OBJETO DE LA INVENCIÓN

Constituye un objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación de los niveles de los polifosfatos inorgánicos en el plasma sanguíneo. Este procedimiento comprende el empleo de la fracción del plasma crioprecipitado, que concentra la mayoría del polifosfato y reduce la contaminación del fosfato libre en la muestra.

ESTADO DE LA TECNICA

Los polifosfatos inorgánicos (polyP) son polímeros de variado tamaño que están presentes en todos los seres vivos (Kornberg, A., J Bacteriol, 1995, 177, 491-6). Como su nombre lo indica, los polyP están formados por más de tres residuos de fosfato, unidos entre sí por enlaces fosfoanhidro de alta energía (Figura 1A). (Kornberg, A., J Bacteriol, 1995, 177, 491-6).

En la industria los polyP han sido ampliamente usados en variadas aplicaciones que incluyen el procesamiento de alimentos, el uso como aditivo alimentario y la reducción de la dureza del agua, entre otros (Kornberg, A., J Bacteriol, 1995, 177, 491-6).

En años recientes, muy variadas funciones han sido asociadas a los polyP relacionadas con la medicina por ejemplo la modulación de la proliferación celular (Wang, L., Fraley, C.D. y col, Proc Nati Acad Sci USA, 2003, 100, 11249-54), la angiogénesis (Han, K.Y., Hong, B.S. y col., Biochem J, 2007, 406, 49-55), la mineralización de los huesos (Schroder, H.C., Kurz, L. y col, Biochemistry (Mosc), 2000, 65, 296-303), el metabolismo energético (Pavlov, E., Aschar-Sobbi, R.y coL, J Biol Chem, 285, 9420-8) y metástasis de tumores (Tammenkoski, M., Koivula, K. y col, Biochemistry, 2008, 47, 9707-13), entre otros. Se ha propuesto que los polyP pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades de las encías (Yamaoka, M., Uematsu, T. y col., Gerodontology, 2008, 25, 10-7), para estimular la regeneración de los huesos (Hacchou, Y., Uematsu, T. y coi, J Dent Res, 2007, 86, 893-7) y en la cicatrización de las heridas (Kim, H.R., Kim, H.Y. y col.),

En este sentido, nuestro grupo de investigación en el año 2004, describió que los polyP se acumulan en las plaquetas humanas y que son secretados por las plaquetas activadas en los procesos de coagulación de la sangre (Ruiz, F.A., Lea, C.R. y col., J Biol Chem, 2004, 279, 44250-7). A partir de ese momento, ha surgido un marcado interés por el estudio de las posibles funciones de los polyP relacionadas con la hematología. En consecuencia, se ha encontrado que los polifosfatos pueden modular la coagulación de la sangre tanto in vitro (Smith, S.A., Mutch, N.J. y col, Proc Nati Acad Sci USA, 2006, 103, 903-8) como in vivo (Muller, F., Mutch, N.J. y col., Cell, 2009, 139, 1143-56), y también, que incrementan la fibrinólisis (Smith, S.A. y Morrissey, J.H., Blood, 2008, 112, 2810-6). Por tanto se ha propuesto que los polyP pueden ser usados para promover la coagulación y disminuir el sangrado (Morrissey, J.H., Smith, S.A. y col., 2006, Patent US2006198837-A1; , 2010, Patent US 2010/0143492 Al; Smith, S.A. y Morrissey, J.H., 2010, Patent US2010/0297257 Al).

Estos estudios, han servido de origen a recientes descubrimientos acerca de funciones para de los polyP relacionadas con la inflamación. Los polyP estimulan la producción del péptido vasoactivo bradikinina, con la consecuente inducción de edemas (Muller, F., Mutch, N.J. et al, Cell, 2009, 139, 1143-56). Los polyP también inducen una la respuesta inflamatoria mediada por el factor nuclear "kappa beta" en las células endoteliales (Bae, J.S., Lee, W. y col, J Thromb Haemost, 2012, 10, 1145-51). Más aún, nuestro grupo ha encontrado que las células de mastocitos y basófilos, determinantes en la inflamación y en los procesos de alergia, contienen estos polyP pro-inflamatorios en su granulos secretores (Moreno-Sánchez, D., Hernandez-Ruiz, L. y col, J Biol Chem, 2012, 287, 28435-44). A pesar de la relevancia de los polyP en la coagulación y en la inflamación, los niveles presentes de este polímero en el plasma de la sangre no han podido ser determinados de manera precisa hasta el momento. Dependiendo los niveles encontrados dentro de las plaquetas, hasta ahora sólo se había estimado que debería estar en unos 3 Μ (Smith, S.A., Mutch, NJ. et al, Proc Nati Acad Sci U SA, 2006, 103, 903-8). La invención que aquí se presenta permite, por primera vez, la estimación precisa de los polyP en el plasma.

Una de las razones que dificulta la medida de polyP en al plasma sanguíneo es la alta concentración de fosfato inorgánico presente (figura IB). Los niveles normales de fosfato en un adulto están entre 0,8 y l,45mM (2,5- 4.5 mg/dL) (Yu, A.S.L., Cecil Medicine, 2011, chap. 121), que son concentraciones 250-500 veces más altas que la estimadas para los polyP.

Recientemente se ha propuesto que algunas de las funciones del polyP en la sangre ocurren a través de su unión con las proteínas presentes en el plasma sanguíneo. Hasta el momento se ha descrito que los polyP se unen y afectan las actividades de las siguientes proteínas del plasma: factor XII (Muller, F., Mutch, NJ. et al, Cell, 2009, 139, 1143-56), fibrina y fibrinógeno (Smith, S.A. y Morrissey, J.H., Blood,

2008, 112, 2810-6; Mutch, N.J., Engel, R. y col, Blood, 2010, 115, 3980-8), trombina (Mutch, N.J., Myles, T. y col, J Thromb Haemost, 2010, 8, 548-55), Proteasa activadora de Factor VII (FSAP) (Muhl, L., Galuska, S.P. y col, Febs J,

2009, 276, 4828-39) y Factor von Willebrand (Montilla, M., Hernandez-Ruiz, L. y col, J Thromb Haemost, 2012).

Un procedimiento ampliamente usado para concentrar algunas de las proteínas del plasma, para donaciones, es la elaboración del crioprecipitado (EDQM, 2010) (figura IB). El crioprecipitado es un concentrado de proteínas de alto peso molecular que se forma cuando el plasma congelado es descongelado lentamente a temperaturas entre 1 a 6°C (Pool, J.G., Gershgold, E.J. y col, Nature, 1964, 203, 312). El concentrado contiene principalmente factor VIII (factor antihemolítico), factor von Willebrand, fibrinógeno, factor XIII, fibronectina, y pequeñas cantidades de otras proteínas del plasma (Sparrow, R.L., Greening, D.W. y col., Methods Mol Biol, 2011, 728, 259- 65).

En el pasado, el crioprecipitado fue usado ampliamente para tratar pacientes con deficiencia del factor von Willebrand (Enfermedad de von Willebrand) o con deficiencia del factor VIII (Hemofilia A), pero en general el tratamiento de éstas patologías se ha ido remplazando por la transfusión de concentrados de los factores purificados (Yang, L., Stanworth, S. y col., Transfus Med, 2012, 22, 315-20). Actualmente, el uso del crioprecipitado es escaso, siendo común sólo para suplir el fibrinógeno en las coagulopatías específicas de los pacientes deficientes en esta proteína (hipofibrinogenemia), así como para tratar otras coagulopatías en los casos donde no se disponga de los factores del plasma aislados (Yang, L., Stanworth, S. et al, Transfus Med, 2012, 22, 315-20).

La invención que aquí se presenta está basada en el hallazgo de que la mayoría de los polyP presentes en el plasma de la sangre están unidos a las proteínas que se acumulan en la fracción del crioprecipitado (Figura 2A).

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EXPLICACION DE LA INVENCIÓN

Constituye un primer objeto de la presente invención un procedimiento para la determinación de los niveles de polifosfatos en el plasma sanguíneo que incluye las siguientes etapas:

a) obtener una muestra biológica de un individuo. La muestra biológica incluye sangre y específicamente plasma sanguíneo.

b) separar las proteínas de alto peso molecular del plasma. Un método propuesto para esta separación es el descrito para la obtención del crioprecipitado para transfusiones. c) determinar, en esta fracción de proteínas, el contenido del compuesto polifosfato. Esta fracción de proteínas contiene la mayoría del polifosfato de la muestra a la vez que cantidades ínfimas de fosfato contaminante.

Los polyP plasmáticos son potentes moduladores de la coagulación y/o trombosis y también tienen también un papel determinante los procesos inflamatorios. Por tanto, los contenidos de polyP en plasma pueden ser utilizados como medida indirecta de la trombosis y de la inflamación.

Por otra parte, para la presente invención se aportan ejemplos en los cuales la muestra biológica se toma de humanos, pero además de los humanos, se puede utilizar para determinar los niveles de polyP en otros mamíferos como por ejemplo, perros, gatos, cerdos, ganado vacuno, ratas y ratones. Esto puede ser de especial importancia para estudiar enfermedades en animales de interés alimentario, así como para observar diferentes modelos animales de patologías.

Específicamente, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) obtención del una muestra biológica del individuo a determinar sus niveles de polyP plasmáticos. b) aislamiento del plasma de los otros componentes de la muestra biológica. c) separación de las proteínas de alto peso molecular del plasma. d) separación de los polifosfatos inorgánicos del resto de componentes de la fracción de proteínas de alto peso molecular del plasma. e) determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores.

La etapa de aislamiento del plasma se lleva a cabo mediante un proceso de centrifugación simple.

La etapa de separación de proteínas de alto peso molecular se realiza mediante la congelación y posterior descongelación lenta del plasma, para formar la fracción conocida como crioprecipitado.

La separación de los polifosfatos de la fracción de crioprecipitado del plasma se realiza mediante un procedimiento que incluye extracciones con soluciones de fenol/cloroformo (polyP total). Alternativamente, la determinación de polifosfatos puede realizarse directamente en la fracción de proteínas del crioprecipitado mediante la precipitación de las proteínas con un ácido fuerte, como ácido perclórico o ácido tricloroacético, y la posterior la neutralización con solución alcalina (polyP unido a proteínas).

La determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado en las etapas anteriores se efectúa, directamente mediante colorimetría o fluorimetría, preferentemente colorimetría.

Alternativamente, la determinación cuantitativa del polifosfato solubilizado y separado incluye:

a) un ataque enzimático para procesar el polifosfato, liberándose los productos resultantes de dicha reacción enzimática.

b) determinación cuantitativa de alguno de los productos resultantes de la reacción enzimática mediante colorimetría o por luminiscencia, preferentemente mediante colorimetría.

Constituye otro objeto de la presente invención un kit para la determinación de los polifosfatos plasmáticos mediante el referido procedimiento. Dicho kit incluye:

- medios para aislar el plasma de la sangre y producir los extractos de proteínas de alto peso molecular (crioprecipitado). - medios para la detección y cuantificación del polifosfato en el crioprecipitado.

- muestras de control de polifosfato y/o plasma para comparar con los valores obtenidos.

Adicionalmente, el kit puede incluir enzimas para el procesamiento específico de polifosfato en productos detectables mediante colorimetría o por luminiscencia.

En realizaciones preferentes del kit, los medios para producir extractos acídicos de las proteínas del crioprecipitado del plasma son ácidos que se seleccionan entre ácido perclórico o ácido tricloroacético, los medios para la detección y cuantificación del polifosfato son reactivos para ensayos colorímétricos, de fluorescencia o de luminiscencia, preferentemente reactivos colorimétricos que se seleccionan entre colorantes básicos como el azul de toulidina o fluoróforos como Fura-2 o DAPI.

En el caso de kits que incluyan enzimas, éstas se seleccionan entre las exopolifosafatasas, la polifosfato kinasas, o la polifosfato glucokinasas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: En el panel A se muestra un esquema de una molécula de polyP (izquierda) y de una molécula de fosfato (derecha). Cada molécula de polyP contiene al menos tres residuos de fosfato. El símbolo designado como "n" representa un número entero superior a 1 y puede ser hasta varios cientos. El panel B muestra un esquema de obtención del crioprecipitado del plasma. El Plasma es congelado y luego descongelado lentamente a temperaturas de 1 a 6°C, lo que induce la precipitación de las proteínas de alto peso molecular o Crioprecipitado (CRIO). También se analizó la fracción de "Plasma Libre de Crioprecipitado" (PLC).

Figura 2: Se muestran histogramas de las medidas de polyP total (en el panel A) y de fosfato (en el panel B), en las fracciones de Crioprecipitado (CRIO) y de "Plasma Libre de Crioprecipitado" (PLC), según la metodología explicada en el Ejemplo 1. En todos los casos se ofrece los valores obtenidos a partir de 1 mi de plasma. Figura 3: Se muestran histogramas de las medidas de polyP total (panel A), del polyP unido a proteínas (panel B) y de fosfato (panel C), en las fracciones de Plasma y de Crioprecipitado (CRIO), según la metodología explicada en el Ejemplo 2.

Figura 4: Se muestran histogramas de las medidas de polyP total (panel A) y del polyP unido a proteínas (panel B), en las fracciones de plasma crioprecipitado, según la metodología explicada en el Ejemplo 3. Las muestras fueron obtenidas de individuos sanos (Control) y de pacientes con dSPD (dSPD).

DESCRIPCIÓN DETALLADA Y MODO DE REALIZACION DE LA INVENCIÓN

Se ha identificado que la mayoría de los polyP se concentran en la fracción de crioprecipitado del plasma. Esta fracción posee niveles muy bajos de fosfato contaminante lo que permite la determinación precisa del polyP presente en el plasma. A pesar de la relevancia de los polyP en la coagulación y en la inflamación, los niveles presentes de este polímero en el plasma de la sangre no han podido ser determinados de manera precisa hasta el momento y el método propuesto resuelve este problema.

Utilizando la metodología descrita más detalladamente en el Ejemplo 1, se ha determinado las concentraciones de polyP y de fosfato en las dos fracciones resultantes del plasma después su congelación y descongelación lenta: El Crioprecipitado (CRIO) y el "Plasma Libre de Crioprecipitado" (PLC) (Figura 2). La mayoría del polyP se concentra en la fracción del CRIO y la mayoría del fosfato se acumula en la fracción PLC (Figura 2). Brevemente, el método se inició con la recogida de sangre de individuos sanos que no sufrían trastornos en la coagulación y que una semana antes de la donación de sangre no habían tomado medicaciones que pudieran afectar sus niveles de coagulación. Seguidamente, el plasma se aisló de la muestra de sangre por centrifugación simple. A continuación se obtuvieron las fracciones de CRIO y de PLC, mediante una congelación a -80°C y posterior descongelación a 4°C, seguido de una centrifugación simple (Pool, J.G., Gershgold, E.J. et al, Nature, 1964, 203, 312; Edqm, 2010). Otros procedimientos pueden ser usados para la separación del crioprecipitado, como el uso de aparatos separadores, membranas y filtros (Foster, P.R., 1986, Patent US 4,638,048; Coelho, P.H. y Wolf, T., 1993, Patent US 5,261,55).

Luego se separan los polyP totales de la muestra por un procedimiento descrito anteriormente (Kumble, K.D. y Kornberg, A., J Biol Chem, 1995, 270, 5818-22) y que incluye: a) la degradación enzimática del ADN, el ARN y las Proteínas; b) extracciones con fenol/cloroformo y con tampón y con cloroformo; y c) concentrar los polyP extraídos para su posterior determinación. Otros procedimientos también podrían ser utilizados para la separación de los polyP como por ejemplo la separación de los polyP de cadena larga descritos en bacteria (Ault-Riche, D., Fraley, C.D. y col, J Bacteriol, 1998, 180, 1841-7). En paralelo, se extraen también los fosfatos contenidos en las muestras de CRIO y de PLC mediante la recogida del sobrenadante, luego de la precipitación con un ácido fuerte como se describe en el Ejemplo 1.

Varios métodos pueden ser utilizados para la detección de polyP, que incluyen, pero no están limitados a, reacciones metacromáticas con colorantes básicos como azul de toluidina (Lorenz, B. y Schroder, H.C., Prog Mol Subcell Biol, 1999, 23, 217-39), la detección de los cambios de fluorescencia de fluoróforos como Fura-2 o DAPI en presencia de polyP (Lorenz, B., Munkner, J. y col, Anal Biochem, 1997, 246, 176- 84; Aschar-Sobbi, R., Abramov, A. Y. y col, J Fluoresc, 2008, 18, 859-66), o la determinación colorimétrica de los productos resultantes después de la incubación de los extractos con enzimas específicas que procesan el polyP. Como ejemplos de las enzimas utilizadas en este útimo tipo de detección están la exopolifosafatasa (Wurst, H. y Kornberg, A., J Biol Chem, 1994, 269, 10996-1001; Ruiz, F.A., Rodrigues, C.O. y col, J Biol Chem, 2001, 276, 26114-21), la polifosfato kinasa (Robinson, N.A., Clark, J.E. y col, J Biol Chem, 1987, 262, 5216-22; Ault-Riche, D., Fraley, C.D. et al, J Bacteriol, 1998, 180, 1841-7), o la polifosfato glucokinasa (Clark, J.E., Beegen, H. y col, J Bacteriol, 1986, 168, 1212-9). Los productos de las reacciones enzimáticas son marcados con cromóforos y son detectados y cuantificados con la ayuda de un espectrofotómetro o colorímetro o un luminómetro. En el ejemplo 1, el polyP ha sido cuantificado por el uso de la forma recombinante y purificada de la exopolifosfatasa inorgánica de levadura (Ruiz, F.A., Rodrigues, C.O. et al, J Biol Chem, 2001, 276, 26114-21). Así mismo, el fosfato de las muestras, así como el producido por la reacción enzimática de la exopolifosfatasa ha sido evaluado colorimétricamente por el uso de azul de molibdeno y verde de malaquita (Lanzetta, P.A., Alvarez, L.J. y col., Anal Biochem, 1979, 100, 95-7).

En el ejemplo 2, realizamos medidas en el Plasma completo y en la fracción de crioprecipitado de individuos sanos (Figura 3). Los niveles de polyP total (panel A) y de fosfato (panel C) fueron determinados como se explicó en el Ejemplo 1. También se incluye la medida del polyP unido a proteínas (panel B) que se obtiene mediante la precipitación de las muestras con un ácido fuerte (en este caso, ácido perclórico) y el posterior análisis de las proteínas precipitadas. Después de la precipitación, las proteínas son resuspendidas y neutralizadas, para seguidamente determinar los polyP unidos a éstas según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, que se basa en la degradación específica con la enzima exopolifosfatasa. En estas mediciones comprobamos que la fracción de crioprecipitado tiene los mayores niveles de polyP total y de polyP unido a proteínas, así como unas cantidades ínfimas de fosfato en comparación con el plasma (Figura 3).

Por último realizamos una prueba de concepto en el Ejemplo 3, utilizando el procedimiento de medida de polyP del plasma en individuos sanos y en pacientes con un trastorno de la coagulación denominado "enfermedad de los reservorios delta" (abreviado como dSPD) (Figura 4).

En algunos individuos, sus plaquetas están deficientes lo que resulta en un trastorno de coagulación denominado "enfermedad de los reservorios delta" o "delta-storage pool disease". Nuestro grupo describió anteriormente que los pacientes con dSPD tienen menos polyP en sus plaquetas (Hernandez-Ruiz, L., Saez-Benito, A. y col, J Thromb Haemost, 2009, 7, 361-3; Ruiz, F.A., Hernandez-Ruiz, L. y col, 2009, WIPO Patent Application WO/2009/109676). Como la mayoría del polyP presente en el plasma debe tener su un origen en las plaquetas, se cree que los pacientes con dSPD deben tener también menor contenido de polyP en el plasma.

Efectivamente, la medición de los niveles de polyP total y del polyP unido a proteínas (Figura 4), nos mostró niveles muy inferiores del polímero en los crioprecipitados de los pacientes con dSPD en comparación con los medidos individuos sanos (Figura 4).

Ejemplo 1:

Este ejemplo describe la metodología utilizada para medir los niveles de polyP total y de fosfato libre de las fracciones de crioprecipitado del plasma y del plasma libre de crioprecipitado (Figura 2).

Los experimentos fueron realizados en muestras de sangre de 10 individuos voluntarios. Los donantes confirmaron, que según su conocimiento, no tenían trastornos en la coagulación. Así mismo, los individuos del estudio confirmaron que no habían tomado alguna medicación que afectase a la coagulación de la sangre en la semana antes de la donación.

Se extraen 4.5 mi de sangre en tubos con citrato de sodio al 3,2%. Las muestras se centrifugaron a 1800 x g por 20 min a 4°C, para la obtención del plasma en el sobrenadante. Se separa el plasma en alícuotas de 1 mi y se congela a -80°C por un período mínimo de 24 horas. Se realiza la descongelación a 4°C, que tarda aproximadamente 30-45 min. A continuación, se centrifugan los plasmas descongelados a 1800 x g por 10 min a 4°C para separar dos fracciones: el Crioprecipitado (CRIO) en el pellet y el Plasma Libre de Crioprecipitado (PLC) en el sobrenadante. El Crioprecipitado se resuspende en 300 μΐ de solución salina (150mM NaCl, pH 7).

El polifosfato Total se aisla, del Crioprecipitado y del PLC, según el procedimiento descrito por Kumble y Kornberg (Kumble, K.D. y Kornberg, A., JBiol Chem, 1995, 270, 5818-22) con modificaciones. Brevemente, a la muestra se le añade las enzimas ADNasa y RNAasa (a una concentración final de 40 μg/ml de cada una) y MgC12 (para obtener una concentración final de 5mM MgC12). Luego la muestra se incuba a 37°C por 30 minutos. A continuación añade la enzima Proteinasa K (350 μg/ml y se incuba a 37°C por 1 hora. Seguidamente, la muestra se extrae con una solución de fenol/cloroformo (1 :1 equilibrada con Tris-HCL, pH 7,5), en el que las fases se obtienen por centrifugación a 14000 x g por 5 min. La fase acuosa se extrae dos veces con 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA y luego tres veces vez con Cloroformo saturado en agua (las fases se obtienen por centrifugación a 14000 x g por 5 min). Se precipita los polyP de la muestra añadiendo 2,5 volúmenes más de etanol muy frió y 10% del volumen de NaCl 5M. Se centrifuga a 14000 x g por 15 min, se extrae el sobrenadante. El pellet resultante se resuspende con 20 μΐ de agua y se utiliza para la determinación de polyP.

Los niveles de polyP fueron determinados en los extractos neutralizados por la medición del fosfato inorgánico (Pi) resultante después del tratamiento con un exceso de la enzima purificada exopolifosfatasa recombinante de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) (Enzima ScrPPXl). La Enzima ScrPPXl fue obtenida por la expresión de un plásmido (cesión de la Universidad de Stanford) con el gen (rPPXl) con colas de histidina de la exopolifosfatasa recombinante de S. cerevisiae (Wurst, H., Shiba, T. y col, J Bacteriol, 1995, 177, 898-906), en la cepa de bacteria E. coli strain CA38 pTrcPPXl (Crooke, E., Akiyama, M. y col., J Biol Chem, 1994, 269, 6290-5). El aislamiento de la Enzima ScrPPXl fue realizado como se describe en Ruiz y col. (Ruiz, F.A., Lea, C.R. et al, JBiol Chem, 2004, 279, 44250-7). La determinación de polyP de los extractos neutralizados, se realizó como se describe a continuación: En un volumen final de 75 μΐ ajustado a concentraciones finales de 60 mM Tris-HCl, pH 7.5, y 15 mM MgC12, se mezclan alícuotas de los extractos junto con 0.5 a 2 μg de Enzima ScrPPXl purificada. Las incubaciones se realizan por al menos 20 min a 37 °C y la producción de Pi resultante fue monitorizada calorimétricamente por el método de detección de fosfato descrito por Lanzetta y col., que utiliza molibdato de amonio y verde de malaquita (Lanzetta, P.A., Alvarez, L.J. et al, Anal Biochem, 1979, 100, 95-7). El fosfato se aisla, del Crioprecipitado y del PLC, del sobrenadante resultante tras la precipitación con un ácido perclórico. Brevemente, a las muestras se les añade 1/5 de su volumen de ácido perclórico (HC104) 3 M. Después de una incubación en hielo de 30 min, los extractos acídicos fueron centrifugados a 14,000 x g por 5 min. Los sobrenadantes resultantes se neutralizaron por la adición de una solución de 1M KOH, 100 mM TrisHCl, lo que produce la formación de KC104 y la precipitación del mismo. El KC104 precipitado fue separado por centrifugación a 14,000 x g por 5 min, y el sobrenadante resultante fue utilizado para la determinación de fosfato.

El fosfato de la muestra fue monitorizado colorimétricamente por el método de detección de fosfato descrito por Lanzetta y col., que utiliza molibdato de amonio y verde de malaquita (Lanzetta, P.A., Alvarez, L.J. et al, Anal Biochem, 1979, 100, 95-7).

Ejemplo 2:

Este ejemplo describe la metodología utilizada para medir los niveles de polyP total, de polyP unido a proteínas y de fosfato libre de las fracciones de plasma congelado y en crioprecipitado del plasma (Figura 3).

Los experimentos fueron realizados en muestras de sangre de 10 individuos voluntarios obtenidos como se explica en el Ejemplo 1. La obtención del Plasma y del Crioprecipitado del Plasma (CRIO), se realiza según procedimientos detallados en el Ejemplo 1. La extracción y detección de los polyP (Figura 3, panel A) y del fosfato (Figura 3, panel C), se realizaron según los procedimientos indicados en el Ejemplo 1.

Para la extracción del polyP unido a proteínas se midió el polyP resultante en el precipitado tras la precipitación con un ácido perclórico. A las muestras, de Plasma o de Crioprecipitado, se les añade 1/5 de su volumen de ácido perclórico (HC104) 3 M. Después de una incubación en hielo de 30 min, los extractos acídicos fueron centrifugados a 14,000 x g por 5 min a 4°C. Los pellets resultantes se resuspenden en 100 μΐ de solución salina (150mM NaCl, pH 7). De la muestra resuspendida se separan alícuotas de 5 μΐ para la determinación de cantidad de proteínas por el método de Bradford, que utiliza el colorante "Brilliant Blue G" (Bradford, M.M., Anal Biochem, 1976, 72, 248-54). El resto de la muestra respondida, se neutraliza con una solución de 1M KOH, 100 mM TrisHCl (hasta lograr un pH entre 6 y 8). Luego se centrifugan a 13000 x g a 4°C durante 5 minutos. En el sobrenadante se determina la concentración de polyP, utilizando la enzima ScrPPXlcomo se explica en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3:

Este ejemplo describe la metodología utilizada para medir los niveles de polyP del Crioprecipitado de plasma en controles sanos y en pacientes con el trastorno de coagulación "enfermedad de los reservorios delta" o dSPD (Figura 4).

Los experimentos fueron realizados utilizando plasma de 10 individuos voluntarios sanos y de cinco pacientes con dSPD. Los donantes del grupo control confirmaron, que según su conocimiento, no tenían trastornos en la coagulación. Así mismo, todos los individuos del estudio confirmaron que no habían tomado alguna medicación que afectase a las plaquetas en la semana antes de la donación de sangre. El diagnóstico de dSPD en los cinco pacientes utilizados se confirmó con anterioridad mediante el análisis de la incorporación de mepacrina por citometría de flujo y por el estudio de la secreción de ATD utilizando luminescencia (Hernandez-Ruiz, L., Saez-Benito, A. et al, J Thromb Haemost, 2009, 7, 361-3).

El plasma se obtuvo a partir demuestras de sangre según se explica en el Ejemplo 1. La preparación de crioprecipitado así como la extracción y detección de los polyP totales en las muestras (Figuras 4, panel A), se realizó como se explica en el Ejemplo 1. La extracción y determinación del polyP unido a proteínas (Figura 4, panel B) se realizó de manera similar como se detalla en el Ejemplo 2. APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Como los polyP plasmáticos son potentes moduladores de la coagulación y/o trombosis, el procedimiento objeto de la presente invención es óptimo para la estimación precisa y rápida de estos procesos. Por tanto, puede ser muy efectivo como alternativa para evaluar pacientes con tratamientos anticoagulantes (como en la administración de heparinas y/o cumarínicos), o como ayuda para diagnosticar defectos en la coagulación congénitos (como la dSPD ó la hemofilia) o adquiridos (como sucede con los pacientes de enfermedades hepáticas y renales, leucemias mieloides, mielodisplasias o síndromes proliferativos).

Por otra parte, como los polyP plasmáticos tienen también un papel determinante los procesos inflamatorios, mediante la modulación de la producción de bradiquinina, el procedimiento objeto de la presente invención puede ser efectivo para estimar la gravedad de diferentes patologías con componente inflamatorio (como por ejemplo diabetes, infecciones, alergias o enfermedades autoinmunes, entre otras).

El procedimiento de la invención sirve de base para el desarrollo de kits para la evaluación y ensayo de los niveles de polyP en plasma de sangre humana y/o de animales. Por ejemplo, los kits podrían incluir enzimas y/o los ensayos colorimétricos que permitan la cuantificación del polyP en el plasma. Se espera que los kits apropiados incluyan, pero no estén limitados a, medios para preparar el crioprecipitado de plasma y para separar la fracción proteica, medios para detectar y/o cuantificar polyP, y también muestras control de polyP para comparar con los valores obtenidos.