Gebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Stilbenoiden aus Lösungsmitteln sowie die Verwendung der hiermit erhaltenen Stilbenoide.

Stand der Technik

Stilbenoide sind Derivate des Stilbens. Zu den Stilbenoiden gehört insbesondere das Resveratrol ( 3 , 4 ' , 5-Trihydroxystilben) , welches ebenfalls zur Stoffklasse der Polyphenole (genauer der polyphenolischen Phytoalexine) zu zählen ist. In Pflanzen werden Stilbenoide, wie etwa Resveratrol, insbesondere bei

Pilzinfektionen oder starker UV-Belastung gebildet; hierbei sind sie das Produkt zweier verschiedener Biosynthesewege, nämlich dem Shikimisäure-Weg und der Fettsäurebiosynthese.

Den Stilbenoiden werden antioxidative Wirkungen zugesprochen. Resveratrol, ein bekanntes Stilbenoid, welches beispielsweise auch während der Weingärung gebildet und insbesondere in Rotwein in hohen Konzentrationen enthalten ist, wirkt als Antioxidants und mindert zudem die Gefahr koronarer Herzerkrankungen (siehe zum Beispiel Becker John V. W. et al . : "Metabolie engineering of Saccharomyces cerevesiae for the synthesis of the wine-related antioxidant resveratrol", FEMS Yeast Research, 4 (1), Seiten 79- 85 (2003) sowie Jang et al . "Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural produet derived from grapes", Science, 275, Seiten 218-220 (1997)).

Aufgrund der vorteilhaften Wirkungen der Stilbenoide werden diese Verbindungen zunehmend in kosmetischen oder

pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt. Dabei erfolgt die Bereitstellung der Stilbenoide meist durch Extraktion aus

Pflanzen; es werden im Stand der Technik auch Verfahren

beschrieben, bei denen Stilbenoide mittels rekombinanter

Mikroorganismen hergestellt werden und bei denen das Stilbenoid meist durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel aus der Kulturbrühe und/oder den Zellen isoliert wird.

Unabhängig von dem eingesetzten Herstellungsverfahren der

Stilbenoide liegen diese Substanzen zeitweise als in einem, organischen Lösungsmittel gelöst vor.

Herkömmliche Verfahren zur Isolierung der Stilbenoide aus den in oben genannter Extraktion gegebenenfalls eingesetzten, nicht mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln umfassen

beispielsweise Chromatographie, Verdampfungs- , Kühlungs-,

Verdrängungskristallisation oder Rückextraktion mit einem weiteren organischen Lösungsmittel.

So beschreibt die WO 2009/016108 eine Isolierung von

Stilbenoiden durch eine sequentielle Extraktion aus n-Hexan mit zunächst Ether, dann Aceton, dann Methanol und letztendlich Wasser .

In der WO0191763 werden Stilbenoide aus dem Lösungsmittel

Ethylacetat mit Hexan auskristallisiert. Es wird also eine klassische Verdrängungskristallisation durchgeführt um die

Stilbenoide aus dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel zu isolieren .

Ein Nachteil des heutigen Standes der Technik ist der

zusätzliche Einsatz von weiteren Lösungsmitteln in der

angewendeten Rückextraktion sowie die Notwendigkeit eines hohen Energieeintrages zur Verdampfung von Lösemitteln oder weiterer Aufreinigungsstufen .

Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem ohne oben beschriebene Nachteile des Standes der Technik die Stilbenoide aus einem organischen Lösungsmittel isoliert werden können.

Beschreibung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich trotz der

bekannten schlechten Wasserlöslichkeit von Stilbenoiden, insbesondere von Resveratrol, durch eine wässrige Phase das Stilbenoid aus einem im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel rückextrahieren lässt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung mindestens eines Stilbenoids aus einem

Reaktionsansatz enthaltend mindestens ein mit Wasser im

Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel umfassend die

Verfahrensschritte A) in Kontakt Bringen des Reaktionsansatzes mit einer wässrigen Phase, B) Abtrennen der wässrigen Phase von dem mit Wasser im Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel und gegebenenfalls C) Isolierung des Stilbenoids aus der wässrigen Phase.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von nach diesem Verfahren erhaltenen Stilbenoiden zur Herstellung von Gebrauchsprodukten des Alltags.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Verringerung des Energieeinsatzes und die Verringerung von Abfallströmen, insbesondere von nicht-wässrigen und somit oft problematischen Lösungsmittelströmen .

Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent . Unter „Stilbenoide" werden im Rahmen der Erfindung mit mindestens einer Hydroxygruppe hydroxylierte strukturelle

Derivate des Stilbens ( 1 , 2-Ethendiylbisbenzen) verstanden, wobei „Stilben" das E- und Z-Isomer bzw. eis- und trans-Isomer

umfasst; Beispiele für Stilbenoide sind daher Resveratrol, Piceatannol, Pinosylvin und Pterostilben .

Der Begriff im „Wesentlichen nicht mit Wasser mischbar"

beschreibt erfindungsgemäß die Eigenschaften von Flüssigkeiten, nicht in jedem beliebigen Verhältnis mit Wasser mischbar zu sein, sondern bei Erreichen einer Sättigungskonzentration ein mehrphasiges System auszubilden. Insbesondere wird hierunter die Eigenschaft verstanden, dass das Lösungsmittel maximal 15 Gew.- %, bevorzugt maximal 10 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 2 Gew.-% an Wasser lösen kann, bezogen auf das Gewicht des

Lösungsmittels .

Unter dem Begriff „Reaktionsansatz" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein System zu verstehen, wie es zum dem Zeitpunkt vorliegt, an dem das zu isolierende Stilbenoid sich zum ersten Mal in einem im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren

Lösungsmittel befindet. Solch ein Reaktionsansatz umfasst im Wesentlichen das im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, das zu isolierende Stilbenoid und aus der Bildung des Stilbenoids notwendigen Reaktionen hervorgegangene

Nebenprodukte. Zur Verdeutlichung und nicht limitierend sind hier genannt: Die erste Extraktionsphase mit einem im

Wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel aus einer Fermentationsbrühe, insbesondere die einer in-situ-Extraktion oder eine erste Extraktionsphase mit einem im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wobei das Stilbenoid aus einem Pflanzenteil isoliert wird.

Bevorzugt besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus den

Verfahrensschritten A) , B) und gegebenenfalls C) . Es können erfindungsgemäß sämtliche Stilbenoide mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden, bevorzugt wird in diesem Zusammenhang 3 , 5 , 4 ' -Trihydroxystilben, insbesondere die trans-Form (Resveratrol ) isoliert.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das in dem Verfahren eingesetzte Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel ist.

Als Lösungsmittel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, kommen prinzipiell alle mit Wasser im

Wesentlichen nicht mischbaren Lösungsmittel in Frage. Solche sind beispielsweise:

verzweigte und unverzweigte, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltende Kohlenwasserstoffe mit Kohlenstoffketten mit einer Länge von 6 bis 16 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel Nonan, Decan, Undecan, Dodecan;

Ester von verzweigten und/oder unverzweigten, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltenden Kohlenstoffketten mit einer

Gesamtkohlenstoff Anzahl pro Molekül von 4 bis 26

Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel Ethylacetat, Octylacetat, Dibutyladipat , insbesondere auch Fettsäureester wie

beispielsweise Ethyldecanoat , Ethyllaurat, Ethyloleat,

Ethylmyristat ;

verzweigte und unverzweigte, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltende Ketone mit Kohlenstoffketten mit einer Länge von 5 bis 16 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel 3-Pentanon, 2- Heptanon, 2-Undecanon, 2-Octanon, Methylisobutylketon;

verzweigte und unverzweigte, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltende Alkohole mit Kohlenstoffketten mit einer Länge von 4 bis 18 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel 1-Nonanol, 1- Octanol, 1-Butanol, Oleylalkohol...etc; Ether von verzweigten und/oder unverzweigten, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltenden Kohlenstoffketten mit einer

Gesamtkohlenstoff Anzahl pro Molekül von 4 bis 12

Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel tert. Methylbutylether,

Diethylether, Diisopropylether ;

verzweigte und unverzweigte, gegebenenfalls Doppelbindungen enthaltenden mit Kohlenstoffketten mit einer Länge von 5 bis 12 Kohlenstoffatomen wie zum Beispiel Caprylsäure, Caprinsäure, Ölsäure, Decansäure;

Polyether wie Polypropylenglycol und Polyethylenglycol ;

pflanzliche Öle wie zum Beispiel Olivenöl, Sojaöl, Palmöl,

Rapsöl .

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt

Lösungsmittel eingesetzt ausgewählt aus der Gruppe umfassend, bevorzugt bestehend aus, Methylisobutylketon, 3-Pentanon,

Ethylbutyrat , Myristylalkoholpolypropoxilat (erhältlich als Tegosoft APM der Firma Evonik Goldschmidt) , Diethyladipat ,

Octylacetat, Ethylacetat, 2-Heptanon, 1-Octanol,

Tritolylphosphat , Triacetin, Oleylalkohol , Nonanol, Dodecan, Dibutyladipat , Diethylsebacat , Polypropylenglycol 1000 bis 4000, 2-Octanon und 2-Undecanon.

Es ist offenbar, dass es vorteilhaft sein kann, Mischungen zweier oder mehr dieser Lösungsmittel in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen.

In Verfahrensschritt A) wird der Reaktionsansatz mit einer wässrigen Phase in Kontakt gebracht; hierbei ist es bevorzugt, dass der Reaktionsansatz direkt mit der wässrigen Phase in

Kontakt gebracht wird; es soll daher bevorzugt keine vorherige Extraktion mit einem nicht-wässrigen Lösungsmittel wie beispielsweise Ether, Aceton oder Methanol durchgeführt worden sein .

Bevorzugt handelt es sich bei der wässrigen Phase um eine Phase, die mindestens 50 Gew.-%, bevorzugt zu mindestens 80 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-% Wasser bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Phase enthält.

Bei der wässrigen Phase handelt es sich bevorzugt um eine basische, wässrige Phase.

Somit weist die wässrige Phase bevorzugt einen pH-Wert von größer 7, bevorzugt von größer 10, insbesondere von größer 12 auf .

Bevorzugt enthält die wässrige Phase Verbindungen, die ein stabiles pH-Wert-Verhalten in dem zuvor genannten Bereich gewährleisten. Solche Puffersubstanzen sind ausgewählt aus der Gruppe Umfassend, bevorzugt bestehend aus: Phosphatpuffer,

Ammoniakpuffer (wässrige NH ₃ -Lösung) , TRIS: Tris (hydroxymethyl ) - aminomethan, HEPES: 4- (2-Hydroxyethyl) -1- piperazinethansulfonsäure, HEPPS: 4- (2-Hydroxyethyl) -piperazin- 1 -propansulfonsäure, Carbonatpuffer .

Besonders bevorzugt enthält die wässrige Phase Alkali- und/oder Erdalkali-Hydroxide in einer Konzentration von 0,1 mol/L bis 20 mol/L, bevorzugt 0,5 mol/L bis 15 mol/L, besonders bevorzugt 0,9 mol/L bis 10 mol/L bezogen auf die gesamte wässrige Phase. In diesem Zusammenhang sind die Hydroxide insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NaOH und KOH.

In Verfahrensschritt B) wird die wässrige Phase von dem im

Wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel

abgetrennt, hierzu kommen alle dem Fachmann bekannten

Trennverfahren für zwei nicht mischbare Flüssigkeiten wie beispielsweise der Einsatz von Separatoren, Zentrifugen,

Dekantern und Abscheidern in Frage.

In Verfahrensschritt C) kann das Stilbenoid, bevorzugt

Resveratrol, aus der wässrigen Phase zur beispielsweise weiteren Verwendung isoliert werden. Hierfür bieten sich Verfahren wie beispielsweise die Verdrängungs-kristallisation an.

Bevorzugt erfolgt in Verfahrensschritt C) die Isolierung des Stilbenoids durch Verdampfen der das Stilbenoid umgebenden

Lösung .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des

Verfahrensschrittes C) wird der pH-Wert der wässrigen Phase auf kleiner 7, bevorzugt kleiner 4, besonders bevorzugt kleiner 2 eingestellt. Hierdurch kommt es zu einer Fällung des

Stilbenoids, bevorzugt Resveratrols , aus der wässrigen Phase. Zur Erniedrigung des pH-Wertes auf vorgenannte Werte kennt der Fachmann viele mögliche Säuren, insbesondere in Wasser gut lösliche organische, mineralische und/oder anorganische Säuren wie beispielsweise Essigsäure, Ameisensäure, Schwefelsäure und Salzsäure. Insbesondere der Einsatz von Salzsäure, bevorzugt in Endkonzentrationen von größer 0,01 mol/L, bevorzugt größer 0,1 mol/L bezogen auf die wässrige Phase, ist hier vorteilhaft.

Es kann von Vorteil sein, wenn die Erniedrigung des pH-Wertes begleitet wird von einer Erniedrigung der Temperatur der

wässrigen Phase, um die Fällung des Stilbenoids, bevorzugt

Resveratrols, aus der wässrigen Phase zu fördern. Daher umfasst Verfahrensschritt C) , neben der pH-Wert Erniedrigung einen

Schritt, bei dem die Temperatur der wässrigen Phase erniedrigt wird, bezogen auf die Temperatur zu Beginn des Verfahrens, wobei vorzugsweise die Temperatur auf kleiner 20 °C, bevorzugt auf kleiner 10 °C, besonders bevorzugt auf kleiner 5 °C erniedrigt wird . Liegt das Stilbenoid, bevorzugt Resveratrol, als Feststoff in der wässrigen Phase vor, kann es mit herkömmlichen, einfachen Mitteln, die dem Fachmann zur Trennung von Fest/Flüssig-Gemengen bekannt sind, abgetrennt werden.

Daher umfasst ein bevorzugtes, erfindungsgemäßes Verfahren in Verfahrensschritt C) , einen Schritt, bei dem das Stilbenoid, bevorzugt Resveratrol, als Feststoff von der wässrigen Phase abgetrennt wird. Erfindungsgemäß bevorzugte Abtrennungen des

Stilbenoids, bevorzugt Resveratrol sind in diesem Zusammenhang

Zentrifugation, Filtration, Sedimentation und Auspressen.

In den anzuwendenden Filtrationstechniken können beispielsweise

Schwerkraftfilter, Vakuumfilter, Filterzentrifugen eingesetzt werden .

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Stilbenoide, insbesondere Resveratrol, sind vorteilhaft in Gebrauchsprodukten des Alltags einzuarbeiten.

Daher leistet einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe die Verwendung mindestens eines Stilbenoids, insbesondere Resveratrol, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Kosmetika, Nahrungsmitteln,

Nahrungsergänzüngsmitteln, Pharmazeutika und Futtermitteln.

In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten

Ausführungsformen beschränkt sein soll. Beispiele :

Rückextraktion mittels wässriger Phase aus PPG1000

Es wurden 20g/L Resveratrol in PPG1000 gelöst. 10 ml dieser

Lösung wurden mit 10 ml 4M wässriger NaOH Lösung versetzt, 30

Sekunden geschüttelt und über Zentrifugation (1 min, 5000 x g) die Phasen wieder getrennt. Die NaOH-Phase wurde abgenommen und mit 4M HCl versetzt bis ein pH <6 erreicht wurde.

Beim Absenken des pH-Wertes fiel das Resveratrol als Feststoff aus .

Der Feststoff wurde über Vakuumfiltration abgetrennt, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 83%; Reinheit (HPLC) : 83%

Eine definierte Menge des erhaltenen Feststoffes wird in Ethanol gelöst. 2 μΐ der Lösungsmittleprobe wurden auf eine Luna PFP (2) Säule (150 x 4.6 mm; 5 μιη; Phenomenex) mittels des Agilent 1200 HPLC-Systems , ausgestattet mit einem Photodioden-Array-Detektor und einem binären Gradientenmischer, injiziert. Resveratrol wurde mit einer mobilen Phase bestehend aus 65% Methanol und 35% Wasser mit 0,5ml Trifluoressigsäure pro Liter, mit einer

Fleißgeschwindigkeit von 0,6 ml/min und einer Säulentemperatur von 25°C eluiert. Resveratrol wurde mittels der Retentionszeit und dem UV/VIS-Spektrum einer Referenzsubstanz ( Sigma-Aldrich) identifiziert. Zur Quantifizierung des Resveratrols in den

Proben wurden die Peakflächen mit denen einer externen

Standardkurve bekannter Konzentration verglichen.

Rückextraktion mittels wässriger Phase aus Diethyladipat

Es wurden 20g/L Resveratrol in Diethyladipat gelöst. 10 ml dieser Lösung wurden mit 10 ml IM wässriger NaOH Lösung versetzt, 30 Sekunden geschüttelt und über Zentrifugation (1 min, 5000 x g) die Phasen wieder getrennt. Die NaOH-Phase wurde abgenommen und mit IM HCl versetzt bis ein pH <6 erreicht wurde. Beim Absenken des pH-Wertes fiel das Resveratrol als Feststoff aus .

Der Feststoff wurde über Vakuumfiltration abgetrennt, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 88,9%; Reinheit (HPLC) : 95%

Rückextraktion mittels wässriger Phase aus Octylacetat

Es wurden 4,5g/L Resveratrol in Octylacetat gelöst. 10 ml dieser

Lösung wurden mit 10 ml IM wässriger NaOH Lösung versetzt, 30

Sekunden geschüttelt und über Zentrifugation (1 min, 5000 x g) die Phasen wieder getrennt. Die NaOH-Phase wurde abgenommen und mit IM HCl versetzt bis ein pH <6 erreicht wurde.

Beim Absenken des pH-Wertes fiel das Resveratrol als Feststoff aus .

Der Feststoff wurde über Vakuumfiltration abgetrennt, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 83,5%; Reinheit (HPLC): 96,4%