Therapeutisch wirksame Proteine wie Erythropoietin, Insulin oder Interferone, sind seit langem bekannt.

Viele dieser Proteine sind bereits als Arzneimittel zugelassen und werden dementsprechend häufig einge- setzt. Aufgrund der hohen mit der Entwicklung und Zulassung dieser Medikamente verbundenen Kosten be- steht jedoch ein Bedarf an einfachen und kostengün- stigen Alternativen zur Bereitstellung von thera- peutisch wirksamen Proteinen. Zudem sind nicht alle therapeutisch wirksamen Proteine als Arzneimittel zugelassen. Gleichwohl besteht jedoch häufig der Bedarf, auch diese Proteine dem Patienten zu appli- zieren. Von besonderer Bedeutung sind dabei auf- grund ihrer mutmaßlichen guten Körpervertraglich- keit autologe, das heißt körpereigene, Proteine. Zu diesen Proteinen gehören der Interleukin-1 Rezep- tor-Antagonist, Interleukin 4, Interleukin 10 und der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor Typ I oder Typ II.

Die Stimulation von Monocyten durch adhärentes Im- munglobulin G zur Bildung des Interleukin-1-Rezep- tor-Antagonisten wird von Arend und Leung in Immu- nological Reviews (1994) 139,71-78 und Moore et al. in Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1992) 6, 569-575, beschrieben. Andersen et al. in Autommu- nity (1995) 22,127-133 erläutert, daß der thera- peutische in vivo zu beobachtende Effekt von Im- munglobulin G nicht auf eine verstärkte Bildung von Interleukin-1-Rezeptor-Antagonistzurückgeführt werden kann und daß die in vitro Bildung des Inter- leukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IRAP, IL-lra) durch Monocyten in Abhängigkeit von an Polypropylen ab- sorbierten Serums-und Plasma-Bestandteilen statt- findet. Verfahren zur Herstellung unmittelbar in einer Therapie einsetzbaren IL-lra werden in diesen Druckschriften nicht beschrieben.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zur Herstellung therapeutisch wirksamer Proteine bereitzustellen, die als kostengünstige und schnell durchzuführende Alternative zum Einsatz und zur Herstellung konventioneller Arzneimittel- präparate dienen.

Die Erfindung löst dieses Problem, indem ein Ver- fahren zur Herstellung mindestens eines therapeu- tisch wirksamen Proteins oder eines Proteingemi- sches in einer Spritze bereitgestellt wird, wobei innere Strukturen der Spritze mit Induktoren, ins- besondere Immunglobulinen, beschichtet werden, die Spritze mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten gefüllt, inkubiert und das therapeutisch wirksame Protein in der Körperflüssigkeit gebildet wird. Die Erfindung sieht also in einem ersten Verfahrens- schritt vor, daß innere Strukturen der Spritze mit Induktoren, insbesondere Immunglobulinen, beschich- tet und diese dort immobilisiert werden. Nach der Beschichtung wird die Spritze in einem zweiten Ver- fahrensschritt mit einer Körperflüssigkeit, insbe- sondere Blut, Lymphflüssigkeit, Speichel oder Urin, gefüllt und inkubiert. Vorzugsweise wird die Kör- perflüssigkeit dem Patienten direkt mit der Spritze entnommen. Die an der inneren Struktur der Spritze immobilisierten Induktoren, insbesondere Immunglo- buline, induzieren in der Körperflüssigkeit spezi- fisch, das heißt je nach eingesetztem Induktor, insbesondere Immunglobulin, und eingesetzter Kör- perflüssigkeit, die Bildung therapeutisch wirksamer Proteine, die demgemäß in der in der Spritze vor- handenen Körperflüssigkeit angereichert beziehungs- weise gebildet werden. Die so angereicherte Körper- flüssigkeit kann in der Spritze steril gelagert und bei Bedarf dem Patienten direkt ohne weitere Be- handlung oder beispielsweise nach Zentrifugation und/oder Sterilfiltration wieder zugeführt werden.

Die Erfindung sieht auch vor, daß die Bildung meh- rerer Proteine in einer Körperflüssigkeit simultan induziert wird, so daß eine Körperflüssigkeit ge- bildet wird, die eine erhöhte Konzentration mehre- rer Proteine aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer inneren Struktur einer Spritze jegli- cher Bereich oder jegliche Struktur der Spritze verstanden, der in ihrem Inneren liegt, mit der aufzunehmenden Körperflüssigkeit in Kontakt kommt und mit Induktoren, insbesondere Immunglobulinen, beschichtet werden kann. In besonders vorteilhafter Weise ist die innere Struktur einer Spritze deren innere Oberfläche gegebenenfalls eine Oberfläche mit einer Strukturierung zur Oberflächenvergröße- rung. Die innere Struktur kann jedoch entweder al- ternativ oder zusätzlich durch Partikel, Kugeln, Gele, Glaswolle, Granulat oder ähnliches gebildet sein, um die innere Oberfläche der Spritze zu ver- größern und so eine größere Beschichtungsoberfläche für die Induktoren, insbesondere Immunglobuline, zur Verfügung zu stellen.

In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfin- dung ist vorgesehen, daß die Spritze, insbesondere die innere Struktur der Spritze, aus Polystyrol, Polypropylen, Glas oder einem ähnlichen Stoff her- gestellt ist, das heißt aus diesen Stoffen besteht oder diese Stoffe im wesentlichen enthält, solange dieser Stoff Induktor-bindende, insbesondere Im- munglobulin-bindende, Eigenschaften aufweist, also eine Adhäsion der Induktoren, insbesondere Im- munglobuline, ermöglicht. In einer bevorzugten Aus- führungsform der Erfindung ist vorgesehen, die in- nere Struktur einer Spritze herzustellen, indem die an sich nicht Protein-bindende innere Struktur der Spritze mit einer Protein-bindenden Beschichtung versehen wird.

Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft insofern, als daß ein einfach durchzuführendes Verfahren be- reitgestellt wird, mit dem autologe, durch Induk- tion, insbesondere Immunglobulin-Induktion, her- stellbare therapeutisch wirksame Proteine herge- stellt werden können und in der so hergestellten Form, das heißt zusammen mit den anderen Bestand- teilen der in der Spritze befindlichen Flüssigkeit dem Patienten direkt, das heißt ohne weitere Mani- pulation wie zum Beispiel Umfüllen in andere Behäl- ter, wieder appliziert werden können. Gegebenen- falls kann zur Abtrennung von festen Bestandteilen eine Zentrifugation und/oder Sterilfiltration vor- gesehen werden. Der Einsatz kommerziell erhältli- cher oftmals teuerer Arzneimittel wird daher aber- flüssig. Zudem ist der Einsatz von therapeutisch wirksamen autologen Proteinen möglich, die bisher arzneimittelrechtlich noch nicht zugelassen und da- her nicht verfügbar sind. Schließlich erweist sich die Erfindung als vorteilhaft, als daß eine Konta- mination, Verunreinigung, Infektion oder ähnliches des therapeutisch wirksamen Proteins vermieden wird, die auf einer außerhalb des Patienten statt- findenden Arzneimittelherstellung beruht.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das therapeutisch wirk- same Protein Interleukin 4, Interleukin 10 oder löslicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor Typ I oder Typ II, besonders bevorzugt der Interleukin-1 Re- zeptor-Antagonist (IRAP oder IL-lra).

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung ist das Im- munglobulin, mit dem die innere Struktur der Spritze beschichtet wird, Immunglobulin G. Im Zu- sammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird un- ter einem Immunglobulin G isoliertes Immunglobulin G aber auch Immunglobulin G-haltige Immunkomplexe, Immunglobulin G-haltige Präparationen wie Sera, Plasma oder das Immunglobulin G Fc-Fragment bezie- hungsweise dieses enthaltende Präparationen oder Komplexe verstanden.

Die vorliegende Erfindung sieht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform also ein Verfahren zur Herstellung des Interleukin-1 Rezeptor-Antagonisten vor, wobei die innere Struktur einer Spritze mit einem Induktor, insbesondere einem Immunglobulin, besonders bevorzugt Immunglobulin G, beschichtet, die Spritze mit einer Körperflüssigkeit, vorzugs- weise Blut, gefüllt, inkubiert und der Interleukin- 1 Rezeptor-Antagonist in der Körperflüssigkeit ge- bildet und angereichert wird. Durch die Bindung oder Adhäsion des Induktors, insbesondere Immunglo- bulin G, an die Oberfläche der inneren Struktur der Spritze ist dieses in der Lage, die im Blut vorhan- denen Monocyten zur Bildung des Interleukin-1 Re- zeptor-Antagonisten zu anzuregen, so daß dieses im Blut angereichert wird. Das sich in der Spritze be- findende Blut kann nach Inkubation, das heißt nach Anreicherung des Interleukin-1 Rezeptor-Antagoni- sten, direkt, ohne weitere Manipulation wie zum Beispiel Umfüllen, wieder dem Patienten zugeführt werden, dem das in die Spritze eingefüllte Blut entnommen worden war. Vorteilhafterweise kann zur Abtrennung fester Bestandteile, wie Zellen, eine Zentrifugation und/oder Sterilfiltration vorgesehen werden. Die Erfindung sieht also auch vor, da$ dem Patienten das Blut mittels der Induktor-beschichte- ten, insbesondere Immunglobulin G-beschichteten, Spritze entnommen, das Blut in der Spritze inku- biert und nach IL-lra-Bildung dem Patienten wieder mit der Spritze zugeführt werden kann. Eine derar- tige Vorgehensweise ist zum Beispiel besonders vor- teilhaft im Bereich der Neuroorthopädie, das heißt beispielsweise bei neurologisch bedingten Rückenbe- schwerden. Für die Behandlung derartiger Beschwer- den kam bisher nur eine Bandscheibenoperation, Cor- tisonbehandlungen, Spülungen mit Kochsalzlösungen oder ähnliches in Betracht. Die vorliegende Erfin- dung erlaubt nun die einfache und kostengünstige Bereitstellung eines therapeutisch wirksamen Prot- eins zur Behandlung der Beschwerden.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, daß die innere Struktur der Spritze zusätzlich mit Anticoagulantien beschichtet wird, insbesondere Heparin. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Anticoagulantien nicht als Beschichtung, sondern ungebunden im Behälter einzusetzen, zum Beispiel in lyophilisiertem oder flüssigem Zustand in die Spritze zu geben.

Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, die Inkubation der Körperflüs- sigkeit in der Spritze aber einen Zeitraum von 12 bis 72 Stunden, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 41°C, insbesondere bei 37°C, durchzuführen.

Die Erfindung sieht in einer Ausgestaltung der Er- findung auch vor, daß nach Bildung des therapeu- tisch wirksamen Proteins in der Körperflüssigkeit die Körperflüssigkeit weiter behandelt wird, um beispielsweise bestimmte Bestandteile dieser abzu- trennen, zum Beispiel Blutplasma oder Blutplätt- chen. Diese Abtrennung kann in bevorzugter Ausfüh- rungsform der Erfindung durch Zentrifugation durch- geführt werden.

Die Erfindung betrifft in einer weiteren Ausfüh- rungsform ein Verfahren zur Herstellung einer zur In-vitro-Induktion von therapeutisch wirksamen Pro- teinen, insbesondere des Interleukin-1 Rezeptor- Antagonisten, geeigneten Spritze, wobei ein Induk- tor, vorzugsweise ein Immunglobulin, insbesondere Immunglobulin G, in die Spritze mit proteinbinden- der innerer Struktur eingebracht und so inkubiert wird, daß der Induktor, insbesondere das Immunglo- bulin G, an die innere Struktur bindet.

Die Erfindung betrifft selbstverständlich auch die so hergestellte Spritze, die in besonders bevorzug- ter Ausführungsform aus Polystyrol, Polypropylen oder Glas hergestellt ist, wobei sich die Spritze durch eine Beschichtung ihrer inneren Struktur mit einem Induktor, insbesondere einem Immunglobulin, vorzugsweise mit Immunglubolin G, auszeichnet.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Im- munglobulinen, insbesondere Immunglobulin G, zum Beschichten von inneren Strukturen von Spritzen, vorzugsweise aus Polystyrol, Polypropylen oder Glas, zur In-vitro-Induktion von therapeutisch wirksamen Proteinen, vorzugsweise dem Interleukin-1 Rezeptor-Antagonisten.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand von Figuren und Ausfüh- rungsbeispielen näher erläutert.

Die Figur zeigt : Die Figur zeigt in schematischer Darstellung eine erfindungsgemäße Spritze.

Beispiel 1 : Die Figur zeigt eine Spritze 1 aus Polystyrol mit einem Stempel 3, einem abschraubbaren Verschluß 5 mit einem Verschlußansatz 13 (male Luer) und einer auf dem Verschlußansatz 13 angeordneten und diesen abschließenden abnehmbaren Kappe 7 mit Septum. Der Stempel 3 weist eine Sollbruchstelle 15 auf. Darge- stellt ist auch mit nicht dargestelltem IgG be- schichtetes Granulat 9 aus Polystyrol. Die Größe der Granulatpartikel 9 liegt zwischen 1 und 3 mm Durchmesser, wobei jedoch auch kleinere Partikel, insbesondere gruger als 100 Fm, eingesetzt werden können.

Zur Herstellung der Spritze 1 wird das Granulat 9 mit einem handelsüblichen IgG-Präparat (Venimmur Behring) beschichtet, indem das IgG-Präparat in die Spritze aufgenommen und das Granulat sowie die Spritzeninnenwand damit benetzt wird. Anschließend wird die Spritze 1 bei Raumtemperatur mindestens 15 Minuten inkubiert, um eine vollständige Bindung des IgG-Präparats an das Granulat 9 und die Spritzenin- nenwand zu gewährleisten. Schließlich wird Heparin (Liquemin N 2500, Heparin-Natrium 2500 I. E.) oder Citrat (ACDA) in die Spritze eingebracht, um eine Koagulation des später aufgenommenen Blutes zu ver- hindern.

Die Spritze 1 wird eingesetzt, indem Blut eines Pa- tienten mit Hilfe eines nicht dargestellten Adap- ters entnommen wird, der die abschraubbare Kappe 7 mittels eines nicht dargestellten Schlauches mit einer nicht dargestellten Kanüle verbindet. Der Ad- apter weist eine Nadel auf, mittels derer das im Verschlußansatz 13 vorhandene Septum durchstochen wird. Anschließend wird der Adapter abgenommen und eine Inkubation des Vollblutes bei 37°C für 24 Stunden unter dem Schutz der abnehmbaren Kappe 7, deren Septum sich selbsttätig geschlossen hat, durchgeführt. Die Inkubation kann stehend oder lie- gend erfolgen. Erfolgt die Inkubation stehend, wird das Plasma durch das Septum und einen sterilen Vor- satzfilter (0,2 ym) abgenommen. Zusätzlich oder al- ternativ kann eine Zentrifugation vorgesehen wer- den. Erfolgt die Inkubation liegend, wird das Blut zentrifugiert und das Plasma durch einen sterilen Vorsatzfilter (0,2 ym) abgenommen. Es kann aber auch vorgesehen sein, das Plasma durch das Septum abzunehmen ohne eine Zentrifugation durchzuführen.

Anschließend wird das Plasma zum Beispiel an einer Nervenwurzel oder einem Gelenk des Patienten rein- jiziert.

Beispiel 2 : Spritze mit Granulat Steriles Granulat aus Polystyrol, Glas oder einem anderen nicht-pyrogenen, proteinbindenden Material wird unter sterilen Bedingungen im Batch-Verfahren mitProtein(zumBeispieleinenachAMGzugelassene<BR> IgG-Präparation(zumBeispielVenimmu,Behring) in sterilem Wasser oder wässrigem Puffer auf 10 bis 100 jum/ml verdünnt) beschichtet und anschließend getrocknet.

Eine herkömmliche Polypropylenspritze (5,10,20 oder 50 ml) wird mit dem proteinbeschichteten Gra- nulat (1,2,4 oder 10 cm3) sowie mit einer hinrei- chenden Menge eines Antikoagulans wie Heparin (Li- quemin, Heparin-Natrium 2500 I. E.) oder Citrat (zum Beispiel ACDA) befüllt.

Die befüllte Spritze wird inklusive Abnahmekanüle und Schlauch verpackt und anschließend Gamma-oder Elektronen-sterilisiert. Auf diese Weise wird Pyro- genfreiheit gewährleistet.

Der Anwender entnimmt das sterile Besteck und ent- nimmt dem Patienten Blut. Die Spritze verfügt an ihrer Öffnung in dem Verschlußansatz aber ein Sep- tum, welches zur Entnahme durch das Abnahmezubehör, also die Nadel des Adapters, durchstochen wird.

Nach Abnahme des Adapters verschließt sich das Sep- tum selbsttätig wieder. Nach Blutentnahme wird der Spritzenstempel an einer Sollbruchstelle abgebro- chen.

Die Spritze mit Blut wird 24 Stunden bei 37°C bis 41°C inkubiert. a) Erfolgt die Inkubation stehend, wird das Plasma durch das Septum und einen sterilen Vorsatzfilter, zum Beispiel 0,2 ym, abgenommen. b) Erfolgt die Inkubation liegend, wird nach Zen- trifugation der Spritze das Plasma durch einen ste- rilen Vorsatzfilter, zum Beispiel 0,2 ym, abgenom- men.

Die Reinjektion des Plasma erfolgt zum Beispiel an einer Nervenwurzel, ins Gelenk oder in die Band- scheibe.

Beispiel 3 : Spritze ohne Granulat Eine Spritze aus einem nicht pyrogenen, proteinbin- denden Material (5,10,20 oder 50 ml) wird steril mit Protein (zum Beispiel eine kommerziell nach AMG zugelassene IgG-Präparation (Venimmu ffi Behring), gegebenenfalls in sterilem Wasser oder wässrigem Puffer auf 10 bis 100 ym/ml verdünnt) beschichtet.

Vorzugsweise besteht die Spritze aus Polystyrol, Glas oder einem speziell modifizierten anderen Ma- terial.

Die beschichtete Spritze wird mit einer hinreichen- den Menge Heparin (Liquemin, Heparin-Natrium 2500 I. E.) oder Citrat (ACDA) befüllt.

Die beschichtete, befüllte Spritze wird inklusive Abnahmekanüle und Schlauch anschließend Gamma-oder Elektronen-sterilisiert. Auf diese Weise wird Pyro- genfreiheit gewährleistet.

Der Anwender entnimmt das sterile Besteck und ent- nimmt dem Patienten Blut. Die Spritze verfügt an der Öffnung über ein in dem Verschlußansatz enthal- tendes Septum, welches zur Entnahme durch das Ab- nahmezubehör, also den eine Nadel aufweisende Adap- ter durchstochen wird. Nach Abnahme des Adapters verschließt sich das Septum selbsttätig wieder.

Nach Blutentnahme wird der Spritzenstempel an einer Sollbruchstelle abgebrochen.

Die Spritze mit Blut wird 24 Stunden bei 37°C bis 41°C inkubiert. a) Erfolgt die Inkubation stehend (zum Beispiel in einem Reagenzglasständer), wird das Plasma durch das Septum abgenommen, wobei eine Filtration durch einen sterilen Vorsatzfilter, zum Beispiel 0,2 ym, erfolgt. b) Erfolgt die Inkubation liegend, wird nach Zen- trifugation der Spritze das Plasma durch das Septum abgenommen, wobei dabei durch einen sterilen Vor- satzfilter, zum Beispiel 0,2 ym, eine Filtration erfolgt.

Die Reinjektion des Plasma erfolgt zum Beispiel an einer Nervenwurzel oder ins Gelenk oder in die Bandscheibe.

Beispiel 4 : Herstellung des Interleukin-1 Rezeptor- Antagonisten in einer Spritze unter Verwendung von Heparin Eine kommerziell erhältliche und arzneimittelrecht- lich zugelassene Immunglobulin G-Präparation (Ven- immuns, Behring) wird in sterilem wässrigem Puffer auf 10 bis 100 yg/ml verdünnt.

Diese Lösung wird in eine sterile Spritze aus Poly- styrol gefüllt, deren innere Oberfläche effizient Protein bindet. Anschließend wird bei Raumtempera- tur eine Inkubation von mindestens 15 Minuten zur Absättigung der inneren Wandfläche mit dem Im- munglobulin G durchgeführt. Die Inkubationszeit kann auch mehr als 24 Stunden betragen.

Nach Abschluß der Inkubation und damit nach Adhä- sion des Immunglobulins G in der inneren Oberfläche der Spritze wird die Immunglobulin G-Lösung aus der Spritze entfernt und die Spritze steril zwischenge- lagert. Arzneimittelrechtlich zugelassenes Heparin (Liquemin, Heparin-Natrium 2500 I. E.) wird in die beschichtete Spritze als Anticoagulanz aufgezogen.

Anschließend wird dem Patienten venöses Blut mit der beschichteten Spritze steril entnommen.

Die Spritze wird bei Raumtemperatur 12 bis 72 Stun- den inkubiert. In dieser Zeit findet eine starke Anreicherung im Plasma enthaltender Proteine, ins- besondere des Interleukin-1 Rezeptor-Antagonisten, im Blutplasma statt. Es konnte eine Konzentration von 1 bis 50 ng/ml des Interleukin-1 Rezeptor- Antagonisten festgestellt werden.

AnschlieBend wird das Blut oder das Plasma dem Pa- tienten mit der beschichteten Spritze injiziert.

Beispiel 5 : Herstellung des Interleukin-1 Rezeptor- Antagonisten in einer Spritze Eine kommerziell erhältliche und arzneimittelrecht- lich zugelassene Immunglobulin G-Präparation (Ve- nimmu 2, Behring) wird sterilem wässrigem Puffer auf 10 bis 100 yg/ml verdünnt.

Diese Lösung wird in eine sterile Polystyrolspritze gefüllt, deren Wandmaterial effizient Proteine bin- det. Eine Inkubation bei Raumtemperatur aber minde- stens 15 Minuten, die der Absättigung der Innen- wandfläche mit dem Immunglobulin G dient, wird durchgeführt.

Nach Abschluß der Inkubation und Adhäsion des Im- munglobulins an der Spritzeninnenwand wird die Im- munglobulin G-Lösung abgenommen und die Spritze steril zwischengelagert.

Anschließend wird dem Patienten venöses Blut mit der Spritze steril entnommen.

Die Spritze wird bei Raumtemperatur über 12 bis 24 Stunden inkubiert. In dieser Zeit findet eine starke Anreicherung im Plasma enthaltender Pro- teine, insbesondere des Interleukin-1 Rezeptor-An- tagonisten, im Blutplasma statt. Es konnte eine Konzentration von 1 bis 50 ng/ml des Interleukin-1 Rezeptor-Antagonisten gefunden werden.

Anschließend wird das verdünnte Blut oder der Kul- turüberstand dem Patienten injiziert.