GEBIET DER ERFINDUNG

1001] Die Erfindung betrifft Verfahren, Reagenzien und einen Teilesatz für den Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln, beispielsweise gemäß EU-Verordnung Nr. 1169/2011 vom 25. Oktober 2011.

STAND DER TECHNIK

[002] Allergene in Lebensmitteln werden in der Regel über eine immunologische Reaktion nachgewiesen. Diese kann mit einer Nachweisreaktion wie einer Farbreaktion gekoppelt sein. EP Γ "73 135 B1 (Univ. Arkansas) und CN 102680696 A (Univ. Jiangnan) offenbaren einen Sandwich-ELISA {enzyme-linked immunosorbent assay) zur Bestimmung der Erdnuss-Allergene Arahl and Arah2. Es gibt Automaten für das Abarbeiten von Immuntests. Derartige Automaten sind teuer und daher ungeeignet für sporadische oder kleine Probenzahlen. Bei Lebensmitteln kommt hinzu, dass sich deren Matrizes stark unterscheiden und diese unterschiedlich für den Immuntest aufbereitet werden müssen. So muss beispielsweise Erdnuss-Allergen in so unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden wie Brotaufstrichen, Brot- und Backwaren, Molkereierzeugnissen, süße Riegel und so weiter.

[003] Sehr nachteilig ist, dass die unterschiedlichen Probenmatrizes nicht uniform aufbereitet werden können. Besonders bei stark aromahaltigen Lebensmitteln mit hohem Fett- oder Öl-Gehalt sind manche Allergene schwer nachzuweisen. Auch besteht bei Homogenisieren der Proben stets die Gefahr einer Kontamination des Labors und der Laborgeräte durch Flugstaub, Vertragen und Anhaften. Der Stand der Technik repräsentiert somit ein Problem.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG [004] Es ist insbesondere Aufgabe der Erfindung, den Nachweis von

Allergenen in Lebensmitteln gemäß EU-Verordnung Nr. 1169/2011 zu vereinfachen und reproduzierbarer zu machen. [005] Die offenbarte Lösung liegt in einem Teitesatz mit Kapseln, enthaltend eine Formulierung für die Extraktion von Allergen aus der Lebensmittelprobe durch Vermengen mit heißem Wasser. Die Lösung liegt somit in einer Formulierung gemäß Anspruch 1.

1006] Weitere Aspekte betreffen ein Verfahren und einen Teilesatz zur

Untersuchung und Aufbereitung von Lebensmittelproben für den immunologischen Nachweis von Allergenen gemäß EU-Verordnung Nr. 1169/2011. Bevorzugte Ausführungsformen sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

[007] Die Formulierung liegt vor in einer Kapsel aus einem wasserlöslichen Wandmaterial, wobei der Kapsel räum bis zum einem Pulver-Schüttvolumen von 70% eine bekannte Menge eines Pulvers oder Granulats enthält, bestehend aus einem in heißem Wasser von über 90 Grad Celsius stabilen, in Bezug auf die Untersuchung neutralen Proteingemisches als Schutzprotein. Das Proteingemisch ist bevorzugt ausgewählt aus Magermilchpulver, Protein von Leguminosen, Proteinmehl der Erbse, vorzugsweise ein in heißem Wasser löslicher Proteinextrakt der Erbse, besonders bevorzugt ein wasserlöslicher hydratisierte Proteinextrakt der gelben Erbse aus kontrolliertem Anbau. Die Wand der Kapsel kann aus wasserlöslicher Gelatine sein, bevorzugt aus wasserlöslicher Hartgelatine, die in heißem Wasser sofort erweicht und sich löst. Das Pulver-Schüttvolumen des Gemisches von Schutzprotein macht vorzugsweise weniger als 70% des Innenraums der Kapsel aus. Durch die lockere Schüttung in der Kapsel wird erreicht, dass sich das Proteingemisch bei Kontakt mit heißem Wasser sofort löst. Wird die Kapsel dichter gefüllt, kommt es zu einem Verkleben des Proteinpulvers bei Zugabe von heißem Wasser. Die Kapsel mit der Formulierung wird so hergestellt, dass der Hohlraum einer zweiteiligen Kapsel bis zu 70% locker gefüllt wird mit einem Pulver oder Feingranulat aus wasserlöslichem Schutzprotein und fakulativ ein oder mehreren Detergenzien, Emulatoren, Netzmitteln, Löse Vermittlern und Tensiden.

[008] Die Offenbarung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe auf die Gegenwart von Lebensmittel-Allergenen, umfassend die Schritte: (i) Einbringen einer bekannten Menge der Lebensmitteiprobe in ein Gefäß, wobei fakultativ die Probe mechanisch zerkleinert wird; (ii) Zusetzen einer Kapsel mit einer bekannten Menge Schutzprotein zu der Probe, wobei ein Verhältnis von Schutzprotein zu Protein in der Probe von mindestens 1 zu 3 angestrebt wird, bevorzugt von 1 zu 1 ; (iii) fakultativ Zusetzen einer Kapsel mit einer bekannten Menge Pufferreagenz; (iv) Zusetzen einer vorbestimmten Menge Wasser mit einer Temperatur von über 60 Grad Celsius zur Probe, so dass die Matrix der Lebensmittelprobe und die Kapselwand schmelzen und sich die Proteine mit dem heißen Wasser mischen; (v) Extraktion der Allergene in dem wässrigen Gemisch gefolgt von einer immunologischen Untersuchung des wässrigen Gemisches auf die Gegenwart von Ziel-Antigenen oder Nachweis-Allergenen. Die Extraktion der Allergene kann erfolgen durch Schütteln, Ultraschall, Vortexen oder Rühren des wässrigen Gemisches oder sonstiges inniges Vermengen. Es folgt fakultativ ein Abtrennen von wasserunlöslichen Komponenten und Fasern durch Dekantieren, Filtration oder Zentrifugation.

[009] Der Teilesatz für den Nachweis von Lebensmittel-Allergenen, umfasst Kapseln mit einer bekannten Menge Schutzprotein und/oder Pufferreagenz; und ein oder mehrere Gefäße mit festen oder flüssigen Reagenzien für eine immunologische Nachweisreaktion. Weiterhin bevorzugt eine Standardreihe mit Nachweis-Allergen oder Ziel-Antigenen für das Erstellung einer Referenz-Eichkurve für bestimmte Sorten von Matrizes. Dies kann erfolgen durch Gefäße, die Ziel-Anttgen oder Nachweis- allergen in bekannten Mengen in flüssiger Form mit stabilisierenden Agenzien aufweisen und zwar bezogen auf das Extraktionsverfahren für eine Matrixsorte. In einer einfachen Ausführungsform kann der Teilesatz eine Farbkarte zur Auswertung der kolorimetrischen Nachweisreaktion enthalten.

[010] Der Teilesatz und das Verfahren eignen sich für den Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln. Sie eignen sich insbesondere für die Untersuchung auf folgende Allergene: Erdnuss und daraus gewonnene Erzeugnisse, glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Dinkel, Kamut und Hybridstämme davon) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Krebstiere und daraus gewonnene Erzeugnisse, Fische (Fischgelatine) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Milch und daraus gewonnene Erzeugnisse, Schalenfrüchte (Mandeln, Haselnüsse, Walnüsse, Kaschnüsse, Paranüsse, Pecannüsse, Pistazien und Macadamia) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sojabohnen und daraus gewonnene Erzeugnisse, Eier und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sellerie und daraus gewonnene Erzeugnisse, Senf und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sesamsamen und daraus gewonnene Erzeugnisse, Weichtiere und daraus gewonnene Erzeugnisse, Lupinen und daraus gewonnene Erzeugnisse. [011] Der Nachweis eines Allergens ist nicht gleichbedeutend mit dem Nachweis eines wasserlöslichen Antigens, denn Allergene sind in der Regel größer als die Ziel-Determinante. Zudem wird die immunologische Reaktion gestört durch einen hohen Gehalt an Fett- oder Öl im Lebensmittel oder durch die Gegenwart von Bitter- Stoffen, beispielsweise aromatische Ketoverbindungen mit denaturierenden Eigenschaften wie beispielsweise Theobromin, Koffein, aromatische Estern und dergleichen. Wird das Allergen dann emulgiert, entweder in einem Wasser-in-ÖI- oder in einer Öl- in-Wasser-Emulsion, so können die Bitter- und Aromastoffe das Allergen denaturieren oder so verändern, dass es sich physikalisch dem Nachweis in der wässrigen Phase entzieht. Das offenbarte Verfahren behebt dieses Problem, in dem der Aufschluss der Matrix und die Extraktion durch heißes Wasser mit einer Temperatur höher 60 Grad Celsius erfolgt und das Aliergen stabilisiert wird mittels eines wasserlöslichen temperaturstabilen untersuchungsneu traien Schutzproteins. Das Schutzprotein fängt die Störsubstanzen, denaturierende Bitterstoffe und Aromastoffe in der Lebens- mittelprobe ab und vermittelt eine Co-Solubilisierung des Ziei-Antigen beziehungsweise des Nachweisallergens. Bevorzugt enthält das Schutzproteingemisch wasserlösliches hydratisiertes Erbsenprotein oder stärkehaltiges Erbsenmehl und somit keine untersuchungsrelevanten Allergene. Erbsenextrakt ist zudem keine Kontaminationsquelle und frei von Allergenen gemäß EU-Verordnung Nr. 1169/20 1. Auch Magermilchpulver ist für viele Untersuchungen geeignet, kann aber nicht bei der Untersuchung auf Milchailergene als Schutzprotein dienen. Die Erbse für das Erbsen- proteinextrakt stammt bevorzugt aus kontrolliertem Anbau, um so einer Kontamination mit Gräsern und anderen Samen zu begegnen. Erbsen sind leicht zu reinigen, zu waschen und zu sieben. Erbsenprotein eignet sich daher als universelles Stabilisie- rungs- und Schutzmitte! für den Nachweis von Allergenen gemäß EU-Verordnung Nr. 1169/20 1. Durch den Zusatz als sichtbare Kapsel wird auch die Gefahr von Pipettierfehlern oder einer Kontamination herabgesetzt.

1012] Das offenbarte Verfahren reduziert die notwendige Laborausrüstung auf heißes destilliertes Wasser (.Teewasser") und gegebenenfalls eine Zentrifuge und Pipetten. Alle weiteren Reagenzien für die Untersuchung können im Testkit (Teilesatz) gebrauchsfertig ausgeliefert werden: wasserlösliche Gelatinekapsel mit Schutzprotein, wasserlösliche Gelatinekapseln mit Puffer und Detergenzien, mit Antikörper beschichtete Kavitäten im Mikrotiterplatten-Format, Wasch konzentrat, Chromogenlösung, Stopplösung, sowie Tropfflaschen mit zweiten Antikörper beziehungsweise Antikörper- konjugal Der offenbarte Assay erlaubt dann einen geordneten Arbeitsablauf und kann sogar durch einen geschulten Laien erfolgen. Er kann somit von einem Hochallergiker für eigene Zwecke zuhause vorgenommen werden. Das Ergebnis der immunologischen Bestimmung kann auch durch eine sichtbare Farbreaktion und eine Farb- karte ausgewertet werden. Für diesen Fall ist der Testkit auf die Sichtbarmachung eines Schwellenwerts (Grenzwerts) für das Ziel-Antigen bzw. Nachweisallergen ausgelegt.

[013] Bei großen Probenzahlen vermindert die Verwendung von Kapseln Pipettierfehler und den Zeitaufwand für das Einwiegen. Sichtbare Kapseln begegnen Fehlern, denn in einer Reihe von Proben werden einzelne Proben leicht ausgelassen oder doppelt bedient. Diese Fehlerform entfällt. Das Behandeln der Lebensmittelprobe mit heißem Wasser von 60 bis 100 Grad Celsius bewirkt ein partielles Schmelzen der meisten Lebensmittelproben und eine raschere Solubilisierung des Allergens. So kann in der Industrie und im Gewerbe bei Eintreffen einer Charge diese in nur circa einer halben Stunde auf die Gegenwart von verdächtigen Allergenen untersucht werden, also während der Lastwagen gegebenenfalls noch auf dem Entladehof steht. So kann die Lagerhaltung verbessert und wirtschaftlich günstiger ausgelegt werden.

[014] Die Offenbarung stellt Mittel bereit, welche die Erstellung einer reproduzierbaren Referenz-Eichkurve für die quantitative Bestimmung von Allergenen in verschiedenen Lebensmitteln ermöglicht. Das hydratisierte Protein aus der Kapsel schützt das Ziel-Antigen bzw. Altergen in der Matrix vor einer Denaturierung oder einem Verschwinden in einer nicht-wässrigen Emulsion. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert so reproduzierbare Extraktionsergebnisse in verschiedenen Erzeugnissen, so dass sich geeichte Referenzkurven für eine quantitative Bestimmung in ver- schiedenen Proben erstellen lassen. Es kann so auch Erdnuss-Allergen in schoko- ladehaigen Produkten - Proben mit sehr schwierigen Produktmatrizes - bestimmt werden. Ohne den Zusatz von hydratisiertem allergenfreiem Schutzprotein ist die Erstellung einer Referenzkurve hingegen unmöglich.

[015] Weitere Vorteile und Ausführungsformen der Offenbarung sind der nachfolgenden eingehenden Beschreibung, den Beispielen und den anliegenden

Abbildungen zu entnehmen. KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

[018] Es zeigt

Fig.1 ein Diagramm mit einer Eichkurve für die erfindungsgemäße Extraktion von verschiedenen Schokoladeerzeugnissen in Gegenwart von Schutzprotein, gefolgt von einer quantitativen immunologischen Bestimmung, wobei auf der Ordinate die gemessene optische Dichte und auf der Abszisse die Konzentration von Erdnuss-Allergen in der Untersuchungsprobe aufgetragen sind;

Fig.2 ein Diagramm mit einer Referenz-Eichkurve gemäß Figur 1 für die immunologische Bestimmung von Mandel-Allergen in Schokoladeerzeugnissen;

Fig.3 ein Diagramm mit einer Referenz-Eich kurve für die immunologische Bestimmung von Haselnuss -Allergen in Schokoladeerzeugnissen;

Fig.4 ein Diagramm mit einer Referenz-Eichkurve für die immunologische Bestimmung von Macadamia-Allergen in Schokoladeerzeugnissen. EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[017] Die Formulierung für den Zusatz zum wässrigen Aufschluss einer Lebensmittelprobe zeichnet sich aus durch eine Kapsel aus einem wasserlöslichem Wandmaterial, die bis zum einem Pulver-Schüttvolumen von höchstens 70% gefüllt ist mit einer vorbestimmten Menge eines allergenfreien hydratisierten Proteinextrakts, bevorzugt als Pulver oder Feingranulat. Der Extrakt mit Schutzprotein ist bevorzugt granuliert, um eine Klumpenbildung zu vermeiden, wegen einer guten Portionierung und um rasches Lösen mittels großer Oberfläche zu erreichen. Die Kapsel ist bevorzugt zu weniger als 50% Pulver-Schüttvolumen mit hydratisiertem Proteinextrakt gefüllt. Der allergenfreie Proteinextrakt stammt bevorzugt aus einer Leguminose, da diese reich an Protein sind - allerdings nicht aus den Leguminosen Sojabohne und Erdnuss. Das allergenfreie Proteingemisch in der Kapsel ist bevorzugt gewonnen aus der gelben Erbse. Es kann vermischt sein mit ein oder mehreren Detergenzien, Emulgatoren, Lösevermittlern und Tensiden. Die Kapsel aus dem wasserlöslichen Wandmaterial besteht bevorzugt aus Gelatine, insbesondere Hartgelatine. [018] Das Verfahren zur Aufbereitung einer Lebensmittelprobe für seine Untersuchung auf die Gegenwart von Allergenen umfasst die Schritte: (i) Einwiegen einer Probe in ein Gefäß, fakultativ unter Zerkleinern; (ii) Zusetzen zur Probe einer ersten wasserlöslichen Extraktionskapsel mit einer bekannten Menge allergenfreiem hydrafeierten Protein; (iil) Zusetzen zur Probe einer zweiten wasserlöslichen Extraktionskapsel mit einer bekannten Menge einer trockenen Pufferformulierung; (iv) Zusetzen zur Probe einer vorbestimmten Menge Wasser mit einer Temperatur von 60 bis 100 Grad Celsius, so dass Probe, Kapseln und Kapselinhalte in dem heißen Wasser schmelzen und aufgehen; und (v) Solubilisieren der Allergene in dem wässrigen Puffer-Protein-Gemisch gefolgt von einer immunologischen Untersuchung des wässrigen Gemisches auf die Gegenwart der Ziel-Antigenen, gegebenenfalls nach einem Abtrennen aller unlöslichen Bestandteile. Das Solubilisieren der Allergene erfolgt durch Schütteln, Vortexen, Rühren, und/oder Homogenisieren. In der Regel, aber nur fakultativ, folgt noch ein Abtrennen von festen wasserunlöslichen Bestand- teilen und Pflanzenfasern durch Zentrifugation, Filtration oder Dekantieren.

[019] Ein weiterer Aspekt betrifft ist das Bereitstellen eines Teilesatzes für den Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln, umfassend: (i) erste wasserlösliche Kapseln, die mit maximal 70% Pulver-Schüttvolumen gefüllt sind mit einer vorgegebenen Menge Pulver oder Feingranulat von allergenfreiem hydratisiertem Proteinextrakt; (ii) zweite wasserlösliche Kapseln mit einer vorbestimmten Menge Pulver oder Feingranulat einer trockenen Pufferformulierung; und (iii) ein oder mehreren Gefäße mit festen oder flüssigen Reagenzien für eine immunologische Nachweisreaktion. Der Teilesatz kann eine Mikrotiterplatte umfassen, welche eine Reihe Vertiefungen mit Antikörpern gegen das Ziel-Antigen aufweist. Der Antikörper gegen das Ziel-Antigen kann auch in einer Lösung oder zur Lösung vorbereiteter Menge in einem Gefäß anliegen. Bevorzugt umfasst der Teilesatz zudem eine Farbkarte, geeignet zu visuellen Erfassung einer kolorimetrischen Nachweisreaktion. Das wasserlösliche Wandmaterial der Kapsel besteht bevorzugt aus Hartgelatine. Pharmazeutische Standard-Kapselgrößen reichen bis zu einer Länge von 2,3 cm und einer Dicke von bis zum 0,84 cm, was eine Schütt-Füllmenge von circa 400 mg Erbsenmehl ( 70%ige Füllung). Die Verwendung von noch größeren Sonderformen und Sondergrößen wird überlegt. Die Kapselhülle besteht üblich aus zwei vorgefertigten zylindrisch geformten Hohlformen, welche nach dem Füllen aufeinander gesteckt werden. [020] Weiterhin kann der Testkit Hartgelatinekapsel nmit einer festen Pufferformulierung enthalten. Besonders bevorzugt ist eine Geiatinekapsei, welche nach Auflösung ein Medium ergibt, enthaltend 100 mM Tris (pH 7-8), 100 mM NaCI, 20 mM Na ₄ P ₂ 07, 1 % Triton™ X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA und 0.5% Deoxycholat. Ein anderer bevorzugter Puffer ist PBS (phosphate-buffered saline, enthaltend 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HP04, 1.8 mM KH2PO4).

[121] Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Proben auf Allergene, umfassend die Schritte: (i) Einwiegen einer vorbestimmten Menge Probe in ein Gefäß, wobei die Probe fakultativ zerkleinert wird; (ii) Zusetzen einer ersten, in Wasser zersetzenden Geiatinekapsei, zu maximal 70% gefüllt mit einer bekannten Menge allergenfreiem hydratisiertem Proteinextrakt, bevorzugt hydratisiertem Proteingranulat der Erbse; (iii) Zusetzen einer zweiten, in Wasser zersetzenden Gelatinekapsel, die eine vorbestimmte Menge Pufferreagenz enthält; und (iv) Zusetzen einer vorbestimmten Menge Wasser mit einer Temperatur von 60 bis 100 Grad Celsius, so dass sich Kapseln und deren Inhalt in dem heißen Wasser zersetze und lösen und Einwirken lassen des heißen Wassers auf die Probe, wobei deren Matrix in der Regel schmilzt und die Probe partiell solubilisiert wird. Die Reihenfolge der Schritte (i), (ii) und (iii) ist beliebig. Das Einwirken des heißen Wassers auf die Probe kann fakultativ unterstützt und beschleunigt werden durch Schütteln, Vertexen oder Schwenken des Probengefäßes, und es erfolgt unter Abkühlung des heißen Wassers. Danach werden unlösliche Bestandteile der Untersuchungsprobe abgetrennt, bevorzugt durch Zentrifugation oder Filtration, und dann der Überstand beziehungsweise das Filtrat immunologisch auf das Allergen hin untersucht.

[022] Eine bevorzugte kommerzielle Ausführungsform betrifft einen Teilesatz für den Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln, umfassend erste, in Wasser zersetzende Kapseln mit einer vorbestimmten Menge hydratisiertem Protein; zweite wasserlösliche Kapseln mit einer vorbestimmten Menge Pufferreagenz; sowie ein oder mehrere Gefäße mit festen oder flüssigen Reagenzien für eine immunologischen Nachweis. Übliche weiteren Komponenten in einem Kit für einen Immunassay sind Standards mit Zielantigen, primäre und sekundäre Antikörper für die Immunreaktion, Substratlösung für eine Farbreaktion, sowie Stopplösung, Wasch puffer und Testpuffer. Die Standards für die Eichkurve können in Konzentrationen und Mengen vorliegen, dass ein Bezug zu einer Eichkurve für eine quantitative Bestimmung in der jeweiligen Untersuchungsmatrix (zum Beispiel für schokoladehaltige Erzeugnisse) besteht. Alternativ können in dem Teüesatz auch Gefäße mit bekannten Mengen (Schwellenwert) Allergen vorhanden sein. Die Standardmengen Allergen können in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt sein, beispielsweise in trockener Form. Weiterhin kann der Teilesatz eine Farbkarte enthalten, wenn die Nachweisreaktion nicht mit Hilfe eines Mikrotiterplatten-Messgeräts ausgemessen wird.

[023] Der erfindungsgemäße Testkit und das Verfahren eignet sich für die Untersuchung auf Allergene-haltige Materialien wie Erdnuss und daraus gewonnene Erzeugnisse, Gluten-haltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Dinkel, Kamut und Hybridstämme davon) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Krebstiere und daraus gewonnene Erzeugnisse, Fische (Fischgelatine) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Milch und daraus gewonnene Erzeugnisse, Schalenfrüchte (Mandeln, Haselnüsse, Walnüsse, Kaschnüsse, Pecannüsse, Pistazien und Macadamia) und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sojabohnen und daraus gewonnene Erzeugnisse, Eier und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sellerie und daraus gewonnene Erzeugnisse, Senf und daraus gewonnene Erzeugnisse, Sesamsamen und daraus gewonnene Erzeugnisse, Weichtiere und daraus gewonnene Erzeugnisse, und Lupinen und daraus gewonnene Erzeugnisse.

[024] Der Einfluss von heißem Wasser auf den chemisch-physikalischen Zustand von Substanzen ist bekannt. Bislang glaubte man aber, dass eine Grenze von 60 Grad Celsius für eine Extraktion von Allergenen aus einer Matrix nicht überschritten werden darf, indem man der Probe zuvor Hartgelatinekapseln mit temperaturstabiien Schutzproteinen zusetzt, kann man wegen der dann möglichen höheren Extraktionstemperaturen auch schwere und harte Matrizes rasch in die Solubilisierung bringen. Viele Lebensmittel müssen aus geschmacklichen Gründen im Mund schmelzen oder sich zersetzen, sonst schmecken sie nicht. Der Einsatz von heißem Wasser über 60 Grad Celsius erlaubt einen raschen Aufschluss der Untersuchungsmatrix.

[025] Weiterhin schmelzen wegen der höheren Temperatur die meisten kakao- und ölhaltige Erzeugnisse in Wasser. Bisher ging man davon aus, dass höhere Temperaturen zu vermeiden sind, um die wichtige Tertiärstruktur des Allergens zu erhalten und immunologisch nachweisen zu können. Lösen oder Solubilisieren bedeutet aber hier ein Übergehen des Ailergens aus der Matrix in einen Zustand in Kontakt mit dem wässrigen Fluid, und es umfasst die Begriffe Emulgieren, Suspendieren und so weiter, wobei man dann eine filterbares oder zentrifugterbares wässriges Gemisch für die weitere Untersuchung erhält. Unlösbare Bestandteile der Matrix wie Pflanzenfasern und Sand können nach dem Solubiiisieren des Ailergens durch Zentrifugation oder Filtration von der wässrigen Phase getrennt.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Herstellung von Hartgelatinekapseln mit hydratisiertem Erbsenprotein

[026] Es wurden kommerzielle Hartgelatine-Kapseln der Größe 000 gefüllt mit 400 mg granuliertem hydratisiertem Proteinextrakt (NUTRALYS® F85M) der gelben Erbse (Pisum sativum), hergestellt von der Firma Roquette, Vic-sur-Aisne, Paris. Hartgelatine ist wasserlöslicher Gelatine ohne Weichmacher. Es wurden Hartgelatine- Kapseln mit Proteingranulat für unterschiedlich große Probengrößen hergestellt. Gj&Se Au LmaJg T eor. Menge Erbse Gewicht Volumen

0 2,16cm x 0,75cm 00mg - 800mg 100 mg 0,68 ml

00 2,3cm x 0,84cm 600mg - 1200mg 123 mg 0,91 ml

000 2,6cm x 0,97cm 800mg - 1600mg 158 mg tß ml [027] Gemäß Hersteller wird der hydratisierte Proteinextrakt wie folgt hergestellt: Die Erbsen sind aus kontrolliertem Anbau, so dass sie frei von anderen Samen beziehungsweise Verunreinigungen mit anderen Allergenen sind. Die Erbsen werden zudem mechanisch vorgereinigt, gewaschen, fein gemahlen und das resultierende Erbsenmehl in Wasser dispergiert und aufgeschlämmt. Die enthaltene Stärke wird in einem Fliehkraftabscheider (Hydrozyklonabscheider) abgetrennt, der hydratisierte Proteinextrakt durch Dekantieren von wasserunlöslichen Pflanzenfasern befreit und die löslichen Proteine durch Fällung aus der wässrigen Phase gewonnen. Es folgt ein Sprühtrocknen mit Granulierung. Das Granulat von hydratisiertem Erbsen- protein ist mischbar, es löst und suspendiert sich als lockeres Granulat sofort in heißem Wasser und es ist frei von Lebensmittel-Allergenen, die in der EU-Verordnung Nr. 1169/2011 vom 25. Oktober 2011 gelistet sind. [028] In Kontakt mit heißem Wasser schmilzt die Hartgelatine und das lockere hydratisierte Erbsenprotein geht in wässrige Lösung.

Beispiel 1A - Herstellung von Hartgelatinekapseln mit Erbsenmehl

[029] Es wurden gelben Erbsen im Labor mehrfach gewaschen, bei erhöhter Temperatur über Nacht bei 60 Grad Celsius getrocknet, sorgfältig geschält und die Erbsen von allen Schalen bereit. Die Erbsen wurden gemahlen, gesiebt und das Erbsenmehl im Mörser fein homogenisiert. Es würden Kapseln wie in Beispiel 1 mit Erbsenmehl hergestellt und bei der Extraktion der Allergene zugesetzt. Auch das Erbsenmehl erwies sich als geeignet, jedoch konnte wegen der noch enthaltenen Stärke kein klarer Überstand erhalten werden. Die Erbsenproteine waren aber in heißem Wasser ohne Weiteres in Gegenwart von Puffer und Detergenzien gut suspendierbar.

Beispiel 1B - Herstellung von Hartgelatinekapseln mit Magermilchpulver

[030] Es wurde anstelle Protein der gelben Erbse Magermilchpulver verwendet. Magermilchpulver enthält rund 36 Prozent Eiweiß, 52 Prozent Milchzucker und wird durch Sprühtrocknung hergestellt. Es würden Kapseln wie in Beispiel 1 hergestellt und bei der Extraktion der Allergene zugesetzt. Auch Molkenpulver erwies sich als geeignet, war in heißem Wasser gut löslich, jedoch kann es wegen der Anwesenheit von Miichallergenen nur als Alternative verwendet werden, wenn die Anwesenheit von Miichallergenen keine Rolle spielt. Zudem ist der geringere Proteinanteil im Granulat beim Zusatz zur Probe zu berücksichtigen.

Beispiel 2 - Herstellung von Hartgelatinekapseln mit Pufferreagenzien

[031] In gleicher Weise wurden Hartgetetine-Kapseln mit festen Puffersalzen befüilt. Die Probenlösung sollte einfachen PBS-Puffer, pH 7.4 (Phosphate-buffered saline = NaCI 137 mM, KCl 2.7 mM, Na ₂ HP0 ₄ 10 rtiM, KH ₂ P0 ₄ 1.8 mM) ergeben. Die

Geiatinekapsel (Größe 0) für eine 20 mi_ Extraktionslösung enthielt 200 mg Puffersalze. Beispiel 3 - Quantitative Bestimmung von Erdnuss-Allergen

1. Proben

[032] Es wurden feinherbe Schokoladen mit bekannten Anteilen Erdnuss (2, 5, 10, 20, 50 oder 100 mg Erdnuss pro Kg (ppm)) hergestellt. 1 g Probe wurde in ein 50 ml Röhrchen mit Deckel eingewogen sowie eine Kapsel 000 mit Schutzprotein gemäß Beispiel 1 (0,4 Gramm hydratisiertes Protein der gelben Erbse) und eine Kapsel mit Pufferreagenz (siehe Beispiel 2) zugesetzt. Als Kontrolle wurden Proben unter Zusatz einer Kapsel Pufferreagenz aufbereitet oder nur eine Kapsel Schutzprotein und Pufferreagenz zugesetzt (Leerprobe). Die Proben wurden bei Umgebungstemperatur mit 20 ml kochend heißem destilliertem Wasser (T>95°C) versetzt, die Röhrchen verschlossen und 15 Sekunden geschüttelt, wobei Probe und Kapseln schmolzen und sich mit dem Wasser mischten. Dann wurde ein 1 mf_ Aliquot des Gemisches in ein Zentrifugengefäß überführt und 5 Minuten bei 8000 g zentrifugiert.

[033] Der wässrige Überstand der Proben ohne Schutzprotein blieb trotz

Zentrifugation trüb. Der wässrige Überstand der Proben mit löslichem Schutzprotein war klar. Der klare Überstand wurde ohne weitere Aufbereitung in die immunologische Bestimmung eingesetzt.

2. Immunologische Bestimmung von Erdnuss-Allergen (ELISA)

[034] Um vergleichbare Inkubationszeiten zu erhalten wurden pro Test maximal 24 Proben untersucht. Die Kavititen für die Vorbereitung der Proben wurden bei Raumtemperatur mit 150 pL extrahiertem Überstand beladen und der Überstand 10 Minuten bei Umgebungstemperatur (20-25 Grad Celsius) equilibriert. Dann wurden 100 pL Überstand in eine Untersuchungskavität überführt, beschichtet mit einem Antikörper gegen Erdnuss-Allergen (polyklonaler Ziegen-Antikörper gegen Gesamt- Erdnussprotein), und 10 Minuten bei Umgebungstemperatur (20-25 °C) inkubiert. Die antikörperbeschichtete Kavität wurden entleert und alle Flüssigkeit durch Ausklopfen (5x) auf saugfähigem Labortuch entfernt. Der Antikörper auf der Wand der Kavität mit dem gebundenen Allergen wurde fünf Mal mit Waschpuffer (300 μΙ PBS, 0.5% TWEEN® 20) gewaschen. Es folgte die Zugabe von peroxidase-konjugiertem Zweitantikörper gegen Erdnuss-Allergen und 10 Minuten Inkubation in HRP-conjugate stabilizer STA2 (Seramun Diagnostica GmbH), gefolgt von weiteren Waschschritten (5 x mit 300 μΙ PBS, 0.5% TWEEN® 20). Für die Farbreaktion wurde 100 μΙ fertige Tetramethyl benzidin(T B)-Substratiösung in die Vertiefungen gegeben und nach 10 Minuten die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 μΙ_ 2 M H ₂ S0 ₄ gestoppt.

[035] Aus den Mittelwerten und den bekannten Konzentrationen an Erdnuss- Allergen wurde eine erste Eichkurve für Standardschokoladen erstellt; siehe Figur 1. Die Ordinate zeigt jeweils die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration von Erdnuss in der Standardschokolade. Im kommerziellen Testkit wird diese Standardkurve des jeweiligen Untersuchungsprodukts nachgebildet durch Standardlösungen mit angepassten Mengen Nachweis- allergen.

3. Vergleich der Extraktion bei schokofadehaltigen Erzeugnissen

[036] Es wurden verschiedene Schokoladen mit und ohne eine Kapsel mit Schutzprotein extrahiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt Die Proben Nr.1-6 (Schoko) wurden in Gegenwart einer Kapsel mit Schutzprotein (0,4 Gramm hydratisiertes Erbsenprotein) aus der Schokoladenmatrix extrahiert. Die Werte waren reproduzierbar und konnten auch auf Varietäten der Schokoladenprodukte erstreckt werden. Wurde kein Schutzprotein bei der Extraktion mit heißem Wasser zugesetzt, war der Erdnussgehalt immunologisch nicht bestimmbar. Erfolgt aber die Extraktion in Gegenwart eines sofort löslichen Schutzproteins, so ist eine allgemeine Eichkurve für die quantitative Bestimmung von Erdnuss-Allergen in schokoladehaltigen Lebensmitteln möglich; siehe Figur 1.

[037] Die gezeigte Eichkurve gilt für Schokoladenprodukte bis zu einer Obergrenze von 25 mg/Kg (ppm), wobei eine optischen Dichte von 1 einem Erdnussgehalt von 10 ppm entspricht (Tabelle I).

[038] Tabelle 1 und die zugehörige Eichkurve in Figur 1 zeigen, dass in Gegenwart von Schutzprotein die Proben durch heißes Wasser aufgeschmolzen und extrahiert werden können. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird offenkundig durch die Gegenwart einer äquivalenten Menge auch das Erdnuss- Allergen im heißem Wasser vor Denaturierung und Fällung geschützt. Eventuelle denaturierende Substanzen und Bitterstoffe in der Schokolade werden durch den Zusatz von Schutzprotein ausverdünnt. War kein Schutzprotein zugegen, so konnte das Erdnuss-Allergen in der Schokolade nicht verlässlich wiedergefunden werden. Beispiel 4 - Untersuchung der Wirkung des Schutzproteins

[039] Es wurden verschiedene Schokoladenerzeugnisse (M&M®, Snickers®) auf Erdnuss untersucht Es wurde jeweils 1 g Erzeugnis in Röhrchen eingewogen und die Probe wie in Beispiel 3 mit und ohne Schutzprotein (Kapsel mit 0,4 g hydratisiertes Erbsenprotein) 15 Sekunden durch Schütteln in 20 mL destilliertem Wasser einer Temperatur von mehr als 90 Grad Celsius extrahiert. Probe und Kapseln schmolzen dabei, und es wurde ein wässriges Gemisch der Probe erhalten. 1 mL des wässrigen Extraktionsgemisches wurde in ein Zentrifugengefäß überführt und 5 Minuten bei £ 8000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in Verdünnungen mit Assaypuffer gemäß. Beispiel 3 immunologisch untersucht; siehe Tabelle 1.

[040] Der Zusatz von Schutzprotein veränderte nicht die Empfindlichkeit der Untersuchung; siehe Proben Nrn. 16-23. Bei Proben mit niedrigem Erdnuss-Anteil (Proben Nrn. 8-9) wurde die Empfindlichkeit höher.

TABELLE I

Quantitative Bestimmung von Erdnuss-Allergen in Schokoprodukten

ConeA Conc x Dil

Pres» Nr. V.nf _ün mm _g 460« Erfawnpratetn

—JbgnggL : t»eftal

Blank 0.112 < LOD mit

Blank 0.062 < LOD ohiw

1 2p ^' pm Schoko 0.314 2.052

2 5ppm Schoko 0.659 6 334

S 10ppm Schoko 0.98 10.566

4 27ppm Schoko 1.498 >2β.250

5 27ppm Schoko 5 0.758 5.879 21.393

6 SOp m Schoko 5 0-S8S 10.773 53.865 I

7 190ppm Schoko 10 Q-.S11 9.132 91 326

8 M&M 4000 0.923 9.365 37458.236

9 Snickers 4000 0.82 7.563 30252.269

10 2ppm Schoko 0.078 < LCD

11 5ppm Schoko 0.073 < LCD

12 lOppm Schoko 0.08 < LOD

13 27ppm Schoko 0.09 < LCC

14 SOppm Schoko 0.114 < LOD

15 100ppm Schoko 0.135 < LOG

Φ

16 M&M 1 2.314 >26,250 >26.250 C

17 M&M 20 2.294 >2β.250 >525 00a

O

18 M&M 400 1.573 >26.260 >10600.00Q

16 M&M 4000 0,723 5.422 21688 556

20 Snickers 1 2.34S »26.260 >26.250

21 Snickers 20 2.352 »26.250 >525,000

22 Snickers 400 1.701 >26.260 > 10600.000

23 Snickers 4000 0.826 8.624 27226.897 Beispiel 5 - Optimierung der Menge an Schutzprotein

[§41] Es wurden unterschiedliche Proben untersucht (jeweils 1 Gramm Schokolade, Keks, Eis). Die Extraktion der Proben erfolgte wie oben geschrieben, wobei die Kapseln unterschiedliche Mengen Schutzprotein (0,3 g; 0,4 g; und 0.5 g) enthielten. Die Proben Nrn. 1-3 wurden nur mit einer Kapsel Pufferreagenz gemäß Beispiel 2 versetzt. Als Kontrolle wurde eine Kapsel mit Schutzprotein (Erbsenprotein - BLANK) im Vergleich zu den Proben Nrn. 4, 8 und 12 verwendet. Alle Proben enthielten eine Kapsel mit 200 mg Pufferreagenz. Die Proben wurden mit 20 ml heißem destillierten Wasser (T > 90 Grad Celsius) versetzt, 15 Sekunden geschüttelt und homogenisiert, ein 1 mL Aliquot des Gemisches dann 5 Minuten bei £ 8000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde wie beschrieben in einem Erdnuss-ELISA untersucht; die Ergebnisse sind Tabelle II zu entnehmen.

[042] Der Vergleich der Proben 5, 9 und 13 (Schoko) zeigt, dass die optimale Menge Schutzprotein für die quantitative Bestimmung von Erdnuss-Allergen in Lebensmitteln (1 Gramm) bei 0,4 Gramm lag. Bei der Probe Nr. 1 (Schoko), Extraktion ohne Zusatz von instant löslichem Schutzprotein konnte man Erdnuss nicht immunologisch nachweisen. Der Vergleich der Bestimmungen von Erdnuss-Allergen in Keks (Proben Nr. 2, 6, 10 und 14); Eis (Proben Nr. 3, 7, 1 1 und 15) und Schokolade (Proben Nrn. 5, 9 und 13) zeigt, dass das Allergen besonders bei schokoladehaltigen Produkten eines Schutzes bedarf. Zudem ist zu berücksichtigen, dass Lebensmittelproben wie Eis bereits erhebliche Mengen Magermilchpulver enthalten können, so dass kein zusätzliches Schutzprotein in manchen Fällen mehr erforderlich ist.

TABELLE II

Beispiel 6- Bestimmung von Erdnuss-Allergen in Haselnusscremes

1. Probenaufbereitung

[043] Es wurde 1 g (ml_) Haseinusscreme als Brotaufstrich in ein Röhrchen eingewogen und mit jeweils einer Kapsel Schutzprotein (0,4 Gramm hydratisiertes Erbsenprotein) und Pufferreagenz (PBS) versetzt. Die Extraktion mit 20 mL heißem Wasser (T > 90°C) und die immunologische Bestimmung von Erdnuss-Allergen in der

Probe erfolgten wie in Beispiel 1.

2. Auswertung

[044] Die Auswertung erfolgte mit Hilfe einer 4-Parameter-Vergleichsfunktion.

Proben mit Extinktionswerten (E450 <™) oberhalb des Standard bereichs wurden in den mittleren Bereich der Standardkurve verdünnt. Der Verdünnungsfaktor (F) und die Einwaage wurden bei der Auswertung berücksichtigt; siehe Gleichung (1 ). Es wurde so der Gesamtanteil Erdnuss in der Haseinusscreme ermittelt. Siehe Gleichung (2) für die Umrechnung auf einen Erdnussprotein-Anteil.

Erdnuss gesamt [mg/kg (L)] = (Wert aus der Standardkurve x F) / Probeeinwaage fg (mL)]

Erdnuss-Protein [mg/kg (L)] = Erdnuss gesamt [mg/kg (L)l x 0.2

TABELLE III

Erdnussgehalt in Haseinusscreme

a} Nactaeisgrenzt

Erdnuss gesamt: 0.5 mg/kg (L)

Erdnussprotein: 0.1 mg kg (L)

b) iistinimijngsgrenze

Erdnuss gesamt: 1 mg/kg (L)

Erdnussprotein: 0.2 mg kg (L) Beispiel 7 - Bestimmung von Schalenfrüchte-Allergen in Schokolade

[045] Es wurden verschiedene Schokoladeproben auf Mandel, Hasefnuss und Macadamia untersucht. Es wurde jeweils 1 g Erzeugnis in Röhrchen eingewogen und die Probe wie in Beispiel 3 mit oder ohne Extraktionskapsel (Kapsel mit 0,4 g hydratisiertes Erbsenprotein oder 1 g Magermilchpulver) 15 Sekunden durch Schütteln in 20 mL destilliertem Wasser einer Temperatur von mehr als 90 Grad Celsius extrahiert. 1 mL des wässrigen Extraktionsgemisches wurde in ein Zentrifugengefäß überführt und 5 Minuten bei > 8000 g zerrtrifugiert. Der Überstand wurde in Verdünnungen mit Assaypuffer gemäß Beispiel 3 immunologisch untersucht; siehe Tabellen IV, V und VI.

[046] Aus den Mittelwerten und den bekannten Konzentrationen an Mandel-, Haselnuss- oder Macadamia-Ailergen wurde jeweils eine Eichkurve für Standardschokoladen erstellt; siehe Figuren 2-4. Die Ordinate zeigt jeweils die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration in mg/Kg von Allergen in der Standard Schokolade. Im kommerziellen Testkit wird diese Standardkurve nachgebildet durch Standardlösungen mit angepassten Mengen Referenzallergen.

[047] Es wurden verschiedene Schokoladeproben mit und ohne Schutzprotein extrahiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabellen IV, V, VI gezeigt. Proben mit bekannten Mengen Mandel - 8mg/Kg - (siehe Figur 2) wurden in Gegenwart einer Kapsel mit Schutzprotein (0,4 Gramm hydratisiertes Erbsenprotein) aus der Schokoladenmatrix extrahiert (Proben Nr.1-2). Ohne Zusatz von Schutzprotein bei der Extraktton, war der Mandelgehalt immunologisch nicht bestimmbar (Proben Nr. 3-4). Eine allgemeine Eichkurve für die quantitative Bestimmung von Mandel-Allergen in Schokoladehaltige Produkte erfolgte nur in Gegenwart eines Schutzproteins. Die gezeigte Eichkurve (siehe Figur 2) gilt für Schokoladenprodukte bis zu einer Obergrenze von 25 mg Mandel-Allergen/Kg).

[048] Es wurden ebenso Schokoladeproben auf die Gegenwart von Haselnuss- oder Macadamia-Ailergen untersucht, wobei jeweils 1 g Probe wie in Beispiel 3 mit (beide Allergene) oder ohne (nur Haselnuss-Allergen) Extraktionskapsel, entweder mit 1g Magermilchpulver oder 0,4 g hydratisiertes Erbsenprotein extrahiert wurde (siehe Tabellen V und VI). Auch wenn Magermilchpulver eine schutzende Wirkung aufweist, bietet das Erbsenprotein einen wesentlichen Vorteil, denn damit keine Kontamination von Allergen (z.B. Milchpulver) im Labor geschieht. Auch hier konnte nur mittels eines Schutzproteins eine allgemeine Eichkurve für die quantitative Bestimmung von Haselnuss- und Macadamia-Allergen in Schokoiadehaltige Produkte erstellt werden. Die gezeigte Eichkurven (siehe Figur 3-4) gelten für Schokoladerv Produkte bis zu einer Obergrenze von 25 mg Allergen/Kg.

TABELLE IV

Mandelgehalt in Schokolade

TABELLE V

Haselnussgehalt in Schokolade

TABELLE VI

Macadamiagehalt in Schokolade

Beispiel 7 - Bestimmung von Erdnuss-Aliergen in Umfeldproben mit Tupfer

[049] Es wurde Tupfer mit Wasser angefeuchtet und die Abstrichflächen unter Wenden der Tupfers mit horizontalen Bewegungen abgerieben. Dieser Vorgang wurde wiederholt, nur mit vertikalen Bewegungen. Die Tupfer wurden in ein Röhrchen überführt. Dann wurden je eine Kapsel mit Schutzprotein (0,4 Gramm hydratisiertes Protein der gelben Erbse) und mit Pufferreagenz (2 x PBS) zugesetzt und schließlich 10 mL heißes destilliertes Wasser mit einer Temperatur über 90 Grad Celsius, Es folgte eine Extraktion der Allergene durch 15 Sekunden Schütteln. Es wurde dann ein 1mL Aliquot in ein Zentrifugengefäß überführt und 5 Minuten bei 8000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in den Allergen-ELISA eingesetzt und analog Beispiel 3, Absatz 2 ausgemessen.

TABELLE VII

Umfeldproben mit Tupfer

a) Nachweisgrenze

Erdnuss gesamt: 0.25 m»/Tupfer

Erdnussprotein: 0.05 pg/Tupfer

b) BestimmungjRrenze

Erdnuss gesamt: 0.5 pg/Tupfer

Erdnussprotein: 0.1 Mg/Tupfer Beispiel 8 - Bestimmung von Erdnuss-Allergen in Umfeldproben mit Schwemm

[OSO] Es wurde ein Schwamm mit Wasser angefeuchtet und die Abstrichfläche damit horizontal und vertikal abgerieben. Der Schwamm wurde zerkleinert und in ein Röhrchen überführt. Die Extraktion des Schwamm erfolgte nach Zusatz von Schutzprotein (Kapsel mit 0,4 Gramm Erbsenprotein) und Pufferreagenz (1 x PBS) mit 20 mL heißem destilliertem Wasser (T > 90°C). Die immunologische Bestimmung erfolgte wie in Beispiel 3, Absatz 2.

TABELLE VIII

Umfeldproben mit Schwamm

a) Naci dsgrenze

Erdnuss gesamt: 0.5 ug/Schwamm

Erdnussprotein: 0.1 Mg Schwamm

bJ ilÄmDSgEiQze

Erdnuss gesamt: 1 ug/5chwamm

Erdnussprotein: 0.2 iig Schwamm Beispiel 9 - Bestimmung von Erdnuss-Allergen in Reinigungswasser

[051] Reinigungswasser (pH 4-9) wurde 1 :1 mit Verdünnungspuffer versetzt und nach Zusatz von Schutzprotein (Kapsel mit 0,4 g Protein der gelben Erbse) und Pufferreagenz direkt immunologisch auf Erdnuss-Allergen untersucht.

TABELLE IX

Erdnussgehaft in Reinigungswasser

a) NachweisRrenze

Erdnuss gesamt: 50 g/L

Erdnussprotein: 10 ug/L

M estimriiM!isgrenffi

Erdnuss gesamt: 100 ug/L

Erdnussprotein: 20 pg L