Le domaine de l'invention est celui de l'analyse de microorganismes cibles dans un échantillon complexe. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes sur un milieu de culture gélose à partir d'un échantillon liquide à analyser ou d'une suspension de microorganismes.

L'isolement de microorganismes sur milieu de culture gélose, à partir d'un échantillon liquide à analyser ou d'une suspension de microorganismes, est une étape souvent indispensable à de nombreux procédés d'analyse microbiologique. Cette étape est notamment utilisée pour réaliser des identifications, vérifier la pureté microbienne d'un échantillon ou encore effectuer un dénombrement bactérien par comptage des colonies isolées ainsi obtenues.

L'une des problématiques majeures pour cette étape d'isolement des bactéries est liée au rapport entre la quantité de microorganismes à étaler et la surface exploitable. En effet, la plupart des supports de milieux géloses ont une surface ne permettant l'isolement que d'une quantité de bactéries comprise entre 15 et 300 UFC (Unité Formant Colonie) donnant tout autant de colonies après croissance.

Dans la plupart des cas, l'échantillon à analyser contient une quantité indéterminée de germes pouvant varier de zéro à plus de 10 ⁸ bactéries par millilitre (ml). Ainsi, pour s'assurer d'un isolement efficace, il est nécessaire en amont de l'étalement sur milieu de culture gélose, de procéder à une série de dilutions en cascade (fréquemment d'un facteur 10), afin de réduire par paliers successifs la charge microbienne de l'échantillon. Un volume déterminé de chaque dilution ainsi réalisée est ensuite étalé sur milieu gélose. Les boites de Pétri correspondant à chacune des dilutions sont ensuite incubées dans une enceinte thermostatée. Après croissance microbienne, il est possible de sélectionner la boite de pétri de milieu gélose dont la charge microbienne sur boite est suffisamment faible pour distinguer et éventuellement repiquer des colonies isolées.

Dans l'optique de réaliser un dénombrement microbien, il est indispensable d'utiliser une boite de pétri ne comprenant que des colonies isolées. Le résultat obtenu de cette façon est considéré fiable lorsqu'il est compris entre 15 et 300 colonies isolées. Bien qu'efficace, la réalisation de méthodes classiques d'isolement telles que décrites précédemment présentent l'inconvénient d'être très laborieuses et de consommer un nombre important de réactifs (boites de pétri, tubes de diluants, oeses etc., générateur d'un volume élevé de déchets (autoclavage, coût du traitement).

Certaines méthodes manuelles se sont vues automatisées grâce à la mise au point de dispositif. C'est le cas par exemple du document EP-O 242 114 qui décrit un appareil et une méthode d'ensemencement d'un milieu de culture avec un échantillon. La méthode consiste à réaliser plusieurs segments d'étalement à partir d'un inoculum. Ces segments sont sous la forme d'arc de cercle et sont réalisés au moyen de quatre têtes d'étalement différentes. Un effet de dilution de l'échantillon est obtenu par chevauchement partiel des segments subséquents. La méthode décrite dans le document est en fait très proche de la méthode d'isolement manuelle de référence qui consiste à réaliser plusieurs segments d'étalement à partir d'un seul inoculum en réalisant des chevauchements des segments afin de charger le moyen d'ensemencement en bactéries et d'obtenir un appauvrissement en bactéries lors du segment d'étalement subséquent.

Le document FR- A-2 694 570 décrit un procédé et un système pour déposer des solutions bactériennes sur un milieu de culture à l'aide d'un stylet en communication fluidique via un tuyau à un distributeur de solution bactérienne et alimenté au moyen d'un vérin. La solution bactérienne est déposée sous forme de spirales ou de spots, par déplacement en rotation du milieu de culture sur une plateforme ad hoc en même temps que la solution bactérienne est déversée sur le milieu. Une telle méthode ne peut être considérée comme une méthode d'isolement dans la mesure où la solution bactérienne est déversée tout au long du déplacement du milieu par rotation. En effet, il n'y a pas d'appauvrissement en solution bactérienne et donc en bactéries.

Plus récemment, de nouvelles méthodes d'isolement ont vu le jour, permettant l'amélioration de l'épuisement bactérien par l'usage d'un applicateur optimisé (WO-A-2005071055). C'est le cas notamment de la méthode d'ensemencement mise en œuvre dans l'automate commercialisé par la demanderesse sous la référence PREVI™ Isola. La mise en oeuvre de cette nouvelle méthode d'isolement permet l'obtention de colonies isolées à partir d'une gamme plus large de charge microbienne dans l'échantillon initial à analyser. En dépit de l'amélioration apportée par l'utilisation de cet applicateur optimisé, la contrainte liée au rapport charge microbienne / surface de gélose reste réelle et l'utilisation de cette technique peut trouver ses limites avec des échantillons très fortement contaminés. De plus, cette technique ne permet pas à l'heure actuelle de réaliser une évaluation précise de la charge microbienne de l'échantillon initial du fait de la proximité des colonies difficiles à compter.

II ressort de l'état de la technique considéré qu'il n'existe pas de méthode d'isolement, voire de dénombrement de microorganismes, simple à mettre en œuvre à partir d'un échantillon à analyser ou d'une suspension bactérienne, sur un unique milieu de culture gélose et qui permette d'obtenir, sur une surface limitée de gélose, des colonies isolées quelle que soit la charge bactérienne initiale dudit échantillon ou de ladite suspension.

Un premier objectif de la présente invention est donc de fournir un procédé d'isolement de microorganismes plus performant que les procédés de l'état de la technique. Un deuxième objectif de la présente invention est de fournir un procédé de dénombrement plus performant que les procédés de l'état de la technique. Un troisième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes permettant l'obtention de colonies isolées sur gamme de charges en microorganismes très large.

Un quatrième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes permettant d'obtenir une évaluation fiable de la charge en microorganismes de l'échantillon ou de la suspension initial(e).

Un cinquième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes exploitable sur une surface réduite de milieu de culture gélose.

Ces objectifs parmi d'autres sont atteints par la présente invention, qui concerne en premier lieu, un procédé d'isolement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :

• Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,

• Appliquer sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, un moyen d'ensemencement,

• Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement horizontal dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension, et

• Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes.

Un deuxième objet de la présente invention concerne un procédé de dénombrement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :

• Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,

• Appliquer sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, un moyen d'ensemencement,

• Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement horizontal dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension,

• Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes, et

• Compter les colonies de microorganismes présentes à la surface du milieu de culture gélose.

Selon l'invention, la rupture et le rétablissement du contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose pendant le déplacement dudit moyen peut s'apparenter à un saut dudit moyen. Ce saut permet au moyen d'ensemencement d'être appauvri en échantillon ou suspension. En effet, tant que le moyen d'ensemencement est en contact avec le milieu de culture gélose, il entraîne le liquide par drainage capillaire. Lors de la rupture de contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose, ledit moyen d'ensemencent est éloigné de la surface du milieu de culture, jusqu'au décrochement du liquide. Il ne se produit alors plus d'entraînement de la veine liquide. Lors de ce décrochement, le moyen d'ensemencement entraîne avec lui une fraction d'échantillon ou de suspension restée accrochée audit moyen d'ensemencement.

Le déplacement du moyen d'ensemencement, pendant que ce dernier est hors de contact avec le milieu de culture, est poursuivi selon une direction sensiblement parallèle à la surface dudit milieu de culture. Ce déplacement doit être suffisant pour que, lorsque le contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose est rétabli, ce nouveau point de contact soit suffisamment loin du dernier point de contact avant rupture, afin d'éviter tout contact entre le moyen d'ensemencement et l'étalement précédent. En effet, un tel contact peut entraîner un transfert de d'échantillon ou de suspension du premier étalement, et des bactéries associées, sur le moyen d'ensemencement limitant ainsi le phénomène d'appauvrissement. Par ailleurs, ceci reviendrait à réaliser un isolement traditionnel, dans lequel durant un étalement le moyen d'ensemencement recoupe les étalements précédents, afin d'être rechargé.

Lorsque le contact est rétabli, le moyen d'ensemencement reprend son déplacement horizontal sur le milieu de culture gélose, entraînant la fraction d'échantillon ou de suspension restée accrochée, par drainage capillaire et permettant un nouvel étalement de cette fraction.

Plusieurs sauts successifs du moyen d'ensemencement peuvent être réalisés, de sorte qu'à chaque rupture de contact, un décrochement de liquide se produit, accentuant l'appauvrissement en échantillon ou suspension du moyen d'ensemencement.

Les facteurs qui influent sur la quantité d'échantillon ou suspension retenue sur le moyen d'ensemencement lors de la rupture de contact sont essentiellement : - la mouillabilité du milieu de culture gélose

- la tension superficielle de l'échantillon ou de la suspension.

Ces deux paramètres influencent l'angle de contact entre la fraction liquide d'échantillon ou de suspension et la surface du milieu de culture et donc la force nécessaire pour rompre la veine liquide. Ces deux paramètres sont par essence variables selon le type de milieu de culture gélose utilisé, mais également le type d'échantillon ou de suspension à analyser.

Avantageusement, dans les procédés selon l'invention, le moyen d'ensemencement présente une multitude de surfaces de contact avec ledit milieu de culture. Un tel moyen d'ensemencement peut être par exemple un applicateur utilisé avec le système PREVI™ Isola, tel que protégé dans la demande de brevet WO-A-2005071055. Alternativement, le moyen d'ensemencement présente une seule surface de contact avec ledit milieu de culture. Un tel moyen peut être par exemple une oese, une anse de platine ou un écouvillon.

Le déplacement du moyen d'ensemencement peut avantageusement être un déplacement rectiligne. Par mouvement rectiligne, on entend un seul ou plusieurs segments rectilignes, éventuellement de directions différents. Un tel mouvement est classiquement utilisé dans le procédé traditionnel d'isolement à l'aide d'une oese ou d'une anse de platine.

Alternativement, le déplacement du moyen d'ensemencement est un déplacement curviligne. Un tel mouvement est celui utilisé dans le système PREVI™ Isola. En effet, le déplacement du moyen d'ensemencement suit les bords de la boite de Pétri lorsque celle-ci est une boite ronde. Par ailleurs, lorsque la moyen d'ensemencement présente plusieurs surfaces de contact avec le milieu de culture, ce déplacement curviligne permet d'augmenter la longueur de l'étalement.

Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre au moyen d'un système automatisé. Un système particulièrement adapté est le système PREVI™ Isola commercialisé par la demanderesse.

Selon un mode de réalisation préférentiel, le nombre de fois où le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli est compris entre 2 et 6 fois.

Selon un autre mode de réalisation préférentiel, le volume d'échantillon ou de suspension déposé(e) sur le milieu de culture gélose est compris(e) entre 10 et lOOOμl.

Sur un mode de réalisation particulièrement avantageux, les segments d'étalement sont de longueurs variables. En effet, pour un même isolement, il peut être intéressant de réaliser des segments d'étalement successifs de longueurs différentes. C'est le cas notamment pour des échantillons suspectés d'être excessivement chargés en microorganismes. Plusieurs segments d'étalement de longueur limitée vont permettre d'appauvrir le moyen d'ensemencement de façon très rapide, sur un très petite surface de milieu de culture. Les segments d'étalement subséquents sont, par contre, de longueur plus importante pour permettre l'obtention de colonies isolées. Les buts et avantages du procédé selon l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui suit, en lien avec le dessin dans lequel :

La figure 1 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et des isolements réalisés selon différents modes opératoires de la méthode de l'invention, avec une suspension bactérienne à environ 10 ⁸ UFC/ml.

La figure 2 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et des isolements réalisés selon différents modes opératoires de la méthode de l'invention, avec une suspension bactérienne à environ 10 ⁷ UFC/ml.

La figure 3 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et un isolement réalisé selon la méthode de l'invention, suivi d'un dénombrement des colonies bactériennes, avec des suspensions présentant des charges bactériennes variables.

La figure 4 représente les clichés d'une analyse comparative entre un dénombrement des colonies bactériennes, réalisés selon la méthode traditionnelle et un dénombrement des colonies bactériennes, réalisés selon la méthode de l'invention, ainsi que l'évaluation du facteur de distribution de volume de suspension bactérienne après chaque reprise de contact.

EXEMPLES

Exemple 1 : Obtention de colonies isolées à partir d'une solution fortement contaminée, sur une surface de gélose réduite :

Mode opératoire : lOOμl d'une solution fortement chargée en Staphylococcus aureus (10 ⁷ ou 10 ⁸ UFC/ml) sont déposés sur le bord d'une boite de milieu de culture gélose. Ce volume est ensuite étalé manuellement et de façon rectiligne à l'aide d'un moyen d'étalement constitué l'applicateur utilisé avec le système PREVI™ Isola, tel que protégé dans la demande de brevet WO-A-2005071055. Un étalement témoin est réalisé sans effectuer de saut avec l'applicateur. A partir d'un dépôt identique à la condition témoin, différentes étalements sont réalisés en parallèle avec ajout d'un nombre croissant de sauts durant l'étalement.

Figure IA : aucun saut (suspension à environ 10 ⁸ UFC/ml) - Figure IB : 5 sauts (suspension à environ 10 ⁸ UFC/ml)

Figure IC : 6 sauts (suspension à environ 10 ⁸ UFC/ml) - Figure ID : 7 sauts (suspension à environ 10 ⁸ UFC/ml)

Figure 2A : aucun saut (suspension à environ 10 ⁷ UFC/ml) - Figure 2B : 3 sauts (suspension à environ 10 ⁷ UFC/ml)

Figure 2C : 6 sauts (suspension à environ 10 ⁷ UFC/ml)

Après incubation, une recherche des colonies isolées est effectuée et une mesure de la longueur d'étalement nécessaire à l'obtention de ces colonies est réalisée.

Résultats :

Concernant la suspension à 10 ⁸ UFC/ml, la largeur (10 cm) de la boite de Pétri n'est pas suffisante pour permettre l'obtention de colonies isolées avec un étalement par la méthode traditionnelle, à savoir en déplaçant le moyen d'étalement sans réaliser de saut (figure IA).

Lorsque 5 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 7,5 cm de longueur d'étalement.

Lorsque 6 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 4,5 cm de longueur d'étalement.

Lorsque 7 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 1,5 cm de longueur d'étalement.

Concernant la suspension à 10 ⁷ UFC/ml, avec un étalement par la méthode traditionnelle, les premières colonies isolées apparaissent après 7,2 cm de longueur d'étalement (figure 2A).

Lorsque 3 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 3 cm de longueur d'étalement. Lorsque 6 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 4 cm de longueur d'étalement.

Les résultats obtenus montrent que, lorsqu'on effectue des sauts avec le moyen d'ensemencement lors de l'étalement de l'échantillon sur le milieu de culture, l'épuisement en bactéries est plus performant permettant ainsi l'obtention de colonies isolées sur une surface réduite de milieu de culture gélose. Par ailleurs, on constate que plus le nombre de sauts est important, plus la longueur d'étalement de l'échantillon nécessaire à l'obtention de colonies isolées est réduite.

Exemple 2 : Intérêts d'un étalement par saut pour la réalisation d'un modèle permettant un dénombrement fiable de la charge microbienne d'un échantillon sur un milieu gélose :

Mode opératoire : lOOμl de solutions chargées en Staphylococcus aureus à différentes concentrations obtenues par dilutions successives d'un facteur 10 sont déposés sur le bord d'un milieu de culture gélose. Ce volume est ensuite étalé manuellement et de façon rectiligne à l'aide de l'applicateur utilisé sur le système PREVI™ Isola. Un étalement témoin est réalisé sans effectuer de saut avec l'applicateur. A partir d'un dépôt identique à la condition témoin, un étalement comprenant 4 sauts successifs est réalisé en parallèle, ces 4 sauts définissant 5 zones distinctes, désignées zone 1 à zone 5.

Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 3, sur laquelle, la colonne de gauche correspond aux étalements témoins et la colonne de droite aux étalements selon la procédé selon l'invention, avec sauts successifs.

Par ailleurs, la ligne A correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 80 000 et 130 000 UFC.

La ligne B correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 8 000 et 13 000 UFC. La ligne C correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 800 et 1 300 UFC.

La ligne D correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 80 et 130 UFC.

Après incubation des milieux de culture, un dénombrement des colonies isolées est effectué sur chaque zone délimitée par un saut de peigne réalisé lors de l'étalement. Résultats :

II apparaît en premier lieu, que certaines zones ne sont pas dénombrables du fait de la proximité des colonies non isolées.

Les résultats témoins (sans saut) montrent qu'avec un étalement classique, un dénombrement n'est réalisable qu'avec la charge bactérienne la plus faible (de l'ordre de 100 UFC). Ainsi, comme on peut le voir, figure 3, ligne D, colonne de gauche, environ 80 colonies sont isolées.

L'optimisation de l'étalement, par sauts (4 dans cet exemple), permet avec une même charge initiale de délimiter clairement plusieurs zones dont certaines présentent uniquement des colonies isolées et donc comptables.

Ainsi, ligne A, colonne de droite, les zones 4 et 5 comptent respectivement 67 et 34 colonies isolées.

Ligne B, les zones 3, 4 et 5 comptent respectivement 116, 24 et 6 colonies isolées.

Ligne C, les zones 2, 3 et 5 comptent respectivement 113, 11 et 2 colonies isolées. La zone 4 ne comporte aucune colonie.

Ligne D, les zones 1, 2 et 3 comptent respectivement 115, 14 et 1 colonies isolées. La charge étant assez faible, les zones 4 et 5 sont vierges de toutes bactéries.

Dans cet exemple, on observe ainsi une relation étroite entre la charge bactérienne de la suspension et la première zone dénombrable. Il apparaît en effet un décalage de la première zone dénombrable avec l'augmentation d'un facteur 10 de la charge microbienne. La répartition est présentée dans le tableau 1 ci-dessous:

Tableau 1 Ainsi, un modèle mathématique apparaît aisément réalisable pour permettre, à partir de la lecture d'une ou plusieurs zone(s) dénombrable(s), d'obtenir une évaluation relativement précise de la charge bactérienne initiale de la solution.

Exemple 3 : Evaluation du facteur de distribution de volume de solution par la méthode d'étalement par saut

Mode opératoire :

A partir d'une solution calibrée à une charge bactérienne théorique de lOOO UFC/ml, on dépose lOOμl de solution dans la zone de dépôt que l'on étale avec l'applicateur utilisé sur le système PREVI™ Isola, en effectuant ou non des sauts. Le nombre de saut effectués étant compris entre 5 et 8. Après incubation, un dénombrement est réalisé sur chacune des zones délimitées par les sauts. Les résultats sont regroupés sur la figure 4. La ligne A correspond à un étalement sans saut. Les lignes B, C, D et E correspondent respectivement à des étalements avec 5, 6, 7 et 8 sauts.

Résultats :

Le nombre de colonies isolées pour chaque zone est reporté dans le tableau 2 ci- dessous :

Tableau 2

En considérant la répartition des bactéries comme homogène dans la suspension, il est ainsi possible de déterminer le volume de suspension étalé sur chaque zone, en faisant une simple règle de trois. Les résultats sont regroupés dans le tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3

L'analyse des résultats obtenus ci-dessous montre une certaine homogénéité dans la répartition des volumes. En effet, en tenant compte du fait que l'étalement est réalisé manuellement, et par conséquent avec une reproductibilité limitée, on observe aux niveaux des zones 1 à 3 un profil sensiblement similaire de répartition du volume de suspension.

Ainsi, dans la zone 1 qui est la zone de dépôt des 100 μl de suspension, environ 80 % du volume initial reste. Dans la zone 2, le volume déposé est de l'ordre de 15 % du volume initial. Enfin, dans la zone 3, c'est entre 1 et 2% du volume qui est déposé. Les valeurs ainsi obtenues d'une zone à l'autre sont assez proches d'une répartition logarithmique.

Autrement dit, d'une zone à la suivante, le nombre de colonies est environ divisé par dix.

En combinant des données de répartition des volumes de solution par zone, et les valeurs de dénombrement correspondantes, il est possible par une approche mathématique simple de concevoir un modèle de calcul permettant une évaluation de la charge microbienne initiale présente dans l'échantillon de base. Compte tenu de l'amélioration que peut par ailleurs apporter l'automatisation de l'ensemencement, cette méthode permettrait par un unique ensemencement de dénombrer avec précision la charge microbienne d'une solution sur une gamme large de charge microbienne.