本发明涉及基因工程技术领域， 具体地说， 涉及一种利用锌指核 酸酶敲除牛 β -乳球蛋白基因的方法。 背景技术

基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息 的技术，常规基因 打靶动物生产的两大限制因素为： 第一， 动物体细胞基因打靶效率很 低， 10· ⁶ ~ 10· ⁷ ; 第二， 生产双等位基因敲除的动物时间周期长， 克隆 效率低。 伴随着分子生物学的不断发展， 涌现出很多新的技术和方法 来提高基因打靶效率， 如釆用无启动子筛选的基因打靶策略， 动物中 干细胞的分离及诱导等。但是这些改进对于生 产基因打靶动物并没有 显著的推动作用， 所以基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶 段。 最近几年， 锌指蛋白核酸酶 （ZFNs ) 的出现极大地提高了基因打靶 的效率， 其将成为生产基因敲除动物的一个重要的突破 口。

牛奶过敏（cow's milk allergy )是小儿最常见的食物过敏类型之 一， 在许多欧美发达国家， 婴儿牛奶过敏发生率约为 2% ~ 3%。 牛奶 过敏是指机体对牛奶蛋白的高反应性 (hypersensitivity^牛奶中含有多 种蛋白质， 其中， α-Sl酪蛋白和 β-乳球蛋白是引起牛奶过敏的主要过 敏源。

Ρ -乳球蛋白是反刍动物如牛、 羊和单胃动物如猪、 马、 猫乳中 的主要乳清蛋白， 人类和啮齿类中基本不存在该蛋白（ Kontopidis等， 2004, LDairy Sci. 87: 785-796 β -乳球蛋白具有凝聚能力和疏水性， 一方面可以作为食品添加剂， 用于甜点、 调味料和涂抹性食品中； 另 一方面， Ρ -乳球蛋白具有较强的视黄醇结合能力和脂肪� �结合能力， 可以用来包含脂溶性维生素用于乳制品、焙烤 食品、运动饮料和营养 增补剂。 利用 β -乳球蛋白的热还原性， 还可以模拟和代替无脂食品 中的动物油， 或者将改良的 β -乳球蛋白应用于酸奶中， 可使普通酸 奶的成胶性提高 6-10倍。

然而 (3 -乳球蛋白功能的研究报道还较少， 尤其是在牛乳中营养 功能的研究方面鲜有报道。 此外， 该蛋白在牛奶中的低量表达或者不 表达对于牛奶过敏是一种有利的缓解措施。 通过基因打靶技术， 将该 基因失活， 是研究其功能和缓解牛奶过敏的一个理想的手 段。

锌指蛋白核酸酶（ ZFNs )融合了 DNA调控元件特异性的结合 DNA 的特性以及内切核酸酶的催化活性， N末端的锌指蛋白能够特异的结 合 DNA序列， 通过 C末端内切核酸酶 Fokl的催化作用， 使得 DNA双链 分子产生断裂（DSB )， 紧接着 DSB就会启动细胞内自身修复机制。 目前主要的修复机制有两种： 一种是非同源重组的末端连接修复机 制， 另一种是同源重组修复机制。 前一种修复机制是一种易错修复常 常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修 复机制来修复 DSB是一 种高保真的修复方式， 一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修 复。 在哺乳动物细胞内， 前一种修复机制占主导作用， 借助 ZFNs特 异性产生 DSB， 引发细胞非同源重组的末端连接修复， 在 DSB位点引 入小片段删除， 或者插入， 造成移码突变， 或者蛋白关键序列的缺失 达到基因敲除目的 （图 1 )。

应用 ZFNs介导基因敲除或者修饰在斑马鱼， 拟南芥等模式生物 中已经成功实现， 并且效率较高 10 - 50% ( Doyon, Y等 , Nat. Biotech.2008, 26: 702-708; Lloyd, A等， PNAS 2005,102:2232-2237 )。 本发明证实了利用 ZFNs在动物体细胞内进行基因的删除或者精细� � 饰是一种行之有效的方法， 能够成功获得基因敲除克隆牛。

常规基因打靶克隆牛的生产流程，包括构建基 因打靶载体， 载体 转染， 细胞药物筛选， 细胞单克隆的鉴定， 体细胞核移植， 克隆牛的 鉴定。 如果需要对第二个等位基因也进行敲除， 需要经历上述同样的 过程， 即需要进行两次细胞克隆， 并且最后得到的克隆牛含有药物筛 选时所必须的抗性基因，最后要得到不含有抗 性基因的动物个体还要 经历一次体细胞克隆。 以牛为例完成上述过程需要的时间为： 载体构 建 3个月， 细胞筛选 1个月， 体细胞核移植、 胚胎发育 1个月， 胚胎移 植妊娠到小牛出生 10个月。 这样， 一次克隆至少需要 14个月的时间。 并且在细胞筛选过程中， 有些甚至无法得到阳性单细胞克隆。 如果实 现无抗性基因的基因敲除牛需要进行三次克隆 ，则所需时间就至少需 要 42个月， 周期长、 风险高。 而本研究证明， 利用 ZFNs技术， 可以 在 12个月内得到双等位基因完全敲除并且不含有� ��性基因的克隆牛。 发明内容

本发明的目的是提供一种利用锌指核酸酶敲除 牛 (3 -乳球蛋白基 因的方法。

为了实现本发明目的， 本发明的一种利用锌指核酸酶敲除牛 P - 乳球蛋白基因的方法， 包括如下步骤：

1 )根据牛 β -乳球蛋白基因序列， 设计 ZFNs-Set l和 ZFNs-Set 2, 其作用的 DNA序列分别为：

ZFNs-Set 1： CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA: ZFNs-Set 2： AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATo

2 )构建 ZFNs-Set l和 ZFNs-Set 2的真核表达载体， 所述真核表达 载体是 pBudCE-ZFNl-2， 它的碱基序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示； 可以是 两个独立的 ZFN真核表达载体， 也可以是一个共表达载体。

共表达载体的构建： 将已经鉴定能在牛成纤维细胞系高效介导 BLG基因敲除的一对 ZFNs ( PZFNl/PZFN2 -set 1 )构建到共表达载体 pBudCE4.1(Invitrogen)上， 分别以 PZFN1/PZFN2 -set 1为模板， 以引 物 1、 2和 3扩增 PZFNl/PZFN2 -set 1上的锌指蛋白核酸酶表达元件， 引物 1上含有 Not I酶切位点， 以引物 1、 3扩增 ZFN1 , 将 PCR产物 TA 克隆连接到 simple-T ( TaKaRa )载体上， 测序验证无突变克隆， 通过 Not l和 Xho l双酶切， 将酶切产物连接到 pBudCE4.1载体上， 获得 pBudCE-ZFNl o 引物 2上含有 Sal I酶切位点， 以引物 2、 3扩增 ZFN2 将 PCR产物 TA克隆连接到 simple-T ( TaKaRa )载体上， 测序验证无突 变克隆， 通过 Sai l和 Xba l双酶切， 将酶切产物连接到 pBudCE-ZFNl 载体上， 获得 pBudCE-ZFNl-2， 其碱基序列如 SEQ ID NO: 1所示， 载 体构建参见图 2。 构建完成的锌指蛋白核酸酶共表达载体， 可以同时 表达一对锌指蛋白核酸酶， 两个锌指蛋白核酸酶分别在 CMV和 EF-1 oc强启动子下游， 可以瞬时高效表达该对锌指蛋白核酸酶， 从而介导 BLG基因的敲除。

引物 1： 5 '-ATAAGAATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGG-3 ' 引物 2: 5 '-ACGCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGG-3 ' 引物 3： 5 '-AAACGATCCTCATCCTGTCTCTT-3 ' 3 )将上述表达载体分别转入牛的成纤维细胞中� � PCR产物测序 方法检测 P -乳球蛋白基因发生敲除的细胞。

本发明还提供通过上述方法获得的基因敲除细 胞。

本发明还提供利用锌指核酸酶生产 P -乳球蛋白基因敲除克隆牛 的方法。

本发明还提供一种制备 P -乳球蛋白基因敲除的牛克隆胚胎的方 法， 其以前述的基因敲除细胞为核移植供体细胞， 离体的卵母细胞为 核移植受体细胞， 通过核移植技术获得牛克隆胚胎。

本发明进一步提供一种制备转基因牛的方法， 其是将前述方法制 备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行 妊娠， 获得转基因牛。

本发明首次利用锌指核酸酶 （ZFNs )成功敲除牛成纤维细胞中 的 P -乳球蛋白 ( BLG )基因， 由此获得基因敲除克隆牛， 与常规的 通过基因打靶技术获得克隆牛相比， 利用 ZFNs介导的基因敲除， 在 单细胞克隆中的敲除效率在 15% ~ 40%之间， 而常规的基因打靶效率 仅为 10· ⁶ ~ 10· ⁷ , 效率提高了 10 ⁴ ~ 10 ⁵ ， 为生产基因敲除动物提供了极 大的便利。

另外， 利用 ZFNs介导的基因敲除， 可以实现一次转染， 得到双 等位基因敲除的细胞克隆， 这在常规基因打靶过程中是难以实现的， 省去了药物筛选过程， 有利于细胞单克隆的形成， 避免了细胞需要对 抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植 和胚胎的发育质量起到 了关键作用， 同时不含有抗性基因， 大大简化了生物安全评价过程。 附图说明

图 1为 ZNFs介导 BLG基因敲除示意图。

-… 图 2为 pBudCE-ZFNl-2表达载体构建示意图。

图 3为 ZFNs介导 BLG基因敲除突变类型， 其中 wt为野生型对照， 下划线碱基为插入序列， · · ·为缺失碱基， 括号数字代表缺失或者插 入碱基个数， 上角标为该突变类型重复出现次数。

图 4为发生基因敲除单细胞克隆测序结果峰图， 其中在作用位点 附近出现双峰（下划线部分）表明发生基因敲 除，否则为野生型序列。 图 5为基因敲除牛测序结果， 其中 野生型 BLG对照； B: 克隆 牛 BLG基因测序结果， 15bp删除； C: 克隆牛 BLG基因测序结果， 9bp 删除； B和 C为同一头牛测序结果， 不含有野生型序列， 为双等位基 因敲除。

图 6为 ZFNs-Set 1作用位点在不同物种之间的同源性比较，其� �方 框内为 ZFNs切割位点。 具体实施方式

以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中 ZFNs设计由 Sigma公司完成， 引物合成由上海生工 完成， 序列测定由北京华大完成。 Taq酶、 T4DNA连接酶、 内切酶均 来自大连 TaKaRa公司， 体外转录试剂盒、 mRNA纯化试剂盒均购自 Applied Biosystems公司， 体细胞克隆所用试剂均购自 Sigma公司。 酶 切、 连接、 回收、 转化、 PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克 隆（第三版)》。

实施例 1 ZFN表达载体的筛选及敲除效率

1、 ZFN的筛选

BLG ( NC— 007309.4 )基因序列信息从 NCBI网站中获得， ZFNs 设计由 Sigma公司完成，设计 ZFNs位点位于第 1、 2外显子上。 ZFNs-Set 1和 ZFNs-Set 2 作用于第一外显子上， ZFNs-Set 3作用于第二外显子 上。 它们作用的 DNA序列分别为：

ZFNs-Set 1： CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA: ZFNs-Set 2： AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT; ZFNs-Set 3:CCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGC。

下划线部分分别为锌指蛋白结合序列， 中间部分为 Fokl内切核酸 酶切割位点。对应的三个 ZFNs表达载体分别为： PZFN1/PZFN2 -set 1， PZFN1/PZFN2 -set 2和 PZFN1/PZFN2 -set 3。 三个表达载体在酵母中 都能发挥作用，参考 Doyon等， Nat Biotechnol, (2008) 26(6):702。

在牛的成纤维细胞系中检测三对表达载体是否 能在对应的细胞 基因组 DNA序列发挥切割作用。在 ZFNs位点两侧设计引物， setl/2-F: 5'-AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3';setl/2-R: 5 '-GCAAAGGACACA GGGAGAAG-3';set3-F: 5 '-CAGCCTCACGTAACCTTTGT-3 ' ;set3-R: 5 '-CCTGCCTTACTGTATGTATC-3 \

电转 （ AMAXA公司） 三对 ZFNs的 mR A, 电转参数为 T-016, 转染剂量为 4μ _§ mRNA每 10 ⁶ 个细胞， 电转 24小时后提取总细胞基因 组； 进行细胞 PCR产物回收纯化， 纯化产物测序。 如果 ZFNs发挥切 割作用， 细胞会启动自身修复机制， 在切割位点会出现小片段的删除 或者插入， PCR产物测序结果峰图为杂合峰图， 即该 ZFNs可用于后 续基因敲除。

以 CEL-I酶为主要检测 ZFNs是否发挥作用的依据， CEL-I检测需 要突变类型占据一定比例， 否则不能检出， 本发明证实， 当敲除效率 为 6%时 （TA克隆统计测序结果）， CEL-I检测结果为阴性。

2、 ZFN敲除效率

敲除效率的统计釆用 TA克隆测序的方式计算， 电转 24小时后提 取总细胞基因组； 进行细胞 PCR产物回收纯化， T载体连接， 测序， 序列比对分析， 突变类型与总有效测序总数（野生型与突变型 克隆的 总和） 的比值则为敲除效率。 在三对 ZFNs中， 第一对有较高的敲除 效率 （6.9% ~ 31.24% )， 测序得到多种敲除基因类型 （图 3 )。 第二对 效率较低 （0 - 6% ), 第三对不发挥作用。

3、 ZFN真核表达载体的构建

ZFNs-Set 1和 ZFNs-Set 2 两个锌指酶需要同时表达才能一起发 挥敲除 BLG基因的功能， 因此在构建载体时可以分别构建 ZFNs-Set 1 和 ZFNs-Set 2的真核表达载体， 将两个载体同时转染到细胞中实现两 个锌指酶同时表达， 也可以将 ZFNs-Set 1和 ZFNs-Set 2构建到一个共 表达载体上， 转染到细胞中同时表达两个锌指酶， 共表达载体的优点 在于减少后续细胞转染、检测等操作程序， 能保证同时表达两个锌指 酶。

以下为共表达载体的构建原理： pBudCE-ZFNl-2共表达载体， 碱 基序列如 SEQ ID NO:l所示。 锌指蛋白核酸酶编码部分， 由两部分组 成：结合特异染色体序列的锌指蛋白结合域； 非限制性内切核酸酶 I切割域。 锌指蛋白结合域的设计和构建可参考美国 No.6，453，242和 6,534,261。 本发明 ZFNs设计含有 5个锌指蛋白单体， 可特异结合 15个 碱基对。锌指蛋白的作用机理可参考 miller等（ 1985 ) Μ^ ·/ 4: 1609; Rhodes(1993) Scientific American Feb.:56-65。非限制性内切核酸酶 Fok I切割域，由 IIS型 Fok I内切核酸酶构成， 其作用方式和机理可参考 Li 等（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 89:4375-4279; Li 等（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 90:2764-2768; Kim 等（1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 91 :883-887; 结合域和切割域两部分构成融合表达蛋白， 通 过酶切连接的方法连接到表达载体上。

以下为共表达载体的构建过程：将已经鉴定能 在牛成纤维细胞系 高效介导 BLG基因敲除的一对 ZFNs ( PZFN1/PZFN2 - set 1 )构建到共 表达载体 pBudCE4.1 (Invitrogen)上 , 分别以 PZFN1/PZFN2 -set 1为模 板， 以引物 1、 2和 3扩增 PZFN1/PZFN2 - set l上的锌指蛋白核酸酶表 达元件， 引物 1上含有 Not I酶切位点， 以引物 1、 3扩增 ZFN1 , 将 PCR 产物 TA克隆连接到 simple-T ( TaKaRa )载体上，测序验证无突变克隆， 通过 Not l和 Xho l双酶切，将酶切产物连接到 pBudCE4.1载体上，获得 pBudCE-ZFNl o 引物 2上含有 Sal I酶切位点， 以引物 2、 3扩增 ZFN2, 将 PCR产物 TA克隆连接到 simple-T ( TaKaRa )载体上， 测序验证无突 变克隆， 通过 Sai l和 Xba l双酶切， 将酶切产物连接到 pBudCE-ZFNl 载体上， 获得 pBudCE-ZFNl-2, 构建过程如图 2。 构建完成的锌指蛋 白核酸酶共表达载体， 可以同时表达一对锌指蛋白核酸酶， 两个锌指 蛋白核酸酶分别在 CMV和 EF-l ot强启动子下游， 可以瞬时高效表达 该对锌指蛋白核酸酶， 从而介导 BLG基因的敲除。

引物 1： 5 '-ATAAGAATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGG-3 ' 引物 2: 5 '-ACGCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGG-3 ' 亏 I物 3 : 5 '-AAACGATCCT CATCCTGTCT CTT-3 '

实施例 2 单细胞克隆的获得以及基因敲除克隆的鉴定

1、 单细胞克隆的获得

利用 AMAXA电转仪电转牛的成纤维细胞， 选用优化电转参数 T-016, 基因转染效率可以达到 90%以上。 转染的遗传物质为 mR A, 在细胞内的半衰期约为 8小时， 不会存在转 DNA时随机插入细胞基因 组的情况， 对于动物的遗传稳定性有良好的保证。 同时不会有抗性基 因的随机整合， 符合生物安全方面的要求。

具体操作方法： 以质粒 pBudCE-ZFNl -2为模板， 用 Applied B iosy stems公司试剂盒回收纯化体外转录的 mRNA， DEPC水洗脱溶 解， 使其终浓度在 500 ng/μΐ 左右。 一对 ZFNs对应的 mRNA各 2μ _β , 总 的 mRNA量为 4μ ₈ , 转染细胞数量为 1 x 10 ⁶ ， 电转染后将细胞接种于 T25细胞培养皿中，培养 24小时后，细胞计数，按照每 500个细胞 /10cm 皿密度将细胞接种于 10cm培养 J 中，补充含有 15%FBS的 DMEM培养 基 10毫升， 在含有 5%C0 ₂ 的 37°C细胞培养箱中培养 6-7天后， 瓶皿表 面会形成分散的单细胞克隆， 在显微镜下挑选细胞分裂相多、 细胞轮 廓清晰、细胞之间紧密、光泽度好的单细胞克 隆，扩繁到 48孔板培养， 培养条件不变。 3-4天后细胞铺满整个孔， 消化细胞， 取出 1/10的细胞 进行细胞 PCR, 用于鉴定细胞单克隆是否发生基因敲除； 剩余细胞接 种于 6孔板， 用于后续阳性克隆的细胞冻存。

2、 基因敲除单细胞克隆的鉴定

单细胞克隆分子的鉴定釆用测序技术， 能够准确判定基因的 DNA序列。 具体的操作方法： 单细胞克隆在 48孔板铺满孔后， 消化 细胞， 取出 1/10的细胞进行细胞 PCR, PCR产物回收纯化， 分成两部 分检测， 一部分直接进行 PCR产物测序工作。 若该克隆发生了基因敲 除， 则 PCR产物测序峰图呈现在切割位点后双峰的结果 ， 如图 4所示。 针对含有特异双峰结果的细胞克隆， 将另一部分 PCR产物进行 TA克 隆， 精确定位基因敲除位点以及详细的序列信息。

常规 ZFNs介导基因敲除的分子检测为 CEL-I检测， 本发明证实， 通过测序方法得到的结果更加直接， 容易操作， 并且准确率可以达到 100%。

实施例 3 基因敲除单细胞克隆的胚胎及克隆牛的制备

1、 基因敲除牛的制备

具体过程包括：

( 1 ) 荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞培养

取 40日龄荷斯坦奶牛胎儿耳组织， 经原代培养、 传代培养、 冷冻 等体外培养操作， 建立牛胎儿成纤维细胞系。

( 2 ) 基因敲除单细胞克隆

基因敲除单细胞克隆的获得同实施例 2。

( 3 ) 转基因克隆胚胎制备及胚胎移植

从屠宰厂收集成年牛的卵巢， 取直径 2~8毫米的卵泡， 回收形态 均匀、 结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体， 将卵丘 -卵母细胞-复合体 以 50-60枚 /孔放入含成熟液 (M199+10%胎牛血清 +0.01U/ml 牛促卵泡 激素 +0.01U/ml 牛促黄体生成激素 +l g/ml 雌二醇)的四孔板，在 38.5 °C、 5%C02培养箱中成熟培养 18〜20h后， 将成熟的卵母细胞放入含 有 0.1%透明质酸酶的管内振荡 2~3min后， 再用玻璃管轻轻吹打， 使 卵丘细胞与卵母细胞完全脱离， 选择形态完整， 细胞质均匀并排出第 一极体的卵母细胞作为体细胞核移植受体。

将带有第一极体的卵母细胞移入含 M199+10%FBS+7.5 g/ml细 胞松驰素 B的操作液中， 在 200倍显微镜下用一玻璃针于极体上方将 透明带切一小口， 然后用内径为 20μπι的玻璃管将第一极体以及其下 方的卵母细胞内的染色体一并吸除， 再放入 M199+20%FBS的溶液中 洗三遍后， 置于培养箱中备用。

将血清饥饿 2~4d的供体细胞（及上述转有抗体双链基因及� �记载 体的转基因细胞） 用 0.25% 胰蛋白酶消化 2〜4min， 选择直径为 10〜12μπι的体细胞用 20μηι直径玻璃管将其移入去核的卵母细胞透� �� 带内，然后将其放入 Zimmerman液（ Brophy B等 , 2003. Nat Biotechnol 21(2):157-162 )中平衡 3〜5min后放入融合槽内， 转动卵细胞使供体细 胞与卵母细胞接触面与电场垂直， 同时在直流脉冲的场强为 2.5kV/cm, 脉冲时间为 10μ3, 脉冲次数为 2次， 脉冲间隔为 Is的条件 -下 -融合 (-融合仪为 B- T- X公司的 EQVK00T)后 迅速将一重构一胚移 _入 M199+10%FBS液中。 将重构胚放入 5 mol/L 离子霉素液中， 4min后 移至 1.9mmol/L 6-DMAP液中， 4h后再移入 CRlaa+5%FBS液中，在 38.5 V , 5%C0 ₂ 培养箱中培养 2天。

将形态优良的第 7天的克隆囊胚移入同期受体母牛的子宫角内� � 受体母牛选择的都是经产母牛， 在移植后的第 60天进行直肠检测， 以 确定妊娠率。

2、 基因敲除牛的分子鉴定

基因敲除牛的分子鉴定具体操作过程为：取牛 耳部组织黄豆粒大 小， 消化提取耳组织基因组 DNA， 实验操作步骤详见《分子克隆（第 三版）》。 用上、 下游检测引物 F: 5'-AGGCCTCCTATTGTCCTCGT-3' 和 R: 5，-GCAAAGGACACAGGGAGAAG-3，扩增目的序列。 纯化回 收 PCR产物， 进行 TA克隆并对菌落单克隆测序分析。

结果表明， 出生的 6头牛犊均为双等位基因敲除的克隆牛， BLG 基因敲除类型为 9bp和 15bp删除（图 5 ), 与细胞水平的鉴定结果一致。 实施例 4 ZFNs敲除细胞 off-targeting效应检测

ZFNs敲除细胞 off-targeting效应， 是指在 ZFNs除了特异性很强的 结合靶序列同时， 也会作用于其他的相似序列， 这样就会产生不想要 的敲除类型， 同时也可能影响个体的生长发育， 对于试验结果可信度 造成较大负面影响。 靶位点选择过程当中已经排除大量 off-targeting 位点， 在表 1中， 以 set 1为例， 除了在牛的全基因组内含有 1个特异的 靶位点之外， 其相似序列相对较少， 只有在含有 6个碱基不同时才会 出现， 这样 ZFNs的 off-targeting效应在一定程度上被减小。

表 1 ZFNs作用位点以及相应的 off-targeting位点 基因组范围内含有不匹配碱基的 序列位点数量

ZFNs 结合位点序列 （划线序列 )

0 1 2 3 4 5 6

Set 1 CCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGA 1 0 0 0 0 0 12 47

Set 2 AGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATAT 1 0 0 0 0 1 7 66

Set 3 CCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGC 1 0 0 0 1 0 0 9 为了更好的检测 ZFNs的 off-targeting效应， 本发明还比较了在不 同物种之间 BLG基因序列的相似性， 在猪和羊中我们发现 ZFNs作用 位点相似性很高（图 6 ),在羊的序列中，只含有 3个碱基的差异， ZFNs 作用位点相似性高达 91.7%, 猪中含有 7个碱基的不同， 因此， 用相同 条件检测 ZFNs在这两种细胞中的作用情况， 大量测序结果表明， 在 牛细胞中发挥作用的 ZFNs-Set l在猪和羊的细胞系中均不发挥作用， 间接证明了 ZFNs作用的特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方 案对本发明作了详 尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本 领域技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 工业实用性 本发明利用 ZFNs介导的基因敲除， 可以实现一次转染， 得到双. 等位基因敲除的细胞克隆， 这在常规基因打靶过程中是难以实现的， 省去了药物筛选过程， 有利于细胞单克隆的形成， 避免了细胞需要对 抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植 效率和胚胎的发育质量 的提高起到了关键作用， 同时不含有抗性基因， 大大简化了生物安全 评价过程。