Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitäts- / Prozesskontrolle von Hopfen, daraus hergestellten Extrakten und (Fertig) Produkten davon, insbesondere sollen qualitativ hochwertige Hopfenextrakte identifiziert werden können.

Hopfen (Humulus) ist eine Pflanzengattung aus der Familie der Hanfgewächse ( Cannabaceae ) mit den Arten Humulus lupulus L. (Synonyme: Cannabis lupulus, Humulus

cordifolius, H. americanus, H. volubilis, H. vulgaris, Lupulus communis, L. humulus, L. scandensj, Japanische Hopfen (Humulus japonicus bzw Humulus scandens (Lour.) Merr) und Yunnan-Hopfen (Humulus yunnanensis Hu) . Die

Gesamtdroge bzw. ein daraus erhaltener Extrakt gilt als Wirkstoff .

Es wurden neben den [alpha]- und [beta] -Bittersäuren die phenolischen Inhaltsstoffe des Hopfens untersucht, wobei neben Xanthohumol zahlreiche weitere Verbindungen vom

Flavontyp in der Hopfenpflanze gefunden wurden (J. F.

Stevens et al . , Phytochemistry 44, 1575-1585 (1997), J. F. Stevens et al . , J. Chromat. A 832 (1-2), 97-107 (1999)). Es handelt sich vor allem um isoprenylierte Flavonoide wie z. B. 6- oder 8-Prenylnaringenin und I soxanthohumol . Stevens et al . (Phytochemistry 53, 759-775 (2000)) untersuchten auch die Chemotaxonomie von Hopfenarten und -taxa (J.F. Stevens et al . , J . Am . Soc . Brew . Chem .56 , 136-145 (1998)). Dem Hopfen wurden immer wieder Östrogene Eigenschaften zugeschrieben. Inzwischen konnte diese Östrogene Aktivität des Hopfens bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass insbesondere die prenylierten Flavone für diese Wirkungen verantwortlich sind (S. R. Milligan et al . , J. Clin.

Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252 (1999)). Für Xanthohumol, das Hauptchalkon des Hopfens, konnten ausgeprägte krebspräventive Eigenschaften nachgewiesen werden (C.

Gerhäuser et al . Molecular Cancer Therapeutics 1, 959-969 (2002) ) .

Technisch wird der Hopfen entweder mit Ethanol oder mit flüssigem oder überkritischem Kohlendioxid extrahiert. Auf Letzteres fallen über 80% der kommerziell verwendeten Hopfenextrakte. Die Technologie der Hopfenextraktion mit Kohlendioxid wurde ausführlich beschrieben von Gardner (D.S. Gardner in, Extraction of Natural Products using near-critical solvents, Ed. M.B. King and T.R. Bott,

Blackie Academic & Professional, Glasgow, 1993) . Die in der Brauwirtschaft eingesetzten überkritischen

Kohlendioxidextrakte werden üblicherweise durch Extraktion bei Drücken von 200-350 bar und 40-60 [deg.]C hergestellt.

Hopfen und dessen Extrakte finden breite Anwendung in Lebensmitteln, Kosmetik und Arzneimitteln. Insbesondere die Inhaltsstoffe wie Prenylchalkone, wie Xanthohumol oder Prenylflavone , wie I soxanthohumol sind von Interesse für Arznei-, Kosmetik- und Lebensmittel.

OChfe o

Xanthohumol (Chalkon)

Isoform von Xanthohumol , Isoxanthohumol (Flavanon)

Weiterhin werden die Arzneimittel relevanten Bestandteile - die Droge - aus den ganzen, getrockneten Blütenständen der weiblichen Pflanze gewonnen. Die getrockneten Hopfenzapfen sind grünlichgelb gefärbt, eiförmig und 2 - 4 cm lang.

Auffällig sind besonders die dachziegelig übereinander liegenden, trockenhäutigen, eiförmig zugespitzten dünnen Deckblätter, welche ebenso wie die Vorblätter und die

Blüten selbst am Grunde Drüsenschuppen besitzen.

Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur

Herstellung von Hopfenextrakten bekannt. Beispielsweise beschreibt DE 10240065 die Anreicherung von geeigneten Hopfenfraktionen oder Herstellung von Hopfenextrakten über die Leitsubstanz Xanthohumol.

Im Stand der Technik ist weiterhin die Anwendung der

Pharmacopoea Europaea (Ph(arm) . Eur . ) zur Analytik für „sonstige Extrakte gemäß Ph . Eur. 6.1" beschrieben.

Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis die Qualität von Hopfenextrakten und deren Produkte zu überwachen und für verschiedene Anwendungen zu sichern. Ferner besteht ein Bedürfnis geeignete Hopfenextrakte zu identifizieren .

Daher ist es Aufgabe der Erfindung ein Prüf erfahren zur Qualitätssicherung von Hopfenextrakten und deren Produkte bereitzustellen .

Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur

Identifizierung von geeigneten Hopfenextrakten und deren Produkte bereitzustellen.

Überraschender Weise konnte festgestellt werden, dass I soxanthohumol eine wesentlich größere Stabilität in

Hopfenextrakten und deren Produkten aufweist. Insbesondere weist I soxanthohumol eine geringere Abbaurate bei Lagerung von Hopfenextrakten und deren Produkten auf.

Dies ist besonders vorteilhaft, da zum einen Isoxanthohumol spezifisch für „Hopfen" ist und Isoxanthohumol sich

hervorragend als analytische Leitsubstanz eignet.

Insbesondere konnte gefunden werden, dass Isoxanthohumol unmittelbar und eindeutig auf die Qualität des

Hopfenextrakts hinweist. Je höher der Gehalt in einer Probe desto besser die erfindungsgemäße Qualitätsprognose.

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur

Qualitätskontrolle von Hopfen, Hopfenextrakten und dessen Hopfenprodukte, wobei Isoxanthumol bestimmt wird.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung von Isoxanthumol als Prüfsubstanz zur Qualitätskontrolle von Hopfen, Hopfenextrakten und dessen Hopfenprodukte, wobei Isoxanthumol bestimmt wird. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Hopfen" einschließlich der Droge, die eingangs genannte

taxonomische Bezeichnung verstanden, insbesondere ist ein „Hopfenextrakt" ein gewonnener Extrakt mittels wässrig und / oder organischen Lösungsmitteln (vorzugsweise Ethanol) . Ferner kann der Extrakt z.B. mittels Pentan, Hexan

entfettet werden. Der Extrakt kann ebenfalls unter Einsatz von Gasen gewonnen werden, insbesondere mit überkritischem Kohlendioxid. Der Extrakt kann als Trockenextrakt

vorliegen .

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter Qualitätskontrolle eine solche verstanden, indem der Gehalt an Isoxanthohumol mindestens 0,005 Gew. % beträgt. Ferner kann der Gehalt über die Zeit von mindestens 1 oder 3 oder vorzugsweise 24 Monaten konstant gehalten werden. Eine erfindungsgemäße gute Qualität ist dadurch gekennzeichnet, dass der nach einer Lagerung von mindestens 1 oder 3 oder vorzugsweise 24 Monaten ermittelte I soxanthohumolgehalt mindestens noch 50 % bis 150 %, vorzugsweise 80 % bis 120 % des ursprünglich zum Zeitpunkt der Einlagerung des Hopfen (produktes ) ersten ermittelten Anfangsgehaltes beträgt. Erfindungsgemäß können Chargen, Proben etc. während des Herstellungsprozesses oder deren Produkte untersucht werden. Dies erlaubt die

Selektion, Identifikation und Überwachung geeigneter

Hopfen ( -produkte ) , z.B. in oder aus einem

Herstellungsprozess .

Weiterhin werden aus solchen Hopfenextrakten im weitesten Sinne Hopfenprodukte gewonnen, wie Lebensmittel, Kosmetik und Arzneimittel, die im weitesten Sinne solche

Hopfenextrakte oder Fraktionen davon enthalten, die

erfindungsgemäß eingeschlossen sein sollen. Nicht

abschließend sind zu nennen: Lebensmittel, insbesondere Bier, Kosmetik und Arzneimittel. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, wobei mittels Prozesskontrolle ein

Hopfenprodukt während der Herstellung auf I soxanthohumol geprüft wird. Dies erlaubt eine direkte Aussage zur

Qualität eines Hopfenproduktes.

Darüber hinaus erlaubt eine solche Prozesskontrolle eine schonende Herstellung von Hopfenprodukten, da der Gehalt von I soxanthohumol kontrolliert werden kann.

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Prozesskontrolle von Hopfenprodukten, wobei der Gehalt von I soxanthohumol kontrolliert wird.

Insbesondere können die Mess-/Zeitpunkte und Probennahmen zum Prozessanfang und Prozessende und laufende

Zwischenmessungen/Probennahmen vorgenommen werden

(Diskontinuierliches Verfahren) . Ebenfalls kann die

Probenahme kontinuierlich vorgenommen werden

(Kontinuierliches Verfahren) .

Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls zur Überwachung von Hopfen, Hopfendroge, Hopfenextrakten und deren Hopfenprodukte eingesetzt werden.

Die Durchführung der Messung kann mittels einschlägig bekannten analytischen Methoden durchgeführt werden (z.B. HPLC, GC, insbesondere HPLC, GC in Kombination mit der Massenspektrometrie, etc.) .

Nachfolgende Beispiele dienen zur Erläuterung der

Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken . Beispiel 1 :

Quantitative High Performance Liquid Chromatography

(quantHPLC)

Verglei chsstandardsubstanzen

Kommerziell erhältliche I soxanthohumol Reinsubstanz,

Kommerziell erhältliche Salizylsäure.

Die Analytik erfolgt auf handelsüblichen

hochleistungsflüssigkeitsehromatographisehen

Gerätekombinationen, vorzugsweise aber nicht zwingend ausgestattet mit einem Bigradientensystem, geeignetem

DefektorSystem (UV und/oder Fluoreszenz und/oder

Leitfähigkeit ) und temperierbarem Säulenofen.

Die Trennung erfolgt auf handelsüblichen Trennsäulen

(beispielsweise gefüllt mit Kieselgel zur Chromatographie, insb. octadecylsyliert (Porengröße 2 bis 10 Mikrometer) mit üblicher Weise verwendeten mobilen Phasen (wässerigorganische Mischungen) , wie nachfolgend beispielhaft detailliert aufgeführt:

Säule: Edelstahl 25 cm x 4 mm innerer Durchmesser,

gepackt mit octadecylsyliertem

Kieselgel zur Chromatographie R (5 \X ) ( z. B. Merck-Kartusche LiChropher 100 RP 18)

Temperatur 20° C

Vorsäule : z. B. Merck LiChrospher 100 RP 18-5

Mobile Pha

A: Wasser : Ameisensäure 99 (V/V)

B: Acetonitril

Gradient :

Zeit [min] Mobile Phase A [%] Mobile Phase B [%]

0 75 25

10 65 35 35 65 35

50 10 90

55 75 25

60 75 25

Flußrate : 1.0 ml / min

Injektions olumen : 50 μΐ

Detektorwellenlänge vorzugsweise 2 i 37 nm (oder 325 nm)

Detektorzelle: 1 cm oder 5 cm

Herstellung der Untersuchungslösungen:

Diejenige Menge Untersuchungsprodukt, die erwartungsgemäß zwischen 0,05 % und 1 % I soxanthohumol enthält, werden in einem 50 ml Meßkolben in 40 ml Methanol unter

gelegentlichem Rühren 30 min im Ultraschallbad behandelt. Nach dem Temperieren wird auf 50 ml aufgefüllt, 15 min gerührt und membranfiltriert. Die vorgeschriebene Menge wird injiziert.

Herstellung der Isoxanthohumol Vergleichslösung:

2.0 mg ± 0.1 Isoxanthohumol (Referenzstandard) werden in 100 ml Methanol gelöst und anschließend 1 zu 20 mit dem

gleichen Lösungsmittel verdünnt. Die vorgeschriebene Menge wird injiziert.

Herstellung der Salizylsäure Vergleichslösung

4.0 mg ± 0.1 of Salizylsäure (Arbeitsstandard) werden wie unter Herstellung der Isoxanthohumol Vergleichslösung beschrieben behandelt. Die vorgeschriebene Menge wird inj i ziert .

Berechnung

Die Berechnung des Gehaltes an Isoxanthohumol im jeweiligen Untersuchungsprodukt erfolgt entweder direkt durch

Vergleich der korrespondierenden Peakflächen gegen den entsprechend zuvor qualifizierten I soxanthohumol- Referenz standard oder unter Verwendung der vorab zwischen I soxanthohumol und Salizylsäure zu ermittelnder

Korrespondenzfaktoren gegen den Arbeitsstandard

Salizylsäure .

Beispiel 2 :

Quantitative Ultra Performance Liquid Chromatographie (quantUPLC)

Prinzip

Die Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) nutzt die Vorteile, die sich aus der Verwendung kleiner Partikel (1,7 pm) unter erhöhtem Arbeitsdruck ergeben, um bei chromatographischen Trennungen eine außerordentliche

Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit (1-5) zu erzielen .

Verglei chsstandardsubstanzen

Kommerziell erhältliche I soxanthohumol Reinsubstanz

Die Analytik erfolgt auf handelsüblichen UPLC- Gerätekombinationen, vorzugsweise aber nicht zwingend ausgestattet mit einem Bigradientensystem, geeignetem DefektorSystem (UV und/oder Fluoreszenz und/oder

Leitfähigkeit ) und temperierbarem Säulenofen.

Die Trennung erfolgt auf handelsüblichen Trennsäulen

(beispielsweise gefüllt mit Kieselgel zur Chromatographie, octadecylsyliert mit üblicher Weise verwendeten mobilen Phasen (wässerig-organische Mischungen) , wie nachfolgend beispielhaft detailliert aufgeführt:

Säule : RP-Säule Agilent Zorbax Eclipse XDB- C18; 4, 6x50 mm; 1,8 pm Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure

Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (V/V)

Detektorwellenlänge: DAD vorzugsweise 287 nm (oder 325 nm)

Fluoreszenz: Anregung: 290 nm

Emission: 410 nm

Säulentemperatur

Herstellung der Untersuchungslösungen :

Diejenige Menge Untersuchungsprodukt, die erwartungsgemäß zwischen 0,05 % und 1 % I soxanthohumol enthält, werden in einem 50 ml Meßkolben in 40 ml Methanol unter

gelegentlichem Rühren 30 min im Ultraschallbad behandelt. Nach dem Temperieren wird auf 50 ml aufgefüllt, 15 min gerührt und membranfiltriert. Die vorgeschriebene Menge wird injiziert.

Herstellung der Isoxanthohumol Vergleichslösung:

2.0 mg ± 0.1 Isoxanthohumol (Referenzstandard) werden in 100 ml Methanol gelöst und anschließend 1 zu 20 mit dem

gleichen Lösungsmittel verdünnt. Die vorgeschriebene Menge wird injiziert. Berechnung

Die Berechnung des Gehaltes an Isoxanthohumol im jeweiligen Untersuchungsprodukt erfolgt durch Vergleich der

korrespondierenden Peakflächen gegen den entsprechend zuvor qualifi zierten I soxanthohumol-Referenz standard