In der Analytik und molekularen Diagnostik gewinnen Mikro- und Nanotechnologien zunehmend an Bedeutung. Für den qualita- tiven und quantitativen Nachweis von Substanzen in einer zu analysierenden Probe werden planare Systeme verwendet, die als Biochips bzw. Biosensoren bezeichnet werden. Die Biochips bilden einen Träger, auf dessen Oberfläche eine Vielzahl von rasterartig angeordneten Nachweisbereichen ausgebildet ist.

Die einzelnen Bereiche unterscheiden sich dabei voneinander in ihrer Spezifität gegenüber einer nachzuweisenden Substanz.

Da vor allem biologische Systeme auf Interaktionen von biolo- gisch aktiven Makromolekülen beruhen, eignen sich Biochips besonders für den Nachweis von biologisch aktiven Molekülen wie Nukleinsäuren (DNA oder RNA), Oligo-und Polypeptiden, Proteinen, Antikörpern sowie Rezeptoren und Liganden.

Daher wurden zahlreiche Biochips hergestellt, die auf Fest- phasentechnologien mit sich selbst organisierenden Mono- schichten ("self-assembled monolayers","SAM") von bifunktio- nellen Molekülen beruhen. Die bifunktionellen Moleküle binden mit einer Seite an die Oberfläche des festen Trägers und mit der anderen Seite an Makromoleküle, die in einer zu untersu- chenden Probe vorliegen. Der Nachweis einer bestimmten Inter- aktion erfolgt mit Hilfe geeigneter Markierungen, beispiels- weise radioaktiver Markierung oder Chemo-bzw. Biolumines- zenz.

Für die Herstellung von Biochips werden Oberflächen aus Me- tall oder Halbmetalloxiden, wie Aluminiumoxid, Quarzglas, oder Glas in eine Lösung von bifunktionellen Molekülen ("Lin- kern") getaucht. Die Lösung enthält eine Halogensilan oder Alkoxysilangruppe zur Kopplung an die Trägeroberfläche, so dass sich eine selbst organisierende Monoschicht ausbilden kann. Die Kopplung der Linker an die nachzuweisenden Makromo- leküle aus der zu testenden Probe erfolgt über geeignete wei- tere funktionelle Gruppen, wie Amino-oder Epoxygruppen.

In der WO 02/10752 A2 wird ein Sensorchip mit einer Träger- oberfläche aus Metalloxid oder Halbmetalloxid beschrieben, auf die eine homogene Polysiloxanschicht aufgebracht ist. Zur Herstellung dieser Mehrfachschicht wird der Sensorchip in ei- ne Lösung eines bifunktionellen Silans eingetaucht und mit einer definierten Geschwindigkeit im Bereich von 0,1 bis 10 mm/s herausgezogen. Das bifunktionelle Silan liegt in einem Lösungsmittel mit einer Siedetemperatur zwischen 50 und 150°C, einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-% und einer Temperatur von 20 bis 100°C vor. Dadurch dass der Sensorchip mit einer definierten Geschwindigkeit aus der Lösung heraus- gezogen wird, bildet sich die Schicht aus bifunktionellem Si- lan unter Bildung einer Polysiloxan-Mehrfachschicht auf der Oberfläche des Sensorchips durch Vernetzung aus.

Demgegenüber beschreibt die WO 00/43539 A2 eine Schicht ("Monolayer"), die aus einem polyfunktionellen Polymer aufgebaut ist. Polymerketten sind an einer Oberfläche angeordnet und jede Polymerkette umfasst viele identische oder verschiedene Einheiten, die ihrerseits funktionelle Gruppen tragen. Über diese funktionellen Gruppen wird eine Interaktion zwischen dem Polymer und einem Molekül aus einer zu testenden Probe möglich. Die polyfunktionellen Polymerketten werden auch als"polymer brush"bezeichnet, weil sie bürstenähnlich von der Oberfläche abstehen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbin- den von Oberflächen, was auch als molekulares Verkleben von Oberflächen bezeichnet werden kann. Das Verfahren stellt da- her eine neue Verbindungstechnik für zwei Oberflächen zur Verfügung. Hierfür wird die Oberfläche eines ersten Trägers mit mindestens einer monoreaktiven Substanz beschichtet. An- schließend wird die monoreaktive Substanz auf der Oberfläche des ersten Trägers immobilisiert und damit dauerhaft befes- tigt. Der so hergestellte erste beschichtete Träger wird mit einem zweiten mit einer monoreaktiven Substanz beschichteten Träger in räumliche Nähe gebracht, so dass die beschichteten Oberflächen einander zugewandt sind. Durch den Kontakt der beiden beschichteten Oberflächen reagieren die monoreaktiven Substanzen chemisch miteinander, so dass eine feste dauerhaf- te Verbindung entsteht. Dadurch dass die Immobilisierung der reaktiven Substanz auf den Trägern sowie das in Kontakt brin- gen der beschichteten Oberflächen der Träger gleichzeitig in einem einzigen Schritt erfolgt, ist das Verfahren besonders einfach und kostengünstig durchzuführen.

Die Oberflächen der beiden Träger können gleichzeitig mit derselben reaktiven Substanz beschichtet werden. Alternativ dazu können aber verschiedene reaktive Substanzen zur Be- schichtung der beiden Oberflächen des ersten und des zweiten Trägers verwendet werden. Bei Verwendung nur einer reaktiven Substanz bilden sich nach der chemischen Verbindung Polymere mit identischen Monomeren aus, während sich bei Verwendung von verschiedenen reaktiven Substanzen Polymere aus unter- schiedlichen Monomeren ausbilden.

Die Oberfläche sowohl des ersten als auch des zweiten Trägers kann nicht nur mit einer sondern auch mit zwei oder mehreren identischen oder verschiedenen reaktiven Substanzen beschich- tet werden. Auf diese Weise können beliebige Polymere aus den unterschiedlichsten Monomereinheiten zusammengesetzt werden.

Nachdem die monoreaktive Substanz auf der Oberfläche des ers- ten und des zweiten Trägers aufgetragen und immobilisiert wurde, kann zusätzlich auf einen oder auf beide beschichtete Träger eine Substanz zur Kreuzvernetzung aufgebracht werden.

Diese Kreuzvernetzungssubstanz ("Crosslinker") ist ein bi- reaktives Molekül, ein polymer brush (WO 00/43539 A2), ein sogenanntes"surface attached network" (EP 0 210 578) oder eine Beschichtung aus einem dünnen Polymerfilm. Wenn die Ei- genreaktivität der monoreaktiven Substanz nicht ausreichend ist, empfiehlt sich das Aufbringen eines Polymers zur Vernet- zung, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Beispiels- weise können die Oberflächen des ersten und des zweiten Trä- gers mit einem Epoxid beschichtet werden, so dass eine Ver- netzung durch Polyethylglykol möglich ist. Ein solches Epoxid ist exemplarisch in Figur 3 gezeigt.

Der in dem Verfahren verwendete Träger ist ein Halbleiter o- der eine verwandte Substanz. Die Oberfläche des Halbleiters besteht aus Silizium, Halbmetalloxiden, vor allem Silizium- oxid (SiOx), Aluminiumoxid oder Siliziumnitrid.

Die monoreaktive Substanz kann einschichtig in Form einer Mo- nolage auf die Oberfläche des Halbleiters aufgebracht werden.

Figur 4 zeigt beispielhaft eine Monolage eines Aminosilans.

Alternativ kann die reaktive Substanz auch in mehreren Schichten als reaktive Lagen auf die Oberfläche aufgebracht werden. Diese reaktiven Lagen werden zusammenfassend als Po- lylage bezeichnet, die eine gelähnliche Struktur bildet. Die Gelstruktur weist den besonderen Vorteil auf, dass Unebenhei- ten der Oberflächenstruktur wirksam ausgeglichen werden kön- nen.

Besonders geeignet ist eine Schichtdicke der monoreaktiven Substanz von ca. 2 nm.

Die monoreaktive Substanz kann insbesondere ein reaktives Si- lan sein. Silan weist nur eine Silangruppe als reaktive Grup- pe auf. Die organische Gruppe ist dann beispielsweise ein ge- sättigter aliphatischer Kohlenwasserstoff. Mittels Radikal- bildnern kann eine chemische Verbindung zu diesen Gruppen aufgebaut werden, wobei das Silan selbst aber nicht reaktiv ist. Die Verbindung ist extrem stabil, da sie keine weiteren reaktiven Gruppen aufweist. Die Bindung an eine reaktive Sub- stanz führt zu einem Reaktionsprodukt, das endgültig ist, so dass die Bindung außer durch extreme Gewalteinwirkung nicht aufzulösen ist.

Besonders geeignete Silane sind Chlorsilane und Alkoxysilane, wobei aber Thiole oder Disulfidgruppen ebenfalls verwendet werden können. Als Ausgangssilane sind folgende Substanzen besonders geeignet, deren Strukturformeln in Figur 1 angege- ben sind : 4, 4'-Azobis- (4-cyano-petansäure (3'-chlordimethylsilyl)- propylester) ; als Verbindung 1 in Figur 1 dargestellt, ebenso geeignet sind die entsprechenden Di-und Tri- chlor-oder Mono-, Di-und Trialkoxysilananaloge ; 2, 4'-Azo- (4-cyano-petansäure (3"-chlordimethylsilyl)- propylester), als Verbindung 2 in Figur 1 dargestellt, ebenso geeignet sind die entsprechenden Di-und Tri- chlor-oder Mono-, Di-und Trialkoxysilananaloge sowie die jeweilige Verbindung mit einem Undecyl-statt einem Propyl- ; oder Disulfid oder Thiolderivate dieses gene- rellen Typs der Azoverbindung ; 4- (3'-Chlordimethylsilyl) propyloxy) -benzophenon, als Verbindung 3 in Figur 1 dargestellt, ebenso geeignet sind die entsprechenden Di-und Trichlor-oder Mono-, Di-und Trialkoxysilananaloge ;

Silane und Disulfid/Thiolderivate von Arylazomalodi- nitrilen, als Verbindung 4 in Figur 1 dargestellt.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Glycid-oxypropyl- trimethoxy-silan zur Beschichtung der Oberfläche des ersten Trägers und Aminopropyl-trimethoxy-silan zur Beschichtung der Oberfläche des zweiten Trägers. Wenn ein Azosilan zur Be- schichtung des ersten Trägers und ein Propyl-trichlor-silan zur Beschichtung des zweiten Trägers verwendet wird, kann die chemische Verbindung zwischen beiden Silanen über thermisch induzierte Radikalbildung stattfinden.

Die monoreaktiven Substanzen können durch verschiedene Ver- fahren wie beispielsweise Aufschleudern (Spin Coating), Gas- phasenabscheidung, Kondensation oder Besprühen aufgebracht werden. Daneben eignet sich insbesondere das Eintauchen der zu beschichtenden Träger in Flüssigkeiten mit reaktiver Sub- stanz. Diese Beschichtung wird als Tauchbeschichtung bezeich- net.

Die chemische Bindung, die zwischen den monoreaktiven Sub- stanzen auf den Oberflächen der beiden Träger zustande kommt, ist eine kovalente Bindung. Beispiele solcher Verbindungen sind in den Figuren 2,3 und 5 gezeigt, wobei in Figur 5 schematisch auch die beiden Träger, die mit den Bezugszeichen 1 bzw. 2 versehen sind, dargestellt sind.

Der molekulare Bindungstyp, auf dem die kovalente Bindung zwischen den monoreaktiven Substanzen beruht, ist eine nukle- ophile oder elektrophile Addition oder Substitution. Außerdem kann eine radikalische Reaktion zwischen funktionellen Grup- pen stattfinden. Die funktionellen Gruppen werden aus der Li- teratur des Standes der Technik unter Berücksichtigung der Klasse von Molekülen, die immobilisiert werden sollen, ausge- wählt. Ebenso sind die Bedingungen der Reaktionszeit, der Temperatur sowie des pH-Wertes entscheidend für die Auswahl.

Eine Reihe von Beispielen können aus der Publikation von G.

T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press 1996, entnommen werden. Besonders geeignet sind aktive oder reakti- ve Ester, wie N-Hydroxysuccinimide (NHS-Ester) sowie Amine, Aliphate, Epoxide, Thiole, Isothiocyanate, Isocyanate, Azide, carboxylische Gruppen oder Maleinimide.

Darüber hinaus können zwischen den oben genannten funktionel- len Gruppen und dem eigentlichen Silan sogenannte Spacer an- geordnet sein. Als Spacer kommen insbesondere acrylische und methacrylische Ester oder Amide von C2-Clo Alkohohlen oder C2- Clo Aminen in Frage. Um als Spacer verwendet zu werden, tra- gen die Alkohole oder Amine zusätzliche funktionelle Gruppen an dem Ende, das nicht die Ester-oder Amidbindung bildet.

Diese funktionelle Gruppe wird entweder direkt für die Inter- aktion mit dem anderen reaktiven Silan benötigt, oder sie wird durch die Einwirkung einer weiteren funktionellen Gruppe in. einem weiteren Schritt gebildet. Die Spacer können auch aus einzelnen Monomeren wie beispielsweise acrylischen Chlo- riden oder Methacrylsäure und deren Derivaten oder reaktiven Estern wie N-Hydroxysuccinimiden oder anderen Monomeren, z. B.

Maleinanhydrid gebildet werden. Die bevorzugten reaktiven Mo- nomere können kovalente Bindungen mit den bifunktionellen Al- koholen oder Aminen, die als Spacer verwendet werden, einge- hen.

Die monoreaktive Substanz kann auf der Oberfläche des Trägers ein quervernetztes Polymer mit reaktiven Seitengruppen bil- den. Dadurch kommt es zu einer besonders starken Verbindung zwischen den beiden Halbleitern. Das Polymer besitzt vorzugs- weise einen Schmelzpunkt von unter 150°C, so dass das Polymer beim Verbinden der Halbleiter in den flüssigen Zustand über- führt werden kann.

Bevorzugt ist weiterhin, einen Spacer mit einer photolabilen Gruppe zu verwenden. Diese photolabile Gruppe wird durch Be- lichtung aktiviert, so dass die reaktive Gruppe von der Si-

langruppe abgetrennt wird. Dadurch wird ein Verbinden an die- ser Stelle verhindert. Grundsätzlich kann durch die Verwen- dung von hartem W-Licht jede Silanlage zerstört werden, so dass die spezifische Reaktivität an dieser Stelle nicht mehr existiert.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Halbleiter, des- sen Oberfläche mit der Oberfläche eines zweiten Halbleiters durch das beschriebene Verfahren verbunden ist, sowie einen Biochip oder Biosensor der einen solchen Halbleiter aufweist.