本発明の標的RNAの検出・定量方法としては� ��以下の(a)~(j)の工程を備えた方法であれば特 に制限されず、標的RNAとは、同定及び/又は� �量の対象となるRNAを意味し、後述するよう� �、16SrRNA中の菌特異的なRNA鎖等を好適に例示� ��ることができる。
(a)標的RNAの5’側標的特異的配列に相当するDN A配列を含むプライマーの5’末端を基板表面� ��固定させ、固相DNA(+)プライマーを調製する� ��程;
(b)標的RNAの3’側配列と相補的なcDNA配列を含� ��プライマーの5’末端側にRNAポリメラーゼプ ロモーター配列を付加し、液相cDNA(-)プライ� �ーを調製する工程;
(b’)必要に応じて、タグ配列の5’末端にRNA� �リメラーゼプロモーター配列を付加した液� �ユニバーサルプライマーを調製する工程;
(c)標的RNAの3’側配列と5’側標的特異的配列� ��を含む試料RNAを調製する工程; 
(d)工程(b)で調製された液相cDNA(-)プライマー� �、工程(c)で調製された試料RNA鎖とを液相で� �触させ、液相cDNA(-)プライマーと試料RNAとを� ��イブリダイズさせ、次いで逆転写酵素によ� ��DNA(-)鎖を伸長させてcDNA鎖-RNA鎖複合体を調� �する工程;
(e)工程(d)で調製されたcDNA鎖-RNA鎖複合体に、D NA鎖-RNA鎖複合体におけるRNA鎖を特異的に分解 するRNA分解酵素を作用させ、一本鎖DNA(-)を調 製する工程;
(f)工程(e)で調製された一本鎖DNA(-)と、工程(a) で調製された固相DNA(+)プライマーとを液相で 接触させ、一本鎖DNA(-)と固相DNA(+)プライマー とをハイブリダイズさせ、次いでDNA依存性DNA ポリメラーゼ活性能を有する酵素によりDNA(+) 鎖を伸長させて二本鎖DNAを調製する工程;
(g)工程(f)で調製された二本鎖DNAにRNAポリメラ ーゼを作用させ、DNA(-)鎖由来のRNAポリメラー ゼプロモーター配列を利用して、一本鎖RNA(-) を増幅させ、増幅した一本鎖RNA(-)と固相DNA(+) プライマーとをハイブリダイズさせ、次いで 逆転写酵素によりDNA(+)鎖を伸長させてcDNA鎖-R NA鎖複合体を調製する工程;
(h)工程(g)で調製されたcDNA鎖-RNA鎖複合体に、D NA鎖-RNA鎖複合体におけるRNA鎖を特異的に分解 するRNA分解酵素を作用させ、固相一本鎖DNA(+) を調製する工程;
(i)工程(h)で調製された固相一本鎖DNA(+)と、工 程(b)で調製された液相cDNA(-)プライマー、又� �工程(b’) で調製された液相ユニバーサルプ ライマーとを液相で接触させ、一本鎖DNA(+)と 液相cDNA(-)プライマー又は液相ユニバーサル� �ライマーとをハイブリダイズさせ、次いでDN A依存性DNAポリメラーゼ活性能を有する酵素� �よりDNA(-)鎖を伸長させて、二本鎖DNAを調製� �る工程;
(j)工程(f)及び工程(i)で調製された二本鎖DNAを 定量する工程;

 上記工程(c)における試料としては、微生物� ��動物、植物等の細胞や組織等のRNA、例えば� ��原核生物における16SrRNAや23SrRNA、真核生物� �おける18SrRNAや28SrRNA等のrRNA、mRNAなどのRNAを� ��むものであれば特に制限されず、また、細� ��溶解液等の生体試料や、生体試料から得ら� ��た培養物やRNA増幅から得られた合成RNAも含� ��れる。これらの中でも、遺伝子の長さが適� ��であり、細胞内に大量に存在し、配列の保� ��性が高い一方で比較的変異しやすい部位も� ��在することが明らかとなっている原核生物� ��おける16SrRNAや、真核生物における18SrRNAを� �適に例示することができる。また、上記微� �物としては、原因菌の特定が困難な肺炎の� �原菌、MRSAの他、クラミジア、リケッチア等� ��養困難な病原微生物を例示することができ� ��。そして、
標的RNAの5’側配列と3’側標的特異的配列と� ��含む試料RNAを調製するとは、試料からチオ� ��アン酸グアニジンや市販のキットなどを用� ��てRNAを抽出したり、抽出したRNAを適宜切断� ��理をして、1又は複数の標的RNAの5’側配列� �3’側標的特異的配列とを含むRNAを調製する� ��とを意味するが、これら標的RNAを含まない� ��合であっても、便宜上試料RNAの調製に含ま� ��る。

 上記工程(a)における標的RNAの5’側標的特異 的配列としては、標的RNAの5’側に存在し、� �料に含まれる標的RNAを他のRNAと区別して検� �・定量することができる標的RNAに特異的な� �列であれば特に制限されず、かかる標的RNA� �5’側配列の選択においては、公知のデータ� ��ースを有利に用いることができる他、検出� ��象となる特定の菌株のRNAを鋳型として、プ� ��イマーを用いてPCR法にて増幅し、増幅断片� ��市販の精製カラム(QIAGEN社製)等で精製後、4� ��ダイターミネーター法によるシークエンス� ��ABI PRIZM ^TM  377 Genetic Analyzer (P.E.Biosystems社製)等で配列 を決定し、その配列情報から標的RNAの5’側� �列を選択することもできる。

 標的RNAの5’側標的特異的配列として、具体 的には、配列表の配列番号1で示される肺炎� �鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)の16SrRNAをコード� ��る遺伝子領域の転写開始部位を1位とした場 合の202位~223位の塩基配列や、配列番号2で示� ��れるインフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)の1 6SrRNAをコードする遺伝子領域の転写開始部位 を1位とした場合の165位~187位の塩基配列や、� ��列番号3で示される肺炎マイコプラズマ(mycop lasmapneumoniae)の16SrRNAをコードする遺伝子領域� ��転写開始部位を1位とした場合の1225位~1245位 の塩基配列や、配列番号4で示される肺炎ク� �ジミア(Chlamydia
pneumoniae)の16SrRNAをコードする遺伝子領域の転 写開始部位を1位とした場合の994位~1017位の塩 基配列や、配列番号5で示されるレジオネラ� �(Legionella spp.)の16SrRNAをコードする遺伝子領� ��の転写開始部位を1位とした場合の436位~459� �の塩基配列や、配列番号6で示される肺炎桿� ��(Klebsiella pneumoniae)の16SrRNAをコードする遺伝 子領域の転写開始部位を1位とした場合の52位 ~71位の塩基配列や、配列番号7で示される緑� �菌(P.aereruginosae)の16SrRNAをコードする遺伝子� �域の転写開始部位を1位とした場合の164位~185 位の塩基配列や、配列番号8で示されるモラ� �セラ菌(Moraxella catarrahalis)の16SrRNAをコードす る遺伝子領域の転写開始部位を1位とした場� �の453位~473位の塩基配列を挙げることができ� ��これらは肺炎の原因菌を特定するための検� ��に好適に用いることができる。

 また、標的RNAの5’側標的特異的配列に相 当するDNA配列とは、標的RNAの5’側のRNA配列� �おけるU(ウリジン)をT(チミン)に代えたDNA配� �をいう。標的RNAの5’側標的特異的配列に相� ��するDNA配列を含むプライマーは、その5’末 端を基板表面に固定させることにより、プラ イマーが固定された基板からなる固相DNA(+)プ ライマーを調製することができる。固相DNA(+) プライマーには、標的RNAの5’側の標的特異� �な配列に相当するDNA配列が存在するため、� �板の部位特異的に標的RNAを特定することが� �き、例えば、複数のウェルを有する基板を� �いる場合、ウェル#1には肺炎連鎖球菌に特異 的配列、ウェル#2にはインフルエンザ菌に特� ��的配列、ウェル#3には肺炎マイコプラズマ� �特異的配列が固定されることになり、各ウ� �ル毎の工程(j)における二本鎖DNAの定量結果� �ら、標的RNAの検出・定量が可能になる。こ� �ように、独立したウェルの底面に1種のみを� ��定した場合、反応液(増幅試薬,キメラプラ� �マー,ユニバーサルプライマー,試料RNAの混合 液)が共通であっても、遺伝子増幅が対応し� �ウェルの中でのみ行なわれることになり、� �的RNAの検出・定量が可能になる。

 プライマーと基板表面との親和性を高め� ��ために、上記プライマーのDNA配列の5’側に おいて、リンカー部を導入することもでき、 導入されるリンカー部としては、例えば、基 板表面上に活性エステル基がある場合には、 該活性エステル基との反応性を高め、効率よ くかつ強固に基板の表面上に固定することが できる点で、アミノ基が好ましい。また、基 板の材質としては、水不溶性でプライマーを 結合することができるものであれば特に制限 されず、直鎖状ポリオレフィン樹脂、環状ポ リオレフィン樹脂、含フッ素樹脂等を挙げる ことができるが、耐薬品性、低蛍光性、透明 性及び成形性に優れている点で、環状ポリオ レフィンを用いることが好ましい。

 また、基板の形状としては、複数種類の� ��酸を同時に定量することができる形状であ� ��ば特に制限されず、フィルム状やチューブ� ��やプレート状の基板を挙げることができる� ��、具体的には96ウェル等のマルチプレート� �好適に挙げることができる。上記基板がマ� �チプレート状である場合には、基板の表面� �、微細加工により小さなマイクロプレート� �構造とすることが好ましい。この場合、基� �表面に複数の凹部を形成し、この凹部にて� �相プライマーを固定することが、凹部を形� �することで、工程(g)において合成された一� �鎖RNA(-)が、効率よく固相DNA(+)プライマーと� �イブリダイズすることが可能となる点で好� �しい。凹部に関しては、深さ150~250μm、底部� ��径0.5~1.5mmのウェルとすることが好ましい。

 基板表面にプライマーを固定する態様と� ��ては特に制限されるものではなく、例えば� ��共有結合、イオン結合、物理的吸着、ゲル� ��固相プライマーを結合させる態様等を挙げ� ��ことができるが、例えば、共有結合を好適� ��示すことができ、具体的には、用いられる� ��板の表面に、リン脂質の親水部を構成する� ��ン酸エステルより誘導される基を有する第� ��単位と、カルボン酸誘導基を有する第二単� ��とを含む高分子物質が基板表面に存在する� ��合に、この高分子物質に含まれる活性エス� ��ル基の一部がアミノ基が5’側にリンカーと して導入されているプライマーと反応して、 プライマーの間で共有結合が形成される方法 を挙げることができる。ここにおいて、第一 単位は、プライマーの非特異的吸着を抑制す る役割を果たし、第二単位は、第二単位に含 まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学 的に固定化する役割を果たし、プライマーは 、この高分子物質からなるコーティング層の カルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当 該基板の表面に固定化される。

 固相プライマーを共有結合により固定す� ��場合、工程(g)においてDNA(-)鎖由来のRNAポリ� ��ラーゼプロモーター配列を利用して産生さ� ��た一本鎖RNA(-)が固相DNA(+)プライマーに捕捉� ��れやすくするために、また、固相プライマ� ��を起点として工程(f)で作製された一本鎖DNA( -)が固相DNA(+)プライマーに結合しやすくする� ��めに、図1(a)に示すようにプライマーを立て て固定することが好ましく、かかる固相プラ イマーを固定する方法としては、例えば、プ ライマーを溶解又は分散した溶液により展着 する方法を挙げることができ、プライマーが ウェル内の基板表面から突き出ている状態に することができる点で、プライマーを溶解又 は分散した溶液のpHとしては、中性からアル� ��リ性であることが好ましく、pH7.6以上がよ� �好ましく、具体的にはTEバッファー(pH8.0)等� �挙げることができる。

 また、展着後、基板表面に固定化されな� ��ったプライマーを除去するため、純水や緩� ��液等で洗浄するのが好ましい。洗浄後はプ� ��イマーを固定化した以外の基板表面の活性� ��ステルの不活性化処理をアルカリ化合物、� ��るいは一級アミノ基を有する化合物で行う� ��が好ましく、上記アルカリ化合物としては� ��水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸� ��トリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水� ��二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化� ��グネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リ� ��ウム、リン酸カリウム等を挙げることがで� ��、上記一級アミノ基を有する化合物として� ��、例えばグリシン、9-アミノアクアジン、� �ミノブタノール、4-アミノ酪酸、アミノカプ リル酸、アミノエタノール、5-アミノ2,3-ジヒ ドロー1,4-ペンタノール、アミノエタンチオ� �ル塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、2-(2- アミノエチルアミノ)エタノール、リン酸二� �素2-アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、 4-(2-アミノエチル)モルホリン、5-アミノフル� ��レセイン、6-アミノヘキサン酸、アミノヘ� �シルセルロース、p-アミノ馬尿酸、2-アミノ- 2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール、5- アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノ フェノール、2-アミノオクタン、2-アミノオ� �タン酸、1-アミノ2-プロパノール、3-アミノ-1 -プロパノール、3-アミノプロペン、3-アミノ� ��ロピオニトリル、アミノピリジン、11-アミ� ��ウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノ� ��ノリン、4-アミノフタロニトリル、3-アミノ フタルイミド、p-アミノプロピオフェノン、� ��ミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が� ��げることができる。これらのうち、アミノ� ��タノール、グリシンを挙げることができる� ��

 また、本発明において用いられる固相プラ� ��マーの基板への固定を確実にするためには� ��洗浄後、75~85℃にて1時間加熱し、加熱処理� ��後、120mJ/cm ² のUVを照射することにより、プライマーを更� ��固定化することがより好ましい。

 上記工程(b)における標的RNAの3’側配列と しては、標的RNAの3’側に存在する配列であ� �ば特に制限されず、3’側の標的特異的な配� ��であってもよいが、複数種の標的RNAに共通� ��る配列(共通保存領域など)を含むプライマ� �とすることで、複数種の標的RNAを検出・定� �する場合、共通の液相キメラプライマー等� �液相cDNA(-)プライマーを用いることができ、� ��の作製が簡便となり有利である。例えば、� ��相cDNA(-)プライマーの種類の増加は非特異的 反応を引き起こすおそれがあるため、可能な 限り試料におけるRNA配列の共通領域配列、例 えば、検出・定量に使用する菌の16SrRNA配列� �共通領域配列を選択して、液相cDNA(-)プライ� ��ーを設計することが好ましく、具体的には� ��配列表の配列番号9で示される肺炎連鎖球菌 や、インフルエンザ菌や、レジオネラ菌や、 肺炎桿菌や、緑膿菌や、モラキセラ菌の16SrRN Aをコードする遺伝子領域の転写開始部位を1� ��とした場合の502位~519位の塩基配列や、配列 表の配列番号10で示される肺炎マイコプラズ� ��や肺炎クラジミアの16SrRNAをコードする遺伝 子領域の転写開始部位を1位とした場合の1378� ��~1392位の塩基配列を挙げることができ、こ� �らは肺炎の原因菌を特定するための液相cDNA( -)プライマー作製に有利に用いることができ� ��。

 また、標的RNAの3’側配列と相補的なcDNA� �列を含むプライマーの5’ 末端側にRNAポリ� �ラーゼプロモーター配列を付加すると液相cD NA(-)プライマーを調製することができるが、� ��的RNAの3’側配列と相補的なcDNA配列を含む� �ライマーの5’ 末端側に、タグ配列を介し� �、RNAポリメラーゼプロモーター配列が付加� �れた液相キメラプライマーとすることが好� �しい。上記液相cDNA(-)プライマー、好ましく� ��液相キメラプライマーは工程(d)で用いられ� ��工程(i)においては液相ユニバーサルプライ� ��ーが好適に用いられる。液相ユニバーサル� ��ライマーは工程(d)で使用することはできな� ��が、工程(i)においては液相ユニバーサルプ� ��イマーが用いられるとき、工程(b’)は必須� ��程となり、工程(b’)における液相ユニバー� ��ルプライマーは、タグ配列の5’ 末端にRNA� ��リメラーゼプロモーター配列を付加するこ� ��により調製することができる。また、液相� ��ニバーサルプライマーにおけるRNAポリメラ� ��ゼプロモーター配列は、液相cDNA(-)プライマ ーにおけるRNAポリメラーゼプロモーター配列 と同じであっても異なっていてもよい。

 標的RNAの3’側配列を有さない液相ユニバ ーサルプライマーは、共通配列(タグ配列の5� ��末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列が� ��らに付加された配列)を有することから、標 的RNAの相違の如何に関わらず、3’側配列の� �違による遺伝子増幅効率を統一することが� �きる。例えば、液相キメラプライマーの混� �量をRNA増幅反応が起こる限界まで減らし、� �わりに液相ユニバーサルプライマーの量を� �加させると、増幅反応が液相ユニバーサル� �ライマーのみの反応に置き換わり、プロモ� �ター配列にRNAポリメラーゼが結合すること� �よりRNA増幅が行なわれるようになり、3’側� ��列の相違による遺伝子増幅効率を統一する� ��とができる。したがって、工程(i)で液相ユ� ��バーサルプライマーを用いるときは、液相� ��ニバーサルプライマーの濃度を、液相キメ� ��プライマー等の液相cDNA(-)プライマーの濃度 の10倍以上、例えば10~100倍にすることが好ま� ��い。

 上記液相キメラプライマーや液相ユニバー� ��ルプライマーにおけるプロモーター配列と� ��ては、該プロモーターを介して特異的にRNA� ��増幅することができるRNAポリメラーゼが存� ��するプロモーター配列であることが好まし� ��、公知のものを適宜選択して用いることが� ��きるが、例えば、T7ポリメラーゼのプロモ� �ター配列(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’)[配列番� �11]、T3RNAポリメラーゼのプロモーター配列(5� ��-TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3’)[配列番号12]、SP6RNA� �リメラーゼのプロモーター配列(5’-ATTTAGGTGAC ACTATAGAATAC-3’)[配列番号13]等を挙げることが� �き、なかでもT7ポリメラーゼのプロモーター 配列が、高いRNA増幅効率の点で好ましい。液 相cDNA(-)プライマーは、DNA合成装置を用いて� �法により合成することができる。また、プ� �モーター配列として標識化プロモーター配� �を有利に用いることができ、この標識を利� �して工程(j)における二本鎖DNAの検出・定量� �簡便に実施することができる。かかる標識� �するための標識物質としては、ペルオキシ� �ーゼ(例えば、horseradish peroxidase)、アルカリ� ��ォスファターゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、� �ルコースオキシダーゼ、グルコ-ス-6-ホスフ� ��ートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素� ��素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ� ��カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ� ��ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセ� ��ルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレ� ��セインイソチオシアネート、フィコビリタ� ��パク、希土類金属キレート、ダンシルクロ� ��イド若しくはテトラメチルローダミンイソ� ��オシアネート等の蛍光物質、 ³ H
、 ¹⁴ C、 ¹²⁵ I若しくは ¹³¹ I等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、� �は化学発光物質を挙げることができる。例� �ば、ビオチン化プロモーター配列を用いる� �合、アビジンあるいは酵素修飾アビジンを� �いて定量することができる。例えば、ビオ� �ンの基質としてストレプトアビジン-β-ガラ� ��トシダーゼを用いる場合には、発色物質と� ��て4-メチル-ウンベリフェリル-β-D-ガラクト� ��ド(4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactoside)を用いるこ とができ、また、ビオチンの基質としてスト レプトアビジン-アルカリフォスファターゼ� �用いる場合には、発色物質として5-ブロモ-4- クロロ-3インドール-リン酸と4-ニトロブルー� ��トラゾリウムクロライドの相互作用により� ��じる青色の不溶性化合物を観察することに� ��り定量することができる。

 上記液相キメラプライマーや液相ユニバ� ��サルプライマーにおけるタグ配列としては� ��3’側配列やRNAポリメラーゼプロモーター配 列とハイブリダイズしない配列が好ましく、 1~20塩基、好ましくは5~15塩基からなり、AGに� �んだ配列が好ましく、具体的には、AGAAGGやAG AAGGに更にAGに富んだ任意の7塩基を付加した� �列、例えばAGAAGGAGCAGGA[配列番号14]等を例示す ることができる。

 本発明において、固相DNA(+)プライマーと� ��相cDNA(-)プライマープライマーとで構成され るプライマーセットを用いることにより増幅 される塩基対数は、鋳型とする核酸の塩基配 列や用いるポリメラーゼの活性等を考慮して 適宜設定することができるが、長すぎると増 幅精度が落ちるおそれがあるため、例えば、 50~500塩基対長とすることが好ましい。

 以下、工程(d)では液相キメラプライマー� ��用い、工程(i)では液相ユニバーサルプライ� ��ーを用いる標的RNAの検出・定量方法におけ� ��工程(d)~(j)を図1,2及び図6を参照しながら説� �する。図1,2は、標識試薬の存在下で無標識� �液相ユニバーサルプライマーを用いる方法� �示し、図6は標識化液相ユニバーサルプライ� ��ーを用いる方法を示す。以下の説明からも� ��かるように、工程(d)~工程(j)は一の反応液中 で行うことができる。

 工程(d)は、工程(b)で調製された液相キメ� ��プライマーと、工程(c)で調製された試料RNA� ��とを液相で接触させ、液相と試料RNAとをハ� ��ブリダイズさせ、次いで試料に含まれるRNA� ��を鋳型として逆転写酵素によりcDNA(-)鎖を5� �側から3’側へと伸長させてcDNA鎖-RNA鎖複合� �を調製する工程であり、例えばデオキシヌ� �レオチドの存在下、逆転写酵素を作用させ� �ことにより、cDNA鎖-RNA鎖複合体を合成するこ とができる。上記逆転写酵素としては、AMV(Av ian Myeloblastosys Virus)から精製されるAMV逆転写 酵素、又は、M-MLV(Molony MurineLeukemia Virus)逆転 写酵素の組換え体クローンを発現する大腸菌 から精製されたM-MLV逆転写酵素等を挙げるこ� ��ができるが、M-MLV逆転写酵素よりも高い伸� �活性をもち、かつ活性温度が高いAMV逆転写� �素を用いることが好ましい。反応温度は、� �用する各酵素を考慮して適宜決定すること� �できるが、例えば、40℃~42℃が好ましい。図 1(a)に示すように、基板1の表面1aに固相プラ� �マー2を固定した後上記反応が開始される(図 1(b)及び(c)参照)。また、図6i)には、標的RNAの3 ’ 側にハイブリダイズした液相キメラプラ� ��マーが、図6ii)には、逆転写により合成され たcDNA鎖-RNA鎖複合体が示されている。

 工程(e)は、工程(d)で調製されたcDNA鎖-RNA� �複合体に、DNA鎖-RNA鎖複合体におけるRNA鎖を� ��異的に分解するRNA分解酵素を作用させ、一� ��鎖DNA(-)を調製する工程であり、工程(e)で使� ��するRNA分解酵素としては、RNAポリメラーゼ� ��活性を阻害することなく、DNA鎖-RNA鎖複合体 におけるRNA鎖を特異的に分解するRNA分解酵素 を用いることが望ましく、具体的には、RNaseH を好適に例示することができる。反応の模式 図を図1(d)や、図6iii)に示す。

 工程(f)は、工程(e)で調製された一本鎖DNA( -)と、工程(a)で調製された固相DNA(+)プライマ� ��とを液相で接触させ、一本鎖DNA(-)と固相DNA( +)プライマーとをハイブリダイズさせ、次い� ��一本鎖DNA(-)を鋳型として、DNA依存性DNAポリ� ��ラーゼ活性能を有する酵素によりDNA(+)鎖を5 ’側から3’側へと伸長させて二本鎖DNAを調� �する工程であり、例えばデオキシヌクレオ� �ドの存在下、DNAポリメラーゼ活性を有する� �素を反応させることにより、二本鎖cDNAを合� ��する方法を挙げることができる。上記DNAポ� ��メラーゼ活性能を有する酵素としては、DNA� ��存性DNAポリメラーゼ活性能を有する酵素で� ��ることが必要であり、5″-又は3″-のエキソ ヌクレアーゼ活性のようなデオキシリボヌク レアーゼ(DNase)活性のないものが好ましい。� �た、上記AMV逆転写酵素のようにDNA依存性DNA� �リメラーゼ活性能を併せ持つ酵素を既に上� �工程(d)にて用いている場合は、DNAポリメラ� �ゼ活性能を有する酵素を添加する必要はな� �。反応の模式図を図1(e)や、図6iv)に示す。

 工程(g)は、工程(f)で調製された二本鎖DNA� ��RNAポリメラーゼを作用させ、DNA(-)鎖由来のR NAポリメラーゼプロモーター配列を利用して� ��一本鎖RNA(-)、すなわち、アンチセンスRNAを� ��幅させ、増幅した一本鎖RNA(-)の3″側と固相 DNA(+)プライマーとをハイブリダイズさせ、次 いでデオキシヌクレオチドの存在下、逆転写 酵素によりDNA(+)鎖を伸長させてcDNA鎖-RNA鎖複� ��体を調製する工程であり、図2(a)に二本鎖cDN A6上に存在するプロモーター配列8を介して一 本鎖RNA9を合成し、固相DNA(+)プライマー2とハ� ��ブリダイズさせる反応の模式図が示されて� ��り、また、図6iv)とv)にアンチセンスRNAが増� ��している様子が、図6vi)に増幅したアンチセ ンスRNAと固相DNA(+)プライマーがハイブリダイ ズしている様子が、図6vii)にcDNA鎖-RNA鎖複合� �がそれぞれ示されている。

 工程(h)は、工程(g)で調製されたcDNA鎖-RNA� �複合体に、DNA鎖-RNA鎖複合体におけるRNA鎖を� ��異的に分解するRNA分解酵素を作用させ、固� ��一本鎖DNA(+)を調製する工程であり、上記RNA� ��解酵素としては前記RNaseHを好適に例示する� ��とができる。図2(b)に固相DNA(+)プライマー2� �介してcDNA鎖(+)10を合成し、cDNA鎖-RNA鎖複合体 を作製した後、このcDNA鎖-RNA鎖複合体のRNA鎖� ��分解して、一本鎖cDNA10を得る反応が示され� ��おり、また、図6viii)にcDNA鎖-RNA鎖複合体のRN A鎖が分解している様子が示されている。

 工程(i)は、工程(h)で調製された固相一本� ��DNA(+)と、工程(b’) で調製された液相ユニ� �ーサルプライマーとを液相で接触させ、一� �鎖DNA(+)と液相ユニバーサルプライマーとを� �イブリダイズさせ、次いでDNA依存性DNAポリ� �ラーゼ活性を有する酵素によりDNA(-)鎖及びDN A(+)鎖をそれぞれ5’から3’側に伸長させて、 二本鎖DNAを調製する工程であり、上記酵素し ては工程(f)で用いた酵素をそのまま利用する ことができる。この工程(i)で、液相ユニバー サルプライマーの量を工程(d)の液相キメラプ ライマーに比べて10倍以上に増加させておく� ��とで、増幅反応が液相ユニバーサルプライ� ��ーのみの反応に置き換わり多種類の遺伝子� ��同時増幅を目的とする場合にすべての液相� ��メラプライマーがユニバーサルプライマー� ��置き換わることになり定量性のある反応が� ��現できる。図2(c)にcDNA鎖10を液相プライマー 3bとハイブリダイズさせる反応が示され、ま� ��図6ix)に一本鎖DNA(+)と標識化液相ユニバーサ ルプライマーとがハイブリダイズしている様 子が、図6x)に標識化二本鎖DNAが示されている 。

 上記工程(g)~工程(i)を2回以上繰り返すこ� �が定量精度を高める上で好ましく、前記の� �うに、工程(d)~工程(i)は同一の反応液中で行� ��れるので、反応時間等の反応条件を調節す� ��ことで、工程(g)~工程(i)は特別な操作をする ことなく2回以上繰り返されることになる。� �6x)に工程(i)に続けて工程(g)の一本鎖RNA(-)及� �DNA(+)鎖が増幅されている様子が示されてい� �。

 工程(j)は、工程(f)及び工程(i)で調製され� ��二本鎖DNAを定量する工程であり、合成され� ��二本鎖DNAを検出、定量する方法としては特� ��限定されるものではなく、二本鎖DNAを標識� ��る標識試薬を反応液中に加えておく方法や� ��デオキシヌクレオチドを予め標識する方法� ��、液相ユニバーサルプライマーや液相キメ� ��プライマーにおけるプライマー配列を標識� ��しておく方法等公知の方法を挙げることが� ��きる。また、リアルタイムPCR等により、定� ��に用いた蛍光色素の蛍光量を、経時的に測� ��することも可能である。このようにして得� ��測定値を積算することにより、得られたDNA� ��幅産物を定量することができる。

 上記標識試薬としては、二本鎖DNAを標識� ��る公知のものを用いることができ、例えば� ��蛍光色素や発色試薬を挙げることができる� ��具体的には、例えば、二本鎖DNA間に取り込� ��れるインターカレーターであるSYBER Green(タ カラバイオ社製)を挙げることができる。例� �ば、SYBER Greenを反応溶液中に加えることで� �基板上で二本鎖DNAが形成されるときにSYBER G reenが取り込まれ、簡便に標識することが可� �である。標識試薬としてSYBER Greenを用いた� �合、マイクロアレイ・スキャナーを用いて� �485nmの励起光で、525nmの蛍光を経時的に観察� ��ることが好ましい。また、二本鎖DNA間に取� ��込まれるエチジウムブロマイドを用いて、U Vで発色させて二本鎖DNAを検出することもで� �る。

 また、デオキシヌクレオチドを予め標識� ��ておく方法としては、例えば、FITCやローダ ミン、Cy3やCy5などのサイアニン等の蛍光色素 により標識する方法を挙げることができ、さ らに、ビオチンやジゴキシゲニン、RI等で標� ��し、アルカリフォスファターゼやペルオキ� ��ダーゼ等の発色試薬によって発色させる方� ��を挙げることができる。これら標識された� ��オキシヌクレオチドは、基板上における二� ��鎖DNAの形成に用いられるため、形成された� ��本鎖DNAを簡便に標識することができる。例� ��ば、ビオチン標識dUTPを用いて二本鎖DNAを検 出・定量する場合には、各反応溶液に[表1]に 示されるビオチン標識するための酵素反応溶 液と、[表2]に示されるCy3ラベル化反応を行う ための試薬とを用い、37℃で15分間反応させ� �ことが好ましい。

 上記工程(d)~(j)においては、工程ごとに上 記記載の酵素等を添加してもよいが、全工程 に必要となる試薬を予め一の反応溶液として 調製し、基板に導入することがより好ましい 。前記のように、上記工程(g)~(i)は繰り返し� �行われ、二本鎖DNAが合成されるが、繰り返� �ごとに、RNA分解酵素、DNAポリメラーゼ等の� �素を新たに反応系に添加する必要がなく、DN A断片の複製・増幅を速やかに且つ簡単に行� �ことができる。そして、基板に反応溶液を� �入するには、基板上に設けられた複数の凹� �を全て覆うことが可能なカバーを基板に被� �、表面張力によって反応溶液を各凹部に導� �することが好ましい。また、カバーを用い� �ことで、反応溶液を分注する手間が省ける� �かりでなく、コンタミネーションの抑制や� �反応溶液の総量を軽減することができ、低� �スト化が図られる。また該カバーは、標識� �薬の検出が容易となるように透明であるこ� �が好ましい。

 本発明の標的RNAの検出・定量方法により� ��微量な試料RNAからも基板上に形成された二� ��鎖DNAを定量することが可能となり、単一又� ��複数種類の標的RNAを同一基板上で簡便に定� ��することが可能となる。また、本発明の標� ��RNAの検出・定量方法を用いて、1又は複数種 類の病原微生物を検出・定量する場合、検出 の際に培養を必要としないことから、特に通 常の手法では培養できないような微生物等を 簡便かつ迅速に検出することができるので、 病原微生物由来のRNAを検出する際にも有効で 、更に、簡便にマルチプレックスを行えるの で、1の試料から複数種類の病原微生物由来� �RNAを一度に簡便に定量することができる。

 本発明のRNAの検出・定量キットとしては� ��標的RNAの5’側標的特異的配列を含むプライ マーの5’ 末端を基板表面に固定させた固相 DNA(+)プライマー、標的RNAの3’側配列と相補� �なcDNA配列を含むプライマーの5’ 末端側にR NAポリメラーゼプロモーター配列を付加した� ��相cDNA(-)プライマーと、逆転写酵素、RNAポリ メラーゼ、DNA鎖-RNA鎖複合体におけるRNA鎖を� �異的に分解するRNA分解酵素とを備えたキッ� �であれば特に制限されず、上記液相cDNA(-)プ� ��イマーが、標的RNAの3’側配列と相補的なcDN A配列を含むプライマーの5’ 末端側に、タ� �配列を介して、RNAポリメラーゼプロモータ� �配列が付加された液相キメラプライマーで� �ることが好ましく、さらに、タグ配列の5’� �末端にRNAポリメラーゼプロモーター配列を� �加した液相ユニバーサルプライマーを備え� �ものが好ましい。また、上記プライマー配� �がビオチン化プロモーター配列等の標識化� �ロモーター配列であるものや、蛍光色素等� �標識試薬を含むものが好ましい。さらに、� �らに、DNA依存性DNAポリメラーゼを含ませて� �くこともできる。本発明のRNAの検出・定量� �ットを用いると、16SrRNA中の菌特異的なRNA鎖� ��の標的RNAを簡便かつ迅速に検出・定量する� ��とができる。

 以下、実施例により本発明をさらに具体的� ��説明するが、本発明は以下の実施例に限定� ��れるものではない。
 (参考例1)
 液相ユニバーサルプライマーを用いた標的R NAの定量的検出
 NASBA法を行い、標的RNA配列を有するRNAの定� �が行えるかどうかを検討した。標的RNAとし� �は、H.influenzaeから抽出したRNAを用い、ネガ� �ィブコントロールとしては、20塩基対からな るポリT配列を用いた。また、標的RNAに対す� �プライマーとして、フォワードプライマー� �はH.influenzaeの16SrRNA遺伝子の165位~187位の塩基 配列に相同的な塩基配列を有するDNAを用いた 。また、リバースプライマーとしては16SrRNA� �伝子の502位~519位の塩基配列に相補的な塩基� ��列を有し、その5’側に13塩基からなるタグ� ��列(AGAAGGAGCAGGA)、さらにタグ配列の5’側にプ ロモーター配列を付加したものを用いた。該 プロモーター配列に関しては、T7RNAポリメラ� ��ゼのプロモーター配列(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCG A-3’)を用いた。ユニバーサルプライマーと� �ては、13塩基からなるタグ配列(AGAAGGAGCAGGA)の 5’側にT7RNAポリメラーゼのプロモーター配列 を付加したものを用いた。

 まず、チューブの表面に活性エステルを有� ��るポリマーをコートし、固相プライマーと� ��て、フォワードプライマーの5’末端に導入 したアミノ基との結合機能を付与した。次に 、H.influenzaeの抽出RNAを緩衝液(50mM Tris-HCl,pH8.3 、6mM MgCl2、40mM KCl)に懸濁し、該RNAが10 ⁴ 、10 ⁵ 、10 ⁶ 、10 ⁷ 、10 ⁸ 、10 ⁹ コピー含まれるように溶液をそれぞれ調製し た。NASBA試薬専用マスターミックス10μl(Biomeru 社製)に0.05μMの本発明の液相キメラプライマ� ��、2μMの本発明の液相ユニバーサルプライマ ー、及びSYBER Green(タカラ社製)1000pgを混合し� ��30秒間95℃で加熱した。その後、5分間65℃で 静置して、抽出RNA溶液を調製した。次に、上 記抽出RNA溶液に、10mM DTT、40ユニットのAMV逆� ��写酵素、0.4ユニットのRNaseH、20ユニットのT7 RNAポリメラーゼの酵素混合液(Biomeru社製)を5μ l添加し、最終容量が20μlの反応溶液を調製し た。その後、41℃に設定した恒温槽に各チュ� ��ブを設置して、NASBA法によりRNAを増幅した� �次にNASBA法により増幅されたH.influenzaeのRNAが 、定量的に増幅されたかを確認するため、増 幅産物(RNA)の電気泳動を行い確認した。この� ��果を図3に示す。図3において、横軸は塩基� �、縦軸は蛍光強度を示している。図3より、� ��型となったゲノムのコピー数が増加するに� ��れ、RNA増幅産物(368nt)の蛍光強度の増加が観 察された。即ち、標的RNAが定量的に増幅され たことが確認できた。

 (参考例2)
 固相DNA(+)プライマーの最適固定量
 次に固相DNA(+)プライマーの固定すべき量を� ��討するため、H.influenzaeに対応する固相プラ� ��マーの量を1.25μM、2.5μM、5μM、10μMとして、 固定用のスポッティング溶液(住友ベークラ� �ト社製)に溶解させ、この1μlを各チューブに 滴下した。滴下後、各チューブを80℃で1時間 保温し、これを検出用のチューブとした。そ の後、10 ⁸ コピーのH.influenzaeの抽出RNAと、上記検出用チ ューブとを用いた反応溶液を調整し、NASBA法� ��よりRNAを増幅した。また、ネガティブコン� ��ロールとしては、20塩基対からなるポリT配� ��を用いた。RNA増幅の際、1分ごとに485nmの励� ��光で525nmの蛍光を60分間測定して増幅された DNAを経時的に検出し、最適なプライマーの量 を決定した。この結果を図4に示す。図4にお� ��て、横軸は時間、縦軸は蛍光強度を示して� ��る。図4より、チューブに固定するプライマ ーの量が1.25μMの際に、最も効率よく標的核� �の増幅が観察された。