METHODE D’ISOLEMENT ET DE DETECTION DE CELLULES SOUCHES

CANCEREUSES

La présente invention concerne une méthode d’isolement et de détection de cellules souches cancéreuses (CSCs) d’organes cibles de cancers hormono-dépendants.

Les organes cibles de cancers hormono-dépendants sont en particulier le sein, l’utérus, la prostate, les ovaires, l’endomètre, la thyroïde et les glandes surrénales.

Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer en France chez la femme. Il touche 48000 personnes par an. Près de 12000 personnes par an décèdent suite à cette pathologie avec environ une femme sur 10 touchée au cours de sa vie. Le taux de survie à 5 ans est très faible dans le cadre d’un cancer du sein métastasé, d’où la notion de précocité du diagnostic qui intervient dans cette pathologie où la présente invention prend tout son sens (Velasco-Velazquez et al., 2011).

Avec près de 3 000 nouveaux cas estimés en 2008 en France, le cancer du col utérin est la onzième cause de cancer chez la femme. Le pic d’incidence est à 40 ans. Le cancer du col utérin est responsable de près de 1 000 décès annuels. Le pic de mortalité est à 50 ans. La majorité des cancers du col utérin sont des carcinomes. Le cancer du col utérin est, dans la majorité des cas, une affection d’origine infectieuse à évolution lente (papillomavirus HPV). Avec près de 54 000 nouveaux cas estimés en France en 2011, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquent, à la fois chez l’homme et dans l’ensemble de la population. Il est très rare avant 50 ans et son incidence augmente progressivement avec l’âge. L’âge moyen au moment du diagnostic est de près de 70 ans.

Le cancer de l’ovaire est la septième cause de cancer chez la femme en incidence avec 4 430 nouveaux cas estimés en 2008. L’âge médian lors du diagnostic est de 65 ans. Le facteur de risque le plus important de cancer de l’ovaire est d’origine génétique.

Le cancer de l’endomètre est le cancer gynécologique le plus fréquent en France, se situant au 5e rang des cancers chez la femme en termes d’incidence avec 6 560 nouveaux cas estimés en 2010. Ce cancer survient généralement après la ménopause. L’âge moyen des patientes lors du diagnostic se situe à 68 ans. Les principaux facteurs de risque du cancer de l’endomètre sont l’obésité, le diabète et le traitement par tamoxifène. Les cancers de la thyroïde sont rares : ils ne représentent que 2 % de l’ensemble des cancers diagnostiqués chaque année en France, soit un peu plus de 8 000 nouveaux cas par an. Cependant, c’est une maladie en constante augmentation : la fréquence des cancers de la thyroïde a progressé de 3 à 5 % chaque année entre 1980 et 2012. La maladie a cependant un bon pronostic : on a déploré 375 décès en 2012, un chiffre en constante diminution depuis plus de trente ans.

Le cancer des glandes surrénales a une incidence annuelle estimée de 1 à 2 cas par million d’habitants. Elle survient le plus souvent chez l’adulte entre 40 et 50 ans mais également chez l’enfant de moins de 15 ans. Cette tumeur est plus souvent observée chez la femme que chez l’homme, sans qu’on en connaisse la raison.

Le cancer du sein comme les autres organes cibles de cancers hormono-dépendants présentent de multiples facteurs induisant un taux de mortalité élevé au sein de la population concernée avec notamment un diagnostic tardif, dont découlent à la fois un cancer plus évolué dit métastatique mais aussi un fort taux de récidive. En effet, ce taux dépend directement du stade auquel est dépisté le cancer. Toutefois, même lorsque le stade de détection est précoce, le taux de récidive reste élevé car certains paramètres ne sont pour l’heure pas pris en compte.

En effet, ce phénomène de récidive peut s’expliquer en partie par la progression tumorale ainsi que par les mécanismes de résistance qui reposent sur l’existence de cellules souches cancéreuses ou cellules initiatrices de tumeur ou cellules pré-cancéreuses, non prise en compte à ce jour. L’échappement thérapeutique de la tumeur aux traitements radio- et chimio- thérapeutique dépend de la présence de ces cellules au sein de la tumeur. Par conséquent, la détection de ces cellules dans le tissu tumoral constitue un moyen de définir le niveau d’agressivité de la tumeur. La caractérisation de biomarqueurs spécifiques des cellules souches cancéreuses est donc d’un grand intérêt diagnostique et pronostique dans le traitement du cancer. Cependant, il n’existe pas actuellement de marqueurs spécifiques des cellules souches cancéreuses (CSCs) qui permettent leur discrimination avec certitude des autres cellules tumorales.

Les difficultés majeures pour isoler et caractériser les CSCs résident dans la taille restreinte de leur population (3 à 4% de la population tumorale) et l’absence de marqueurs spécifiques. Il existe donc un besoin important de diagnostic précoce et de développement d’une nouvelle méthode de détection et/ou d’isolement des cellules souches cancéreuses (Bomken et al., 2010).

Une identification précoce de la présence des cellules souches cancéreuses permettrait aux cliniciens de disposer d’un facteur prédictif de la maladie.

De plus, elle offrirait de nouvelles perspectives dans le diagnostic de dangerosité du cancer.

En effet, l’information supplémentaire disponible pour le clinicien devrait permettre de limiter les risques de récidive ou d’aggravation de la maladie par une adaptation du traitement.

L’établissement de nouveaux marqueurs parait donc d’une importance majeure dans le traitement ciblé de ces pathologies (Tao et al., 2008).

La présente invention concerne une méthode spécifique de détection puisqu’elle ne reconnaît que les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants et est donc plus efficace que les méthodes classiques. De plus, sa mise en œuvre est plus rapide par rapport aux méthodes existantes, car ces dernières ne sont pas généralisables en raison de leur non-reproductibilité et regroupent à la fois des cellules souches et non souches cancéreuses. Les cancers hormono-dépendants sont des cancers sensibles aux hormones sexuelles. Les tumeurs hormono-dépendantes se forment principalement dans des tissus dont le fonctionnement est normalement régulé par des hormones. La croissance des tumeurs est stimulée par les hormones, comme par exemple par la testostérone, hormone sexuelle masculine dans le cas du cancer de la prostate, ou les œstrogènes, hormones sexuelles féminines sécrétées par les ovaires, dans le cas du cancer du sein.

Par l’expression « cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono dépendants », on entend les cellules souches cancéreuses provenant d’organes dans lesquels le développement oncogénique peut être impacté par les hormones présentes dans ces organes, mais également les cellules souches cancéreuses provenant de ces organes lorsque le développement oncogénique n’est pas impacté par les hormones.

Autrement dit, cela correspond aux cellules souches cancéreuses provenant d’organes cibles de cancers hormono-dépendants, mais également auxdites cellules souches cancéreuses provenant desdits organes lorsque les cancers atteignant ces organes ne sont pas hormono- dépendants (cancers non hormono-dépendants). Les organes cibles de cancers hormono-dépendants sont des organes sous influence hormonale.

La fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer et l’Institut National du Cancer donnent comme exemples de cancers hormono-dépendants les cancers du sein, de l’utérus, de la prostate et des ovaires, de l’endomètre, de la thyroïde et des glandes surrénales. A noter que le cancer du sein est également appelé cancer mammaire.

Ainsi, les organes cibles de cancers hormono-dépendants sont en particulier le sein, l’utérus, la prostate, les ovaires, l’endomètre, de la thyroïde et les glandes surrénales.

Dans la majeure partie des cas, les cancers touchant ces organes sont hormono-dépendants, c’est-à-dire que les hormones jouent un rôle dans la prolifération des cellules cancéreuses. Cependant dans certains cas, les cancers touchant ces organes ne sont pas hormono dépendants, c’est-à-dire que les hormones n’ont aucun effet sur les cellules cancéreuses.

Ainsi, les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants isolées et détectées par la présente invention, correspondent aux cellules souches cancéreuses de ces organes cibles de cancers hormono-dépendants, dans le cas où ces organes sont atteints d’un cancer hormono-dépendant mais également dans les cas particuliers où ces organes sont atteints d’un cancer non hormono-dépendant.

Dans un mode de réalisation particulier, les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants correspondent à des cellules souches cancéreuses de sein, utérus, prostate, ovaires, endomètre, thyroïde ou glandes surrénales, que ces organes soient atteints d’un cancer hormono-dépendant ou d’un cancer non hormono-dépendant.

Dans la présente demande l’expression « cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants » est équivalente à l’expression « cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants », et ces deux expressions sont utilisées de manière indifférente.

Ainsi, le cancer du sein est un exemple type de cancers hormono-dépendants. Toutefois, le cancer du sein peut également être un type de cancer non hormono-dépendant. Par exemple, et de façon non limitative, le cancer du sein triple négatif est un type de cancer du sein non hormono-dépendant Dans un premier aspect, la présente invention concerne l’utilisation, en tant que moyen de marquage, d’une lectine, pour la détection et/ou l’isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Dans un second aspect, la présente invention concerne une méthode d’isolement et de détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants comprenant le marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants avec au moins une lectine.

Dans un troisième aspect, la présente invention concerne une méthode de diagnostic de l’agressivité et/ou du risque de récidive d’un cancer hormono-dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant comprenant une étape d’isolement et/ou de détection des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Dans un quatrième aspect, la présente invention concerne un kit comprenant une lectine pour détecter ou isoler des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Au sens de la présente invention, on entend par « moyen de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants » une substance capable de se lier spécifiquement à un marqueur exprimé à la surface des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Selon un aspect général, la présente invention concerne 1 ^‘ 'utilisation in vitro d’au moins une lectine pour le marquage de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants, choisie parmi les lectines Maackia amurensis lectin II (MAH-II), Euonymus europaeus lectin (EEL), Psophocarpus tetragonolobus lectin I (PTL-I) et Grijfonia Simplicifolia lectin II (GSL-II), pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique.

Ces lectines sont bien connues de l’homme de métier et disponibles commercialement (notamment par la société Vector Laboratories et Emelca Biosciences). Des revues répertorient leur structure (. Lectin Structure, Rini JM, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1995 ; 24 : 551-77) tandis que d’autres plus récentes décrivent tout leur historique ( Insight of Lectins-A review, Singh et al., International Journal of Scientific and Engineering Research, volume 3, issue 4, avril 2012) et les avancées dans leur utilisation notamment en immunohistochimie ( Lectin Histochemistry : Historical Perspectives, State of the Art, and the Future, Brooks SA, Methods Mol Biol, 2017, 1560 :93-l07).

Les lectines MAH-II et PTL-I reconnaissent les glycanes O-liés présents à la surface des cellules. Plus particulièrement, la lectine MAH-II reconnaît spécifiquement le motif disialyl-T [NeuAc a2-3Gal al-3(NeuAc a2-6)Gal Ac] et la lectine PTL-I reconnaît spécifiquement les motifs Gal a 1-3 (Luc a l-2)Gal et Gal Ac a 1-3 (Luc a l-2)Gal des antigènes B et A.

La lectine EEL reconnaît les glycanes galactosylés présents à la surface des cellules. Plus particulièrement, la lectine EEL reconnaît le motif Gal a l-3(Fuc a l-2)Gal de l’antigène B et le motif Fuc a 1 -2Gai 1 -3GlcNAc de l’antigène H.

La lectine GSL-II reconnaît les glycanes N-liés, en particulier les glycanes N-liés tri ou tétra antennés agalactosylés, c’est-à-dire sans galactose.

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro de la lectine MAH-II et/ou de la lectine EEL pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique.

Au sens de la présente invention, l’échantillon biologique est un échantillon prélevé sur un patient présentant un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant ou susceptible de présenter un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant.

Au sens de l’invention, cet échantillon peut être une biopsie solide ou liquide, frottis, biopsies extemporanées d’un organe cible de cancers hormono-dépendants.

L’échantillon biologique peut ainsi correspondre à un échantillon d’un organe cible de cancers hormono-dépendants, dans le cas où cet organe est atteint d’un cancer hormono- dépendant ou est susceptible de l’être, mais aussi dans le cas où cet organe est atteint d’un cancer non hormono-dépendant ou est susceptible de l’être.

L’échantillon biologique peut ainsi correspondre à un échantillon provenant du sein, de l’utérus, de la prostate, des ovaires, de l’endomètre, de la thyroïde ou des glandes surrénales.

Cet échantillon est susceptible de contenir des cellules souches cancéreuses.

Contrairement ou en compléments des analyses usuelles en anatomo-pathologie, P utilisât ion des lectines selon la présente invention permet in fine de caractériser à un stade précoce ledit échantillon, comme étant pré-tumoral ou tumoral. Par le terme « pré-tumoral » on entend en amont de la tumeur avec un potentiel pouvant ou non amener un caractère tumoral à G échantillon.

En effet, l'anatomo-pathologie étudie les lésions macroscopiques et microscopiques de tissus prélevés sur des êtres vivants malades ou décédés par biopsie, frottis ou biopsie extemporanée. Cette branche de la médecine s’attache ainsi à l'étude morphologique des anomalies macroscopiques et microscopiques des tissus biologiques et des cellules pathologiques prélevées, mais pas à la recherche de cellules souches cancéreuses et donc pas aux propriétés d’ auto-réplication des cellules.

L’anatomo-pathologie ne permet pas à partir d’études morphologiques, d’établir une caractérisation précoce de P échantillon car les anomalies observées surviennent à un stade où le caractère d’ auto-réplication des cellules cancéreuses est déjà exprimé.

Au contraire, la présente invention s’attachant directement à la détection de la présence de cellules souches cancéreuses, celle-ci permet de caractériser l’échantillon à un stade plus précoce que l’anatomo-pathologie, soit avant même que les cellules souches cancéreuses aient pu exprimer leur caractère d’auto-réplication entraînant les anomalies morphologiques au niveau des tissus.

La méthode selon la présente invention peut être mise en œuvre en aval d’une analyse d’anatomo-pathologie. Dans ce cas l’échantillon est caractérisé comme tumoral, susceptible d’être tumoral ou non suspecté d’être tumoral suite à l’étude d’anatomo-pathologie. La méthode selon la présente invention s’intéressant spécifiquement aux cellules souches cancéreuses, elle permet dans ce cas de confirmer le diagnostic obtenu en anatomo pathologie, ou d’infirmer ce diagnostic.

En effet, dans le cas où un échantillon n’est pas suspecté d’être tumoral en anatomo pathologie, la présente invention peut permettre d’infirmer ce diagnostic en révélant le caractère tumoral ou pré-tumoral dudit échantillon du fait qu’elle est basé sur des paramètres différent de l’anatomo-pathologie, en l’occurrence la présence et éventuellement la quantification de cellules souches cancéreuses.

Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine pour le marquage de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants, choisie parmi les lectines Maackia amurensis lectin II (MAH-II), Euonymus europaeus lectin (EEL), Psophocarpus tetragonolobus lectin I (PTL-I) et Grijfonia Simplicifolia lectin II (GSL-II), pour obtenir des cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique.

notamment au moins deux lectines choisies parmi MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, en particulier les deux lectines MAH-II et EEL.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins deux lectines choisies parmi MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro de deux lectines choisies parmi MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisies parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL), (MAH-II, PTL-I), (MAH-II, GSL-II), (EEL, PTL-I), (EEL, GSL-II), (PTL-I, GSL-II).

Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange des deux lectines MAH-II et EEL, également noté MAH-II/EEL.

Pour l’ensemble de la demande, un mélange de lectines noté par exemple (MAH-II/EEL) est équivalent à un mélange de lectines noté (MAH-II, EEL).

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, d’au moins deux lectines, lesdites au moins deux lectines étant en quantité égale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins deux lectines choisi parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins deux lectines étant en quantité égale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne P utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites deux lectines étant en quantité égale dans ledit mélange.

Par quantité égale, on entend que chacune des deux lectines est utilisée en quantité identique par rapport à l’autre. Il s’agit d’un ratio en poids de 1 :l entre les deux lectines.

Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL), (MAH-II, PTL-I), (MAH-II, GSL-II), (EEL, PTL-I), (EEL, GSL-II), (PTL-I, GSL-II), lesdites deux lectines étant en quantité égale dans ledit mélange. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne 1 ^‘ 'utilisation in vitro de deux lectines, lesdites deux lectines étant un mélange MAH-II/EEL, dans lequel chacune des lectines sont en quantité égale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, d’au moins deux lectines, lesdites au moins deux lectines étant en quantité inégale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins deux lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins deux lectines étant en quantité inégale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne G utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites deux lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange.

Par quantité inégale, on entend que chacune des lectines est présente en quantité différente par rapport à l’autre. Il s’agit en particulier d’un ratio en poids de 2 :l entre les deux lectines.

Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de deux lectines choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL), (EEL, MAH- II), (MAH-II, PTL-I), (PTL-I, MAH-II), (MAH-II, GSL-II), (GSL-II, MAH-II), (EEL, PTL- I), (PTL-I, EEL), (GSL-II, EEL), (EEL, GSL-II), (PTL-I, GSL-II), (GSL-II, PTL-I), lesdites deux lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange, en particulier dans un ratio en poids de 2 : 1.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro de deux lectines, lesdites deux lectines étant un mélange (MAH-II et EEL), dans lequel les lectines sont en quantité inégale dans un ratio en poids de 2 : 1 soit 2 MAH-II pour 1 EEL.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, de deux lectines, lesdites deux lectines étant en quantité inégale dans un ratio en poids de 2 :l, notamment l’utilisation in vitro telle que décrite ci-dessus des deux lectines MAH-II/EEL dans un ratio en poids de 2 : 1.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle au moins deux lectines sont utilisées, lesdites au moins deux lectines étant en quantité égale ou en quantité inégale, notamment en quantité inégale dans un ratio en poids de 2 :1, et de préférence les deux lectines étant MAH-II/EEL en quantité inégale dans un ratio en poids de 2 : 1.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne G utilisation in vitro d’au moins trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-l et GSL-II.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne P utilisation in vitro de trois lectines choisies parmi MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Ainsi, dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II ,EEL, PTL-I), (MAH- II ,EEL, GSL-II), (EEL, PTL-l, GSL-II), (MAH-II, PTL-I, GSL-II).

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins trois lectines étant en quantité égale. Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites trois lectines étant chacune en quantité égale dans ledit mélange.

Par quantité égale, on entend que chacune des trois lectines est utilisée en quantité identique par rapport aux autres. Il s’agit d’un ratio en poids de 1 :l :l entre les trois lectines. Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines, choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL, PTL-I), (MAH-II, EEL, GSL-II), (EEL, PTL-l, GSL-II), (MAH-II, PTL-I, GSL-II), lesdites trois lectines étant en quantité égale dans ledit mélange.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins trois lectines étant en quantité inégale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne P utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites trois lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange. Dans le cas de G utilisation de trois lectines, par quantité inégale, on entend que les trois lectines ne sont pas utilisées en quantité égale les unes par rapport aux autres, et qu’au moins deux lectines sur les trois sont utilisées dans des quantités différentes. Il s’agit en particulier d’un ratio en poids 2 :1 :1 entre les trois lectines.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange de trois lectines choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL, PTL- I), (EEL, MAH-II, PTL-I), (PTL-I, MAH-II, EEL), (MAH-II, EEL, GSL-II), (EEL, MAH-II, GSL-II), (GSL-II, MAH-II, EEL), (EEL, GSL-II, PTL-I), (PTL-I, EEL, GSL-II), (GSL-II, EEL, PTL-I), lesdites trois lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange, en particulier dans un ratio en poids de 2 : 1 : 1.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines étant en quantité égale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines étant en quantité égale dans ledit mélange.

Par quantité égale, on entend que chacune des quatre lectines est utilisée en quantité identique par rapport aux autres. Il s’agit d’un ratio en poids de 1 :l :l :l entre les quatre lectines.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines étant en quantité inégale.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’un mélange des quatre lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange.

Dans le cas de l’utilisation de quatre lectines, par quantité inégale, on entend que les quatre lectines ne sont pas utilisées en quantité égale les unes par rapport aux autres, et qu’au moins deux lectines sur les quatre sont utilisées dans des quantités différentes. Il s’agit en particulier d’un ratio en poids 2 :1 : 1 : 1 entre les quatre lectines. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne G utilisation in vitro d’un mélange de quatre lectines choisi parmi les mélanges suivants : (MAH-II, EEL, PTL-I, GSL-II), (MAH-II, EEL, GSL-II, PTL-I), (MAH-II, PTL-I, EEL, GSL-II), (MAH-II, PTL-I, GSL-II, EEL), (MAH-II, GSL-II, PTL-I, EEL), (MAH-II, GSL-II, EEL, PTL-I), (EEL, MAH-II, PTL-I, GSL-II), (EEL, MAH-II, GSL-II, PTL-I), (EEL, PTL-I, MAH-II, GSL-II), (EEL, PTL-I, GSL-II, MAH-II), (EEL, GSL-II, MAH-II, PTL-I), (EEL, GSL-II, PTL-I, MAH-II), (GSL-II, EEL, PTL-I, MAH-II), (GSL-II, EEL, MAH-II, PTL-I), (GSL-II, PTL-I, EEL, MAH-II), (GSL-II, PTL-I, MAH-II, EEL), (GSL-II, MAH-II, EEL, PTL-I), (GSL-II, MAH-II, PTL-I, EEL), (PTL-I, GSL-II, MAH-II, EEL), (PTL-I, GSL-II, EEL, MAH-II), (PTL-I, EEL, GSL-II, MAH-II), (PTL-I, EEL, MAH-II, GSL-II), (PTL-I, MAH-II, EEL, GSL-II), (PTL-I, MAH-II, GSL-II, EEL), lesdites quatre lectines étant en quantité inégale dans ledit mélange, en particulier dans un ratio en poids de 2 : 1 : 1 : 1.

L’utilisation de deux, trois ou quatre lectines permet dans certains cas une meilleure spécificité du marquage des cellules souches cancéreuses.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle la lectine MAH-II reconnaît les glycanes O-liés, en particulier le motif disialyl-T [NeuAc a2-3Gal al-3(NeuAc a2-6)GalNAc], la lectine PTL-I reconnaît les glycanes O-liés, en particulier les motifs Gal a l-3(Luc a l-2)Gal et GalNAc a l-3(Luc a 1- 2)Gal des antigènes B et A, la lectine EEL reconnaît les glycanes galactosylés, en particulier le motif Gal a l-3(Luc a l-2)Gal de l’antigène B et le motif Luc a 1 -2Galf 1 -3GlcNAc de l’antigène H, et la lectine GSL-II reconnaît les glycanes N-liés, en particulier les glycanes N- liés tri ou tétra antennés agalactosylés.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit cancer est un cancer du sein, de l’utérus, de la prostate et des ovaires, de l’endomètre, de la thyroïde ou des glandes surrénales.

Le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL est un mode de réalisation avantageux dans la détection et l’isolement des CSCs d’un cancer hormono-dépendant, lorsque ledit cancer est un cancer du sein hormono-dépendant ou non hormono-dépendant.

La lectine utilisée dans le cadre de l’invention peut être conjuguée. Au sens de l’invention, on entend par le terme « conjuguée » que la lectine est liée de manière covalente à une autre molécule.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne rutilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à un fluorophore. Au sens l’invention, un fluorophore peut être tout fluorophore susceptible d’être utilisé pour la cytométrie en flux. De tels fluorophores sont disponibles dans le commerce. Il s’agit par exemple de l’Alexa fluor, en particulier l’Alexa fluor 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 750 ou 790, l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la Rhodamine, l’allophycocyanine (APC) et la Phycoérythrine (PE). Avantageusement, le fluorophore est choisi parmi la rhodamine, le FITC ou l’Alexa fluor, en particulier l’Alexa fluor 488, l’Alexa fluor 594 ou l’Alexa fluor 633.

Cette caractérisation du fluorophore au sens de l’invention, s’applique à tout mode de réalisation de la présente invention faisant intervenir un fluorophore.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à un radio-isotope. Au sens de l’invention, un radio-isotope est choisi parmi l’iode 125, le tritium ou le technétium.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à une enzyme.

Au sens de l’invention, l’enzyme est une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, c’est-à-dire une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou une enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent, c’est-à-dire une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent.

Au sens de l’invention, un « substrat chromogène » désigne un substrat donnant un produit coloré après conversion par une enzyme. Au sens de l’invention un « substrat chimio luminescent » désigne un substrat donnant un produit luminescent après conversion par une enzyme.

Dans un cas particulier de l’invention, ladite enzyme catalysant la formation d’un produit coloré est choisie parmi la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la b-galactosidase.

Dans le cas particulier de la HRP, le substrat chromogène est choisi parmi 3,3'- Diaminobenzidine (DAB), 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidme (TMB), ou 2,2'-azmo-bis(acide 3- ethylbenzothi azo lme-6-sulphonique) (ABTS) .

Dans le cas particulier de la phosphatase alcaline, le substrat chromogène est le NBT (Nitrobleu de tétrazolium) et le BCIP (bromochlorylindolophosphate).

Dans un cas particulier de l’invention, ladite enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent est la HRP et le substrat luminescent est le luminol.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à des billes d’or.

Dans un autre mode de réalisation particulier, la lectine est conjuguée à la biotine. Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi :

- un fluorophore en particulier choisi parmi la rhodamine, FITC ou l’Alexa Fluor - un radio-isotope en particulier choisi parmi l’iode 125, le tritium ou le technétium,

- une enzyme utilisant un substrat chromogène ou luminescent, ladite enzyme étant en particulier choisie parmi la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la b-galactosidase,

- des billes d’or ou - la biotine.

Il a également été mis en évidence par les Inventeurs que les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants pouvaient être détectées via l’utilisation d’une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants. Au sens de la présente invention, on entend par « détection » le fait d’identifier par des méthodes d’UV/visible, de luminescence, de fluorescence, de radioactivité, d’enzymologie la présence de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants au sein d’un échantillon biologique.

Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants suivi de la détection des cellules souches cancéreuses dans un échantillon biologique, via la détection de ladite lectine conjuguée.

Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée de manière covalente à un fluorophore.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne P utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à un fluorophore et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants par microscopie à fluorescence ou par lecteur de fluorescence.

Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à un radio-isotope.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à un radio-isotope et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par une gamma caméra.

Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène ou un substrat chimio luminescent.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à la péroxydase de raifort et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par microscopie à luminescence ou par un lecteur de luminescence par ajout d’un substrat chimio luminescent, tel que le luminol.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne 1 ^‘ 'utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à la péroxydase de raifort et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par microscopie UV/visible ou par lecteur d’absorbance, via l’ajout d’un substrat chromogène choisi parmi 3,3 - Diaminobenzidine (DAB), 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB), ou 2,2’-azino-bis(acide 3- ethylbenzothiazo line-6-sulphonique) (ABTS) .

Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à des billes d’or.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à des billes d’or et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par microscopie électronique.

Dans un mode de réalisation, la lectine peut être conjuguée à la biotine, pour donner une lectine biotinylée.

Ainsi, selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à la biotine et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par la lectine conjuguée à la biotine par l’un des modes précédemment décrit dans le quel ledit marqueur, fluorophore, radio-isotope, enzyme, billes d’or, est lui-même conjugué avec de la streptavidine ou de l’avidine.

Lorsque le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à la biotine et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par la lectine conjuguée à la biotine, la détection est faite : o par microscopie à fluorescence lors de P utilisation d’un fluorophore conjugué à de la streptavidine ou à de l’avidine,

o par lecteur de luminescence lors de l’utilisation d’une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent conjuguée à de la streptavidine ou à de l’avidine o par gamma caméra lors de l’utilisation d’un radio-isotope conjugué à de la streptavidine ou à de l’avidine,

o par microscopie électronique lors de l’utilisation de billes d’or conjuguées à de la streptavidine ou à de l’avidine,

o par microscopie UV/visible lors de l’utilisation d’une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à de la streptavidine ou à de l’avidine.

Il a également été mis en évidence par les Inventeurs que les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants pouvaient être isolées via G utilisation d’une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Par « isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants » on entend l’extraction des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants d’un échantillon biologique, débarrassées de tout autre type cellulaire.

Ainsi, la présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants suivi de l’isolement des cellules souches cancéreuses dans un échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée.

Cet isolement permet un enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants. Par le terme « enrichissement », on entend que la proportion des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants par rapport aux cellules totales contenues dans l’échantillon est augmentée, du fait de la déplétion de l’échantillon en cellules non souches cancéreuses.

On parle alors d’un échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants.

Ainsi par l’expression « isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants » dans le contexte de l’invention, on entend « enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants ».

Ainsi, au sens de la présente invention, on entend également par « isolement » le fait d’obtenir une population de cellules enrichie en cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants à partir d’un échantillon biologique. Le terme « enrichi » désigne au sens de la présente invention une population de cellules dans laquelle le rapport nombre de cellules souches cancéreuses / nombre total de cellules est d’au moins 4 tel que déterminé par le rapport cellules Epcam high + / cellules Epcam high - par cytométrie en flux.

L’enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses permet une détection et une quantification plus fiable et plus aisée des cellules souches cancéreuses du fait que la population cellulaire recherchée est alors présente en plus grande proportion dans l’échantillon.

Ainsi, il a été mis en évidence par les Inventeurs qu’un échantillon biologique pouvait être enrichi en cellules souches cancéreuses de manière particulièrement efficace en utilisant une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Dans un mode de réalisation particulier, l’isolement des cellules souches cancéreuses marquées par au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, peut être suivie d’une étape d’amplification cellulaire. Ainsi, après l’isolement des cellules, celles-ci peuvent être mises en culture dans un milieu permettant d’augmenter la quantité de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée et est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées.

Dans un mode particulier de réalisation, la lectine est conjuguée à la biotine et l’isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées est réalisé via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine.

Dans ce mode de réalisation, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées avec une lectine conjuguée à la biotine, sont fixées sur le support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine, par l’affinité biotine- streptavidine ou biotine-avidine.

Le support peut également être en verre, en polydiméthylsiloxane (PDMS), en silicone, ou en plastique tel que le polyméthylméthacrylate (PMMA), le polystyrène (PS) ou en copolymère cyclique d’oléfïnes (COC).

Des exemples de supports appropriés sont donnés dans la revue de Kim et al. ( Protein immobilization techniques for microfluidics assays, Kim et al., Biomicrofluidics, 7, 041501, 2013). Par le terme « fonctionnalisé », on entend que le support est chimiquement modifié pour être recouvert de streptavidine ou d’avidine immobilisée.

La revue Kim et al., précédemment citée, donne des exemples de fonctionnalisation de support.

Dans un mode de réalisation plus particulier, ledit support est constitué de billes magnétiques. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l’invention, ledit support est constitué de billes magnétiques et l’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants marquées est réalisé par tri magnétique en présence d’un aimant.

Dans ce mode de réalisation, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants avec une lectine conjuguée à la biotine, sont fixées sur les billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine, par l’affinité biotine- streptavidine ou biotine-avidine.

Sous l’effet d’un aimant, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants fixées sur les billes magnétiques sont isolées au sein de l’échantillon. Cet isolement peut être suivi de la récupération de l’échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses, par élimination du surnageant, puis par élution des cellules souches cancéreuses liées audit support.

Ladite élution peut être réalisée en condition acide pour rompre la liaison streptavidine- - biotine ou avidine-biotine.

Dans le cas particulier où ledit support est constitué par des billes magnétiques et où la streptavidine ou l’avidine est liée aux billes magnétiques par une liaison ADN, ladite élution est réalisée par traitement à la DNAse.

Selon un autre mode de réalisation, la lectine utilisée pour le marquage est une lectine conjuguée à un fluorophore et l’isolement est réalisé par tri cellulaire en cytométrie en flux.

Le tri cellulaire par cytométrie en flux permet ainsi d’obtenir une fraction de l’échantillon enrichie en cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

La cytométrie en flux est une technique bien connue de l’Homme du métier qui permet notamment de trier les cellules en différentes fractions en fonction de leur marquage fluorescent.

Le tri cellulaire par cytométrie en flux dans le cadre de l’invention permet ainsi d’obtenir :

- d’une part, une fraction de l’échantillon comportant les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par une lectine conjuguée à un fluorophore, et

- d’autre part, une fraction de l’échantillon contenant les autres types cellulaires contenus dans l’échantillon de départ.

L’invention permet également le marquage, l’isolement puis la détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants en utilisant au moins une lectine conjuguée.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne 1 ^‘ 'utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants avec une lectine conjuguée est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants marquées puis de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants isolées, via un nouveau marquage desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants isolées

avec une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine.

Ainsi dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne rutilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée à une biotine ou à un fluorophore et est suivi de

- l’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine dans le cas d’une lectine conjuguée à la biotine comme décrit dans la présente invention, ou via la cytométrie en flux dans le cas d’une lectine conjuguée avec un fluorophore, comme décrit dans la présente invention, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées et isolées,

- puis d’un nouveau marquage avec une lectine conjuguée selon l’invention, desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées et isolées, suivi de la détection desdites cellules selon les modes de détection décrits dans la présente demande.

Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants est réalisé avec une lectine conjuguée et est suivi de la détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées via la détection de la lectine conjuguée.

Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite ci-dessus, dans laquelle ledit marquage de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants avec une lectine conjuguée à un marqueur est suivi de l’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans laquelle ledit marqueur est la biotine et ledit isolement est réalisé via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine constitué de billes magnétiques et en présence d’un aimant, ou

dans laquelle ledit marqueur est un fluorophore et ledit isolement est réalisé en cytométrie en flux.

Selon l’invention, ledit échantillon biologique à partir duquel les cellules souches cancéreuses sont isolées ou détectées est un échantillon biologique provenant d’un organe cible de cancers hormono-dépendants tel que le sein, l’utérus, la prostate, les ovaires, l’endomètre, la thyroïde et les glandes surrénales, prélevé chez un patient atteint d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant ou une biopsie prélevée chez un patient suspecté d’avoir un tel cancer.

Ainsi, selon un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation in vitro, telle que décrite précédemment, dans laquelle ledit échantillon biologique est un échantillon d’organes cibles de cancers hormono-dépendants.

L’échantillon biologique peut correspondre à une biopsie solide ou liquide, frottis, biopsies extemporanées selon les cas.

L’échantillon biologique de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendant peut également être une lignée cellulaire cancéreuse d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant ou une tumeur induite chez un animal par injection de lignées cellulaires cancéreuses, par exemple chez la souris ou le rat. La lignée cellulaire est de préférence une lignée cellulaire cancéreuse de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendent. Selon ce mode de réalisation, la tumeur induite contient des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants qui sont avantageusement isolées des autres cellules de la tumeur afin d’être étudiées.

Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne l’utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique, dans laquelle ledit échantillon biologique est constitué par des cellules en suspension. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne G utilisation in vitro d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le marquage de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique, dans laquelle ledit échantillon biologique est constitué par un tissu cellulaire.

La présente invention concerne également un procédé de marquage in vitro des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, comprenant une étape de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées, dans un échantillon biologique.

Ce procédé de marquage peut être intégré au sein d’un procédé de détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants utilisant une lectine conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, la biotine ou des billes d’or.

La présente invention concerne également un procédé in vitro de détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique, comprenant :

(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée_à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou la biotine, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses de cancers hormono dépendants sont marquées par au moins une lectine,

suivi d’

(b) une étape de détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono dépendants marquées par au moins une lectine.

Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à un fluorophore, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées sont détectées par microscopie à fluorescence ou lecteur de fluorescence. Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à un radio-isotope, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées sont détectées par une gamma caméra.

Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré telle que la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline, la glucose oxydase ou la b-galactosidase, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées sont détectées par microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance suite à l’ajout d’un substrat chromogène.

Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à une enzyme catalysant la formation d’un produit luminescent telle la HRP, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées sont détectées en microscopie à luminescence ou par un lecteur de luminescence, suite à l’ajout d’un substrat chimio luminescent tel que le luminol.

Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée à des billes d’or, les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées sont détectées par microscopie électronique.

Dans un mode de réalisation du procédé où la lectine est conjuguée avec de la biotine, lesdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sont détectées par l’un des modes de détection décrit ci-dessus dans lequel ledit marqueur est conjugué à la streptavidine ou à l’avidine. Le procédé de marquage peut également être intégré au sein d’un procédé d’isolement de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants utilisant une lectine conjuguée un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, la biotine ou des billes d’or.

Dans un mode de réalisation, le procédé selon la présente invention permet d’isoler les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants. Cette étape d’isolement permet en particulier d’étudier les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants détectées dans un échantillon tumoral hormono-dépendant afin, par exemple, de découvrir de nouveaux traitements capables d’éliminer ces cellules souches cancéreuses fréquemment à l’origine de récidives et de métastases. Par « procédé in vitro d’isolement », on entend que l’échantillon biologique est enrichi en cellules souches cancéreuses (CSCs) de cancers hormono-dépendants par déplétion des cellules non souches cancéreuses (CNSCs) de cancers hormono-dépendants.

Les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sont spécifiquement séparées des autres types cellulaires présents dans l’échantillon, tel qu’ éventuellement des cellules non souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants (CNSCs), par l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II.

Cet enrichissement de l’échantillon en CSCs permet d’obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sont majoritairement représentées, c’est-à-dire qu’elles sont présentes en quantité supérieure par rapport aux autres types cellulaires, notamment par rapport aux CNSCs.

Ainsi, la présente invention concerne également un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique comprenant :

(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine ou à un fluorophore, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sont marquées par au moins une lectine,

suivi d’

(b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants marquées par au moins une lectine.

Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon comprenant :

(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants sont marquées par au moins une lectine,

suivi d’

(b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants marquées par au moins une lectine, via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine.

Cet isolement peut être suivi de la récupération de l’échantillon enrichi en cellules souches cancéreuses, par élimination du surnageant, puis par élution des cellules souches cancéreuses liées audit support.

Ladite élution peut être réalisée en condition acide pour rompre la liaison streptavidine/avidine - biotine.

Selon un mode de réalisation, ledit support est constitué par des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine et ladite étape d’isolement est réalisée par tri magnétique en présence d’un aimant.

Dans le cas particulier où ledit support est constitué par des billes magnétiques et où la streptavidine ou l’avidine est liée aux billes magnétiques par une liaison ADN, ladite élution est réalisée par traitement à la DNAse.

Dans un mode particulier de réalisation, la présente invention concerne un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique comprenant :

(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un fluorophore pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants sont marquées par au moins une lectine,

suivi d’

(b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants marquées par au moins une lectine, par tri cellulaire en cytométrie en flux. Le tri cellulaire en cytométrie en flux permet ainsi d’obtenir une fraction de l’échantillon enrichie en cellules souches cancéreuses.

Avant le marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants à l’étape (a), les cellules de l’échantillon sont avantageusement dissociées les unes des autres. Cette dissociation des cellules peut être réalisée selon des procédures conventionnelles, par exemple en utilisant une ou plusieurs enzymes capables de séparer les cellules les unes des autres sans altérer les glycanes exprimés à la surface des cellules, en particulier le motif fucose a 1-2 galactose. La dissociation des cellules peut par exemple être mise en œuvre avec le mélange Liberase® commercialisé par la société Roche Diagnostic.

La présente invention concerne donc également des procédés selon l’invention, comprenant une étape préalable de dissociation des cellules de l’échantillon les unes des autres avant l’étape de marquage.

Ainsi, la présente invention concerne également un procédé in vitro d’isolement de cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique comprenant :

(a) une étape de marquage des cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine ou à un fluorophore, pour obtenir un échantillon biologique dans lequel les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants sont marquées par au moins une lectine,

suivi d’

(b) une étape d’isolement desdites cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants marquées par au moins une lectine,

ladite étape d’isolement étant réalisée via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine constitué par des billes magnétiques et en présence d’un aimant, lorsque ladite lectine est conjuguée à la biotine,

et ladite étape d’isolement étant réalisée par tri cellulaire en cytométrie en flux, lorsque ladite lectine est conjuguée à un fluorophore. L’étude des cellules souches cancéreuses à des fins de recherche et de diagnostic représente aujourd’hui une nécessité, en particulier pour mettre en évidence de nouvelles substances capables d’agir contre ces cellules. L’étude de ces cellules est également particulièrement utile dans le cadre de la médecine personnalisée.

Les cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sont une population de cellules particulières qui, en raison de leur résistance aux traitements de chimiothérapie, conduisent à la reformation de la tumeur et à la récidive tumorale. La présente invention permet donc, par la détection ou l’isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, d’évaluer le risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant.

La détection des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, éventuellement suivie de leur quantification, permet d’évaluer les risques de progression d’une tumeur.

La présente invention concerne donc également l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour le diagnostic in vitro du risque de récidive et/ou de l’agressivité d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono- dépendant ou non hormono-dépendant.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant, comprenant les étapes de :

(a) Marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants d’un échantillon biologique avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH- II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par au moins une lectine, dans ledit échantillon biologique, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine,

(b) Détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par

- microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;

- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;

- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;

- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;

- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;

(c) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants ;

(d) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants dans ledit échantillon biologique par rapport à l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique,

et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique

(e) Déduction du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant, comprenant les étapes de :

(a) Marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants d’un échantillon biologique avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH- II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par au moins une lectine dans ledit échantillon biologique,

ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore ou de la biotine,

(b) Isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants marquées par au moins une lectine conjuguée :

lors du marquage avec une lectine conjuguée à la biotine, ledit isolement est effectué via un support fonctionnalisé avec de la streptavidine ou de l’avidine, en particulier ledit support fonctionnalisé est constitué de billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ou de l’avidine et ledit isolement est effectué par tri cellulaire magnétique en présence d’un aimant, ou lors du marquage avec une lectine conjuguée à un fluorophore, ledit isolement est effectué par tri cellulaire en cytométrie en flux.

(c) Nouveau marquage des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants isolées avec au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, pour obtenir des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants isolées et marquées par le nouveau marquage,

ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine,

(d) Détection desdites cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants isolées et marquées par le nouveau marquage par - microscopie en fluorescence ou lecteur de fluorescence lorsque la lectine est conjuguée à un fluorophore ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un fluorophore conjugué à la streptavidine ou à l’avidine;

- microscopie à luminescence ou lecteur de luminescence lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chimio luminescent conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;

- gamma caméra lorsque la lectine est conjuguée à un radio-isotope, ou lorsque que la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via un radio-isotope conjugué à la streptavidine ou à l’avidine ;

- microscopie UV/visible ou lecteur d’absorbance lorsque la lectine est conjuguée à une enzyme utilisant un substrat chromogène, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via une enzyme utilisant un substrat chromogène conjuguée à la streptavidine ou à l’avidine ;

- microscopie électronique lorsque la lectine est conjuguée à des billes d’or, ou lorsque la lectine est conjuguée à la biotine et est détectée via des billes d’or conjuguées à la streptavidine ou à l’avidine ;

(e) Eventuellement quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants ;

(f) Comparaison de l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants dans ledit échantillon biologique par rapport à l’intensité de la détection de cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique,

et éventuellement comparaison de la quantification de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants dans ledit échantillon biologique par rapport à la quantification de cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique ;

(g) Déduction du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant à partir de la présence et éventuellement de la quantité de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants. L’intensité de la détection des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, et éventuellement leur quantification est comparée par rapport un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique.

L’échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique est utilisé comme témoin.

Par « échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique » on entend un échantillon prélevé sur le même individu que l’échantillon biologique, mais dans un tissu voisin de celui où est prélevé ledit échantillon biologique, et qui ne présente pas de cellules tumorales en analyse d’anatomo-pathologie et qui ne présente pas de cellules souches cancéreuses par la méthode selon l’invention.

L’échantillon sain est donc un échantillon caractérisé par l’absence de cellules tumorales en analyse par anatomo-pathologie et l’absence de cellules souches cancéreuses par la méthode selon l’invention.

La quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants permet de déterminer l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant. Cette quantification peut être établie par différentes méthodes telles que : la cytométrie en flux, le western blot, la PCR quantitative avec des marqueurs génériques tels que Oct-4, cMycl, Gli-l ou EpCam ou un test de clonogénicité.

Plusieurs de ces méthodes peuvent également être utilisées en parallèle afin de former un faisceau de présence de CSCs et ainsi augmenter la fiabilité de la quantification.

Dans un mode de réalisation particulier, la quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants est réalisée par un test de clonogénicité.

Un test de clonogénicité consiste en la mise en culture de l’échantillon biologique pour observer la capacité des cellules à reformer des sphères tumorales. Cette propriété d’auto- renouvellement et d’auto-réplication est propre aux cellules souches cancéreuses, une cellule souche cancéreuse unique est ainsi à l’origine d’une sphère tumorale formée. Ainsi, la comptabilisation des sphères tumorales formées, permet de quantifier les cellules souches cancéreuses dans l’échantillon.

Ces méthodes, avantageusement la qPCR avec des marqueurs génériques tels que Oct-4, c- Myc, Gli-l ou EpCam et le test de clonogénicité, permettent également la détection des cellules souches cancéreuses afin de déterminer la présence ou l’absence de ces cellules après l’étape d’isolement des cellules souches cancéreuses. Ces méthodes se présentent donc comme des alternatives aux susdites étapes (c) et (d), correspondant respectivement au nouveau marquage et à la détection des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants isolées.

Cette détection est facilitée et rendue plus fiable de par G enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses.

La détection par ces méthodes permet également de valider l’efficacité de l’enrichissement de l’échantillon en cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants par la méthode selon l’invention, soit l’efficacité de la méthode à isoler des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants.

Dans les méthodes de diagnostic de la présente invention, plus l’intensité de la détection dans l’échantillon biologique est élevée par rapport à un échantillon sain jouxtant le l’échantillon biologique, plus le risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono- dépendant est fort et plus le cancer est agressif.

De la même manière, plus la quantité de cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans l’échantillon biologique est élevée par rapport à un échantillon sain jouxtant l’échantillon biologique, plus le risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant est fort et plus le cancer est agressif.

La détection et la quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants dans un échantillon biologique permettent ainsi de déterminer l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant et sa capacité à se développer.

La détection et la quantification des cellules souches cancéreuses de cancers hormono- dépendants s’inscrivent également dans une démarche de médecine personnalisée. En effet, la détection des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants dans l’échantillon biologique permettant d’évaluer la valeur pronostique du traitement, permet ainsi d’adapter le traitement.

L’ensemble des procédés de détection et d’isolement et l’ensemble des méthodes de diagnostic décrits précédemment et comportant l’utilisation d’au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, PTL-I, GSL-II et EEL, sont également réalisables avec au moins deux lectines ou au moins trois lectines choisies parmi les lectines MAH-II, PTL-I, GSL-II et EEL, voire avec les quatre lectines MAH-II, PTL-I, GSL-II et EEL. Ainsi, les différents mélanges de lectines décrits dans la présente demande, ainsi que les différents ratios en lectine dans ces mélanges, sont applicables à la réalisation de l’ensemble des procédés de détection et d’isolement et de l’ensemble des méthodes de diagnostic décrites dans la présente demande.

La présente invention concerne également un kit de détection in vitro de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique, comprenant au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un marqueur choisi parmi : un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme, des billes d’or ou de la biotine.

La présente invention concerne également un kit d’isolement in vitro de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique, comprenant au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine.

La présente invention concerne également un kit d’isolement in vitro de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants, dans un échantillon biologique comprenant au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à un fluorophore.

La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant, ou non hormono-dépendant comprenant :

- au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine,

- et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, conjuguée à un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or. La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro du risque de récidive du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant et/ou de l’agressivité du cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique d’un cancer hormono-dépendant ou non hormono-dépendant, comprenant :

- au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée un fluorophore,

- et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, conjuguée à la biotine, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.

La présente invention concerne également un kit de diagnostic in vitro du risque de récidive de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants et/ou de l’agressivité de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants, comprenant au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine, et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, conjuguée à un fluorophore, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or, ou

comprenant au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, ladite lectine étant conjuguée un fluorophore, et éventuellement au moins une lectine choisie parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, conjuguée à la biotine, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins deux lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins deux lectines conjuguées étant en quantité égale

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins deux lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins deux lectines conjuguées étant en quantité inégale

Ainsi, dans un mode de réalisation, les kits selon la présente invention peuvent comprendre deux lectines conjuguées choisies parmi : (MAH-II, EEL), (EEL, MAH-II), (MAH-II, PTL-I), (PTL-I, MAH-II), (MAH-II, GSL-II), (GSL-II, MAH-II), (EEL, PTL-I), (PTL-I, EEL), (GSL- II, EEL), (EEL, GSL-II), (PTL-I, GSL-II), (GSL-II, PTL-I), lesdites au moins deux lectines étant en quantité inégale dans lesdits kits, en particulier dans un ratio en poids de 2 : 1.

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins trois lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins trois lectines conjuguées étant en quantité égale.

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre au moins trois lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites au moins trois lectines conjuguées étant en quantité inégale.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, les kits selon la présente invention peuvent comprendre trois lectines conjuguées choisies parmi : (MAH-II, EEL, PTL-I), (EEL, MAH-II, PTL-I), (PTL-I, MAH-II, EEL), (MAH-II, EEL, GSL-II), (EEL, MAH-II, GSL-II), (GSL-II, MAH-II, EEL), (EEL, GSL-II, PTL-I), (PTL-I, EEL, GSL-II), (GSL-II, EEL, PTL-I), lesdites trois lectines étant en quantité inégale dans lesdit kits, en particulier dans un ratio en poids de 2 :l :l.

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre quatre lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines conjuguées étant en quantité égale.

Les kits selon la présente invention décrits ci-dessus peuvent comprendre quatre lectines conjuguées choisies parmi les lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites quatre lectines conjuguées étant en quantité inégale.

Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, les kits selon la présente invention peuvent comprendre quatre lectines conjuguées choisies parmi : (MAH-II, EEL, PTL-I, GSL-II), (MAH-II, EEL, GSL-II, PTL-I), (MAH-II, PTL-I, EEL, GSL-II), (MAH-II, PTL-I, GSL-II, EEL), (MAH-II, GSL-II, PTL-I, EEL), (MAH-II, GSL-II, EEL, PTL-I), (EEL, MAH-II, PTL- I, GSL-II), (EEL, MAH-II, GSL-II, PTL-I), (EEL, PTL-I, MAH-II, GSL-II), (EEL, PTL-I, GSL-II, MAH-II), (EEL, GSL-II, MAH-II, PTL-I), (EEL, GSL-II, PTL-I, MAH-II), (GSL-II, EEL, PTL-I, MAH-II), (GSL-II, EEL, MAH-II, PTL-I), (GSL-II, PTL-I, EEL, MAH-II), (GSL-II, PTL-I, MAH-II, EEL), (GSL-II, MAH-II, EEL, PTL-I), (GSL-II, MAH-II, PTL-I, EEL), (PTL-I, GSL-II, MAH-II, EEL), (PTL-I, GSL-II, EEL, MAH-II), (PTL-I, EEL, GSL-II, MAH-II), (PTL-I, EEL, MAH-II, GSL-II), (PTL-I, MAH-II, EEL, GSL-II), (PTL-I, MAH-II, GSL-II, EEL), lesdites quatre lectines étant en quantité inégale dans lesdits kits, en particulier dans un ratio en poids de 2 : 1 : 1 : 1.

D’après un autre mode de réalisation, l’invention concerne également des kits de diagnostic in vitro du risque de récidive de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants et/ou de l’agressivité de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants pour définir une valeur pronostique pour l’adaptation thérapeutique de cancers hormono-dépendants ou non hormono-dépendants,

comprennent le mélange de lectines MAH-II et EEL, et/ou le mélange de lectines MAH-II et PTL-I, et/ou le mélange de lectines MAH-II et GSL-II, et/ou le mélange de lectines EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines PTL-I et GSL- II, et/ou le mélange MAH-II, EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine MAH-II, EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines MAH-II, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectine EEL, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites lectines étant conjuguées à la biotine, et des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine, et éventuellement le mélange de lectines MAH-II et EEL, et/ou le mélange de lectines MAH-II et PTL-I, et/ou le mélange de lectines MAH-II et GSL-II, et/ou le mélange de lectines EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines PTL-I et GSL-II, et/ou le mélange MAH-II, EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine MAH-II, EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines MAH-II, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectine EEL, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectines MAH- II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites lectines étant conjuguées à un fluorophore, un radio isotope, une enzyme ou des billes d’or, ou

comprennent le mélange de lectines MAH-II et EEL, et/ou le mélange de lectines MAH-II et PTL-I, et/ou le mélange de lectines MAH-II et GSL-II, et/ou le mélange de lectines EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines PTL-I et GSL- II, et/ou le mélange MAH-II, EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine MAH-II, EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines MAH-II, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectine EEL, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites lectines étant conjuguées un fluorophore, et éventuellement le mélange de lectines MAH-II et EEL, et/ou le mélange de lectines MAH-II et PTL-I, et/ou le mélange de lectines MAH-II et GSL-II, et/ou le mélange de lectines EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines PTL-I et GSL-II, et/ou le mélange MAH-II, EEL et PTL-I, et/ou le mélange de lectine MAH-II, EEL et GSL-II, et/ou le mélange de lectines MAH-II, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectine EEL, PTL-I et GSL-II et/ou le mélange de lectines MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, lesdites lectines étant conjuguées à la biotine, un radio-isotope, une enzyme ou des billes d’or.

DESCRIPTION DES FIGURES :

La Figure 1 montre les résultats de la séparation de cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants sur un échantillon de cellules issues de la lignée MCF-7, lignée de cellules cancéreuses d’origine mammaire.

Les cellules souches cancéreuses sont examinées à partir d’un tri de cellules issues de la lignée MCF-7, à l’aide du ratio Epcam High + / Epcam High - , avec l’utilisation de billes magnétiques sur lesquelles est greffée de la streptavidine et l’utilisation des lectines biotinylées suivantes : MAH-II biotinylée (Lectine MAH-II), EEL biotinylée (Lectine EEL), PTL-I biotinylée (Lectine PTL-I), GSL-II biotinylée (Lectine GSL-II), un mélange en quantité égale (ratio en poids 1 :1) des lectines biotinylées MAH-II /EEL (Mélange 1) ou le mélange en quantité inégale (ratio en poids 2 :1) des lectines biotinylées MAH-II /EEL (Mélange 2).

La Figure 2 montre des coupes de prélèvements de tissu mammaire provenant de biopsie de patients sains (Figure 2A) ou atteints d’un cancer du sein (Figure 2B) :

Figure 2A : le traitement d’un tissu sain par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :l) met en évidence l’absence de marquage des cellules, démontrant l’absence de cellules souches cancéreuses mammaires dans le tissu sain.

Figure 2B : le traitement d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses du sein (zone foncée).

La Figure 3 montre des coupes de prélèvements de tissu ovarien provenant de biopsie de patients sains (Figure 3A) ou atteints d’un cancer de l’ovaire (Figure 3B) :

Figure 3A : le traitement d’un tissu sain par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :l) met en évidence l’absence de marquage des cellules, démontrant l’absence de cellules souches cancéreuses ovariennes dans le tissu sain. Figure 3B : le traitement d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono- dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses de l’ovaire (zone foncée).

La Figure 4 montre des coupes de prélèvements de tissu utérin provenant de biopsie de patients sains (Figure 4A) ou atteints d’un cancer de l’utérus (Figure 4B) :

Figure 4A : le traitement d’un tissu sain par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :l) met en évidence l’absence de marquage des cellules, démontrant l’absence de cellules souches cancéreuses utérines dans le tissu sain.

Figure 4B : le traitement d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses de l’utérus (zone foncée).

EXEMPLES

Exemple 1 : Protocole d’isolement des cellules souches cancéreuses issues de cancers du sein

L Matériels requis

Réactifs et matériel

Lectine individuelle biotinylée ou mélange de lectines biotinylées marquant spécifiquement les Cellules Souches Cancéreuses issues de cancers hormono- dépendants, ici cancer du sein (préparée à partir des lectines individuelles de Vector Laboratories et de Emelca Biosciences)

Kit CELLection Biotin Binder (Invitrogen) contenant des billes magnétiques couplées à la streptavidine par une liaison ADN

Aimant

Tampons

Versène (Invitrogen) comprenant du tampon phosphate salin (PBS) et de l’EDTA Tampon 1 : PBS (Tampon phosphate salin sans Ca ²⁺ et Mg ² ) avec 0.1% BSA (Albumine de sérum bovin), pH 7.4

Tampon 2 : PBS (Phosphate Buffer Saline sans Ca ²⁺ et Mg ² ) avec 0.1% BSA (Bovine Sérum Albumine) et 0.6% de citrate de sodium

- Tampon 3 : RPMI 1640 avec 1% de FCS (Sérum de veau fetal), lmM CaCl ₂ et 5mM de MgCl ₂ , pH 7.0-7.4.

IL Durée de T expérimentation

20 min pour préparer les cellules

20 min pour marquer les cellules - 20 min pour incuber les cellules marquées avec les billes

10 min pour récupérer la suspension non enrichie en CSCs 15 min pour casser la liaison CSCs/billes

5 min pour récupérer la suspension enrichie en CSCs d’intérêt

- TOTAL : lh30

III. Mode opératoire par tri magnétique :

1. Préparation des cellules. Les cellules de la lignée MCF-7 (lignée de cellules de cancer mammaire) sont décollées de leur support avec du Versène pendant 10 min à 37°C.

2. Les cellules sont comptées et le nombre de cellules est ajusté à 1.10 ⁷ dans l’échantillon.

3. La suspension cellulaire est centrifugée à 300g pendant 10 min puis le surnageant est éliminé.

4. Blocage des sites aspécifiques. lmL de Tampon 2 est ajouté.

5. Marquage des cellules. Une quantité totale en lectines de 10 pg est ajoutée, de manière à ce que lors d’une pluralité de lectines, les quantités de chacune soient identiques.

Ainsi, sont ajoutés :

- 10 pg d’une lectine individuelle biotinylée choisie parmi : choisie parmi les lectines MAH-

II, EEL, PTL-I et GSL-II, ou

-5 pg de chaque lectine pour le mélange 1 (MAH-II / GSL-II)

- 6.66 pg de la lectine MAH-II et 3.33 pg de la lectine GSL-II pour le mélange 2. Le mélange alors obtenu est incubé 10 min à 4°C.

6. 500pL de Tampon 2 est ajouté afin de laver les cellules et la suspension est centrifugée à 300g pendant 10 min et le surnageant est éliminé.

7. Ajout des billes. Les cellules sont resuspendues dans lmL de Tampon 2 puis 25 pL de billes magnétiques couplées à la streptavidine préalablement lavées sont ajoutées et resuspendues à l’aide de Tampon 1. Le mélange est incubé 20 min à 4°C sous agitation douce.

8. Récupération de la suspension NON enrichie en CSCs. Le tube est alors placé sur l’aimant pendant 2 min. Les cellules marquées par les lectines biotinylées et liées aux billes magnétiques couplées à la streptavidine, précipitent en direction de l’aimant (tri cellulaire magnétique) et sont alors séparées des cellules non marquées. Le surnageant contenant les cellules non marquées est ensuite retiré en maintenant le tube placé sur l’aimant, et est conservé dans un tube Lalcon.

9. Le tube contenant alors les cellules souches cancéreuses marquées est retiré de l’aimant. lmL de Tampon 1 est ajouté. Le tube est agité par vortex et replacé sur l’aimant pendant 2 min, puis le surnageant est à nouveau retiré et conserver dans le même falcon qu’à l’étape 8. Cette étape est répétée deux fois.

10. Les cellules souches cancéreuses marquées, encore liées aux billes magnétiques, sont resuspendues à l’aide de 200m1 de Tampon 3 préchauffé à 37°C. 4pL de tampon de coupure de la liaison cellules/billes constitué de DNasel, sont ajoutés. Ce mélange est incubé 15 min à température ambiante sous agitation douce.

11. La suspension est agitée avec une pipette vigoureusement 5 à 10 fois afin de faciliter la libération des cellules.

12. Récupération de la suspension enrichie en CSCs. Le tube est placé sur l’aimant pendant 2 min. Les billes magnétiques sont alors séparées des cellules souches cancéreuses marquées et le surnageant contenant les cellules souches cancéreuses marquées est transféré dans un tube contenant 200pL de tampon 3 préchauffé à 37°C. Les étapes 11 et 12 peuvent être répétées une nouvelle fois afin d’enrichir le rendement.

Ces expériences ont été réalisées dans des conditions similaires avec chacune des lectines individuellement (MAH-II, EEL, PTL-I, GSL-II), un mélange en quantité égale (ratio en poids 1 :l) de deux lectines (Mélange 1 : MAH-II / EEL) ou un mélange en quantité inégale (ratio en poids 2 :l) de deux lectines (Mélange 2 : 2 MAH-II / EEL).

Les résultats de ces différents essais sont présentés dans la figure 1.

Ainsi que le montrent les résultats de ces essais, l’utilisation du mélange 1, soit les lectines MAH-II et EEL en mélange équimolaire, permet l’isolement des cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants, dans ce cas d’un cancer mammaire, et ce de façon prépondérante par rapport aux autres essais réalisés en parallèle.

Ces résultats permettent également de démontrer que les cellules souches cancéreuses de cancer du sein présentent à leur surface de façon majoritaire des glycanes O-liés et en particulier le motif disialyl-T [NeuAc a2-3Gal al-3(NeuAc a2-6)GalNAc] et des glycanes galactosylés, en particulier le motif Fuc a 1 -2Gai 1 -3GlcNAc de l’antigène H.

En effet, les lectines MAH-II et EEL révèlent une efficacité particulière pour isoler et détecter ce type de cellules souches cancéreuses.

Exemple 2 : Test de clonogénicité

L’objectif d’un test de clonogénicité est d’observer la capacité des cellules à reformer des sphères (correspondant chez le patient à la reformation d’une masse tumorale) donc leur capacité proliférative.

Le test de clonogénicité est dans cet exemple utilisé pour confirmer la présence des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants et quantifier lesdites cellules dans un échantillon après isolement des cellules souches cancéreuses de cancers hormono-dépendants par la méthode d’isolement décrite dans la présente invention. Il permet ainsi de démontrer l’efficacité de la méthode d’isolement selon l’invention par rapport à un échantillon témoin non soumis cette méthode (cellules non triées).

Les tests de clonogénicité ont été réalisés dans une plaque à 6 puits à une densité de 500 cellules /cm ² dans un milieu de composition RPMI (Gibco) supplémenté de 50 unités/mL de pénicilline, 50 unités/mL de streptomycine (Gibco) et 2.4 g/L de bicarbonate de sodium, 1 M de tampon HEPES (Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France), IX progestérone (Sigma Aldrich), IX putrescine (Sigma), 0.025 g/mL héparine (Sigma Aldrich), 30% (m/v) glucose (Sigma Aldrich,), IX supplément de croissance B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 ng/mL EGL (Sigma Aldrich), 20 ng/mL LGL humain basique (Sigma Aldrich), IX supplément insuline-transferrine- sélénite de sodium (Roche diagnostics, Meylan, Lrance).

L’évolution des colonies a été observée après incubation à 37 °C dans une atmosphère de C0 ₂ pendant trois semaines et quantifiée avec le logiciel ImageJ®.

Les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono-dépendants isolées à partir de la méthode d’isolement décrite dans la présente invention conduisent à la formation de sphères contrairement au témoin. Il s’agit d’un test de clonogénicité ayant pour témoin des cellules non triées (T-), contre des cellules triées positivement par MAH-II biotinylée (Lectine MAH-II), EEL biotinylée (Lectine EEL), PTL-I biotinylée (Lectine PTL-I), GSL-II biotinylée (Lectine GSL-II), le mélange en quantité égale (ratio en poids 1 :l) de lectines biotinylées MAH-II/EEL (Mélange 1), le mélange en quantité inégale (ratio en poids 2 :l) de lectines biotinylées 2 MAH-II/EEL (Mélange 2). La méthode selon la présente invention permet donc d’obtenir des cellules souches capables de reformer des tumeurs (résultats non présentés).

Exemple 3 : Marquage visible de lectines sur coupe histologique paraffinée (Figure 2 : sein)

Matériel utilisé : Blocs de paraffine, Glace, Microtome, Lames superfrost®, Automate Bond Max (Leica Microsystems) avec ordinateur, Consommables Leica (alcool, tampon de lavage, tampon ER1, tampon dewax, étiquettes, coverslips, tubes), tampon PBS-BSA 5%, Lectines biotinylées (MAH-II et GSL-II (Vector Lab), EEL et PTL-I (Emelca Biosciences)), Kit Bond Intense R détection (Leica), milieu de montage Leica, lamelles et microscope.

Les blocs de paraffine contenant les prélèvements de cancers du sein provenant de chacun des patients identifiés par leur numéro (donné par le service d’anatomie pathologique) ont été placés dans la glace pendant environ 1 heure afin d’être refroidis, ceci afin de faciliter leur coupe au microtome à une épaisseur de 4mhi.

Des lames dites « superfrost », ceci pour un maximum d’adhésion du tissu coupé ont été identifiées par les mêmes numéros que ceux présents sur les blocs. Une goutte d’eau a été placée au centre de chacune de ces lames.

Les coupes ont été réalisées au microtome et placées sur la goutte d’eau préalablement déposée. Les lames ont par la suite été posées sur une plaque chauffante à 37°C afin de faciliter leur adhésion et l’excédent d’eau a été retiré. L’ensemble des lames réalisé a été placé au sein d’une étuve à 37°C dans l’objectif de les sécher.

La suite de la manipulation a fait intervenir l’automate Bond Max de chez Leica relié à un ordinateur possédant un logiciel pilotant l’automate. Durant le temps où les lames sont à l’étuve, l’ensemble de la manipulation de marquage immunohistochimique a été préparé en commençant par la vérification du niveau sur l’automate de chacun des produits nécessaires à la réalisation de la manipulation, puis à l’identification des lames avec leur même numéro ceci sur le logiciel pilotant l’automate. Des étiquettes permettant un protocole standardisé ont été générées. La dilution des lectines et leur quantité ont été calculées et le kit nécessaire préparé. Il est à noter que chacun des produits utilisés a dû être scanné et le niveau remis à zéro avant chacune des expérimentations effectuées.

Les étiquettes ont par la suite été collées sur leurs lames correspondantes à la sortie de l’étuve et des coverslips, éléments en plastique placés sur la coupe permettant une répartition homogène du produit sur toute la surface de la lame au cours de la manipulation grâce aux propriétés de contact, ont été placés sur chacune des lames.

Le portoir de lames a été placé dans l’automate et après reconnaissance par le lecteur de chacun des éléments et des lames identifiés par leurs codes-barres présents sur les étiquettes, la manipulation a été initiée. Elle a commencé par un déparaffinage à la chaleur grâce au produit Dewax de chez Leica permettant par la suite l’accessibilité des anticorps. Cette étape ainsi que toutes les autres a été suivie de lavages, grâce au Bond Wash 10X préalablement dilué, ceci à trois reprises.

Cette étape a été suivie d’un prétraitement pendant 5 min avec le tampon ER1 de chez Leica, correspondant à un tampon citrate à pH =6, qui permet de démasquer les antigènes, c’est-à- dire de les rendre accessibles.

La lectine biotinylée ou un mélange de deux lectines biotinylées choisies parmi MAH-II, EEL, PTL-I et GSL-II, diluée dans une solution de PBS avec de la BSA à 5% (afin d’empêcher les accroches aspécifiques de par son pouvoir saturant), a été placé sur la coupe pendant 20 min. Le kit Bond Intense R détection (Leica) grâce à l’intervention d’une streptavidine-HRP jouant le rôle d’anticorps secondaire a permis de par ses propriétés de révéler la ou les lectines biotinylées en marron grâce aux propriétés de la DAB, substrat de l’enzyme HRP (peroxydase du raifort), permettant de révéler le complexe biotine/streptavidine-HRP. Une étape de contre coloration bleutée grâce à la présence d’hématoxyline a ensuite été réalisée pendant 7 min afin de rendre l’ensemble du prélèvement identifiable.

Les lames ont été retirées de l’automate. Les coupes ont été ensuite réhydratées en plongeant les lames manuellement dans un bain d’alcool par deux fois pendant 5 min. Cette étape de réhydratation a été poursuivie par un bain de toluène durant 5 min également. Les lames ont pu dès lors être montées en mettant une goutte de milieu de montage (Leica).

Les lames ont enfin été observées au microscope.

Le marquage d’un tissu sain, obtenu à partir d’une biopsie mammaire, par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 : 1) a montré l’absence de marquage des cellules. Il peut donc en être déduit l’absence de cellules souches cancéreuses mammaires dans ce tissu (Figure 2A).

Dans un tissu tumoral coexistent plusieurs types cellulaires : des cellules non-souches tumorales, des cellules souches non-tumorales, des cellules souches tumorales et des cellules non- souches non-tumorales. Le marquage d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses du sein (Figure 2B).

Exemple 4 : Marquage visible de lectines sur coupe histologique paraffinée (Figure 3 : ovaire)

Le protocole de cette manipulation est identique à celui de l’Exemple 3 ci-dessus. Cependant, les prélèvements contenus dans les blocs de paraffine nécessaires à la réalisation de ce présent exemple sont issus de cancers de l’ovaire provenant de patients. Le marquage d’un tissu sain, obtenu à partir d’une biopsie ovarienne, par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :l) a montré l’absence de marquage des cellules. Il peut donc en être déduit l’absence de cellules souches cancéreuses ovariennes dans ce tissu (Figure 3A). Dans un tissu tumoral coexistent plusieurs types cellulaires : des cellules non-souches tumorales, des cellules souches non-tumorales, des cellules souches tumorales et des cellules non- souches non-tumorales. Le marquage d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono- dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses de l’ovaire (Figure 3B).

Exemple 5 : Marquage visible de lectines sur coupe histologique paraffinée (Figure 4 : utérus) Le protocole de cette manipulation est identique à ceux de l’Exemple 3 et de l’Exemple 4 ci- dessus. Cependant, les prélèvements contenus dans les blocs de paraffine nécessaires à la réalisation de ce présent exemple sont issus de cancers de l’utérus provenant de patients.

Le marquage d’un tissu sain, obtenu à partir d’une biopsie utérine, par le mélange en quantité égale des deux lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :l) a montré l’absence de marquage des cellules. II peut donc en être déduit l’absence de cellules souches cancéreuses utérines dans ce tissu

(Figure 4A).

Dans un tissu tumoral coexistent plusieurs types cellulaires : des cellules non-souches tumorales, des cellules souches non-tumorales, des cellules souches tumorales et des cellules non- souches non-tumorales. Le marquage d’un tissu tumoral par le mélange en quantité égale des lectines MAH-II/EEL (ratio 1 :1) met en évidence la capacité de ce mélange de lectines à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses d’organes cibles de cancers hormono dépendants, dans le cas présent à marquer sélectivement les cellules souches cancéreuses de l’utérus (Figure 4B).