Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Einbringen einer aufzukonzentrierenden biologischen Probe mit biologischem Material in eine zentrifugal-mikrofluidische Kartusche und anschließender Analyse des biologischen Materials mittels eines zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens.

Die Detektion biologischer Materialien spielt in der Prozessindustrie, beispielsweise bei der Überwachung und Reinigung von Industriewasser oder Klär- bzw. Abwasser, in der Lebensmittelproduktion und im Pharma- und Lifescience-Bereich eine zunehmend wichtige Rolle. Derartig zu detektierendes bzw. darauf zu überwachendes biologisches Material können beispielsweise Viren, Bakterien, Algen, Pilze, Keim-/Zellen/Zellkulturen, Mikroorganismen, DNA, RNA und/oder subzelluläre Partikel, insb. Exosomen, sein.

Hierzu werden großvolumige Proben aus den zu untersuchenden bzw. zu überwachenden Prozessen entnommen und das biologische Material angereichert bzw. isoliert, um das angereicherte biologische Material anschließend beispielsweise für die Extraktion von Nukleinsäuren zu verwenden.

So ist beispielsweise in der Patentschrift DE 10 2008 023 297 B4 ein neuartiger Ansatz zur Aufkonzentrierung von Biomolekülen aus einer biologischen Probe und zur nachfolgenden Extraktion von Nukleinsäuren offenbart.

Die Patentschrift beschreibt die Nutzung der Fähigkeit von Alginaten, in Lösungen mit niedrigem Kalziumgehalt zu gelieren und sog. Hydrogele zu bilden. Die Ursache der Gelierung begründet sich in der Einlagerung von Kalziumionen in die Zickzackstruktur der GG-Blöcke. Auf diese Zone lagert sich dann die Zickzackstruktur eines anderen Alginatmoleküls. Es kommt hierdurch zur Ausbildung dreidimensionaler Strukturen. Die Ausbildung von Gelen erfolgt auch in Kombination mit starken Säuren. Die entstandenen Gelstrukturen können darüber hinaus auch wieder spezifisch zerstört werden.

Unter Ausnutzung der Ausbildung von Alginatgelen kann die Anreicherung von Biomolekülen einfach und schnell erfolgen und nachfolgend die Isolierung von Nukleinsäuren durchgeführt werden. Der Ablauf des Verfahrens ist wie folgt beschrieben:

1 . Mischen einer wässrigen Alginatlösung mit einer flüssigen biologischen Probe

2. Zugabe einer wässrigen Lösung, welche die Gelausbildung/ Pelletbildung induziert (z.B. Verwendung einer 1 M Kalziumchloridlösung oder einer 1 %igen Salzsäurelösung)

3. Mischen der Probe und kurze Inkubation bei Raumtemperatur

4. Zentrifugation der Probe und Entfernung des Überstandes

5. Auflösen des Pellets oder Gelstückchens und damit Freisetzung der Biomoleküle und ggf. nachfolgende direkte Isolierung von DNA oder RNA in an sich bekannter Art und Weise.

Das in der Patentschrift offenbarte Verfahren ist extrem effizient und gestattet es, auch großvolumige Proben schnell und einfach für die Anreicherung von Biomolekülen einzusetzen. Allerdings zeigt das beschriebene Verfahren einen großen Nachteil. Die Automatisierung des Prozesses ist schwierig durchzuführen. Dies wird in der Patentschrift damit begründet, dass der Anreicherungsschritt immer mittels Zentrifugation erfolgen muss, welche bekannter Weise in einem automatisierten Prozess nicht einfach umzusetzen ist.

Hier setzt das in der Offenlegungsschrift DE 10 2015 215 894 A1 beschriebene Verfahren zur Anreicherung von Biomolekülen und zur Entfernung der Biomoleküle aus einer biologischen Probe an, in dem ein Verfahren beschrieben wird, welches auf einen Zentrifugationsschritt verzichten kann.

Das Verfahren wird dabei wie folgt beschrieben: 1 . Versetzen einer biologischen flüssigen Probe mit einer Alginatlösung und mit Salzen von di- bzw. polyvalenten Kationen (z.B. Kalzium-, Zink,- oder Aluminiumsalze) oder mit einer Säure

2. Zugabe von magnetischen oder paramagnetischen Partikeln

3. Separieren der Partikel und Entfernen des Probenüberstandes, so dass sich die anzureichernden Biomoleküle vollständig in einem Komplex aus Alginatgel und magnetischen bzw. paramagnetischen Partikeln befinden

4. Freisetzung der komplexierten Biomoleküle dadurch, dass Reagenzien zugesetzt werden, welche die Alginat-Gelstruktur wieder zerstören

5. Nach Zugabe dieser Reagenzien erfolgt eine Resuspendierung der Partikel und eine Inkubation. Die Inkubation dient dabei der Auflösung der Alginat-Gelstruktur und der Freisetzung der Biomoleküle.

6. Nachfolgend werden die magnetischen bzw. paramagnetischen Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes abgetrennt. Der resultierende Überstand enthält die Biomoleküle, welche nachfolgende dann aufgearbeitet oder analysiert werden können.

Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass die Automatisierung nur bedingt mit einem zufriedenstellenden Ergebnis durchzuführen ist. Dies liegt insbesondere daran, dass die Resuspendierung der Partikel und die Inkubation notwendig ist, um die Freisetzung zu ermöglichen und dass dieser Verfahrensschritt relativ viel Zeit benötigt.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren vorzuschlagen, welches besser automatisierbar ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 .

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen einer aufzukonzentrierenden biologischen Probe mit biologischem Material in eine zentrifugal-mikrofluidische Kartusche und anschließender Analyse der biologischen Probe mittels eines zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens, umfasst die folgenden Schritte: a) Mischen der flüssigen biologischen Probe zumindest mit einer wässrigen Alginatlösung; b) Zugabe einer wässrigen Lösung, welche die Gelausbildung/ Pelletbildung induziert; c) Mischen der biologischen Probe und kurze Inkubation, vorzugsweise bei Raumtemperatur, so dass das biologische Material der biologischen Probe in dem Alginatgel gebunden wird; d) Separieren des in dem Alginatgel gebunden biologischen Materials und anschließendes Entfernen des Probenüberstandes; e) Zugabe eines Transferpuffers; f) Einbringen des in dem Alginatgel gebundenen biologischen Materials der biologischen Probe in die zentrifugal-mikrofluidische Kartusche; g) Durchführen des zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens auf an sich bekannte Art und Weise.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren vorgeschlagen, welches die Kombination des in der Patentschrift DE 10 2008 023297 B4 beschriebenen Verfahrens mit einem zentrifugal-mikrofluidischen System vorsieht. Ein aus dem beschriebenen Verfahren resultierender Komplex aus Alginatgel und biologischem Material sowie ggfls. in dem Alginatgel befindlichen magnetischen und/oder paramagnetischen Partikel (im Folgenden auch kurz als PME-Komplex bezeichnet, wobei PME für „Polymer Mediated Enrichment“ steht) kann erfindungsgemäß mit Hilfe eines Transferpuffers direkt in eine zentrifugal-mikrofluidische Kartusche gegeben werden. Grund hierfür ist, dass überraschenderweise herausgefunden wurde, dass im Gegensatz zum dort beschriebenen PME-Workflow keine Ablösung des biologischen Materials aus dem PME-Komplex notwendig ist, um das biologische Material mittels eines zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens nachweisen zu können.

Als biologische Probe kommen hierbei beispielsweise Blut, Serum, Wasser/Abwasser, flüssige Lebensmittel, Homogenisate (aus beispielsweise klinischen oder veterinären Materialien) sowie Lebensmitteln und Beprobungsmaterialien bei der Hygieneüberwachung in Frage. Bei einem zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahren werden Standardlaborprozesse, wie Zentrifugieren, Mischen, Aliquotieren, Lysieren, Amplifizieren und Detektieren in einer mikrofluidischen Kartusche implementiert und durchgeführt. Die mikrofluidischen Kartuschen werden teilweise auch als „Lab-on-a-disc“ bezeichnet und beinhalten mikrofluidische Kanalstrukturen für die Fluidführung und/oder mikrofluidische Kammerstrukturen für das Auffangen von Flüssigkeiten. Die Kartuschen werden auf an sich bekannte Art und Weise in einem rotationsbasierten Verfahren, bei dem die Kartusche mit einer vordefinierten Abfolge von Drehfrequenzen (Frequenzprotokoll) durch ein spezielles Prozessiergerät rotiert werden, bearbeitet, so dass durch die Zentrifugalkraft ein entsprechender Verarbeitungs- und/oder Analyseschritt durchgeführt werden kann.

Eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass vor der Zugabe der wässrigen Lösung in Verfahrensschritt b) magnetische und/oder paramagnetische Partikel zugegeben werden. Insbesondere kann das Verfahren vorsehen, dass beim Verfahrensschritt d) das Separieren mittels eines Magneten durchgeführt wird.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass beim Verfahrensschritt d) das Separieren mittels zentrifugieren durchgeführt wird.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass ein Volumen des zuzugebenden Transferpuffers in Abhängigkeit der zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche gewählt wird. Insbesondere kann das Verfahren vorsehen, dass das Volumen des zuzugebenden Transferpuffers aus dem Bereich von ca. 50-500pL ausgewählt wird.

Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht vor, dass das Einbringen der biologischen Probe in die zentrifugalmikrofluidische Kartusche ohne vorheriges Auflösen und/oder Trennen der in dem Alginatgel gebunden biologischen Probe und ggfls. der in dem Alginatgel befindlichen magnetischen und/oder paramagnetischen Partikel durchgeführt wird.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 : ein erstes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem der PM E-Komplex aus Alginatgel und biologischem Material besteht,

Fig. 2: ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem der PME-Komplex aus Alginatgel, biologischem Material sowie in dem Alginatgel befindlichen magnetischen und/oder paramagnetischen Partikel besteht und

Fig. 3: das Ergebnis eines zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens für eine biologische Probe die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in die zentrifugal-mikrofluidische Kartusche eingebracht wurde, ohne dass zuvor eine Ablösung des biologischen Materials aus dem PME-Komplex erfolgte.

Fig. 1 und 2 zeigen jeweils ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einbringen einer aufzukonzentrierenden biologischen Probe mit biologischem Material in eine zentrifugal-mikrofluidische Kartusche 15 und anschließender Analyse der biologischen Probe mittels eines zentrifugalmikrofluidischen Analyseverfahrens. Hierfür ist in den Fig. 1 und 2 das aus der Patentschrift DE 102008 023 297 B4 bekannt Verfahren schematisch in einem Kasten dargestellt, der mit dem Bezugszeichen 1 versehen ist. Die Neuerung gegenüber diesem bekannten Verfahren ist in einem Kasten mit gestrichelten Linien und Bezugszeichen 2 dargestellt. Die in den Fig. 1 und 2 dargestellten Ausführungsbeispiele unterscheiden sich dahingehend, dass in dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der PME-Komplex 12a aus Alginatgel und biologischem Material besteht und keine magnetischen und/oder paramagnetischen Partikeln umfasst, wohingegen gemäß dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel der PME-Komplex 12b aus Alginatgel, biologischem Material sowie in dem Alginatgel befindlichen magnetischen und/oder paramagnetischen Partikeln besteht. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht nun in einem ersten Schritt vor, dass eine flüssige biologische Probe mit biologischem Material 4 mit einer wässrigen Alginatlösung, bspw. in einem Probengefäß mit einem Deckel 3, gemischt wird. Biologisches Material können, wie bereits eingangs beschrieben Viren, Bakterien, Algen, Pilze, Keim-/Zellen/Zellkulturen, Mikroorganismen, DNA, RNA und/oder subzelluläre Partikel, insb. Exosomen, sein.

In einem daran anschließenden zweiten Schritt 5 wird eine wässrige Lösung, welche die Gelausbildung/ Pelletbildung induziert, zugegeben. Zum Beispiel kann eine 1 M Kalziumchloridlösung oder einer 1 %ige Salzsäurelösung zugegeben werden. Optional können gemäß dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel vor der Zugabe der wässrigen Lösung, die die Gelausbildung/ Pelletbildung induziert, noch magnetische und/oder paramagnetische Partikel der Probe zugegeben werden.

Anschließend wird, in einem dritten Schritt, die biologische Probe 4 gemischt und für eine kurze Zeit inkubiert 6. Die Inkubationszeit kann hierbei im Bereich von 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise im Bereich von 7 bis 25 Minuten, besonders bevorzugt im Bereich von 10 bis 20 Minuten liegen. Das Mischen und die Inkubation erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur und dient dazu, dass das biologische Material der Probe 4 in dem sich ausbildenden Alginatgel gebunden wird.

In einem daran anschließenden vierten Schritt 7 wird das in dem Alginatgel gebundene biologische Material 4 separiert und anschließend der über den separierten Anteil der biologischen Probe 9 überstehende Probenüberstand 8 entfernt. Das Separieren 7 kann dabei auf unterschiedliche Weise erfolgen. So kann das Separieren 7 in dem Fall, dass der Probe 4 keine magnetischen und/oder paramagnetischen Partikel zugesetzt sind, mittels Zentrifugation durchgeführt werden. In dem Fall, dass der Probe zuvor magnetischen und/oder paramagnetischen Partikel zugesetzt wurden, kann die Separation mittels eines außerhalb des Probengefäßes angeordneten (externen) Magnets 16 erfolgen, wie dies in dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel der Fall ist. Nach dem Schritt des Separierens 7 des in dem Alginatgel gebunden biologischen Materials 4 und Entfernen des Überstandes 8 wird in einem fünften Schritt 10 ein Transferpuffer 11 zugegeben. Als Transferpuffer 11 können bspw. Wasser, salzhaltige Puffer wie PBS, Transfermedien für Mikroorganismen oder Viren dienen.

Anschließend wird in einem sechsten Schritt 13 das in dem Alginatgel gebundenen biologischen Material in ein Proben-Inlet 14 der zentrifugalmikrofluidischen Kartusche 15 eingebracht. Das Einbringen kann in an sich bekannter Weise beispielsweise durch Pipettieren in die Kartusche 15 oder Transfer mittels aufsaugfähiger Materialien erfolgen.

In einem letzten Schritt wird das in die zentrifugal-mikrofluidische Kartusche 15 eingebrachte in dem Alginatgel gebundenen biologischen Material durch ein zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens auf an sich bekannte Art und Weise analysiert.

Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines zentrifugal-mikrofluidischen Analyseverfahrens für eine biologische Probe 4 die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in die zentrifugal-mikrofluidische Kartusche 15 eingebracht wurde ohne, dass eine Ablösung des biologischen Materials aus dem PME-Komplex 12a, 12b erfolgte.

Zu Demonstrationszwecken wurden Abwasserproben als biologische Probe entnommen und auf das Virus SARS-CoV-2 hin untersucht. Die Abwasserproben wurde aus einem Zulauf einer Abwasserreinigungsanlage einer Region entnommen, deren tagesaktuelle Inzidenz zum Zeitpunkt der Probenentnahme in etwa bei 300 lag, so dass davon ausgegangen werden kann, dass sich das Virus SARS-CoV-2 im Abwasser befindet. Es wurden insgesamt zwei Proben mit jeweils 10 ml Abwasser entnommen.

Die Abwasserproben wurde gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt und entsprechend in eine zentrifugal-mikrofluidische Kartusche eingebracht und durch ein zentrifugal-mikrofluidisches Analyseverfahren auf das Virus hin untersucht. Als Positivkontrolle wurde in eine der Proben zusätzlich ein artifizieller Virus (AccuPlex™ SARS-CoV-2 Reference Material Kit - Full Genome von Seracare, MA USA) mit 250 Kopien/ml (2500 Kopien pro Probe) gespikt.

Das in Fig. 3 abgebildete Ergebnis zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, ohne das in der Patentschrift DE 10 2008 023 297 B4 beschriebene notwendige Ablösen des biologischen Materials aus dem PME- Komplex, Coronaviren aus Abwasser zu detektieren. Auf einer ersten zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche ließ sich sowohl das Coronavirus (CoV D1.1 - D1.3, durchgezogenen Kurven) als auch die Kartuschen-interne Prozesskontrolle (IC D1.1 - D1.3, gepunktete Kurven) nachweisen. Der zugegebene PME-Komplex störte dabei weder die mikrofluidischen Prozesse noch die molekular-biologische Vervielfältigung von Coronaviren-RNA und Prozesskontrolle mittels PCR auf der Kartusche.

Das frische Abwasser auf der ersten zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche (D1 in Fig. 3) zeigte einen Ct Wert von 33 für den Coronavirus (CoV D1 .1 - D1 .3, durchgezogenen Kurven) und einen Ct Wert von 21 für die interne Prozesskontrolle (zur Verifizierung der Funktionstüchtigkeit des Nachweissystems der Disk, IC D1.1 - D1.3, gepunktete Kurven in Fig. 3). Das frische Abwasser der zweiten zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche (D2 in Fig. 3) zeigt für die interne Prozesskontrolle denselben Ct Wert (IC D2.1 - D2.3, gepunktete Kurve) und für das Coronavirus aufgrund des gespikten artifiziellen Virus jedoch einen niedrigeren Ct Wert von 30 (CoV D2.1 - D2.3, gestrichelte Kurven).

Bezugszeichenliste

An sich bekanntes Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von Nukleinsäuren und/oder Viren aus einer biologischen Probe Erfindungsgemäße Verfahrensschritte Probengefäß mit Deckel

Biologische Probe mit biologischem Material

Verfahrensschritt Zugabe Reagenzien (Magnetpartikel und

Alginatgel)

Inkubationsschritt

Separationsschritt

Probenüberstand bzw. Verfahrensschritt zum Entfernen des Probenüberstandes

Separierter Anteil der biologischen Probe

Verfahrensschritt Zugabe Transferpuffer

Transferpuffer a PME-Komplex ohne magnetische und/oder paramagnetischen Partikeln b PME-Komplex mit magnetische und/oder paramagnetischen Partikeln

T ransfer-Verfahrensschritt

Proben-Inlet einer zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche Zentrifugal-mikrofluidischen Kartusche

Externer Magnet