本发明涉及生物医药技术领域， 尤其涉及一种诱导细菌进入活的非可培 养状态的方法。

背景技术

在不利环境下， 多种细菌会进入一种活的非可培养 （vi able but nonculturabl e, VBNC) 状态。 该状态是非芽孢细菌的一种休眠形式， 可以提 高细菌在不利环境下的存活能力。目前已知 60多种细菌都能进入活的非可培 养状态， 其中绝大部分为致病菌。 虽然活的非可培养状态细菌仍然具有代谢 活性， 但在该菌常用的非选择性培养基上不能生长或 形成菌落， 因此常规细 菌检测方法如平板计数法检测不到活的非可培 养状态细菌的存在， 这样就可 能低估检测样品中细菌的数量， 给人 带来安全隐患。 开展有关活的非可培 养状态细菌的特征及形成机制等方面的研究对 有效杀灭活的非可培养状态细 菌至关重要。 但由于获得活的非可培养状态细菌需要很长的 时间， 因此限制 了对其研究的进度。

目前诱导细菌进入活的非可培养状态的方法主 要是寡营养结合低温的方 法。 但该方法所需的诱导时间长， 通常要一个月以上， 丛而限制了对活的非 可培养状态细菌的研究进度。

发明公开

本发明的目的是提供一种诱导细菌进入活的非 可培养状态的方法。 本发明提供的诱导目的细菌进入活的非可培养 状态的方法， 包括如下步 骤- 将目的细菌经高压二氧化碳处理， 使其进入活的非可培养状态。

上述方法中， 所述高压二氧化碳处理的条件如下： 压力为 5-7 MPa、 温 度为 25 37 t、 时间为 5- 60 min ₀

上述方法中， 所述高压二氧化碳处理的条件如下：

压力为 5 MPa、 温度为 25 。C、 时间为 40 min;

或压力为 5 MPa、 温度为 31 °C、 时间为 30 min;

或压力为 5 MPa、 温度为 37 V、 时间为 25 min。

在本发明的实施例中， 所述高压二氧化碳处理为将目的细菌用高压二 氧 化碳装置进行高压二氧化碳处理， 在本发明的实施例中， 高压二氧化碳装置 型号 CAU HPCD 1 (高密度二氧化碳杀菌装置， 在专利 ZL20052(H32590, X中 公开） ， 具体步骤： 将 20 mL待诱导菌液 （细菌悬浮液） 装入玻璃瓶中， 用 封口膜封好；将菌液放入反应釜中，对菌液进 行 HPCD处理，处理压力为 5 MPa, 处理温度为 25 。C， 保压时间为 40 min ; 达到上述处理参数后立即卸压； 得 到诱导后菌液。

上述方法中， 在所述高压二氧化碳处理前还包括如下步骤： 将所述目的 细菌洗涤、 悬浮， 得到细菌悬浮液。

上述方法中， 所述洗涤和所述悬浮均采用生理盐水， 所述生理盐水具体 为 0. 85% (质量百分含量) NaCl水溶液。

上述方法中， 所述目的细菌为处于对数期的目的细菌。

上述方法中， 所述目的细菌为大 II杆菌， 所述大肠杆菌具体为

Escherichia col J 0157 : H7。

在上述方法中， 在高压二氧化碳处理后， 还包括如下步骤： 检测经过诱 导处理后的目的细菌的活菌数和可培养菌数； 若可培养菌数为零面活菌数不 为零， 则目的细菌进入了活的非可培养状态； 其中， 检测经过诱导处理后的 目的细菌活菌数采用 pi/srro 9双染法， 检测经过诱导处理后的目的细菌可 培养菌数采用平板计数法。

本发明的另一个目的是提供一种细菌培养方法 。

本发明提供的细菌培养方法， 包括上述方法的步骤。 实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得 到。

下面结合实施例对本发明做进一步说明， 以上实施例仅用以说明本发明 的技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施对本发明进行了洋细说明， 本领域 的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换, 而不脱离本发明技:术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范 围当中。

实施例 1、 诱导细菌进入活的非可培养状态

一、 高压二氧化碳诱导

1、 细菌悬浮液制备 采用 0.85% (质量百分含量） C1水溶液洗涤对数生长期的 £ coli 0157 :H7 (菌株编号 NCTC12900) 菌体两次， 然后用 0.85% (质量百分含量) NaCi水溶液重悬菌体， 使菌体浓度约为 10 ⁸ cfu/mL, 作为待诱导菌液 （细菌 悬浮液） ；

2、 高压二氧化碳处理

实验组： 用自行设计的高压二氧化碳杀菌机（型号 CAU-- HPCD 1, 高密度 二氧化碳杀菌装置， 在专利 ZL200520132590. X中公开）对菌液进行高压二氧 化碳处理； 具体步骤： 将 20 nL待诱导菌液 （细菌悬浮液） 装入玻璃瓶中， 用封口膜封好； 将菌液放入反应釜中， 对菌液进行 HPCD处理， 处理压力为 5 MPa, 处理温度为 25 V ' 保压时间为 40 min; 达到上述处理参数后立即卸压； 得到诱导后菌液。

对照组： 待诱导菌液不进行高压二氧化碳处理， 只在 25 Ό放置 40min。 二、 检测

活菌数测定方法： 采用 PI/SYTO 9双染法； 具体步骤： 将配比好的染料 混合物 (PI:SYT0 9体积比为 1:1) 与诱导后菌液按照 3:1000的比铜混合， 混合均匀后在室温下避光孵育 15 min 孵育完成后， 在荧光显微镜下观察 (1000X) 并计数， 通常需要选择 10个视野， 而且一个样品要做两次重复。

可培养菌数测定方法：采用平板计数法；具体 步骤：参照 GB 4789.2-2010 方法， 将诱导后菌液用 0,85% NaCl进行 10倍逐级稀释， 根据预实验吸取 3 个连续稀释度的稀释样 1 mL于灭菌平皿中， 倒入约 20 mL TSA培养基摇匀， 待培养基凝固后倒置于 37 'C培养箱中培养 24 h, 然后记录菌落数。

采用上述方法分别检测实验组和对照组的活菌 数和可培养菌数， 从而计 算活的非可培养状态菌数 （活菌数 可培养菌数） 。

以检测细菌是否进入了活的非可培养状态， 当可培养菌数为零而活菌数 不为零时就认为细菌进入了活的非可培养状态 。

结果如下： 实验组诱导后菌液的活菌数为 10 ⁶ · ⁷⁹ cfa/mL _; 诱导后菌液的 可培养菌数为 0; 进入了活的非可培养状态的菌数为 W ⁶ . ⁷⁹ _C fii/mL。

对照组的可培养菌数仍约为 10 ^s cfu/mL, 基本认为没有活的非可培养状 态的菌。

因此， 可以看出， 本发明的方法在高压二氧化碳诱导 40 min Εΐί获得了活 的非可培养状态的 £ _C a/i0157:H7 _o 而目前采用的寡营养结合低温法需要 1 个月的时间， 因此本发明的方法可以诱导细菌快速进入活的 非可培养状态。 实施例 、 诱导细菌进入活的非可培养状态

一、 高压二氧化碳诱导

1、 细菌悬浮液制备

与实施例 1中的一的步骤 1的方法相同。

2、 高压二氧化碳诱导

与实施例 1中的一的步骤 2的方法基本相同， 仅将处理温度变为 31 V， 保 压时间变为 30 min ; 得到诱导后菌液。

二、 检测

与实施倒 1中的二的方法相同。

结果如下： 实验组诱导后菌液的活菌数为 W cfu/mL; 诱导后菌液的可 培养菌数为 0 _; 因此进入了活的非可培养状态的菌数为 l( ^8s cfu/mL。

对照组的可培养菌数仍约为 10 ⁸ cfu/rnl. 基本认为没有活的非可培养状 态的菌。

因此， 可以看出， 本发明的方法在高压二氧化碳诱导 30 min时获得了活 的非可培养状态的 £ _co 7i 0l57 : H7。

本实施例同实施例 1相比， 高压二氧化碳使£ co7i 0157 : H7进入活的 非可培养状态的诱导时间更加缩短， 而且获得的活的非可培养状态的菌数与 实施例 1接近。

实施例 3、 诱导细菌快速进入活的非可培养状态

一、 高压二氧化碳诱导

1、 细菌悬浮液制备

与实施例〖中的一的步骤 1的方法相同。

2、 高压二氧化碳诱导

与实施铜 1中的一的步骤 1的方法基本相同， 仅将处理温度变为 37 。C， 保 压时间变为 25 niin; 得到诱导后菌液。

结果如下： 实验组诱导后菌液的活菌数为 10 ⁵ ' ⁷² _C fii/mL _; 诱导后菌液的可 培养菌数为 0 ; 因 进入了活的非可培养状态的菌数为 10 ⁵ ' ⁷² cf _U /mL。

对照组的可培养菌数仍约为 10 ⁸ cfu/mL , 基本认为没有活的非可培养状 态的菌。

因此， 可以看出， 本发明的方法在高压二氧化碳诱导 25 min时获得了活 的非可培养状态的 A 0157 : H7。

本实施例同实施例 1和 2相比， 高压二氧化碳使 K coli 0157 : H7进入 活的非可培养状态的诱导时间更短， 但获得的活的非可培养状态的菌数要低 于实施例〗和 2。

工业应用

本发明的实验证明， 本发明开发一种诱导细菌进入活的非可培养状 态的 方法， 利用高压二氧化碳技术处理细菌， 可促使细菌在 1 h之内快速进入活 的非可培养状态； 本发明的方法加快了活的非可培养状态细菌的 制备， 提高 了有关活的非可培养状态细菌的研究进度。