarrolló un protocolo muy similar para tejido hepático. Con este fin se aislaron hepatocitos mediante el protocolo tradicional de digestión con colagenasa en dos pasos, desarrollado por Seglen (Seglen, P.O., Methods in Cell Biology, vol. XIII, David M. Prescott ed., Academic Press, 1976; Chapter 4, pp. 29-83) y se cultivaron en presencia de células endoteliales del propio hígado. Las células se sembraron en 60 μΙ por pocilio, a una densidad de 100.000 células/cm ² . Las células endoteliales procedentes del propio hígado estaban a una densidad de 60.000 células/cm ² . El medio de cultivo en este caso fue: DMEM 4,5 g/l glucosa con glutamax (2 mM), piruvato sódico (1 mM) y hepes (1 0 mM) (Gibco), suero fetal de ternera 1 0% (Hyclone), pen icil ina- estreptomicina 1 00 U/ml-100 g/ml (Gibco), 2-beta-mercaptoetanol 0,1 mM (Gibco), hidrocortisona 0,1 g/ml (Sigma), insulina-transferrina-selenio 5 g-5 g-5 ng/ml (Roche), factor inhibidor de leucemia recombinante de ratón 1 .000 U/ml (Chemicon) y EGTA 1 ,5 mM (Sigma).

En el caso del cultivo de los hepatocitos junto con las células endoteliales hepáticas, se observó cómo a partir del día 6 de cultivo (Figura 3A) se comenzaron a formar unas agrupaciones celulares que proliferaban a gran rapidez (n= 10). En el día 10 del cultivo aparecieron colonias de unas 1 .500 células que proliferaban muy rápido (n= 10) (Figura 3B). En este caso, el incremento observado en la proliferación celular fue de 2,8 ± 0,2 (n= 10, p< 0,001 ) veces (Figura 3C).

Ejemplo 3. índice de incorporación de BrdU en las colonias celulares.

Tras 10 días de cultivo en el medio inductor de la proliferación, se llevó a cabo un estudio de incorporación de BrdU para ver el grado de replicación de las células que formaban parte de las colonias. La incorporación de BrdU a las 24h se evaluó mediante inmunofluorescencia. Como anticuerpo primario se usó anti-BrdU (Abcam, número de catálogo ab6326), a una dilución 1 /400 (Figura 4A). En la figura 4B se puede observar cómo tras 10 días de cultivo en presencia del medio inductor, la incorporación de BrdU y, por tanto, la replicación en las colonias que proliferan, fue del 96 ± 3% (n= 10). Este incremento en la replicación fue altamente significativo cuando se comparó con islotes cultivados en el medio control durante 10 días, en cuyo caso la incorporación de BrdU fue de 0,9 ± 0,3% (n= 10) (Figura 4B, n= 10, p< 0,001 ).

Ejemplo 4. Transición epitelio-mesénquima de las colonias celulares cultivadas en presencia del medio inductor.

Tras 14 días de cultivo en el medio inductor se llevó a cabo un estudio del grado de desdiferenciación celular. Para ello se hicieron dobles inmunocitoquímicas para insulina y citoqueratina 19 (Figura 5). La citoqueratina 19 es un marcador del tejido epitelial. Para la insulina se empleó como anticuerpo primario anti-insulina monoclonal (Sigma, número de catálogo 12018), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 594 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. Para la citoqueratina 19 se empleó como anticuerpo primario un anti-citoqueratina 19 policlonal (Abcam, número de catálogo ab15463), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. En la imagen se observa que las células de la periferia del clon eran positivas para insulina y citoqueratina 19 (n= 3). Estos datos señalaban que el 3 ± 1 % de las células positivas para insulina, es decir, de origen endotelial, estaban sufriendo una transición epitelio-mesénquima. Estas células de la periferia del clon eran las que dieron lugar a las colonias de células proliferantes.

Ejemplo 5. Mareaje para precursores endocrinos en las células de las colonias que proliferan.

Tras 14 días de cultivo en el medio inductor, se estudió la presencia de marcadores endocrinos o de precursores de los mismos. Para ello se hicieron dobles inmunocitoquímicas para neurogenina-3 y citoqueratina 19 (Figura 6). La neurogenina 3 es un marcador de células precursoras endocrinas. Para la neurogenina 3 se empleó como anticuerpo primario anti-neurogenina 3 monoclonal (Beta Cell Biology Consortium, número de catálogo AB2013), a una dilución 1 /50. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 488 (Invitrogen), a una dilución 1/300. Para la citoqueratina 19 se empleó como anticuerpo primario un anti-citoqueratina 19 policlonal (Abcam, número de catálogo ab15463), a una dilución 1 /200. Como anticuerpo secundario se empleó Alexa Fluor 594 (Invitrogen), a una dilución 1 /300. En la imagen se observa que el 95 ± 4% de las células de la colonia expresaban a la vez neurogenina 3 y citoqueratina 19 (n= 3). Esta colocalización, en todas las células de la colonia, indicó que aunque las células que se replicaban rápidamente en la colonia sufrían un proceso de desdiferenciación, tenían propiedades de células precursoras endocrinas. Es decir, se estaba obteniendo una población de células que proliferaban rápidamente con características de precursores endocrinos.