FAUST, Tillmann (Parkweg 4, Weisenheim, 67256, DE)
RICHTER, Ulrike (Carl-Bosch-Str. 38, Ludwigshafen, 67056, DE)
SUBKOWSKI, Thomas (Wichernstr. 13, Ladenburg, 68526, DE)
KAROS, Marvin (Fröbelstr. 2, Neustadt, 67433, DE)
DANNER, Thomas (Bahnhofstr. 32, Erpolzheim, 67167, DE)
FAUST, Tillmann (Parkweg 4, Weisenheim, 67256, DE)
RICHTER, Ulrike (Carl-Bosch-Str. 38, Ludwigshafen, 67056, DE)
SUBKOWSKI, Thomas (Wichernstr. 13, Ladenburg, 68526, DE)
KAROS, Marvin (Fröbelstr. 2, Neustadt, 67433, DE)
Patentansprüche
1. Verfahren zum Aufschluss biologischer Zellen mittels einer Homogenisiervorrichtung, die a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen den Blenden ein statischer Mischer befindet und gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet und/oder mechanische Energieeinbringung erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den bei den Zellen um einen natürlichen oder rekombinanten Organismus handelt.
3. Verfahren zur Isolierung eines Proteins aus einer Produktionszelle mittels einer Homogenisiervorrichtung, die a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen den Blenden ein statischer Mischer befindet und gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet und/oder mechanische Energieeinbringung erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Protein um ein Hydrophobin handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Produktionszelle vor dem Homogenisieren abgetötet wird.
6. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, enthaltend einen Ve- rahrensschritt gemäß Anspruch 1.
02.07.2007/SA Fig. |
Verfahren zur Isolierung von Proteinen aus Produktionszellen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zellaufschluss biologischer Zellen und der anschliessenden Isolierung von Proteinen aus Produktionszellen sowie eine Vorrichtung dazu.
Beschreibung des Standes der Technik
Liegt ein fermentativ hergestelltes Produkt interazellulär vor, so muß die Zelle nach Beendigung der Fermentation aufgeschlossen werden (Enzym- oder Proteinfreisetzung). Hierbei kommt es darauf an, die Zelle zu öffnen und die inneren Zellbestandteile, speziell das gesuchte Molekül, meist ein Protein, in die Kulturbrühe freizusetzen. Dabei spielt es keine Rolle, ob diese Proteine schon in der gewünschten nativen Form oder inaktiv als Inclusion Body vorliegen. Neben dem gewünschten Protein werden dabei auch weitere lösliche Proteine freigesetzt. Das Produkt kann dann nach dem Zellaufschluss von den sogenannten Zelltrümmern z.B. durch Sedimentation in einer Zentrifuge, durch Filtration oder durch fraktionierte Sedimentation abgetrennt und ggf. weiter aufgereinigt werden.
Die physikalischen Kräfte, die zum Zellaufschluss genutzt werden, sind mechanische Kräfte, die durch Prall, Reibung, Spannung, Druck, Pressung, Kavitation oder Schall aufgebracht werden können. In den dafür konstruierten Maschinen und Apparaten werden in der Regel mehrere dieser Wirkkräfte erzeugt. Das außen sichtbare Merkmal ist der spezifische Leistungseintrag. Die möglichst effektive Nutzung der eingebrachten Energie hinsichtlich Zerkleinerungswirkung ist dabei ein wichtiges Entscheidungskriterium für das zu wählende Verfahren (Storhas W. Bioverfahrensentwicklung. Wiley-VCh Verlag GmbH & Co KgaA Weinheim. 2003). Neben den rein mechanischen Zellauf- schlussverfahren können auch chemische (z.B. Säure/Lauge, Salze, Lösungsmittel), biologische, wie z.B. Enzyme, Phagen, Autolyse (Wisemen, Process Biochem.4 63-65 (1969); Asenjo JA, Andrews BA, Hunter JB, LeCorre S, Process Biochem. 20: 158-164. 1985, Lam KS, GrootWassink JWD, Enzyme Microb Technol. 239-242. 1985; Tanny GB, Mirelman D, Pistole T. Appl Environ Microbiol 40. 269-273. 1980), thermische und physikalische (z.B. osmotischer Druck, gefrieren und auftauen, Gefriertrocknen) oder eine Kombination aus diesen Verfahren zum Zellaufschluss eingesetzt werden. Zum Beispiel berichten Bailey et al. (Improved homogenization of recombinant E. coli follow-
ing pre-treatment with guanidine hydrochloride. Biotechnol Prog 11 : 533- 539. 1995) von einer Verbesserung des Zellaufschlussgrads durch Zugabe von Detergenzien und Chaotropen vor der Homogenisation.
Die Hochdruckhomogenisation ist das in der großtechnischen Aufarbeitungspraxis am häufigsten eingesetzte Desintegrationsgerät. Das Prinzip des Hochdruckhomogenisators beruht auf einer durch die spontane Druckabsenkung hervorgerufenen Kavitation, die mit starken Spannungskräften zur Zellzerstörung führt. Beim Zerfall der Kavitationsdampfblasen entstehen Drücke von bis zu 10 5 bar, die letztendlich für die Zerstö- rung der Zelle mitverantwortlich sind. Die Suspension wird meist mit geringem Vordruck der Kolbenpumpe zugeführt, die sie auf den Homogenisationsdruck spannt. In der Homogenisiereinheit setzt das Ventil diesen Druck in Geschwindigkeit, Scherung, Normal- und Zugspannungskräfte um. Dabei entsteht eine stark kavitierende Strömung. Diese Vorgänge dauern je nach Druck ca. 200 bis 250 msec. Die Hauptein- flussgrößen auf die Desintegration im Hochdruckhomogenisator sind theoretisch die Homogenisationsdruckdifferenz, Passagenzahl, Design des Homogenisierventils, Konzentration der Zulaufkonzentration und Temperatur (Storhas, 2003).
Beim Hochdruckzellaufschluss steigt die Temperaturerhöhung im allgemeinen propor- tional zur verwendeten Druckdifferenz an (ca. 2,2 0 C pro 10Mpa, Storhas, 2003). Eine Erhöhung der Produktausbeute durch verbesserten Zellaufschluss bei höheren Druckdifferenzen steht damit ggf. einer Hitzeinaktivierung des Produktes gegenüber. Eine Erhöhung der Druckdifferenz zur Verbesserung des Zellaufschlussgrads zieht folglich eine erhöhte Kühlkapazität nach sich.
Durch eine Optimierung der Ventilkonstruktion kann eine Energieeinsparung bei gleichbleibender Produktqualität bzw. für das Downstreaming verbesserte Eigenschaften durch z.B. kleinere Zelltrümmer oder engere Größenverteilungen der Zellbruchstücke bei gleichen Energieeinträgen erzielt werden. Zum Beispiel zeigt Storhas (2003), dass ein Messerkantenventil bei Versuchen zur Freisetzung von Enzymen aus Bäckerhefen den höchsten Wirkungsgrad besitzt, gefolgt von Kegelventil und Flachventil.
Eine kommerziell erhältliche Abwandlung des Hochdruckzellaufschlusses ist der sogenannte „Microfluidizer" (Firma Microfluidics, USA). Hierbei wird die Zellsuspension durch Einsatz einer Intensivierungspumpe auf den gewünschten Druck bei konstantem Durchfluß gebracht. Die Zellsuspension wird dann durch genau definierte Mikrokanäle mit fester Geometrie innerhalb einer sogenannten Aufschlusskammer geleitet, wodurch
die Zellsuspension auf hohe Geschwindigkeiten beschleunigt wird. Hierdurch werden sehr hohe Scherraten generiert (=Scherzone). Im Anschluss an die Scherzone wird die Zellsuspension in eine Prallzone geleitet, bei der die Zellen durch Aufprall aufgeschlossen werden. Für diese Aufschlussmethode ist ein Aufschlussgrad von bis zu 99% bei einmaligem Durchlauf einer E.coli-Suspension bei 1240 bar zu erwarten (Microfluidics Prospekt, Innovation durch Microfluidizer Prozessor-Technologie, 2005).
Häufig werden Zellen auch durch Prall-Druck-Zerkleinerung in Rührwerkskugelmühlen (RKM) aufgeschlossen, wobei hier überwiegend große Zelltrümmer entstehen. Der Zellaufschluss durch Einsatz von Rotor-Stator-Maschinen und Kolloid-Mühlen ist denkbar.
Die Größe der aus einem mechanischen Zellaufschluss resultierenden Zelltrümmern kann das Trennergebnis in einem Tellerseparator direkt beeinflussen (Wong et al. Cen- trifugal processing of cell debris and inclusion bodies from recombinant E. coli, Bioseparation 6: 361-372, 1997). berichten von einer besseren Abtrennleistung der im Produkt unerwünschten Zelltrümmern von Inclusion Bodies bei Einsatz eines Tellerseparators, wenn die Größe der Zelltrümmer bei gleichbleibender Inclusion-Body-Größe reduziert wird. Eine Reduzierung der Zelltrümmergröße konnte in diesem Fall durch Erhö- hung der Homogenisatorpassagen von 2 auf 10 erreicht werden. Durch Erzeugung kleinerer Zelltrümmer, die bevorzugt im Klarlauf des Separators abgetrennt wurden, konnte die Reinheit des Inclusion Body Konzentrats um 58 % gesteigert werden.
Sofern die aufgeschlossene Zellsuspension ein gelöstes Wertprodukt enthält, kann die Abtrennung der Zelltrümmer über Filtrationsverfahren allerdings durch kleinere Zelltrümmer erschwert werden (Storhas, 2003).
Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren benötigen hohe Energiemengen, erfordern mehrmaliges Wiederholen des Aufschlussschrittes, befriedigen nicht hinsicht- lieh der quantitativen Ausbeute an funktionellem Protein, verwenden teilweise toxische Substanzen und bringen oftmals starke Verunreinigungen mit Nukleinsäuren ein, die die weitere Aufarbeitung erschweren. Oftmals sind die Verfahren auch aus Kostengründen nur im kleinen Maßstab anwendbar, so dass eine technische Herstellung von Proteinen so nicht rentabel durchzuführen ist.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zum Aufschluss biologischer Zellen mit dem eine besonders gute Isolierung von Proteinen aus Produktionszellen gelingt bereitzustellen, dass die o.g. Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet.
Die Aufgabe wurde gelöst durch ein Verfahren zum Aufschluss biologischer Zellen mit dem eine besonders gute Isolierung von Proteinen aus Produktionszellen gelingt, mittels einer Homogenisiervorrichtung, die a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen den Blenden ein statischer Mischer befindet und gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet und/oder mechanische Energieeinbringung erfolgt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung eines Prote- ins aus einer Produktionszelle mittels einer Homogenisiervorrichtung, die a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen den Blenden ein statischer Mischer befindet und gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet und/oder mechanische Energieeinbringung erfolgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine Vorrichtung zum Aufschluss biologischer Zellen mit der eine besonders gute Isolierung von Proteinen aus Produktionszellen gelingt, die
a) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit we- nigstens einer Austrittsdüse besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen den Blenden ein statischer Mischer befindet und gegebenenfalls zusätzlich mechanische Energieeinbringung erfolgt oder
b) aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte besteht, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet und/oder mechanische Ener- gieeinbringung erfolgt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Arten von biologischen Zellen aufgeschlossen und insbesondere Proteine im Anschluss an den Zellaufschluss besonders gut aus Produktionszellen isoliert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erzielt einen vergleichbaren Zellaufschlussgrad bei deutlich niedrigerem Differenzdruck (ca. Faktor 2) gegenüber dem Stand der Technik. In anderen Worten wird beim gleichen Differenzdruck ein höherer Zellaufschlussgrad gegenüber dem Stand der Technik erzielt. Damit kann der erforderliche Aufwand zur anschliessenden Abtötung der biologischen Zellen durch z.B. Konti-Sterilisation oder Chemikalienzugabe deutlich reduziert werden. Desweiteren werden die Eigenschaften der Zellbruchstücke so beeinflusst, dass eine anschliessende Abtrennung der Zellbruchstücke über einen Separator bzw. Düsenseparator deutlich erleichtert wird. Bevorzugt verwendet wird das Verfahren zum Zellaufschluss, wenn anschliessend nicht-enzymatische Proteinen isoliert werden müssen, insbesondere wenn oberflächenaktive Proteine isoliert werden müssen. Ganz besonders gut gelingt damit die anschliessende Isolierung von Proteinen mikrobiellen, pflanzlichen Ursprungs, insbesonders von Proteinen aus der Klasse der Hydrophobine.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 AS, die charakteristisch für filamentö- se Pilze sind und nicht in anderen Organismen vorkommen. Kürzlich wurden Hy- drophobin-ähnliche Proteine in Streptomyces coelicolor entdeckt, die als „Chapline" bezeichnet werden und ebenfalls hoch oberflächenaktive Eigenschaften haben. An Wasser/Luft-Grenzflächen können sich Chapline zu Amyloid-ähnlichen Fibrillen as- semblieren (Classen et al. 2003 Genes Dev 1714-1726 ; Elliot et al. 2003, Genes Dev. 17, 1727-1740).
Hydrophobine sind in einer wasserunlöslichen Form auf der Oberfläche von verschiedenen pilzlichen Strukturen, wie z.B. Lufthyphen, Sporen, Fruchtkörpern, verteilt. Die Gene für Hydrophobine konnten aus Ascomyzeten, Deuteromyzeten und Basidiomyzeten isoliert werden. Einige Pilze enthalten mehr als ein Hydrophobingen, z.B. Schi- zophyllum commune, Coprinus cinereus, Aspergillus nidulans. Offensichtlich sind verschiedene Hydrophobine in unterschiedlichen Stadien der pilzlichen Entwicklung involviert. Die Hydrophobine sind dabei vermutlich verantwortlich für unterschiedliche
Funktionen (van Wetter et al., 2000, Mol. Microbiol., 36, 201-210; Kershaw et al. 1998, Fungal Genet. Biol, 1998, 23, 18-33).
Als biologische Funktion für Hydrophobine wird neben der Reduzierung der Oberflä- chenspannung von Wasser zur Generierung von Lufthyphen auch die Hydrophobisie- rung von Sporen beschrieben (Wösten et al. 1999, Curr. Biol., 19, 1985-88; Bell et al. 1992, Genes Dev., 6, 2382-2394). Weiterhin dienen Hydrophobine zur Auskleidung von Gaskanälen in Fruchtkörpern von Flechten und als Komponenten im Erkennungssystem von pflanzlichen Oberflächen durch pilzliche Pathogene (Lugones et al. 1999, Mycol. Res., 103, 635-640; Hamer & Talbot 1998, Curr. Opinion Microbiol., Band 1 , 693-697).
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich auch mit sehr gutem Erfolg auf die Isolierung von Fusionsproteinen anwenden. Darunter sind Proteine zu verstehen, die min- destens eine Polypeptidkette besitzen, die in dieser Form in der Natur nicht vorkommt, und aus zwei Teilen künstlich zusammengesetzt worden ist. Insbesondere ist das er- findungsgemässe Verfahren zur Isolierung von Hydrophobinen geeignet.
Besonders gut geeignete Hydrophobine für das erfindungsgemäße Verfahren sind Po- lypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
X n -C -Xi -5O -C -X 0 - 5 -C -Xp-C -Xi-I OO -C -Xi -5O -C -X 0 - 5 -C -Xi -5O -C -X m (I)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 500 , bevorzugt zwischen 15 und 300, stehen, p für eine Zahl zwischen 1 und 250, bevorzugt 1-100 steht, und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit X n oder X m oder X p abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 20 Aminosäuren lange Peptidsequenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindes- tens 20° bewirken.
Die mit C 1 bis C 8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C 1 bis C 8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemässen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Disulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der einzelnen C-positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Besonders vorteilhafte Polypeptide sind solche der allgemeinen Formel (II)
Xn"C -X 3 -2 5 -C -X θ -2"C -X 5 - 50 -C -X2- 35 -C -X2-I 5 -C -X θ -2"C -X 3 - 35 -C "X m (H)
wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann und die bei X stehenden Indizes die Anzahl der Aminosäuren darstellen, wobei die Indizes n und m für Zahlen zwischen 2 und 300 stehen und C für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin steht, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine der mit X n oder X m abgekürzten Peptidsequenzen für eine mindestens 35 Aminosäuren lange Peptidse- quenz steht , die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft ist, die nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Kontaktwinkeländerung von mindestens 20° bewirken.
Die Herkunft der Hydrophobine spielt dabei keine Rolle. So können die Hydrophobine beispielsweise aus Mikroorganismen wie z.B. Bakterien, Hefen und Pilzen isoliert worden sein. Insbesondere Hydrophobine , die mittels gentechnisch veränderter Organismen gewonnen wurden, kommen erfindungsgemäß in Betracht.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Proteine leichter isolieren. Die Isolierung aus einer Produktionszelle ist meistens einer der ersten Schritte bei der Reindarstellung eines Proteins, sofern das Protein intrazellulär hergestellt und gespeichert wird.
Als Produktionszelle wird dabei jede Art von Zelle oder Zellverband bezeichnet; insbesondere solche Zellen tierischen, pflanzlichen oder pilzlichen Ursprungs bzw. Mikroorganismen aus der Gruppe der Bacteria bzw. Archaea. Bevorzugte Produktionszellen sind rekombinante Organismen. Besonders gut geeignete Produktionszellen sind Pro- karyonten (einschliesslich der Archaea) oder Eukaryonten, besonders Bakterien ein- schliesslich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus. megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pasto- ris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen), CHO.
Die Produktionszelle kann direkt nach der Kultivierung (z.B. Fermentation) in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden; es ist aber auch möglich, die Produktionszelle erst abzutöten, beispielsweise durch Sterilisation, und ggf die Zellmasse durch Filtration des Kultivierungsmediums anzureichern.
Die Homogenisiervorrichtung zum Zellaufschluss besteht entweder aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Blende mit wenigstens einer Austrittsdüse, wobei die Düsen axial zueinander angeordnet sind. Im Zwischenraum zwischen den Blenden befindet sich ein statischer Mischer. Gegebenenfalls erfolgt zusätzlich eine mechanische Energieeinbringung.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren Blenden weisen wenigstens eine öffnung, d.h. wenigstens eine Düse auf. Dabei können die beiden Blenden jeweils eine beliebige Anzahl an öffnungen aufweisen, bevorzugt jedoch nicht mehr als jeweils 5 öffnungen, besonders bevorzugt nicht mehr als jeweils drei öffnungen, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als jeweils zwei öffnungen und insbesondere bevorzugt nicht mehr als jeweils eine öffnung. Beide Blenden können eine unterschiedliche oder die selbe Anzahl an öffnungen aufweisen, bevorzugt haben beide Blenden die selbe Anzahl an öffnungen. Im allgemeinen handelt es sich bei den Blenden um perforierte Platten mit mindestens je einer öffnung.
In einer anderen Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Verfahrens ist die zweite Blende durch ein Sieb ersetzt, d.h. die zweite Blende hat eine Vielzahl von öffnungen bzw. Düsen. Die einsetzbaren Siebe können einen großen Bereich an Porengrö- ßen überspannen, in der Regel liegen die Porengrößen zwischen 0,1 und 250 μm, bevorzugt zwischen 0,2 und 200 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,3 und 150 μm und insbesondere zwischen 0,5 und 100 μm.
Die öffnungen bzw. Düsen können jede denkbare geometrische Form haben, sie kön- nen beispielsweise kreisrund, oval, eckig mit beliebige vielen Ecken, die gegebenenfalls auch abgerundet sein können, oder auch sternförmig sein. Bevorzugt haben die öffnungen eine kreisrunde Form.
Die öffnungen haben in der Regeln einen Durchmesser von 0,05 mm bis 1 cm, bevorzugt von 0,08 mm bis 0,8 mm, besonders bevorzugt von 0,1 bis 0,5 mm und insbeson- dere von 0,2 bis 0,4 mm.
Die beiden Blenden sind vorzugsweise so konstruiert, dass die öffnungen bzw. Düsen axial zueinander angeordnet sind. Unter axialer Anordnung soll verstanden werden, dass die durch die Geometrie der Düsenöffnung erzeugte Strömungsrichtung bei bei- den Blenden identisch ist. Die öffnungsrichtungen der Eintritts- und Austrittsdüse müssen dazu nicht auf einer Linie liegen, sie können auch parallel verschoben sein, wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht. Vorzugsweise sind die Blenden parallel ausgerichtet.
Es sind jedoch andere Geometrien, insbesondere nicht parallele Blenden oder unterschiedliche öffnungsrichtungen der Ein- und Austrittsdüse möglich.
Die Dicke der Blenden kann beliebig sein. Bevorzugt haben die Blenden eine Dicke im Bereich von 0,1 bis 100 mm, bevorzugt von 0,5 bis 30mm und besonders bevorzugt von 1 bis 10 mm. Dabei ist die Dicke (I) der Blenden so gewählt, dass der Quotient aus Durchmesser (d) der öffnungen und Dicke (I) im Bereich von 1 :1 , bevorzugt 1 :1 ,5 und besonders bevorzugt 1 :2 beträgt.
Der Zwischenraum zwischen den beiden Blenden kann beliebig lang sein, in der Regel beträgt die Länge des Zwischenraums 1 bis 500 mm, bevorzugt 10 bis 300 mm und besonders bevorzugt 20 bis 100 mm.
Im Zwischenraum zwischen den Blenden befindet sich erfindungsgemäß ein statischer Mischer, der die Strecke zwischen den beiden Blenden ganz oder teilweise ausfüllen kann. Bevorzugt erstreckt sich der statische Mischer über die gesamte Länge des Zwischenraums zwischen den beiden Blenden. Statische Mischer sind dem Fachmann bekannt. Es kann sich dabei beispielsweise um einen Ventil-Mischer handeln oder um einen statischen Mischer mit Bohrungen, einen aus geriffelten Lamellen oder einen aus ineinandergreifenden Stegen. Weiterhin kann es sich um einen statischen Mischer in Wendel-Form oder in N-Form oder um einen solchen mit heiz- oder kühlbaren Mischelementen handeln.
Durch den Einbau eines statischen Mischers in den Zwischenraum zwischen den beiden Blenden wird die Stabilität der erhaltenen Proteinsuspension erheblich verbessert.
Zusätzlich zu dem statischen Mischer kann in dem Zwischenraum zwischen den beiden Blenden noch eine mechanische Energieeinbringung erfolgen. Die Energie kann beispielsweise in Form von mechanischen Schwingungen, Ultraschall oder Rotationsenergie eingebracht werden. Dadurch wird eine turbulente Strömung erzeugt, die bewirkt, dass die Partikel im Zwischenraum nicht agglomerieren.
Alternativ zu dieser ersten Variante kann die Mischvorrichtung aus einer Blende mit wenigstens einer Eintrittsdüse und einer Prallplatte bestehen, wobei sich im Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte gegebenenfalls ein statischer Mischer befindet. Alternativ oder zusätzlich zu dem statischen Mischer kann in dem Zwischen- räum eine mechanische Energieeinbringung erfolgen.
Für die Blende mit Eintrittsdüse, dem Zwischenraum mit statischem Mischer und der mechanischen Energieeinbringung gilt das obengesagte.
In dieser Variante wird die zweite Blende durch eine Prallplatte ersetzt. Die Prallplatte hat in der Regel einen Durchmesser, der 0,5 bis 20 %, bevorzugt 1 bis 10 % kleiner ist als der Rohrdurchmesser an der Stelle, an der die Prallplatte eingebaut ist.
Generell kann die Prallplatte jede geometrische Form haben, bevorzugt in Form einer runden Scheibe, so dass in Frontalaufsicht ein Ringspalt zu sehen ist. Denkbar ist beispielsweise auch die Form eines Schlitzes oder eines Kanals.
Die Prallplatte kann analog zur zweiten Blende bei der oben beschriebenen Variante in unterschiedlichen Abständen zur ersten Blende angebracht sein. Dadurch ist der Zwischenraum zwischen der Blende und der Prallplatte beliebig lang, in der Regel beträgt die Länge des Zwischenraums 1 bis 500 mm, bevorzugt 10 bis 300 mm und besonders bevorzugt 20 bis 100 mm.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist gegenüber denen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren einige Vorteile auf, da besonders hohe Ausbeuten des Proteins in aktiver Form erhalten werden.
Die Temperatur, bei der der biologische Zellaufschluss nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt, beträgt in der Regel 0 bis 150 0 C, bevorzugt, 5 bis 80 0 C, besonders bevorzugt 20 bis 40 0 C. Dabei können alle in der Vorrichtung eingesetzten Homogenisiereinheiten temperierbar sein.
Die Homogenisierung wird in der Regel bei Drücken oberhalb des Atmosphärendrucks, d.h. > 1 bar durchgeführt. Dabei übersteigen die Drücke jedoch nicht einen Wert von 10 000 bar, so dass bevorzugt Homogenisierdrücke von > 1 bar bis 10 000 bar, bevorzugt 5 bis 2 000 bar und besonders bevorzugt von 10 bis 1500 bar eingestellt werden .
Die im erfindungsmäßen Verfahren verwendeten Produktionszellkonzentrationen (als Gesamt-Trockensubstanz) betragen etwa von 3 bis 25 gew-% bevorzugt 5-15 gew-%. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Proteinisolate können je nach Verwendungszweck entweder direkt oder nach Renaturierung des Proteins, weiterer Aufreinigung und ggf. Formulierung eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Herstellverfahren für ein Protein, das unter anderem die oben beschriebene Isolierung aus einer Produktionszelle umfasst.
Eine Aufreinigung der Proteine kann im Anschluss an das erfindungsgemäße Verfahren mit bekannten Verfahren erzielt werden. Besonders gut gelingt die Aufreinigung, wenn das Zellprotein in sg. Inclusion Bodies vorliegt. In diesem Fall lassen sich diese besonders vorteilhaft durch Zentrifugalseparation in einem Separator bzw. Düsensepa- rator selektiv von den unerwünschten Zelltrümmern abtrennen. Im Anschluss an die Renaturierung des Proteins kann die weitere Aufreinigung mit bekannten, chroma¬
ll
tographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Zentrifugalseparation, Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Bei Vorlage eines löslichen Zellproteins im Anschluss an den Zellaufschluss direkt mit bekannten, chromatographischen Verfahren, wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Zentrifugalseparation, Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese erfolgen. Geeignete Verfahren werden bei- spielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Anschliessend oder alternativ kann gewünschtenfalls eine Formulierung des Proteins erfolgen durch Trocknung und ggf. Zusatz von Hilfs- und Konservierungsstoffen.
Experimenteller Teil
Fermentation und Aufarbeitung (Beispiele 1-8) 200ml Komplexmedium werden in einem 1000 ml_ Erlenmeyerkolben mit zwei Seitenschikanen werden mit einem E. coli Stamm von LB-Amp Platte (100μg/ml Ampicillin) inokuliert (=erste Vorkultur). Der Stamm wird bis zu einer OD 6 oo nm von ca 3,5 bei 37°C auf einem Schüttler mit d o = 2,5 cm bei 200 rpm inkubiert. Im Anschluss werden 4 weitere 1000 ml_ Erlenmeyerkolben mit Schikanen (jeweils mit 200 ml_ Komplexmedium) mit jeweils 1 ml_ der ersten Vorkultur beimpft und bei 37°C im Schüttelschrank (d o = 2,5 cm, n = 200 rpm) inkubiert (= 2. Vorkultur). Sobald die OD 6 oo nm > 6 ist, wird der mit Komplexmedium gefüllte Vorfermenter aus dieser zweiten Schüttelkultur beimpft. Nach erreichen einer OD 6 oo nm > 9 oder OTR = 80 mmol/(l*h), wird der Hauptfermenter beimpft. Die Hauptkultur wird bis zu einer OD von 70 im Fed-Batch gefahren. Die Fer- mentation wird durch Abkühlung auf 4 0 C abgebrochen. Die Zellmasse wird mit einer Durchflussrate von 200 l/h über einen Tellerseparator gefahren. Aus 3300 kg Fermentationsbrühe werden 860 kg Konzentrat erhalten. Die resuspendierten Zellen werden mit 1200 kg Wasser aufgefüllt und die Lebendzellzahl wird bestimmt (= Nullprobe). Der Trockensubstanzgehalt (TS) der resuspendierten Zellbrühe beträgt 5 gew %.
Für den Zellaufschluss werden die suspendierten Zellen mittels einer Hochdruckpumpe auf den gewünschten Betriebsdruck bracht (Abb. 1 ). Die anschließende Druckentspannung findet in der beschriebenen Hochdruckblende statt. Dabei findet der Zellaufschluss statt. Verantwortlich sind Scher-, Dehn und turbulente Strömungskräfte, die an den suspendierten Mikroorganismen angreifen. Im Labormaßstab wird mir einem Durchfluß von ca. 25 l/h und einem Arbeitsdruck nach der Pumpe von bis zu 2500 bar gearbeitet. Die Temperatur auf der Saugseite der Pumpe ist beliebig (meist Raumtemperatur bzw. auf 4°C vorgekühlt). Auf der Austrittsseite führt die dissipierte Energie zu einer Temperaturerhöhung von bis zu 50° C. Daher ist unmittelbar nach der Hochdruckdüse ein Wärmeübertrager eingebaut. Zusätzlich kann/ist die Düse selbst bereits gekühlt (werden). Für den Zellaufschluss wurden folgende Düsenpaare eingesetzt: 500 bar: 0,2 und 0,4 mm
1000-2400 bar 0,1 und 0,2 mm
Abb.2: Verfahrensfliessbild Hochdruckblende.
Fermentation und Aufarbeitung (Beispiel 9)
200ml Komplexmedium werden in einem 1000 ml_ Erlenmeyerkolben mit zwei Seiten- Schikanen werden mit einem YaaD-DewA-His6 exprimierenden E. coli Stamm von LB- Amp Platte (100μg/ml Ampicillin) inokuliert (=erste Vorkultur). Der Stamm wird bis zu einer OD 6 oo nm von ca 3,5 bei 37°C auf einem Schüttler mit d o = 2,5 cm bei 200 rpm inkubiert. Im Anschluss werden 4 weitere 1000 mL Erlenmeyerkolben mit Schikanen (jeweils mit 200 mL Komplexmedium) mit jeweils 1 mL der ersten Vorkultur beimpft und bei 37°C im Schüttelschrank (d o = 2,5 cm, n = 200 rpm) inkubiert (= 2. Vorkultur). Sobald die OD 6 oo nm > 6 ist, wird der mit Komplexmedium gefüllte Vorfermenter aus dieser zweiten Schüttelkultur beimpft. Nach erreichen einer OD 6 oo nm > 9 oder OTR = 80 mmol/(l*h), wird der Hauptfermenter beimpft. Die Hauptkultur wird im Fed-Batch Verfahren in mineralischem Medium gefahren. Bei einer OD 6 oo nm > 70 werden die Zellen mit 50 μm IPTG induziert. Nach einer Induktionszeit zwischen 4 und 20h wird die Fermentation abgebrochen und der Kesselinhalt auf 4 0 C gekühlt. Die Zellen werden im Anschluss an die Fermentation mittels eines Düsenseparators mit einer Durchflussrate von 700 L/h von der Fermentationsbrühe abgetrennt (Konzentrat: TS =13,4 gew-%, BTM = 10,4 gew-%) und in VE-Wasser resuspendiert. Nach erneuter Separation der
Zellen durch Einsatz des Düsenseparators liegt ein Trockensubstanzgehalt von 14,9 gew-% und eine Biotrockenmasse von 13,3 gew-% vor.
Der Scale-up vom Labor- (Beispiele 1-8) in den Technikumsmaßstab wurde auf Durch- sätze von bis zu 700 l/h und Drücke bis zu 2500 bar durchgeführt. Für die Temperaturen auf der Eingangsseite gelten die gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1-8 (siehe oben). Die zellhaltige Suspension wird mittels einer Druckluftmembranpumpe über einen 70 μm Vorfilter geleitet. Mit einem Vordruck von mindestens 1 ,5 bar wird die zellhaltige Suspension mit einer Hochdruckkolbenpumpe auf den entsprechenden Druck gebracht und passiert dann den sogenannten Blendenblock. Der Blendenblock besteht aus 2 Blenden. Die erste Blende besitzt 14 Bohrungen mit jeweils 0,1 bzw. 0,2 mm Durchmesser (siehe oben). Nach Durchlaufen einer Bohrung mit 8 mm Durchmesser passiert die zellhaltige Suspension die zweite Blende mit einem Durchmesser von 1 ,5 mm zur drucklosen Seite. Im Anschluss passiert die zellhaltige Suspension den Kühler.
Bestimmung der Lebendzellzahl
Zur Bestimmung der Lebendzellzahl werden jeweils 100; 10 und 1 μL Suspension auf LB AMPI 00 Agarplatten ausgestrichen, die bei 37°C über Nacht inkubiert werden. Die Colony Forming Units (CFU) werden anschliessend gezählt und es wird auf die Le- bendzellzahl pro Volumen hochgerechnet.
Definitionen
Gesamt-Trockensubstanz: Getrocknete Probe, enthält gesamte Trockensubstanz Biotrockenmasse: 2-fach gewaschene und im Anschluss getrocknete Probe
Aufschlussgrad
Der Aufschlussgrad [A) wird definiert über
N 0 Lebendzellzahl vor Zellaufschluss N Lebendzellzahl nach Zellaufschluss (einmaliger Durchlauf)
Aktivitätstest
Zur Beurteilung der Proteinaktivität werden die Beschichtungseigenschaften des wiedergelösten sprühgetrockneten bzw. sprühgranulierten Hydrophobinfusionsproteins herangezogen. Die Evaluierung der Beschichtungseigenschaften wird bevorzugt auf
Glas bzw. Teflon als Modelle für hydrophile bzw. hydrophobe Oberflächen vorgenommen.
Glas:
Konzentration Hydrophobin: 50 mg/L
Inkubation von Glasplättchen über Nacht (Temperatur: 80 0 C) in 1OmM Tris pH 8 nach Beschichtung waschen in VE-Wasser danach Inkubation 10min / 80 0 C / 1% SDS waschen in VE-Wasser
Teflon:
Konzentration: 50 mg/L
Inkubation von Teflonplättchen über Nacht (Temperatur: 80°C) in 1OmM Tris pH 8 nach Beschichtung waschen in VE-Wasser danach Inkubation 10min / 80 0 C / 1 % SDS waschen in VE-Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser bestimmt. Es ergeben sich z.B. folgende Werte:
Ansatz mit YaaD-DewA Fusionsprotein (Kontrolle: ohne Protein; YaaD-DewA-His 6 : 100 mg/L gereinigter Fusionspartner):
Beispiel 1
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über einen Microfluidizer Prozessor M-7125- 30 S. N. 200414 mit den Aufschlusskammern "Ceramic IXC H10Z-6 slot" und "Ceramic APMH30Z" der Firma Microfluidics bei einem Differenzdruck von 1750 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 2 Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 500 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 3
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 1000 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 4
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 1200 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durch- lauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 5
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 1400 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 6
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 1800 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 7
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 2000 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Beispiel 8
Ein Teil der resuspendierten Zellen wird über die Hochdruckblende (HD-Blende) bei einem Differenzdruck von 2400 bar aufgeschlossen. Die Durchflussrate beträgt dabei 3,3 L/min. Die im Zellaufschluss resultierende Lebendzellzahl nach einmaligem Durchlauf ist in Tab. 1 aufgeführt.
Die Beispiele zeigen (siehe auch Abb.2 und 3), dass die Hochdruckblende bei gleicher Druckdifferenz zu einem wesentlich höheren Aufschlussgrad gegenüber dem Stand der Technik führt.
Beispiel 9
Die Zellsuspension wird unter Einsatz der Hochdruckblende bei einem Differenzdruck von 1000; 1500 und 2000 bar mit einer Durchflussrate von 700 l/h aufgeschlossen und die jeweilige Lebendzellzahl bestimmt (siehe Tab.2). Die bei 2000 bar Differenzdruck aufgeschlossene Zellbrühe wird mit einer Durchflussrate von 400 L/h über einen Düsenseparator gefahren. Die gewünschten Inclusion Bodies sammeln sich bevorzugt im Konzentrat 1 an (TS = 14,8 gew-%, m = 347 kg), während die Zelltrümmer bevorzugt mit dem Klarlauf 1 (TS = 8,2 gew-%, m = 508 kg) abgetrennt werden. Das Konzentrat wird mit 500 L Wasser aufgefüllt und erneut bei 400 l/h über den Düsenseparator gefahren (= Waschschritt). Die gewünschten Inclusion Bodies sammeln sich bevorzugt im Konzentrat 2 an (TS = 11 gew-%, m = 343 kg), während die Zelltrümmer bevorzugt mit dem Klarlauf 2 (TS = 2,9 gew-%, m = 508 kg) abgetrennt werden. Der Waschschritt wird wiederholt. Es resultiert ein IB-Austrag von 370 kg mit 7,9 gew-% Trockensubstanzgehalt. Dieses erhaltene Konzentrat wird auf pH 12,5 eingestellt und nach 15 min. wird der pH auf 9 abgesenkt. Die neutralisierte Hydrophobin-haltige Lösung wird zur Feststoffabtrennung über eine Röhrenzentrifuge gefahren. Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschliessenden Zentrifugation im überstand enthal- ten. Dieser überstand wird im folgenden als „wässrige Hydrophobin-Lösung bezeichnet". Der Trockensubstanzgehalt der wässrigen Hydrophobin-Lösung beträgt 3,4 gew- %. Der Hydrophobin-haltigen Lösung wird Mannitol als Trocknungshilfsstoff im Verhält-
nis TS:Mannitol = 1 :1 zugegeben. Diese Lösung wird mit einer Zweistoffdüse Typ Gerig Gr.O mit einer Einsprührate von 41 kg/h in 1200 kg/h Stickstoff im Gleichstrom versprüht. Der Sprühturm hat einen Durchmesser von 800 mm und eine Höhe von 12 m. Die Eintrittstemperatur des Trocknungsgases beträgt dabei 161 DEG. Die Austrittstemperatur des Trocknungsgases beträgt 80 DEG. Die Abscheidung erfolgt im Filter, in welchem 31 ,7 kg Trockengut wiedergefunden werden. Aus dem Turm werden 6,1 kg Trockengut ausgekehrt. Die aus dem Aktivitätstest resultierenden Kontaktwinkel des wiedergelösten Hydrophobin-haltigen Trockenguts sind in Tab. 2 aufgeführt. Das Proteingel des wiedergelösten Trockenguts ist in Abb. 3 dargestellt.
Tab. 1 : Lebendzellzahl und Aufschlussgrad für die Nullprobe und Beispiele 1-8.
Tab 2 Lebendzellzahl und Aufschlussgrad für Beispiel 9
Tab 3 Kontaktwinkel nach Sprühtrocknung von Hydrophobin A mit Mannit
Erläuterung der Abbildungen:
Abb. 1 : Lebendzellzahl [1/mL] der Beispiele 1-8. Abb. 2: Aufschlussgrad [-] der Beispiele 1-8. Abb. 3: Proteingel Beispiel 9:
4-12% Bis-Tris Gel/MES Puffer, links: nach Sprühtrocknung von Hyrophobin A mit Mannit, rechts: Marker: Prestained SDS-Page Standards, Auftrag/Slot: 15 μg
Pr
Next Patent: METHOD FOR THE PRODUCTION OF DRY FREE-FLOWING HYDROPHOBIN PREPARATIONS