ПЦР-АНАЛИЗА

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способам выделения ДНК.

Известен широко используемый в молекулярной биологии и генной инженерии фенольный метод выделения ДНК с применением протеиназы К и 10% ДСН для расщепления вируса, удаления белков и выделения ДНК. Недостатком данного метода является его трудоемкость, невысокая эффективность при необходимости работы с такими агрессивными агентами, как хлороформ и фенол (Роа-Сhuп Сhапg, Yuап-Liпg Lее, Jui-Нιmg

Shiсп, Нарру К. Shiсh. Rарid diffеrепtiаtiоп оf vассiпе strаiпs апd fiеld isоlаtеs оf lаriпgоtrаhеitis virus bу rеstriсtiоп frаgmепt lепgth роlуmоrрhism оf PCR рrоduсts // J. Virоl. Меth. 66 ( 1997) 179- 186).

Предлагаемый способ является более эффективной процедурой выделения ДНК вируса ИЛТ птиц из вируссодержащих материалов для FfT]P анализа и предназначен для использования в лабораторных и научно-исследовательских учреждениях, занимающихся ПЦР - диагностикой ДНК- содержащих вирусных инфекций.

Сущность метода выделения ДНК вируса ИЛТ птиц из вируссодержащих материалов заключается в лизисе и инактивации протеаз гуанидинизотиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на частицах диоксида кремния. Приготовление сорбента

6 г двуокиси кремния (SiO ₂ ) суспендировать в деионизированной воде (общий объем 50 см ³ ) в стеклянном цилиндре. Уравновешивать в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем верхнюю водную фазу удалить отсасыванием. Объем верхней фазы может варьировать в зависимости от исходного SiO ₂ Оставшийся осадок суспендировать на шейкере, после добавить 50 см ³ воды, перемешать и снова оставить на ночь при комнатной температуре. Затем удалить отсасыванием верхнюю фазу, прилить (в объеме верхней фазы) вновь деионизированной воды и оставить на 5 ч. Удалить отсасыванием верхнюю фазу, которая с каждым разом становится прозрачнее. Осадок перемешать и довести рН концентрированной HCl до 2. Разлить готовый SiO ₂ по стеклянным сосудам в небольшом объеме и автоклавировать при 121 ⁰ C в течение 20 мин. Данный раствор хранится при комнатной температуре в темноте в течение 6 месяцев.

Приготовление буферов Лизирующий буфер: растворить 12 г гуанидинизотиоцианата в 10 см ³ 0,1 M Трис-НСl, рН 6,4; 2,2 см ³ 0,2 M ЭДТА, рН 8,0, добавить 0,26 г Тритона X-100.

Примечание: для приготовления O ₅ IM Трис-НСl, рН 6.4 брать основной Трис (молек. масса 121.14 г/моль), доводить рН соляной кислотой. Промывочный буфер: растворить 12 г гуанидинизотиоцианата в 10 см ³ 0,1 M Трис-НСl, рН 6,4. Примечание: растворять гуанидинизотиоцианат нагреванием в водяной бане при 60-65 ⁰ C.

Внимание: гуанидинизотиоцианат при нагревании может выделять токсичный газ! ! ! Выделение ДНК проводят из органо-тканевых материалов, аллантоисной жидкости и трахеальных смывов.

1 В пробирку объемом на 1,5 см ³ добавляют 900 мкл лизирующего буфера и 50 мкл готового сорбента SiO ₂ , перемешивают 10 с, затем добавляют 200 мкл исследуемого образца, вновь перемешивают (10 с) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

2 Смесь осаждают центрифугированием в течение 1 мин (микроцентрифуга "МiпiSрiп", Еррепdоrf) при максимальной скорости. Супернатант удаляют, добавляют 1 см ³ промывочного буфера и осадок ресуспендируют на вортоксе, затем осаждают центрифугированием в течение 1 мин при максимальной скорости.

3 Супернатант удаляют и вновь повторяют процедуру с промывочным буфером (шаг 2).

4 Супернатант удаляют и добавляют 1 см ³ 70% спирта, (осадок не ресуспендировать!), центрифугируют 1 мин при максимальной скорости. Вновь промывают 70% спиртом.

5 Удаляют супернатант, осадок высушивают в пробирках с открытыми крышками при 56 ⁰ C в течение 10 мин.

6 Осадок ресуспендируют в 50 мкл ТЕ-буфера ((10 мМ трис- HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), инкубируют при 56 ⁰ C в течение 10 мин, затем центрифугируют при максимальной скорости в течение 2 мин.

7. Супернатант переносят в другую пробирку и еще раз центрифугируют при максимальной скорости в течение 1 мин (для удаления оставшихся силика-частиц), затем снова переносят в другую пробирку для последующего использования в ПЦР).

В качестве объекта исследований использовали вирус ИЛТ птиц, штамм "Отар"; патологический материал (трахея, гортань) с подозрением на болезнь; трахеальные смывы от птиц. Результаты экспериментов подтверждают, что вышеописанная методика позволяет в течение 1 ч выделять вирусную ДНК, пригодную для

ПЦР-анализа благодаря быстрому лизису клеток и сорбции ДНК на сорбенте. Метод эффективен тем, что по сравнению с фенольным методом потери ДНК не наблюдаются; он удобен, экономичен, технологичен и пригоден для подготовки образцов к амплификации.