DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a un método para incrementar la fertilidad de las plantas y a las plantas obtenidas mediante dicho método. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la agricultura.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El calentamiento global tiene un impacto negativo sobre la agricultura, por ejemplo contrarrestando los efectos positivos que el aumento de C02 podría tener sobre la fisiología de las plantas. Por ejemplo, la producción de granos de arroz desciende un 10% por cada 1°C que aumenta la temperatura nocturna, y se estima que cada aumento de 1°C por encima de los 15°C reduce la producción de trigo en un 3-4%, mientras que cada día que el maíz pasa por encima de 30°C reduce el rendimiento un 1 %. Uno de los problemas más graves que provocan las altas temperaturas sobre los cultivos es el descenso de la fertilidad del polen, documentado ya en varias especies como el tomate, el algodón, la cebada o el arroz. El efecto dañino sobre el polen parece deberse a la combinación de una menor dehiscencia de las anteras, menor producción de granos de polen, esterilidad del polen, y reducida germinación del polen in vivo. Por este motivo, la investigación de tratamientos o variedades que permitan a las plantas seguir siendo fértiles en altas temperaturas es muy activa.

Varios compuestos han sido probados con éxito en el laboratorio para mejorar la fertilidad del polen, como el etileno, los brasinosteroides o las auxinas, mientras que la obtención de nuevas variedades se realiza tanto con abordajes de mejora tradicional como mediante aplicaciones biotecnológicas basadas en la genética molecular.

La solicitud de patente EP2394513A1 describe un método para restaurar la esterilidad masculina en plantas gramíneas que comprende la administración de auxinas a las plantas.

La solicitud de patente EP2054516B1 describe plantas modificadas genéticamente que presentan características fenotípicas mejoradas, como un incremento en la producción de semillas y la tolerancia al estrés abiótico. Este documento describe plantas que tienen una expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRC (Proteínas Relacionada con el Crecimiento) y el procedimiento para obtener dichas plantas.

La patente ES2334539B1 describe el uso del gen que codifica la enzima PPAT (fosfopanteteína adeniltransferasa) para la obtención de plantas transgénicas que presentan una mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido de ácidos grasos en semillas y composición aminoacídica modificada.

Liao, P. y col. 2014 (PLoS One, 9(5):e98264) describen un muíante de 3-hidroxi-3- metilglutaril-coenzima A sintetasa (HMGS), la segunda enzima de la vía del mevalonato (MVA), que mejora el rendimiento en la producción de semillas cuando se sobreexpresa en una planta.

No obstante, todavía existe en el estado de a técnica la necesidad de proporcionar plantas cuya fertilidad esté incrementada o no se vea mermada en condiciones de estrés.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que la inhibición o el bloqueo de la metilación del ácido indol acético (AIA) en las plantas provoca un mayor crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas en las que dicha metilación no está inhibida o bloqueada. Como consecuencia de este crecimiento, la fertilidad de las plantas se ve incrementada, llegando incluso a ser restaurada en aquellas plantas en las que debido a condiciones de estrés, como las altas temperaturas o la escasez de agua, su fertilidad se ve mermada. Los inventores llegaron a esta conclusión tras truncar en Arabidopsis thaliana el gen que codifica la proteína ácido indolacético-carboximetiltransferasa 1 (IAMT1), enzima encargada de metilar el AIA para dar lugar al AlA-metilado (Me-AIA), y observar que la pérdida de la función de esta enzima origina acelera el crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas control (ver Ejemplo 1 y Figuras 5 y 6). Por lo tanto, se puede concluir que la inhibición de la metilación del AIA da lugar a un incremento en la fertilidad de las plantas, lo que se traduce en un mayor rendimiento de los cultivos al obtener plantas que generan más semillas y con ello, más frutos.

Así, en el contexto de la presente invención, se contempla una planta que comprende la ruta de metilación del AIA bloqueada o inhibida. Como entiende el experto en la materia, el bloqueo o la inhibición de una ruta metabólica puede llevarse a cabo a diferentes niveles: puede inhibirse o bloquearse la expresión del gen que codifica la enzima IAMT1 , por ejemplo, mediante el empleo de moléculas que impidan la unión de la ANR polimerasa, mutando el promotor para que no sea reconocido por los factores de transcripción, empleando inhibidores de la transcripción como ARNs de interferencia, mutando la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína para que se exprese una enzima no funcional, etc., puede inhibirse o bloquearse la propia enzima IAMT1 mediante el empleo de compuestos agentes inhibidores que se unan a la enzima e impidan que realice su función (también denominados agentes inhibidores), etc. Independientemente del procedimiento empleado, la consecuencia es que no se produce la metilación del AIA y con ello, se incrementa la fertilidad de la plantas.

A la vista de este descubrimiento, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán descritos en detalle a continuación.

Planta de la invención

En vista de lo anteriormente expuesto, en un aspecto la presente invención se relaciona con una planta, de aquí en adelante "planta de la invención", que comprende el gen que codifica la proteína IAMT1 , caracterizada porque dicha proteína IAMT1 :

(i) está ausente o en unos niveles no detectables por técnicas conocidas, o

(ii) no es funcional, es decir, no es capaz de metilar el AIA, o

(iii) se presenta en la planta en unos niveles inferiores con respecto a la planta control, siendo dicha diferencia estadísticamente significativa, de forma que se observa el fenotipo descrito en la planta de la presente invención, y

(iv) dicha la planta no pertenece a la especie Arabidopsis thaliana.

Particularmente, la planta de la invención se caracteriza porque:

(i) la expresión de dicho gen está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control, o da lugar a una proteína no funcional, y

(ii) dicha la planta no pertenece a la especie Arabidopsis thaliana. Excepto A. thaliana, cualquier planta puede ser objeto de la presente invención, tanto mono- como dicotiledónea. En la presente invención, dentro del término planta se incluyen plantas completas, antecesores y progenies de las plantas y partes de las plantas incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos mencionados comprende disminuida, bloqueada o inhibida la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 , o una proteína IAMT1 no funcional.

Las plantas incluidas en la presente invención pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, seleccionadas de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (e.g. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (e.g. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, oilseed rape, turnip rape]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Casta nea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleífera), Eleusine coracana, Erag rostís tef, Erianthus sp., Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (e.g. Glycine max, Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (e.g. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (e.g. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luff a acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (e.g. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyri forme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (e.g. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phieum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (e.g. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsac[upsilon]m dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (e.g. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.

Ejemplos de plantas objeto de la presente invención incluyen, sin limitar a, plantas de interés agronómico, tales como plantas de cereales (trigo, centeno, cebada, etc), árboles frutales, plantas forrajeras (por ejemplo, las leguminosas, berenjenas, pimientos, melones, sandías, pepinos, calabacines, judías, guisantes, habas, cebollas, col china, perejil, rabanito, etc.), y plantas ornamentales.

No obstante, en una realización particular, la planta de la presente invención pertenece al género Solanum sp., en particular es una tomatera. La tomatera de la presente invención puede seleccionarse, por ejemplo, de entre Solanum lycopersicum, Solanum peruvianum, Solanum pimpinellifolium, Solanum lycopersicoides, Solanum sitiens, Solanum juglandifolium, Solanum ochranthum, Solanum cheesmaniae o Solanum galapagense.. Preferiblemente la tomatera es de la especie Solanum lycopersicum, o sus sinónimos Lycopersicon esculentum, Lycopersicon esculentum Mili., Lycopersicon esculentum var. esculentum, Solanum esculentum, Solanum esculentum Dunal. Más preferiblemente, la variedad de tomatera puede ser seleccionada de la lista de Anna russian, Applause, Aussie, Baladre, Bella rosa, Black cherry, Black russian, Blondkopfchen, Brandywine, Carbón, Ceylan, Cherokee purple, Cherry, Cherry Redondo, Tomate Cherry Pera Amarillo, Comanche, Costoluto genovese, Ditmarcher, Eros, Gallician, Glacier, Gartenperle, Green sausage, Grushovka, Harzfeuer, Hugh, Japanesse black, Jersey devil, Kosovo, Krim black, Kumato, Liguria, Limachino, Lime green salad, Manitoba, Marvel stripe, Moneymaker, Muchamiel, Estrella, Opalka, RAF, Black Pear, Piña Hawaiana, Rio grande, San marzano, Siberian, Sprite, Sugary, Sun sugar, Tigerella, White Queen, Raf Claudia, Roma, Valenciano, Pera de Girona, Montserrat, Corazón de Buey, Angela, Colgar en Rama, Ciruela Negro, Optima, Pata Negra, Copia, Velasco, Montenegro, Vertyco, Ventero, Ramyle, Pitenza, Paladium, Mayoral, Razymo, Motto, Caniles, Byelsa, Royalty, Trujillo, Delizia, Dumas Duratom, Larguero, Torry, Tovistar, Pintón, Grueso, Larga Vida, Marenza o Window box Roma.

La planta de la presente invención se puede obtener mediante múltiples procesos, entre los cuales están las técnicas de mejora genética clásica de cruce y selección o los procedimientos microbiológicos como la obtención de cíbridos o la fusión de células somáticas.

La planta de la invención comprende el gen que codifica la proteína IAMT1. La proteína IAMT1 es la ácido indolacético-carboximetiltransferasa 1 , enzima encargada de metilar el AIA para dar lugar al AlA-metilado (Me-AIA). En una realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 50% con la SEQ ID NO: 1. La secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde la proteína IAMT1 procedente de A. thaliana cuyo número de acceso al NCBI es NP_200336.1 , versión es NP_200336.1 Gl: 15240487.

Las secuencias con al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 1 son secuencias homologas de la proteína IAMT1. Las secuencias homologas se refieren a secuencias de especies distintas con expresiones fenotípicas similares que proceden de una secuencia ancestral común. Dentro de la homología de secuencia se distinguen dos tipos de homología: la ortología y la paralogía. Las secuencias ortólogas pertenecen a especies que tienen un antepasado común. Las secuencias parálogas son aquellas que se encuentran en el mismo organismo y una procede de la duplicación de la otra.

SEQ ID NO: 1

mgskgdnvav cnmklerlls mkggkgqdsy annsqaqamh arsmlhllee tlenvhlnss aspppftavd lgcssgantv hiidfivkhi skrfdaagid ppeftaffsd lpsndfntlf qllpplvsnt cmeeclaadg nrsyfvagvp gsfyrrlfpa rtidffhsaf slhwlsqvpe svtdrrsaay nrgrvfihga gektttaykr qfqadlaefl raraaevkrg gamflvclgr tsvdptdqgg agllfgthfq dawddlvreg lvaaekrdgf nipvyapslq dfke vdang sfaidkl vy kggspl vne pddasevgra fasscrsvag vlveahigee lsnklfsrve sratshakdv lvnlqffhiv aslsft En la presente invención se entiende por "identidad" o "identidad de secuencia" al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo Needleman y Wunsch (1970, J Mol Bio 48: 443-453) para encontrar el alineamiento de las dos secuencias que maximizan el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. El algoritmo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10] calcula el porcentaje de identidad de secuencias y desarrolla un análisis estadístico de similitud entre las dos secuencias. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

En una realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 60%, 70%, 80%, 90% o 100% con la SEQ ID NO: 1. En otra realización todavía más particular, la proteína IAMT1 comprende un 72% con la SEQ ID NO: 1 que, en otra realización aún más particular, comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 correspondiente a la proteína IAMT1 de tomate (N° de acceso NCBI: XP_004251920.1 versión XP_004251920.1 Gl:460413073).

SEQ ID NO: 2

matlgdnkdn vvsnlkler mlsmkggkge asyvnnsqaq gqharsmlhl lketldgvql irssdnddip fvivdlgcsc gsntvyiidv ivehmrkrfe kadqqipefs affcdlpsnd fntlfqllpp lanngmeecl asnshrsyfa agvpgsfyrr lfparsidvf ysafslhwls qvpd vldkq nvaynkgriy ihganesttk aykkqfqsdl anflcarske mkrggsmflv clgrtsmdpi dqggagllfg thfqdawddl vqeglitsek rdnfnipvya psiqdfke v eangsftinn lqvfrggspl vnhpddaae vgralaiscr svsgvlvdah igeqlgdelf trverraarh akelieklqf fhivaslslv

Ejemplos de proteínas IAMT1 de otras especies incluyen, pero no se limitan a (la identidad de secuencia (BLAST) con la SEQ ID NO: 1 se muestra entre corchetes), la secuencia SEQ ID NO: 3 procedente de Brassica napus (n° acceso a NCBI: CDY19899.1) [95%], la secuencia SEQ ID NO: 4 de Cucumis meló (n° de acceso NCBI: XP_008447710.1) [77%], la secuencia SEQ ID NO: 5 de Cucumis sativus (n° de acceso NCBI: XP_004151408.1) [78%], la secuencia SEQ ID NO: 6 de Fragaria vesca (n° de acceso a NCBI: XP_004294422.1) [76%], la secuencia SEQ ID NO: 7 de Glycine max (n° de acceso a NCBI: XP_003551758.1) [76%], la secuencia SEQ ID NO: 8 de Solanum tuberosum (n° de acceso a NCBI: XP_006344874.1) [72%], la secuencia SEQ ID NO: 9 de Malus domestica (n° de acceso NCBI: XP_008364459.1) [74%], la secuencia SEQ ID NO: 10 de Jatropha curcas (n° de acceso NCBI: KDP39201.1) [75%], la secuencia SEQ ID NO: 1 1 de Prunus pérsica (n° de acceso NCBI: XP_007211413.1) [74%], la secuencia SEQ ID NO: 12 de Theobroma cacao (n° de acceso NCBI: XP_007020694.1) [74%], la secuencia SEQ ID NO: 13 de Citrus sinensis (n° acceso NCBI: XP_006474991.1) [71 %], la secuencia SEQ ID NO: 14 de Vitis vinífera (n° de acceso a NCBI: XP_002277167.1) [72%] y la secuencia SEQ ID NO: 15 de Oryza sativa (n° de acceso BNCI: NP_001054175.1) [63%].

La planta de la invención se caracteriza por tener inhibida la ruta de metilación del AIA, es decir, la cantidad de Me-AIA que la planta es capaz de producir está disminuida respecto a una planta control que no presenta inhibida dicha ruta metabólica. Tal como se ha explicado anteriormente, la metilación del AIA se lleva a cabo, principalmente, por la enzima IAMT1. Por lo tanto, inhibiendo la expresión o la función de dicha enzima, se inhibe o inactiva la metilación del AIA. Por otro lado, como entiende el experto en la materia, también cabe la posibilidad de eliminar o delecionar el gen completo (o parte) que codifica la proteína IAMT1 , de forma que dicha proteína está ausente en la planta (o en unos niveles no detectables por técnicas conocidas).

En una realización particular, la planta de la invención se caracteriza porque la expresión del gen que codifica la IAMT1 está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control, o da lugar a una proteína no funcional.

En la presente invención se entiende que la expresión de un gen está disminuida/reducida, bloqueada o inhibida/eliminada respecto a un control, cuando los niveles de la proteína codificada por el gen y/o la actividad de la proteína son menores en comparación una planta control (planta silvestre o wild type). Así, en el contexto de la presente invención se entiende por "control" a una planta silvestre o wild type. La reducción o eliminación de la expresión o la actividad de la proteína está en orden aumentado de preferencia por lo menos de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Un ensayo sobre cómo se puede determinar la actividad de la proteína IAMT1 se describe en el ejemplo 1 de la presente solicitud (e.g. midiendo la cantidad de AIA-Me).

Las distintas técnicas que pueden emplearse para disminuir, bloquear o inhibir la expresión de un gen son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y su uso es práctica de rutina para el experto en la materia.

Para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos. Para realizar el silenciamiento génico, este puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1 , 10 o menos 50 nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5' y/o 3', ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del gen que codifica la proteína de interés (gen diana que, en la presente invención es el gen que codifica la proteína IAMT1), o de cualquier gen que codifique una proteína con una identidad de secuencia del 50% con la SEQ ID NO: 1.

Un procedimiento para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión del gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante). En dicho procedimiento, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través del silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo, preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende las secuencias de control. Una secuencia de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNhp). El ARNhp se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles generales adicionales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).

La realización de los procedimientos como se describe en el presente documento no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de "silenciamiento génico" bien conocidos para lograr los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión del gen (regulación por disminución). El silenciamiento en este caso se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos, denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés) en una orientación en sentido en una planta. "Orientación en sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reduciría la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introducen diversas copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de la co-supresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de "ácidos nucleicos antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos "en sentido" que codifica una proteína, es decir, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria al gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. La expresión "región codificante" se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácido. La expresión "región no codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (denominado también regiones no traducidas 5' y 3').

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa, pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido para solo a una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5' y 3' del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un transcripto de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede iniciar de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido como se describe en el presente documento puede construirse usando síntesis química y las reacciones de ligamiento enzimático utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para el aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). La transformación o transfección de células vegetales puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales. Como es bien conocido, pueden utilizarse múltiples sistemas tales como vectores plasmídicos, liposomas, electroporación, micro inyección, difusión, bombardeo de partículas (gene gun), coprecipitación con fosfato de calcio, empleo de vectores virales, etc. Para una revisión de la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, el libro titulado Ingeniería genética y transferencia génica, de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, el capítulo 9, titulado Transferencia génica a plantas, páginas 283-316.

Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador. Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los procedimientos descritos en el presente documento (tanto si se introduce en una planta como se genera in situ) se hibridan con o se unen a los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser cualquier complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a los receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al ligar la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento. En el contexto de la presente invención, ejemplos de secuencias de nucleótidos que dan lugar ácidos nucleicos antisentido y que pueden emplearse para silenciar la expresión de un gen se describen en las secuencias SEQ I D NO: 39, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41 (Ejemplo 3). La disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, tal como un ARNm, en el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden utilizarse para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente por tanto el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo: Cech y col. Patente de Estados Unidos N° 4.987.071 ; Y Cech y col. Patente de Estados Unidos N° 5.1 16.742). Como alternativa, los transcriptos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos pueden utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad específica de ribonucleasa de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261 , 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es ampliamente conocido en el estado de la técnica.

El silenciamiento génico también puede producirse por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de transposón) o mediante estrategias como describen, entre otros, Angelí y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede estar provocada por una proteína no funcional. Por ejemplo, la proteína puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que es aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden exhibir su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para el silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569- 84, 1991 ; Helene y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-361992; Y Maher, LJ. Bioassays 14, 807-15, 1992. Las expresiones "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de control de ácidos nucleicos localizada en dirección 5' del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Incluidas en los términos anteriormente mencionados se encuentran las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA que es necesaria para el inicio de transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras en dirección 5', potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. La expresión "elemento regulador" también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. Los promotores en la dirección 5' de la secuencia de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora e 3' tal como terminadores u otras regiones reguladores 3' que se ubican lejos de la ORF. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido. La expresión "unido operativamente" como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Un experto conocerá otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que un polipéptido está implicado. En particular, se puede prever que las moléculas fabricadas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana. Como alternativa, puede establecerse un programa de detección hasta identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden utilizarse, por ejemplo, para realizar recombinación homologa. Para desactivar la expresión génica y/o traducción de ARNm pueden utilizarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Principalmente funcionan para regular la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayor parte de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana.

Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamiento erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) al unirse a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento de bases con ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN se reflejan frecuentemente en niveles de ARNm reducidos de los genes diana. Los microARN artificiales (amiARN), que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden utilizarse para ayudar en el diseño de los amiARN específicos (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Están disponibles para el público las herramientas convenientes para el diseño y la generación de los amiARN y sus precursores (Schwab y col., Plant Ce1 l18, 1 121-1 133,2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta dada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que exista una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica será capaz de adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado.

Por otro lado, también se contempla la posibilidad de llevar modificaciones post- traduccionales para inactivar la proteína IAMT1 y que ésta no pueda llevar a cabo la metilación del AIA. La modificación postraduccional de una proteína es un cambio químico ocurrido en ésta después de su síntesis. Las modificaciones postraduccionales ocurren mediante cambios químicos de los aminoácidos que constituyen las proteínas y pueden ser de muchos tipos. Ejemplos de modificación postraducciones incluyen, sin limitar a, acilación, fosforilación, metilación, hidroxilación, glicosilación, glicación, sulfonilación, prenilación, nitrosilación y nitración.

En resumen, la planta puede ser manipulada genéticamente para obtener plantas en la que el promotor que regula la transcripción del gen en cuestión esté inactivo (por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones en el genoma), administrar compuestos que impidan la transcripción del gen y/o la traducción del ARNm, tales como ARN de interferencia (siARN, miARN o piARN), etc. Por otro lado, la planta de la invención también puede caracterizarse por que la expresión del gen que codifica la IAMT1 da lugar a una proteína no funcional (en la presente invención, la proteína IAMT1 no puede llevar a cabo la metilación del AIA). Como en el caso anterior, técnicas de ingeniería genética pueden emplearse para expresar proteínas no funcionales, por ejemplo, introducción de truncaciones, mutaciones, deleciones, inserciones, etc. que originan que la proteína IAMT1 no pueda desempeñar su función, es decir, no puedan reconocer al sustrato (AIA) y metitarlo. Adicionalmente, técnicas para obtener las plantas de la invención incluyen, pero no se limitan a, la técnica de Tilling y la técnica de CRISPR/CAR.

La técnica de Tilling (del inglés Targeting Induced Local Lesions in Genomes) es una técnica de genética molecular emplea una mutagénesis química inducida, por ejemplo mediante etilmetanosulfonato o naranja de acridina, sobre un grupo de individuos y tras este protocolo, se detecta mediante la técnica adecuada la presencia de mutaciones en el gen deseado. El TILLING combina mutagénenis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimientos. La técnica de TILLING es ampliamente conocida en el estado de la técnica (McCallum y col. 2000, Nat Biotecnol 18: 455-457; revisado por Stemple 2004, Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

La técnica de CRISPR (del inglés de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) puede usarse para introducir mutaciones genéticas en localizaciones específicas del ADN genómico, tal como se describe en la solicitud de patente US2014273235A1.

En una realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. Sin querer estar vinculados a ninguna teoría, se cree que debido a esta deleción, la proteína IAMT1 no es capaz de unirse al AIA (el sustrato) y llevar a cabo su metilación.

Adicionalmente, en el contexto de la presente invención, también se contemplan agentes inhibidores, inactivadores o bloqueadores de la propia proteína IAMT1 (tal como se ha mencionado previamente), y su uso para el incremento o la restauración de la fertilidad de las plantas, consiguiendo con ello una mayor producción de semillas y frutos.

Como se ha explicado previamente, una característica de la planta de la invención es que ésta presenta una fertilidad incrementada con respecto a una planta control, es decir, puede producir más semillas y más frutos que una planta control, tanto en condiciones óptimas como en condiciones de estrés abiótico, tanto por sequía como por altas temperaturas. Así, en una realización particular, la planta presenta un incremento de la fertilidad en condiciones de estrés hídrico (escasez de agua) o térmico (altas temperaturas), más en particular, el incremento de la fertilidad se produce a una temperatura de entre 15°C y 37°C, preferiblemente, de entre 20°C y 29°C, más preferiblemente, en días largos, es decir, en presencia de más de 12 horas de luz.

Como entiende el experto en la materia, la planta de la invención comprende en su genoma el gen que codifica la proteína IAMT1 , en donde la expresión de dicho gen está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control o da lugar a una proteína no funcional. Como se ha explicado anteriormente, dicha expresión disminuida, bloqueada o inhibida o de lugar a una proteína no funcional puede conseguirse mediante técnicas de silenciamiento genético que conlleven la introducción de modificaciones genéticas en el gen que codifica dicha la proteína IAMT1. Por este motivo, dentro de la presente invención, también se contempla el germoplasma derivado de la planta de la invención que lleva incorporado en su genoma la modificación genética que origina que su expresión este disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control o da lugar a una proteína no funcional.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un germoplasma procedente de la planta de la invención en donde dicho germoplasma (i) se selecciona del grupo que consiste en una célula, una célula germinal (polen) y una semilla procedente de dicha planta, y (ii) comprende una modificación genética en el gen que codifica la proteína IAMT1 que origina que su expresión esté disminuida, bloqueada o inhibida o de lugar a una proteína no funcional. En la presente invención se entiende por "germoplasma" el material biológico que contiene la variabilidad genética intraespecífica o a los materiales genéticos que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo.

El término "célula" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una célula vegetal. Así pues, el término célula comprende, al menos, una célula del parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).

En una realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. Método de la invención

Tal como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto que la inhibición de la metilación del AIA da lugar a un incremento en la fertilidad de las plantas. Así, en el contexto de la presente invención, se contempla un método para incrementar o restaurar la fertilidad de una planta que comprende inhibir, disminuir o bloquear la ruta de metilación del AIA. Los métodos y técnicas para inhibir, disminuir o bloquear la ruta de metilación del AIA han sido descritos previamente y son aplicables al presente aspecto inventivo. Entre dichas técnicas, se encuentra la inhibición, la disminución o el bloqueo de la enzima encargada de metilar el AIA, es decir, la proteína IAMT1.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para incrementar la fertilidad de una planta, de aquí en adelante método de la invención, que comprende inhibir, disminuir o bloquear

(i) la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 con respecto a un control o

(ii) la actividad de la proteína IAMT1.

Los términos "inhibir", "disminuir" y "bloquear" han sido definidos y explicados previamente en la presente descripción, así como los métodos que existen en el estado de la técnica para inhibir, disminuir o bloquear la expresión de genes o la actividad de las enzimas. Dichas definiciones y explicaciones son aplicables al presente aspecto inventivo.

Así, en una realización particular, la planta pertenece al género Solanum sp., en particular, a la especie Solanum lycopersicum (tomate).

En otra realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 50% con la SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, la inhibición, la disminución o el bloqueo de la expresión del gen o de la actividad de la proteína se lleva a cabo mediante la técnica CRISPR o TILLING.

En otra realización particular, se produce un incremento de fertilidad en condiciones de estrés hídrico o estrés térmico.

Todas estas realizaciones particulares han sido descritas en detalle previamente en el presente documento y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Uso del gen que codifica la proteína IAMT1

Tal como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la pérdida de la función de la enzima IAMT1 acelera el crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas control (ver Ejemplo 1 y Figuras 5 y 6) y con ello, se incrementa la fertilidad de las plantas, lo que se traduce en un mayor rendimiento de los cultivos al obtener plantas que generan más semillas y con ello, más frutos.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del gen que codifica la proteína IAMT1 para incrementar de fertilidad de la planta.

En la presente invención, se entiende por "incrementar la fertilidad" a la mayor producción de semillas con respecto a una planta control, tanto en condiciones óptimas como en condiciones de estrés abiótico, tanto por sequía como por altas temperaturas. En una realización particular, dicho incremento de fertilidad se produce por inhibición, bloqueo o disminución de la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 , o por la expresión de dicho gen de una proteína IAMT1 no funcional.

En otra realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 50% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. Todas estas realizaciones particulares así como los términos empleados han sido definidos y/o explicados en los aspectos inventivos anteriores.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Descripción molecular de los alelos mutantes de IAMT1 en Arabidopsis thaliana. (A) Esquema de las inserciones de T-DNA que dan lugar a los alelos iamt1-1 (línea SALK_072125) e iamt1-2 (línea GT_5_41946). (B) Productos de PCR obtenidos por la combinación de oligonucleótidos indicada en cada caso. (C) Nivel de expresión, medido por RT-qPCR, del alelo silvestre del gen IAMT1 en plantas de A. thaliana de 10 días de edad cultivadas en luz continua.

Figura 2. Cuantificación de los niveles de Me-AIA en plántulas silvestres (Col-0) y del muíante iamt1-1 cultivadas durante diez días en luz continúa. La diferencia entre ambos es estadísticamente significativa (p<0,01) [t-student].

Figura 3. Aspecto general de las plantas silvestres (Col-0) y del muíante iamt1-1 cultivadas duraníe 35 días en días largos (16 horas de luz, 8 horas de oscuridad).

Figura 4. Acíividad DR5::GUS en ovarios de plañías silvesíres (Col-0) y del muíaníe iamt1-1. Las flechas indican las regiones más acíivas, que corresponden a las que muesíran mayor acíividad de auxinas (AIA).

Figura 5. Tubos polínicos en ovarios de plañías silvesíres (Col-0) y del muíaníe iamtl- 1 polinizados manualmeníe con polen silvesíre. Los íubos se visualizan medianíe la íinción de la calosa que se acumula a su paso. Las flechas indican hasía donde alcanzan los íubos polínicos en cada ovario, 2 horas después de la polinización.

Figura 6. Producción de silicuas (frutos) en plañías silvesíres (Col-0) y del muíaníe iamt1-1, cuando ésías son culíivadas consíaníemeníe a la íemperaíura ópíima de crecimiento (20°C), a una temperatura alta que provoca estrés (29°C), o cuando se cultivan a 20°C pero se transfieren a 29°C en el momento de la floración. Los resultados son la media de frutos producidos por planta, después de analizar 36 plantas de cada genotipo en cada condición de crecimiento. La diferencia entre ambos genotipos es estadísticamente significativa (p<0,001) [t-student].

Figura 7. Producción de semillas en plantas silvestres (Col-0) y del muíante iamt1-1, cuando éstas son cultivadas constantemente a la temperatura óptima de crecimiento (20°C), a una temperatura alta que provoca estrés (29°C), o cuando se cultivan a 20°C pero se transfieren a 29°C en el momento de la floración. Los resultados son la media de frutos producidos por planta, después de analizar 36 plantas de cada genotipo en cada condición de crecimiento. La diferencia entre ambos genotipos es estadísticamente significativa (p<0,001) [t-student].

Figura 8. Producción de frutos de tomate en plantas sometidas a estrés por sequía y altas temperatura tratadas con auxinas. Las plantas se cultivaron a 25°C en invernadero hasta el momento de comenzar la floración, cuando se transfirieron a una cabina a 37°C y se cesó el riego. La mitad de las plantas fueron rociadas con AIA 100 μΜ y produjeron frutos, mientras que la otra mitad sin AIA no produjeron frutos.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1

Con el fin de analizar el efecto de la mutación del gen IAMT1 en Arabidopsis thaliana, se obtuvieron del centro de germoplasma de Nottinghem (NASC) semillas portadoras de inserciones de T-DNA en la región codificante de dicho gen (Fig. 1A). Éstas correspondían a los códigos SALK_072125 (que se renombró iamtl^) y GT_5_41946 (que se renombró iamt1-2). Se seleccionaron plantas homozigotas para cada una de las inserciones (Fig. 1 B) mediante PCR (ver Técnica 1) utilizando como cebadores los oligonucleótidos indicados en la Tabla 1. En las plantas homozigotas se determinó mediante RT-qPCR (ver Técnica 2 y Tabla 1) el nivel de expresión de un ARNm completo correspondiente a IAMT1 en plantas silvestres (accesión Col-0) y del muíante iamt1-1 en el mismo fondo genético (Fig. 1 C). Teniendo en cuenía la sensibilidad de la técnica, y que se detectan una expresión más de 1000 veces menor en el muíante iamt1-1, el resultado indica que dicho muíante no puede sinteíizar una proíeína IAMT1 compleía en ningún caso. De hecho la muíación iamt1-1 se predice que provocaría en cualquier caso la aparición de una proíeína íruncada en la que no esíaría présenle el posible ceníro acíivo de la proíeína, al fallar varios aminoácidos clave, como la Gly-226.

La deíerminación, mediante la técnica de cromatografía de gases acoplada a especíromeíría de masas (GC-MS) (ver Técnica 3), del Me-AIA producido en plántulas culíivadas en luz coníinua durante diez días indicó que el muíante iamt1-1 no ha perdido compleíameníe la acíividad carboximeíil íransferasa a pesar de no expresar el alelo silvesíre del gen IAMT1 (Fig. 2). A pesar del defecto en IAMT1 , el aspecto general de las plañías muíaníes iamt1-1 era indisíinguible del de plañías conírol (Col- 0) (Fig. 3). Sin embargo, en ovarios del muíante sí que fue posible enconírar una mayor acumulación de AIA libre asociada a la falía de meíilación del AIA, como indica de forma indirecía la íinción de β-glucuronidasa (GUS) en plañías expresando el gen GUS bajo el conírol del promotor DR5, que es inducible por auxinas (AIA) (Fig. 4) (ver Técnica 4).

Para esíudiar el efecto de la muíación de IAMT1 sobre la capacidad reproducíiva de las plañías, se analizó mediante íinción con azul de anilina (Técnica 5) la deposición de calosa en ovarios polinizados manualmente con polen silvesíre. Esía íinción permite visualizar los íubos polínicos mieníras aíraviesan el ovario hasía alcanzar los óvulos. Dos horas después de la polinización, los íubos polínicos apenas habían aíravesado el esíilo de ovarios de plañías silvesíres (Col-0), mieníras que en los ovarios del muíante iamt1-1 los íubos polínicos habían alcanzado ya la posición de los primeros óvulos (Fig. 5).

El crecimiento más rápido de los íubos polínicos en el muíante iamt1-1 sugería que esía caracíerísíica podría conferir una veníaja al muíante en condiciones ambieníales en las que la viabilidad del polen esíá compromeíida, como en casos de sequía o de elevadas íemperaíuras. Para comprobar esía hipótesis, se culíivaron plañías del muíante iamt1-1 y de su pareníal silvesíre (Col-0) hasía compleíar su ciclo viíal en varios regímenes de íemperaíura (conseguidos en fiíoírones regulados a 20°C, o a 29°C). Al finalizar la floración se determinó el número de frutos y de semillas íoíales por plañía. El muíante iamt1-1 produjo siempre más frutos (Fig. 6) y más semillas (Fig. 7) que el conírol de plañías silvesíres en todas las condiciones: (1) cuando las plañías eran cultivadas en días largos a 20°C; (2) cuando las plantas se cultivaron en días largos a 29°C desde la germinación; y (3) cuando las plantas se cultivaron en días largos a 20°C y fueron transferidas, justo en el momento de comenzar la floración, a una cámara con igual luminosidad pero a 29°C. Estos resultados indican que las plantas con una capacidad reducida de metilar el AIA muestran una mayor capacidad reproductiva que las silvestres incluso en condiciones de estrés térmico, posiblemente por el crecimiento acelerado de los tubos polínicos en sus ovarios.

Ejemplo 2

Para comprobar que el enriquecimiento en AIA observado en los ovarios del muíante iamt1-1 de A. thaliana es responsable de su mayor capacidad reproductiva en condiciones de estrés, y para averiguar si este efecto podría extenderse a otras especies vegetales, se realizó un análisis de fertilidad en plantas de tomate (Solanum lycopersicum cv Moneymaker) en condiciones de estrés.

Se cultivaron 16 plantas de tomate a 26°C en invernadero, y en el momento de florecer se transfirieron todas a una cabina a 37°C y se cesó el riego, al tiempo que se rociaban 8 de las plantas con una solución de AIA 100 μΜ, y las 8 restantes sólo con agua. El tratamiento se mantuvo durante dos semanas cada 2 días, y al cabo de ese tiempo se comprobó que ninguna de las plantas tratadas con agua habían producido frutos, mientras que todas las plantas tratadas con AIA habían producido frutos de tamaños variables (Fig. 8). Este resultado está de acuerdo con informes públicos previos utilizando plantas de arroz, y también apoya la idea de que el mayor nivel de AIA en ovarios del muíante iamtl es la causa probable del mantenimienío de la capacidad reproducíiva en condiciones de esírés íérmico y de sequía.

Ejemplo 3: Proíeínas homologas a la proíeína IAMT1 e inhibidores de su expresión

Los inveníores han ideníificado dos proíeínas homologas a la proíeína IAMT1 cuya inhibición aumenía el íamaño de los íubos polínicos. Dichas proíeínas y las secuencias de nucleóíidos que las codifican son las siguieníes:

Proíeína indol-3-aceíaío O-mefilfransferasa 1 (GenBank gi|460397058|ref|XP_004244085.1) procedeníe de Solanum lycopersicum (SEQ ID NO: 28). La secuencia de nucleóíidos que codifica dicha proíeína se describe en la secuencia SEQ ID NO: 29 (gen Solyc07g64990, GeneBank accession number XM_004244037). La secuencia de ADNc se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 30.

Proteína similar a S-adenosil-L-metionina ácido salicílico carboxil metiltransferasa (en inglés S-adenosyl-L-methionine salicylic acid carboxyl methyltransferase-like protein) (AHRD V1 **** Q9FLN8_ARATH) procedente de S. lycopersicum (SEQ ID NO: 31). La secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína se describe en la secuencia SEQ ID NO: 32 (gen Solyc12g14500, Accession number XM_004251872). La secuencia de ADNc se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 33.

Mediante el empleo de técnicas recombinantes se han desarrollado dos fragmentos de ADNc que transferidos a un vector son capaces de inducir el silenciamiento de los genes arriba descritos.

Clonaje de los fragmentos seleccionados

Los fragmentos seleccionados se amplificaron por PCR a partir de ANDc de tomate utilizando los siguientes oligos:

^■ gen Solyc07g64990

S07 for 5'

CCACCCCGACGATATCGGTCCAAAGAAATGAAGAGAGGTG 3' (SEQ ID NO: 34)

S07 rev 5' CGCGTCGTCTGGATGGCTAACCACA 3' (SEQ ID NO: 35)

^■ gen Solyc12g 14500

S12 for ^ 5' GGTCTAAAGAAATGAAGAGAGGTGGT 3' (SEQ ID NO: 36)

S12 rev 5' CTTTGGACCGATATCGTCGGGGTGGTTGACAACTAG 3' (SEQ ID NO: 37)

El fragmento S07 se amplificó con los oligos S07for y S07rev. El fragmento S12 se amplificó con los oligos S12for y S12rev. El fragmento S1207 se amplificó con los oligos S12for y S12rev, utilizando los fragmentos S07 y S12 como molde. Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pCR2.1. Una vez verificadas las secuencias por secuenciación se transfirieron al vector viral pTRV2 mediante digestión con enzimas de restricción y ligación con T4 Ligasa.

Diseño del VIGS (Virus-induced gene silencing):

Se ha usado la herramienta "VIGS tool" de Solgenomics (Tomato Functional Genomics Datábase) para definir las regiones finalmente seleccionadasde cada uno de los genes de Solanum lycopersicum. El resultado es una indicación de las regiones óptimas para utilizar con la técnica VIGS.

Fragmento del cDNA utilizado para transferir al vector viral pTRV2 e inducir el silenciamiento del gen Solyc07g64990 (Desde ahora fragmento S07):

GGTCCAAAGAAATGAAGAGAGGTGGTTCTATGTTTTTAGCTTGTTTAGGTAGAACT

TCTGTTGACCCTACTGATCAAGGTGGGGCTGGACTTCTCTTTGGTACACACTTTCA

AGATGCTTGGGATGATCTTGTCCAAGAGGGCCTAATTACTAGTGAGAAAAGGGAC

AAGTTCAATATTCCAGTGTATGCACCAAGCATTCAAGATTTCAAAGAAGTGGTAGA

AGCAAATGACTCATTCAAAATTAACAATCTTCAAGTTTTTAGGGGAGGTAGCCCTC

TTGTGGTTAGCCATCCAGACGA (SEQ ID NO: 38)

Fragmento del cDNA utilizado para transferir al vector viral pTRV2 e inducir el silenciamiento del gen Solyc12g14500 (Desde ahora fragmento S12):

GGTCTAAAGAAATGAAGAGAGGTGGTTCCATGTTTTTAGTTTGCTTAGGAAGGACC

TCTATGGATCCAATAGACCAAGGTGGGGCTGGACTTCTTTTTGGGACTCATTTTCA

AGATGCTTGGGATGATCTTGTCCAAGAGGGTCTAATTACAAGTGAAAAGAGGGAC

AACTTTAACATCCCAGTGTATGCACCAAGTATACAAGATTTTAAGGAAGTGGTTGA

AGCCAATGGCTCATTCACTATCAACAACCTTCAAGTTTTTAGGGGAGGGAGTCCTC

TAGTTGTCAACCACCCCGACGAT (SEQ ID NO: 39)

Fragmento generado combinando los dos fragmentos seleccionados de cada gen para transferir al vector viral pTRV2 e inducir el silenciamiento de ambos genes (Solyc07g64990 y Solyc12g14500; desde ahora fragmento S1207)

GGTCTAAAGAAATGAAGAGAGGTGGTTCCATGTTTTTAGTTTGCTTAGGAAGGACC TCTATGGATCCAATAGACCAAGGTGGGGCTGGACTTCTTTTTGGGACTCATTTTCA AGATGCTTGGGATGATCTTGTCCAAGAGGGTCTAATTACAAGTGAAAAGAGGGAC AACTTTAACATCCCAGTGTATGCACCAAGTATACAAGATTTTAAGGAAGTGGTTGA AGCCAATGGCTCATTCACTATCAACAACCTTCAAGTTTTTAGGGGAGGGAGTCCTC TAGTTGTCAACCACCCCGACGATATCGGTCCAAAGAAATGAAGAGAGGTGGTTCT ATGTTTTTAGCTTGTTTAGGTAGAACTTCTGTTGACCCTACTGATCAAGGTGGGGC TGGACTTCTCTTTGGTACACACTTTCAAGATGCTTGGGATGATCTTGTCCAAGAGG GCCTAATTACTAGTGAGAAAAGGGACAAGTTCAATATTCCAGTGTATGCACCAAGC ATTCAAGATTTCAAAGAAGTGGTAGAAGCAAATGACTCATTCAAAATTAACAATCTT CAAGTTTTTAGGGGAGGTAGCCCTCTTGTGGTTAGCCATCCAGACGACGCG (SEQ ID NO: 40).

MÉTODOS

TÉCNICA 1. Genotipado por PCR de las inserciones de T-DNA.

Se extrajo el ADN de las plantas empleando el método descrito en Edwards K, Johnstone C, Thompson C (1991), Nucleic Acids Res 19: 1349, usando los cebadores indicados en la Tabla 1 en las combinaciones indicadas en la figura 1 , se realizó la reacción estándar de PCR empleando la enzima ExTaq (Takara) y un programa de 30 ciclos (30 segundos a 95°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto a 68°C)

Tabla 1. Oligonucleótidos usados como cebadores en reacciones de PCR

TÉCNICA 2. RT-qPCR de IAMT1 en el mutante iamt1-1. Se extrajo el ARN de las plantas empleando el Mini kit RNAeasy (QIAgen) siguiendo el protocolo indicado por la casa comercial. La síntesis del cDNA se realizó a partir de 1 μg de ARN mediante el kit Superscript III (LifeTechnologies), siguiendo las instrucciones de la casa comercial, y la qPCR de IAMT1 y del gen control EF1a se efectuó con los cebadores indicados en la Tabla 1 y el kit SYBR Green Quantitative (Sigma).

TÉCNICA 3. Cuantificación del Me-AIA.

Se recogieron plántulas de Arabidopsis thaliana de diez días cultivadas en luz continua y se congelaron en nitrógeno líquido. La extracción se realizó a partir de 100 mg de tejido, con tres réplicas biológicas en paralelo para cada genotipo. Se añadieron 1 mL de metanol y 50 pmol de 2H-Me-AIA, se calentó la mezcla durante 2 minutos a 60°C y después se mantuvo durante al menos 1 hora a temperatura ambiente hasta que todo el metanol se evaporó. El sedimento se disolvió en 2 mL de tampón fosfato sódico (50 mM, pH 7.0) conteniendo 5% de metanol, y se sometió a 10 minutos de tratamiento de ultrasonidos (Branson B5510DTH, Branson Ultrasonics, Dunbury, EEUU). A continuación se ajustó el pH a 2,5 con ácido clorhídrico 1 M, y se purificó la muestra mediante extracción en fase sólida usando columnas Oasis HLB 1 mL / 30 mg (Waters Corporation, Milford, EEUU) acondicionadas con 1 mL de metanol y 1 mL de agua, y equilibradas con 0,5 mL de tampón fosfato sódico (50 mM, pH 2,5). Tras la aplicación de la muestra, la columna se lavó dos veces con 1 mL de metanol 5%, y se eluyó con 2 mL de metanol 80%. El eluído se secó completamente usando un concentrador a vacío (Vacufuge plus, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). A cada extracto se le añadió entonces 20 μΙ de Ν,Ο-bis (trimetilsilil trifluoroacetamida con 1 % de trimetilclorosilano (BSTFA+TMCS, 99: 1 (v/v), Supelco, Bellefonte, EEUU). Se transfirieron los extractos a viales de 400 μΙ de GC-MS, y se incubaron durante 70 minutos a 60°C.

Para analizar el Me-AIA, se inyectó 1 μΙ de cada muestra mediante un autoinyector CombiPAL (CTC Analytics, Zwingen, Suiza) a un cromatógrafo de gases Bruker Scion- 455 (BRUKER Daltonics, Bremen, Alemania) equipado con una columba de 30 m x 0,25 mm con una fase estacionaria de 0,25 mm ZB35 (Phenomenex, Torrance, EEUU). Como fase móvil se usó helio a un flujo de 1 mL/minuto. La temperatura del inyector era de 250°C, y la temperatura de la columna se mantuvo a 50°C durante 1 ,20 minutos. A partir de ahí, la temperatura de la columna fue aumentando a 30°C/minuto hasta alcanzar 120°C, y después a 10°C/minuto hasta los 325°C, manteniéndola a esa temperatura durante 5 minutos más. El efluente de la columna se introdujo en la fuente iónica de un espectrómetro de masas triple cuadrupolo Bruker Scion-TQ, usándolo en modo EI-MRM. La temperatura de transferencia se fijó a 250°C, y la temperatura de la fuente iónica a 200°C. Los iones se generaron con -70 eV en una corriente de emisión de 80 μΑ. El tiempo de permanencia fue de 100 ms, y se registraron las reacciones m/z 261 a 202 (Me-AIA endógeno) y m/z 266 a 207 (2H-Me-AIA estándar). Como gas de colisión se usó argón a 1 ,5 mTorr. La cantidad del compuesto endógeno se calculó a partir del cociente entre la señal del compuesto no marcado y el fragmento conteniendo el isótopo estable.

TÉCNICA 4. Evaluación de la señalización de auxinas mediante DR5::GUS

Se introdujo mediante cruces genéticos el marcador DR5::GUS en el fondo iamt1-1 y en las flores de plantas adultas de este muíante y de su parental en Col-0 se examinó la expresión de este marcador mediante el protocolo estándar de tinción de GUS descrito en Blázquez MA, Soowal L, Lee I, Weigel D (1997), Development 124: 3835- 3844.

TÉCNICA 5. Visualización de los tubos polínicos

Se siguió al pie de la letra lo especificado en la publicación Mori T, Kuroiwa H, Higashiyama T, Kuroiwa T (2006), Nat. Cell Biol. 8: 64-71.