La présente invention concerne des procédés pour augmenter la diversité et/ou la quantité des métabolites secondaires d'intérêt produits par des micro -organismes ainsi que des procédés pour détecter et isoler ces métabolites secondaires notamment des antibiotiques.

Les procédés selon l'invention comprennent la modification génétique des microorganismes de façon à ce qu'ils induisent la production de métabolites secondaires d'intérêt, comme les antibiotiques, chez d'autres micro -organismes lorsqu'ils sont cultivés ensemble.

Les métabolites primaires sont des molécules communes et essentielles qui sont retrouvées chez la très grande majorité des êtres vivants. En comparaison, les métabolites secondaires sont des molécules, généralement de faible masse moléculaire, qui semblent ne pas être indispensables à la croissance cellulaire. Ils sont par contre associés à une très grande variété d'activités biologiques (Berdy J. J. Antibiot. 58 :l-26, 2005).

La synthèse des métabolites secondaires par les micro -organismes requiert l'expression d'un ensemble de gènes différentiellement régulés impliqués dans le métabolisme secondaire. Les métabolites secondaires, de par leur nombre phénoménal ainsi que par leur extraordinaire diversité moléculaire, sont une ressource inestimable pour la recherche continuelle de nouvelles structures chimiques d'importance médicale et commerciale. L'industrie pharmaceutique, en particulier, a découvert et développé un très grand nombre de médicaments à partir de métabolites secondaires produits par des bactéries, des champignons, ou encore des plantes. Ces médicaments issus de métabolites secondaires couvrent une grande variété d'indications thérapeutiques comme, par exemple, les maladies infectieuses, l'oncologie, ou encore les troubles du métabolisme (Newman et al. J.Nat.Prod. 70 :461-477, 2007).

Ces molécules d'origine naturelle à fort potentiel de bioactivité ont donc une grande importance d'un point de vue économique. Ainsi, des campagnes importantes de collecte d'échantillons biologiques ont été entreprises pour découvrir de nouvelles molécules. De large collections de micro -organismes provenant de niches écologiques diverses ont été constituées par des laboratoires de recherche publics et privés. Bien souvent, la culture en laboratoire de ces micro-organismes s'avère difficile. En effet, dans leur environnement naturel, il est indispensable pour certaines bactéries d'éliminer leurs compétiteurs microbiens afin de protéger leur niche écologique ou leur association avec leur hôte. Cela se traduit par la nécessité pour ces dernières de produire des combinaisons de molécules adaptées aux flores microbiennes environnantes. Cette production représente néanmoins un coût énergétique important pour la bactérie, qui adaptera donc sa réponse antimicrobienne aux compétiteurs rencontrés et par conséquent aux signaux qu'ils émettront. Dans des conditions classiques de culture en laboratoire, la bactérie est dans un environnement favorable, sans compétiteurs, elle n'exprimera donc pas l'ensemble de son potentiel antimicrobien. La production en laboratoire des métabolites secondaires par ces micro- organismes est difficilement reproductible car très sensible à la composition du milieu de culture employé. Ceci s'explique par la difficulté de reproduire en laboratoire les conditions environnementales naturelles du micro -organisme qui induisent l'expression de ses gènes impliqués dans la biosynthèse de métabolites secondaires d'intérêt. Autrement dit, la très grande majorité des gènes responsables de la biosynthèse de métabolites secondaires bioactifs demeurent silencieux dans les conditions de culture classiquement employées en microbiologie.

Plusieurs technologies ont été développées pour contraindre les micro -organismes à exprimer ces voies de biosynthèse. Elles peuvent être regroupées en deux catégories.

La première catégorie rassemble les méthodes qui utilisent des molécules de petite masse molaire pour induire la production de métabolites secondaires. Il peut s'agir de molécules connues pour être impliquées dans la communication intercellulaire bactérienne, ou de molécules qui ne sont pas connues pour participer à des fonctions biologiques précises (WO 01/73096 ; Corre C. ét al. PNAS 105 : 17510-17515 2008 ; Kawaguchi T. et al. J. Antibiot. 41 : 360-365 (1988) ; Mitova M.I. et al. J. Nat. Prod. 71 : 824-827 (2008)). Dans cette catégorie peuvent aussi être incluses les techniques qui consistent à mettre au moins deux micro -organismes en présence de façon à ce que l'un induise la biosynthèse de métabolites secondaires par l'autre micro -organisme par émission de molécules signal (Ueda K. et al. J. Antibiot. 53 : 879-982 (2000) ; Angell S. et al. Chem. Biol.13 : 1349- 1359 (2006) ; Madonado et al). La seconde catégorie rassemble les méthodes qui modifient génétiquement un micro -organisme de façon à déréguler son métabolisme et ainsi induire la production de métabolites secondaires normalement non synthétisés en conditions de laboratoire (US5821077). Les travaux réalisés dans ce cadre montrent que les fonctions biologiques les plus pertinentes à moduler sont la transcription et la traduction. Ainsi, plusieurs travaux montrent l'intérêt de modifier les enzymes au cœur de ces processus, les ribosomes et les ARN polymérases (US 2002/098552, WO 02/079453, US 4376823, US 5310677). Dans ce sens, Ochi (Ochi K. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 : 1373-1386, 2007 et Ochi et al, 2004) a introduit la notion d'« ingénierie du ribosome », car plusieurs parties des ribosomes peuvent être modifiées, ce qui a pour conséquence d'améliorer ou d'induire la production de métabolites secondaires. Les travaux sur l'ARN polymérase se sont en revanche limités à des modifications de la sous-unité β de l'enzyme, codé par le gène rpoB. De plus, ces modifications n'ont été générées que par l'utilisation de l'antibiotique rifampicine, ce qui cantonne les localisations des mutations de l'ARN polymérase dans des régions très spécifiques. Avant notre invention, aucune étude n'a rendu compte des conséquences de modifications de la sous-unité β' de l'ARN polymérase, codé par le gène rpoC, sur l'induction de la biosynthèse de molécules d'intérêt, ni des conséquences simultanées de modifications générées conjointement sur les sous-unités β et β' de l'ARN polymérase. En outre, ces documents ne décrivent pas l'utilisation de micro-organismes dérégulés comme micro -organismes inducteurs pour augmenter la diversité des métabolites secondaires produits par des micro -organismes producteurs d'intérêt.

L'objet de l'invention est de modifier génétiquement le système de transcription d'un micro -organisme et en particulier l'ARN polymérase d'un micro -organisme de façon à déréguler son système de communication intercellulaire. En conséquence, ce microorganisme va émettre dans son milieu extracellulaire des molécules signal qui vont induire la production en quantités détectables de métabolites secondaires d'intérêt, en particulier des antibiotiques, par des micro -organismes producteurs mis en présence avec ce micro organisme devenu inducteur. Les procédés selon l'invention se distinguent de l'état de la technique dans le fait de modifier génétiquement l'ARN-polymérase des microrganismes inducteurs pour que ceux- ci acquièrent la propriété d'induire chez d'autres bactéries la biosynthèse de métabolites secondaires ayant des propriétés antibiotiques in vitro. Angell et al. ont cherché à comprendre les mécanismes synergétiques naturels qui commandent la production de la pyocyanine en tentant de reproduire en laboratoire des conditions naturelles, sans modifier génétiquement les microorganismes inducteurs à leur disposition. Notre méthode a pour but de modifier volontairement des microorganismes sauvages non-inducteurs afin de les déréguler. Le résultat de cette dérégulation est qu'elles induisent alors la biosynthèse de métabolites secondaires chez d'autres des microorganismes producteurs. Les résultats obtenus montrent qu'un microorganisme sauvage non-inducteur peut devenir inducteur lorsque son ARN-polymérase est modifiée génétiquement. Notre procédé repose donc sur la transformation de microorganismes non inducteurs en microorganismes inducteurs.

Les procédés selon l'invention permettent en particulier d'induire la production de métabolites secondaires dans une grande variété d'échantillons biologiques pour la recherche de nouveaux composés ayant des propriétés antibiotiques.

RESUME DE L'INVENTION

L'invention a pour objet un procédé pour identifier un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques produit par un micro -organisme producteur comprenant les étapes suivantes : a) Mise à disposition d'un micro -organisme inducteur portant au moins une mutation dans la sous-unité β et/ou la sous unité β' de son ARN polymérase le rendant résistant à au moins un antibiotique, b) Mise en présence du micro -organisme producteur avec ledit micro -organisme inducteur, c) Détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques par ledit microorganisme producteur.

De préférence, ladite mise à disposition du microorganisme inducteur comprend la préparation d'un micro -organisme inducteur par sélection, sur un milieu de culture contenant le ou lesdits antibiotiques, de mutants spontanés, devenus résistants à au moins un desdits antibiotiques, par au moins une mutation dans la sous-unité β et/ou la sous unité β' de leur ARN polymérase les rendant résistants à au moins un desdits antibiotiques.

De préférence, le micro -organisme inducteur est résistant à au moins un antibiotique choisi parmi la daptomycine, la rifampicine, la rifaximine, la rifapentine, la rifabutine, la streptolydigine, la microcine J25, la corallopyronine, la ripostatine, la lipiarmycine, la sorangicine, la molécule GE23077 et la molécule CBR703.

De préférence, le micro -organisme inducteur est choisi parmi Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Photorhabdus luminescens, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Burkholderia multivorans, Ralstonia solanacearum, Myxococcus xanthus, Deinococcus deserti et Mycobacterium bovis. Plus préférentiellement, le micro -organisme inducteur est choisi parmi

Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces griseus et Bacillus subtilis résistants à la rifampicine et/ou à la lipiarmycine.

Dans un mode de réalisation, le micro -organisme inducteur est une souche de

Bacillus subtilis résistante à au moins un antibiotique choisi dans le groupe comprenant la daptomycine, la rifampicine, la rifaximine, la rifapentine, la rifabutine, la streptolydigine, la microcine J25, la corallopyronine, la ripostatine, la lipiarmycine, la sorangicine, la molécule GE23077 et la molécule CBR703.

Dans un autre mode de réalisation, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis résistante à la rifampicine portant la mutation Q469R dans la sous-unité β de son ARN polymérase.

Dans un autre mode de réalisation, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis résistante à la lipiarmycine portant la mutation R326L dans la sous-unité β' de son ARN polymérase.

Préférentiellement, dans l'étape b) ladite mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend la co-culture du microorganisme producteur et du microorganisme inducteur dans un milieu de culture liquide.

Préférentiellement, dans l'étape b) ladite mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend la mise en contact du microorganisme producteur avec un milieu de culture liquide du microorganisme inducteur.

Dans un autre mode de réalisation, dans l'étape b) ladite mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend la mise en contact du microorganisme producteur avec un extrait cellulaire du microorganisme inducteur.

Préférentiellement, dans l'étape b) ladite mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend la mise en contact du microorganisme producteur avec un milieu de culture du microorganisme inducteur par culture desdits microorganismes dans un même récipient dans lequel ledit microorganisme producteur et ledit microorganisme inducteur sont séparés par un filtre permettant au milieu de culture de diffuser dans la totalité du récipient.

Dans un mode de réalisation préféré, dans l'étape b) ladite mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend la culture du micro -organisme producteur et du ledit micro -organisme sur deux points distincts d'un même milieu de culture solide, et l'étape c) comprend la détection de la production d'un métabolite secondaire ayant des propriétés antibiotiques par le dépôt d'un milieu de culture solide ou semi-solide ensemencé avec un micro -organisme test sur la culture de l'étape précédente puis l'observation des plages d'inhibition de croissance du micro -organisme test se formant autour du microorganisme producteur.

Avantageusement, à l'étape c) ladite détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques comprend la mise en contact dudit micro -organisme test avec les métabolites secondaires produits par ledit micro -organisme producteur.

Avantageusement, à l'étape c) ladite détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques comprend la mise en contact d'un micro -organisme test avec le milieu de culture précédemment produit par le microorganisme producteur. L'invention se rapporte aussi à des procédés selon l'invention dans lesquels le micro -organisme test est choisi parmi Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Streptococcus pneumoniae, Bacillus spp, Clostridium spp, Escherichia coli, Klebsiella spp, Acinetobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp, Enterobacter spp, Proteus mirabilis, Serratia marescens, Morganella spp, Candida spp, Aspergillus spp.

L'invention se rapporte aussi à des procédés selon l'invention dans lesquels le micro -organisme producteur est choisi parmi Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas luminescens, Bacillus subtilis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Burkholderia multivorans, Ralstonia solanacearum, Myxococcus xanthus, Polyangiumcellulosum, Nannocystis exedens, Angiococcus disciformis, Cystobacter ferrugineus et Deinococcus radiodurans. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention décrit un nouveau procédé pour faire produire une grande variété de métabolites secondaires par un micro -organisme producteur. De façon surprenante, la production de divers métabolites secondaires peut être induite en présence d'un micro -organisme inducteur dont l'ARN polymérase a été modifiée ou dérégulée de telle sorte que ce micro -organisme est devenu résistant à un antibiotique.

L'invention a donc pour objet un procédé pour identifier un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques produit par un micro -organisme producteur comprenant les étapes suivantes : a) Mise à disposition d'un micro-organisme inducteur portant au moins une mutation dans la sous-unité β et/ou la sous unité β' de son ARN polymérase le rendant résistant à au moins un antibiotique, b) Mise en présence du micro -organisme producteur avec ledit micro -organisme inducteur, c) Détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques par ledit microorganisme producteur.

De préférence, ladite mise à disposition du microorganisme inducteur comprend la préparation d'un micro -organisme inducteur par sélection, sur un milieu de culture contenant le ou lesdits antibiotiques, de mutants spontanés, devenus résistants à au moins un desdits antibiotiques, par au moins une mutation dans la sous-unité β et/ou la sous unité β' de leur ARN polymérase les rendant résistants à au moins un desdits antibiotiques.

Par « métabolite » secondaire, on entend un produit formé au cours du métabolisme cellulaire que produisent les micro-organismes en dehors des voies métaboliques strictement nécessaires à assurer la survie.

Ces métabolites peuvent avoir des activités présentant un grand intérêt tel que par exemple des propriétés antibiotiques.

Par les termes « propriété antibiotique », on entend des molécules ayant une activité anti-bactérienne, anti-fongique, antiparasitaire, antivirale et/ou cytotoxique. Par « micro -organisme producteur », on entend un micro -organisme produisant ou ayant la capacité de produire des métabolites secondaires en particulier des métabolites secondaires ayant une activité antibiotique. Tout micro -organisme peut être utilisé dans les procédés selon la présente invention. L'invention permet avantageusement de cribler un grand nombre de microorganismes producteurs pour leur capacité à produire des métabolites secondaires d'intérêt ayant en particulier des propriétés antibiotiques. Les procédés selon l'invention permettent ainsi de cribler des collections ou des banques de micro -organismes pour une activité particulière telle qu'une activité antibiotique par exemple.

Dans un mode de réalisation, le micro -organisme producteur est un procaryote.

Dans les procédés selon l'invention, le micro -organisme producteur est de préférence choisi parmi Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas luminescens, Bacillus subtilis, Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Burkholderia multivorans, Ralstonia solanacearum, Myxococcus xanthus, Polyangium cellulosum, Nannocystis exedens, Angiococcus disciformis, Cystobacter ferrugineus et Deinococcus radiodurans.

De façon préférée, le micro -organisme producteur est Chromobacterium violaceum. Dans les procédés selon l'invention, le micro -organisme inducteur est résistant à au moins un antibiotique suite à une modification dans son ARN polymérase. Dans un mode de réalisation préféré, le micro -organisme inducteur est résistant à au moins un antibiotique ciblant l'ARN polymérase.

Chez les procaryotes, il existe une seule ARN polymérase comprenant les sous- unités α, β, β' et σ. Les micro -organismes inducteurs de la présente invention portent une modification de leur ARN polymérase les rendant résistants à au moins antibiotique. De préférence, cette modification affecte le site catalytique de l'ARN polymérase c'est à dire la sous-unité β et/ou la sous-unité β' de l'ARN polymérase.

Par modification, on entend toute mutation ou autre changement dans la structure ou l'activité de l'ARN polymérase du micro -organisme inducteur rendant celui-ci résistant à un antibiotique.

Avantageusement, le micro -organisme inducteur porte au moins une mutation dans la sous-unité β et/ou la sous unité β' de l'ARN polymérase.

De préférence, le micro -organisme inducteur est résistant à un antibiotique choisi parmi la daptomycine, la rifampicine, la rifaximine, la rifapentine, la rifabutine, la streptolydigine, la microcine J25, la corallopyronine, la ripostatine, la lipiarmycine, la sorangicine, la molécule GE23077, la molécule CBR703. L'antibiotique GE32077est produite par la souche DSMZ13491 décrite dans le document EP 1213298.

L'antibiotique CBR703 est disponible commercialement chez Maybridge®.

L'antibiotique n'est pas forcément un antibiotique dont le mode d'action est l'inhibition de l'ARN polymérase mais pour lequel des micro -organismes peuvent développer une résistance par des modifications et /ou des mutations de l'ARN polymérase. Ceci est par exemple le cas de la daptomycine. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le micro -organisme inducteur est résistant à la daptomycine.

Tout micro -organisme pouvant être rendu résistant à un antibiotique par modification de son ARN polymérase peut être utilisé comme micro -organisme inducteur.

Ces micro-organismes résistants peuvent être obtenus par sélection sur un milieu de culture contenant l'antibiotique. Le séquençage du gène de l'ARN polymérase permet ensuite de vérifier que l'ARN polymérase est affectée.

De préférence, le micro -organisme inducteur est choisi parmi Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis,

Photorhabdus luminescens, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Burkholderia multivorans, Ralstonia solanacearum, Myxococcus xanthus, Deinococcus deserti et Mycobacterium bovis.

Les gènes codant pour les sous-unités β (gène rpoB) et β' (gène rpoC) de ces microorganismes sont connus et leurs références GENBANK sont indiquées ci-dessous :

> Pseudomonas aeruginosa (GenelD - rpoB : 881699, rpoC : 881710),

> Pseudomonas syringae (GenelD - rpoB : 1182239, rpoC : 1182240), > Pseudomonas fluorescens (GenelD - rpoB : 3479976, rpoC : 3479975),

> Bacillus subtilis (GenelD - rpoB : 936335, rpoC : 935977),

> Photorhabdus luminescens (GenelD - rpoB : 2800389, rpoC : 2800390),

> Streptomyces coelicolor (GenelD - rpoB : 1100095, rpoC : 1100096),

> Streptomyces griseus (GenelD - rpoB : 6215550, rpoC : 6209662), > Acinetobacter baumannii (GenelD - rpoB : 4918494, rpoC : 4918744),

> Klebsiella pneumoniae (GenelD - rpoB : 6937894, rpoC : 6936988),

> Staphylococcus aureus (GenelD - rpoB : 5330265, rpoC : 5332400),

> Escherichia coli (GenelD - rpoB : 6058462, rpoC : 6058956), > Salmonella enterica (GenelD - rpoB : 1071592, rpoC : 1071605),

> Stenotrophomonas maltophilia (GenelD - rpoB : 6394221, rpoC : 6391890),

> Enterococcus faecalis (GenelD - rpoB : 1202073, rpoC : 1202072),

> Streptococcus pneumoniae (GenelD - rpoB : 7329105, rpoC : 7328419), > Burkholderia multivorans (GenelD - rpoB : 5765195, 6360112, rpoC : 6360030),

> Ralstonia solanacearum (GenelD - rpoB : 1221888, rpoC : 1221887),

> Myxococcus xanthus (GenelD - rpoB : 4102843, rpoC : 4101549),

> Deinococcus deserti (GenelD - rpoB : 7738058, rpoC : 7738057), et

> Mycobacterium bovis (GenelD - rpoB : 4697686, rpoC : 4696375). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis résistante à un antibiotique choisi dans le groupe comprenant la rifampicine, la rifaximine, la rifapentine, la rifabutine, la streptolydigine, la microcine J25, la corallopyronine, la ripostatine, la lipiarmycine, la sorangicine, la molécule GE23077 et la molécule CBR703. Préférentiellement, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis portant au moins une mutation dans le gène rpoB codant pour la sous-unité β de l'ARN polymérase et/ou dans le gène rpoC codant pour la sous-unité β' de l'ARN polymérase.

Plus préférentiellement, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis dans laquelle le gène rpoB est muté par la substitution de la glutamine en position 469 par une arginine et/ou dans laquelle le gène rpoC est muté par la substitution de l'arginine 326 par une leucine.

Dans un premier mode de réalisation, le micro -organisme inducteur est une souche de Bacillus subtilis résistante à la rifampicine portant la mutation Q469R dans la sous-unité β de son ARN polymérase. Dans un autre mode de réalisation, le micro -organisme inducteur est une souche de

Bacillus subtilis résistante à la lipiarmycine portant la mutation R326L dans la sous-unité β' de son ARN polymérase.

Dans les procédés selon l'invention, le micro -organisme producteur est mis en contact ou en présence avec le micro -organisme inducteur afin d'induire chez le producteur la synthèse de métabolites secondaires qui ne sont pas produits dans des conditions de culture habituelles. Cette mise en contact peut s'effectuer selon toute technique connue de l'homme du métier. Cette mise en contact peut notamment s'effectuer par co-culture du microorganisme producteur avec le micro -organisme inducteur. La co-culture peut être réalisée sur milieu de culture solide en ensemençant le milieu avec les deux micro -organismes à une certaine distance l'un de l'autre. La co-culture peut aussi s'effectuer dans un milieu liquide dans un réacteur mono- ou bi-compartimental.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la mise en contact du microorganisme producteur et du micro -organisme inducteur s'effectue sur un milieu de culture solide.

Dans un autre mode de réalisation, le micro -organisme producteur est mis en culture dans un milieu préparé partiellement ou complètement à partir d'un milieu stérilisé dans lequel a préalablement poussé un micro -organisme inducteur. Ce milieu comprend alors les métabolites secondaires produits par le micro-organisme inducteur.

Dans un autre mode de réalisation, le micro -organisme producteur est mis en culture dans un milieu contenant des extraits cellulaires de micro-organismes inducteurs préparés par exemple par broyât ou par lyse.

Dans les procédés selon l'invention, la mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend par exemple la co-culture du microorganisme producteur et du microorganisme inducteur dans un milieu de culture liquide. Dans les procédés selon l'invention, la mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend par exemple la mise en contact du microorganisme producteur avec un milieu de culture liquide du microorganisme inducteur.

Dans les procédés selon l'invention, la mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend par exemple la mise en contact du microorganisme producteur avec un extrait cellulaire du microorganisme inducteur.

Dans les procédés selon l'invention, la mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend par exemple la mise en contact du microorganisme producteur avec un milieu de culture du microorganisme inducteur par culture desdits microorganismes dans un même récipient dans lequel ledit microorganisme producteur et ledit microorganisme inducteur sont séparés par un filtre permettant au milieu de culture de diffuser dans la totalité du récipient. Dans les procédés selon l'invention, la mise en présence du microorganisme producteur avec ledit microorganisme inducteur comprend par exemple la culture du micro -organisme producteur et du ledit micro -organisme sur deux points distincts d'un même milieu de culture solide, et l'étape c) comprend la détection de la production d'un métabolite secondaire ayant des propriétés antibiotiques par le dépôt d'un milieu de culture solide ou semi-solide ensemencé avec un micro -organisme test sur la culture de l'étape précédente puis l'observation des plages d'inhibition de croissance du micro -organisme test se formant autour du microorganisme producteur.

Tout autre technique permettant d'induire la production de métabolites secondaires chez le micro -organisme producteur en présence du micro -organisme inducteur ou du moins en présence des métabolites secondaires produits par ce micro -organisme inducteur peut être employée dans les procédés selon la présente invention.

Les procédés selon l'invention comprennent ensuite la détection de la production d'un métabolite d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques par ledit microorganisme producteur.

Ces métabolites sont typiquement détectés par un criblage pour une activité d'intérêt. Toute technique connue de l'homme du métier pour détecter une activité d'intérêt peut être employée dans les procédés selon l'invention. La détection de l'activité du ou des métabolites secondaires synthétisés par le micro -organisme producteur s'effectue de préférence par des techniques in vitro.

Dans les procédés selon l'invention, ladite détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques comprend par exemple la mise en contact dudit micro -organisme test avec les métabolites secondaires produits par ledit micro -organisme producteur. Dans les procédés selon l'invention, ladite détection de la production d'un métabolite secondaire d'intérêt ayant des propriétés antibiotiques comprend par exemple la mise en contact d'un micro -organisme test avec le milieu de culture précédemment produit par le micro -organisme producteur.

Après la détection d'un métabolite secondaire présentant une activité antibiotique, ce dernier pourra être purifié ou isolé selon toute technique appropriée. Dans un mode de réalisation préféré, le ou les métabolites secondaires produits par le micro -organisme producteur ont une activité antibiotique. Cette activité peut être détectée en mettant en contact un micro -organisme test avec les métabolites secondaires produits et en observant l'inhibition de la croissance de ce micro -organisme test. Dans un mode de réalisation avantageux, l'étape b) comprend la co-culture du micro -organisme producteur avec ledit micro -organisme inducteur sur un milieu de culture solide, et l'étape c) comprend la détection de la production d'un métabolite secondaire ayant des propriétés antibiotiques par le dépôt d'un milieu de culture solide ou semi-solide ensemencé avec un micro -organisme test sur la co-culture de l'étape précédente puis l'observation des plages d'inhibition de croissance du micro -organisme test.

Préférentiellement, le micro -organisme test est un micro -organisme potentiellement pathogène.

De préférence, le micro -organisme test est choisi parmi Staphylococcus spp,

Enterococcus spp, Streptococcus pneumoniae, Bacillus spp, Clostridium spp, Escherichia coli, Klebsiella spp, Acinetobacter spp, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia spp, Enterobacter spp, Proteus mirabilis, Serratia marescens,

Morganella spp, Candida spp, Aspergillus spp.

Plus préférentiellement, le micro -organisme test est Staphylococcus aureus.

FIGURES

Figure 1 : Schéma représentatif de la méthode d'identification d'inducteur de la production d'antibiotique.

EXEMPLES

Exemple : Couple inducteur/producteur Bacillus subtilis/Chromobacterium violaceum Cet exemple décrit comment des modifications génétiques de la bactérie Bacillus subtilis la rendent capable d'induire la production d'un antibiotique par la bactérie Chromobacterium violaceum. A) MATERIELS ET METHODES

Souches microbiennes. Les souches de Bacillus subtilis CIP 52.62 , Chromobacterium violaceum CIP 53.2 et Staphylococcus aureus CIP 76.25 (Collection Institut Pasteur utilisées ont été acquises auprès du Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur.

Antibiotiques. La rifampicine a été fournie par Sigma-Aldrich. La lipiarmycine a été produite selon la méthode décrite par Talpaert et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 328-334, 1975).

B) OBTENTION DE MUTANTS DE B. SUBTILIS RESISTANTS A LA RIFAMPICINE (RIFR).

La rifampicine est un antibiotique inhibant la transcription en agissant sur l'ARN polymérase bactérienne. Des mutants spontanés de B. subtilis résistants à la rifampicine ont été isolés par étalement d'une culture de 10 ⁹ CFLVmL de B. subtillis CIP 52.62 sur un milieu LB-agar contenant 10 μg/mL de rifampicine. Après purification de l'ADN génomique de la souche sauvage et des mutants, la région du gène rpoB (GenelD NCBI :

936335) impliquée de façon systématique dans la résistance à la rifampicine a été amplifiée par PCR et séquencée. La substitution de la glutamine 469 par une arginine

(CAA/CGA) s'est avérée être responsable du phénotype de résistance à la rifampicine.

C) OBTENTION DE MUTANTS DE B. SUBTILIS RESISTANTS A LA LIPIARMYCINE (LIPR)

La lipiarmycine est un antibiotique inhibant la transcription en agissant sur l'ARN polymérase bactérienne. Des mutants spontanés de B. subtilis résistants à la lipiarmycine ont été isolés par étalement d'une culture de 10 ⁹ CFU/mL de B. subtillis CIP 52.62 sur un milieu LB-agar contenant 40 μg/mL de lipiarmycine. Après purification de l'ADN génomique de la souche sauvage et des mutants, la région du gène rpoC (GenelD NCBI : 935977) impliquée dans la résistance à la lipiarmycine a été amplifiée par PCR et séquencée. La substitution de l'arginine 326 par une leucine (CGT/CTT) s'est avérée être responsable du phénotype de résistance à la lipiarmycine. D) CO-CULTURE DES SOUCHES DE B. SUBTILIS AVEC LA SOUCHE DE C. VIOLACEUM

Quatre cultures indépendantes de B. subtilis CIP 52.62, de B. subtilis CIP 52.62 RifR (Q469R), de B. subtilis CIP 52.62 LipR (R326L) et de C. violaceum CIP 53.2 sont réalisées dans 5 mL de milieu LB pendant 24h, sous agitation. 50 μL de ces cultures sont ensuite déposés sur des boites de pétri contenant du LB-agar selon la répartition suivante :

• Boîte 1 : dépôt de 50 μL de C. violaceum CIP 53.2 (producteur) • Boîte 2 : dépôts de 50 μL de B. subtilis CIP 52.62 (inducteur 1) et de 50 μL de C. violaceum CIP 53.2 (producteur) espacés de 3 cm (co-culture 1)

• Boîte 3 : dépôts de 50 μL de B. subtilis CIP 52.62 RifR (Q469R) (inducteur

2) et de 50 μL de C. violaceum CIP 53.2 (producteur) espacés de 3 cm (co- culture 2) • Boîte 4 : dépôts de 50 μL de B. subtilis CIP 52.62 LipR (R326L) (inducteur

3) et de 50 μL de C. violaceum CIP 53.2 (producteur) espacés de 3 cm (co- culture 3).

Les boites de pétri ensemencées sont ensuite incubées à 28°C pendant 48h. A la suite de cette étape, 10 mL de gélose LB-agar dite « molle », ensemencée par 100 μL d'une culture confluente de Staphylococcus aureus CIP 76.25, sont ajoutés à chaque boîte 1 à 4. Les boites de pétri sont alors incubées à 37°C pendant 24h. A l'issue de cette incubation, les plages d'inhibition de croissance de S. aureus sont observées et relevées.

Dans nos conditions de culture, C. violaceum seul ne produit pas d'antibiotique contre S. aureus. Lorsqu'il est co-cultivé avec une souche sauvage de B. subtilis, il ne produit pas non plus d'antibiotique. La souche sauvage de B. subtilis n'induit donc pas la production d'antibiotique chez C. violaceum. En revanche, une activité antimicrobienne de C. violaceum est observée lorsque ce micro -organisme est co-cultivé en présence des souches de B. subtilis qui possèdent des ARN polymérases mutées. Ces deux souches, B. subtilis RifR et B. subtilis LipR, induisent donc la production par C. violaceum d'un antibiotique actif contre S. aureus. (Voir tableau 1). Tableau 1. Activité antimicrobienne de C. violaceum co-cultivé ou non en présence de différentes souches de B. subtilis contre S. aureus.

Au moins une mutation sur l'ARN polymérase de B. subtilis, soit portée par la sous-unité β codée par le gène rpoB, soit portée par la sous-unité β' codée par le gène rpoC, fait que cette bactérie devient capable d'induire la production par C. violaceum d'un antibiotique actif contre S. aureus. En présence de ces souches de B. subtilis génétiquement modifiées, C. violaceum produit un antibiotique normalement non bio synthétisé dans les conditions classiques de microbiologie de laboratoire.

Dans notre travail expérimental, la co-culture des souches inductrices et productrices est réalisée sur un milieu gélose « solide » en boîte de Pétri. Les tests d'activité antimicrobienne sont réalisés par ajout à cette même boîte d'une gélose ensemencée par un pathogène d'intérêt. La détermination de l'activité antibactérienne se fait par mesure du diamètre du halo d'inhibition de croissance du pathogène d'intérêt autour des bactéries co- cultivées sur la boîte (voir FIG. 1 du brevet). Il est donc exclu que l'activité antibactérienne mesurée autour de C. violaceum soir due à l'activité antibactérienne de B. subtilis.

Pour confirmer ce résultat, nous avons réalisé des cultures de B. subtilis sauvage, B. subtilis RifR et B. subtilis LipR, ainsi qu'une culture témoin sans bactérie (témoin n°l). Chaque culture a été centrifugée, et le surnageant stérilisé par filtration sur membrane 0.2μ. Le surnageant est ensuite concentré par lyophilisation. Ces surnageants ont été testés en activité antimicrobienne contre S. aureus. Aucune activité antimicrobienne n'a été observée. Les surnageants concentrés ont ensuite été respectivement utilisés pour préparer 4 milieux de culture pour C. violaceum. Aucune activité antimicrobienne contre S. aureus n'a été observée pour ces milieux de culture non ensemencés. Les 4 milieux de culture et une culture témoin (témoin n°2) sont alors ensemencés par C. violaceum. Après 48 h d'incubation, les milieux sont centrifugés et les surnageants sont testés en activité antimicrobienne contre S. aureus. On retrouve les mêmes résultats qu'en culture solide. Tableau 2. Activité antimicrobienne contre S. aureus de C. violaceum cultivé dans différents milieux contenant ou non des extraits de culture de B. subtilis

REFERENCES

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REFERENCES BREVET

US 5821077

US 2002/098552 WO 02/079453 US 4376823 US 5310677