CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de marcação, com radionuclídeos, de análogos da somatostatina, bem como ao reagente para diagnóstico "in vivo" ou "in vitro" a base de análogos da somatostatina marcados com radionuclídeos, ao seu uso para diagnóstico, ao método de diagnóstico "in vitro" ou "in vivo" de doenças cuja fisiopatogenia envolva receptores de somatostatina e ao kit para diagnóstico de doenças cuja fisiopatogenia envolva receptores de somatostatina.

A invenção está relacionada precisamente às áreas médica e veterinária, visando à avaliação de doenças cuja fisiopatogenia envolva receptores de somatostatina, tais como: doenças endocrinológicas, doenças neurológicas, doenças auto-imunes, doenças granulomatosas, doenças pulmonares, tumores neuroendócrinos, tumores cerebrais, além de toda e qualquer doença que envolva receptores de somatostatina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A somatostatina é um peptídeo regulador com duas formas bioativas, somatostatina-14 e somatostatina-28; produzida por células neuroendócrinas no cérebro, modulando a neurotransmissão. Receptores de somatostatina localizam-se nas membranas celulares, podendo ser encontrados em tumores de origem endócrina, tumores intracranianos, leptomeninge, adenomas de glândula pituitária anterior, células gliais, medula adrenal, paragangliomas, células C da tireóide, células de Merkell, células pancreáticas, células endócrinas gastrointestinais e broncopulmonares, linfócitos ativados e, diversas outras células endócrinas (Patel YC, Srikant CB. Somatostatin receptors. TEM 1997;8:398-405; Schmidt M, Scheidhauer K, Luyken C, Voth E, Hildebrandt G, Klug N, Schicha H. Somatostatin receptor imaging in intracranial tumours. Eur J Nucl Med 1998; 25:675-686).

A somatostatina possui propriedades imunomoduladoras potentes.

Estes efeitos incluem redução de atividade linfocítica, redução da secreção gástrica e intestinal, ativação do eixo hipotálamo-hipófise e ação antiinflamatória; apresenta, também, múltiplos efeitos moduladores no sistema imune e função das células sinoviais, como inibidor da angiogênese, anti-proliferativa e propriedades analgésicas (Baccaglini L, Pillemer SR, Baum BJ. Sjogren's syndrome: a possible pathogenetic mechanism involving somatostatin. Oral Dis 2000;6:264-6; Paran D, Paran H. Somatostatin analogs in rheumatoid arthritis and other inflammatory and immune-mediated conditions. Curr Opin Investig Drugs 2003,4: 578-582).

Em 1979, Bauer sintetizou a octreotida, um derivado octapeptídeo sintético da somatostatina, a qual contém aminoácidos essenciais para a ligação ao receptor celular desta (SSTR), presente na hipófise e outros tecidos. Foram isolados, clonados e sequenciados alguns subtipos de SSTR. Os subtipos 1 , 2, 3 e 5 estão presentes nos tecidos hipofisários normal e tumoral. No entanto, o 2 e o 5 são mais prevalentes nos adenomas secretores de hormônio do crescimento (GH) {Bauer W, Briner U, Doepfner W, et al. SMS 201-995; a very potent and selective octapeptide analogue of somatostatin with prolongéd action. Life Sei 1980;31:1133-1140). A redução do tamanho e a estabilização do peptídeo contra o ataque enzimático resultaram em uma estrutura biologicamente mais estável. Testes "in vivo", em ratos, demonstraram que esta tem capacidade de inibição do GH sete mil vezes maior que a somatostatina nativa dada a sua alta estabilidade. Comparando-se as meias-vidas, a da octreotida é cerca de 30 vezes maior do que a da somatostatina. Cabe ressaltar que a interrupção de seu uso não resulta em hipersecreção rebote (Bauer W, Briner U, Doepfner W, et ai SMS 201-995; a very potent and selective octapeptide analogue of somatostatin with prolonged action. Life Sei 1980;31:1133-1140).

Estudos clínicos tiveram início, em 1982, sob a liderança de Allan

Harris, sendo inicialmente investigada a eficácia da octreotida na acromegalia e em tumores gastrintestinais e pancreáticos. Em 1987, seu uso foi aprovado graças ao sucesso dos resultados clínicos observados. Tem sido utilizada como inibidora principalmente da liberação do GH e do glucagon, embora também seja utilizada, em menor escala, para inibição da insulina (Bauer W, Briner U, Doepfner W, et al. SMS 201-995; a very potent and selective octapeptide analogue of somatostatin with prolonged action. Life Sei 1980;31:1133-1140; Battershill PE, Clissold SP. Octreotide: a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and thèrapeutic potential in conditions assocíated with excessive peptide secretion. Drugs 1989;38:658-702; Lewis I, Bauer W, Albert R, Chandramouli N, Pless J, Weckbecker G, Bruns C. A novel somatostatin mimic with broad somtotropin release inhibitory factor receptor binding and superior thèrapeutic potential. J Med Chem 2003;46:2334-2344;

Pless J, Bauer W, Briner U, Doepfner W; Marbach P; Maurer R; Petcher TJ; Reub JC; Vonderscher J. Chemistry and pharmacology of SMS 201-995, a long- acting octapeptide analogue of somatostatin. Scand J Gastroenterol 1986; 21: 54- Os análogos de somatostatina são, também, eficazes no tratamento da oftalmopatia de Graves, da síndrome carcinóide, de tumores neuroendócrinos, tumores adrenais e de outras condições {Lahlou H, Guillermet J, Hortala M, Vernejoul F, Pyronnet S, Bousquet C, Susini C. Molecular signaling of somatostatin receptors. Ann N YAcad Sei 2004;1014:121-13).

Desta forma, abre-se uma grande perspectiva da utilização da octreotida marcada para avaliação de diversas doenças como as acima descritas além de outras doenças (endocrinológicas, neurológicas, auto-imunes, granulomatosas, pulmonares), tumores benignos e malignos (neuroendócrinos, cerebrais, entre outros), enfim, toda e qualquer doença que envolva receptores de somatostatina. Alguns exemplos do potencial do uso desta droga marcada serão expostos abaixo:

Oftalmopatia de Graves

A oftalmopatia de Graves é uma condição auto-imune que afeta o conteúdo orbital. Decorre de processo inflamatório com edema dos músculos extra-oculares e tecidos conectivos, cursando com complicações oculares, as quais podem ser irreversíveis quando em fase fibrótica. Seu curso clínico pode evoluir de forma independente da atividade da doença tireoideana. Métodos de imagem, como a tomografia computadorizada, podem evidenciar aumento dos músculos extra-oculares, porém não diferenciam edema de fibrose. A ultra- sonografia das órbitas também pode mostrar edema assim como a ressonância magnética. Contudo, nenhuma delas apresenta sensibilidade ótima. Definir se há ou não inflamação é importante para tomada de decisão terapêutica já que, a resposta à terapia antiinflamatória ou imunossupressora, ou ainda à radioterapia só ocorrerá na presença de inflamação ativa. Na ausência de processo inflamatório a opção terapêutica é a cirurgia descompressiva para evitar progressão da lesão ocular, particularmente por compressão do nervo óptico (Stan MN, Garrity JA, Bradley EA, Woog, JJ, Bahn MM, Brennan MD, Bryant, SC, Achenback SJ, Bahn RS. Randomized, double-blind, placebo- controlled trial of long-acting release octreotide for treatment of GravesOphthalmopathy. J Clin Endocrinol Metab 2006;91:4817-4824; Dabon- Almirante CL, Surks Ml. Clinicai and laboratory diagnosis of thyrotoxicosis. Endocrinol Metab Clin North Am 1998;27:25-35; Martin A, Nakashima M, Zhou A, Aronson D, Werner AL, Davies TE. Detection of major T cell epitopes on human thyroid stimulating hormone receptor by overriding immune heterogeneity in patients with Graves' disease. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:3361-3366; Paschke R, Ludgate M. The thyrotropin receptor in thyroid diseases. N Engl J Med 1997;337:1675-1681).

Pacientes com oftalmopatia de Graves, moderado-grave, são usualmente tratados com terapia imunossupressiva. Contudo, o uso, de corticóides ou radioterapia retrobulbar, melhoram os sintomas em apenas 65% dos pacientes e, assim, o restante dos pacientes é tratado sem benefícios. A provável razão é que esta terapia é utilizada em pacientes com doença de Graves grave, porém com oftalmopatia inativa {Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide-scintigraphy is a disease-activity parameter in Graves' ophthalmopathy. Clin Endocrinol 1999;50:373-379; Burch HB, Wartofsky L. GravesOphthalmopathy: current concepts regarding pathogenesis and management. Endocr Rev 1993;14:747-793; Prummel MF, Wiersinga WM. Medicai management of Graves' ophthalmopathy. Thyroid 1995;5:231-234).

Os análogos da somatostatina têm efeitos imunomoduladores que, em teoria, são uma opção atrativa para o tratamento desta condição. A somatostatina inibe a proliferação dos linfócitos, a produção de fatores estimulantes de granulócitos e macrófagos, as citocinas inflamatórias, as imunoglobulinas e os fatores que atuam no processo auto-imune da órbita. Além disso, cabe ressaltar que SSTR têm sido identificados em fibroblastos na órbita e em linfócitos ativados. Na tentativa de identificar a fase em que se encontra a oftalmopatia de Graves outros métodos têm sido estudados como ensaios laboratoriais [dosagens de triiodotironina (T3), tiroxina livre (T4 livre), tireotropina (TSH), anticorpo anti-receptor de TSH (TRAb), anticorpo anti- peroxidase (TPOAb)] e avaliações clínicas (tratamento com drogas antitireoidianas) (Peixoto MC, Buescu A, Gonçalves MRB, Albernaz, MS, Coeli CM, Vaisman M. Use of clinicai and laboratory data for prediction of Grave's disease 1-year remission after 12 months of treatment with antithyroid drugs. Endocrinologist 2008;18:25-29). Estudos com anticorpos IgG policlonais humanos, marcados com tecnécio-99m (Tc-99m), não demonstram boa correlação com escore clínico apesar de se associarem com fases precoces da doença. Contudo, a atividade da oftalmopatia de Graves mostra correlação com a captação de análogos da somatostatina em cintilografias da órbita utilizando índio- 1 1-dietilenotriaminopentacetico-octreotida (1 1 1 1n-DTPA- octreotida) (Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide-scintigraphy is a disease-activity parameter in Graves' ophthalmopathy. Clin Endocrinol 1999;50:373-379; Hinterberg W, Cerny C, Kinast H, Pointner H, Tragi KH. Somatostatin reduces the release of colony-stimulating activity (CS A) from PHAractivated mouse spleen lymphocytes. Experientia 1978;34:860-862; Blum AM, Metwali A, Mathew RC, Cook G, Elliott D, Weinstock JV. Granuloma T lymphocytes in murine chistosomiasis mansoni have somatostatin receptors and respond to somatostatin with decreased IFN-γ secretion. J Immunol 1992;149:3621-3626; Pasquali D, Vassallo P, Exposito D, Bonavolonta G, bellastella A, Sinisi AA. Somatostatin receptor gene expression and inhibitory effects of octreotide on primary cultures of orbital fibroblasts from GravesOphthalmopathy. J Mol Endocrinol 2000;25:63-71). Um método adequado de medir esta captação pode ajudar a definir quais pacientes serão beneficiados pela imunossupressão. Alguns estudos qualitativos e quantitativos para medir esta captação têm sido relatados, mas não tem demonstrado boa reprodutibilidade {Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide-scintigraphy is a disease-activity parameter in Graves' ophthalmopathy. Clin Endocrinol 1999; 50:373-379; Kahaly G, Gorges R, Diaz M, Hommel G, Bockisch A. lndium-111- pentetreotide in Graves' disease. J Nucl Med 1998;39:533-536). O padrão-ouro seria a análise histopatológica da biópsia de músculo orbitário, porém não é realizado, na maioria dos estudos, por não aceitação por parte dos pacientes, além de ser um método invasivo (Gerding MN, Van Der Zant FM, Van Royen EA, Koornneef L, Krenning EP, Wiersinga WM, Prummel MF. Octreotide- scintigraphy is a disease-activity parameter in Graves' ophthalmopathy. Clin Endocrinol 1999;50:373-379).

Derivados de somatostatina marcados não podem ser utilizados em imagens, pois possuem uma meia-vida extremamente curta (3 minutos), por isso utilizam-se os análogos de somatostatina. Estes, como por exemplo, a octreotida, possibilita a sua utilização na aquisição de imagens, pois sua meia vida biológica é de 90 minutos (Kahaly G, Gorges R, Diaz M, Hommel G, Bockisch A. lndium-111 -pentetreotide in Graves' disease. J Nucl Med 1998;39:533-536). Portanto, a marcação desta molécula com o tecnécio-99m é de grande interesse, por ser um método não invasivo e, este, ser um radionuclídeo amplamente utilizado para marcação de células e moléculas em Medicina Nuclear. Este fato se deve a algumas de suas características físicas como, meia-vida de seis horas e emissão de radiação gama, com energia de 140 keV, baixo custo e disponibilidade imediata através de geradores de Molibdênio-99/Tecnécio-99m (Mo-99/Tc-99m) produzidos pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares /Comissão Nacional de Energia Nuclear (IPEN/CNEN). Baseado nisso, foi desenvolvido um método simples para a marcação da octreotida com tecnécio-99m, o qual foi aplicado em cobaias para avaliação de sua biodistribuição e posteriormente, em pacientes com oftalmopatia de Graves, após terem sido realizados os ensaios "in vitro";

Oncologia

Em 1990, descobriu-se que vários tumores humanos como os de mama, próstata, pâncreas, ovário e o meningioma, apresentavam receptores altamente específicos para a somatostatina, e que a sua função era a de inibir o crescimento tumoral nestes órgãos. Já foi demonstrado que a somatostatina inibe o crescimento de tumor de próstata de rato, tumor de mama de camundongos e o câncer pancreático de cobaias (Felippe Júnior, J. Somatostatina: efeitos anti câncer ligados ao seu papel no metabolismo dos carboidratos porque ela inibe as enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase e transcetoíase. Disponível em: http://www. medicinacomplementar. com. br/tema220805a. asp [Acesso em 22/03/09]).

Acredita-se que a somatostatina funcione como um inibidor das enzimas glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e transcetoíase, as quais estão envolvidas na síntese de ribose, coluna dorsal dos ácidos nucléicos necessários para a formação de ácido ribonucléico (RNA) e ácido desoxirribonucléico (DNA) no processo de proliferação celular maligna (Felippe Júnior, J. Somatostatina: efeitos anti câncer ligados ao seu papel no metabolismo dos carboidratos porque ela inibe as enzimas glicose-6-fosfato desidrogenase e transcetoíase. Disponível em: http://www. medicinacomplementar. com. br/tema220805a. asp [Acesso em 22/03/09]).

Os tumores neuroendócrinos representam um grupo raro e heterogéneo de neoplasias originadas de células pertencentes ao sistema neuroendócrino; são caracterizados pela presença de células secretoras de aminas e peptídeos. Esses tumores são originados em glândulas endócrinas como na medula adrenal, hipófise, paratireóide, bem como ilhotas endócrinas dentro da tireóide e pâncreas e dispersas em células endócrinas no trato respiratório e gastrointestinal (Kaltsas GA, Besser GM, Grossman AB. The diagnosis and medicai management of advanced neuroendocrine tumors. Endocr Rev. 2004;25:458-511; Rufini V, Calcagni ML, Baum, RP. Imaging of neuroendocrine tumors. Seminars in Nuclear Medicine. 2006,228-247).

Os tumores carcinóides se originam do sistema neuroendócrino periférico, podendo surgir em qualquer órgão do corpo, mas originam-se principalmente em quatro locais: brônquios, apêndice, reto e intestino delgado. São classificados de acordo com a origem embriológica de cada órgão. Os carcinóides do trato anterior incluem tumores oriundos de pulmão ou estômago. Carcinóides do trato médio derivam de células do intestino delgado, do apêndice e do cólon ascendente. Os carcinóides do trato posterior se originam em cólon descendente e reto (De Vries H, Verschueren RC, Willemse PH, Kema IP, De Vries EG. Diagnostic, surgical and medicai aspect of the midgut carcinoids. Câncer Treat Rev. 2002; 28: 11-25). Em alguns casos, os tumores carcinóides apresentam a síndrome carcinóide que está associada à produção de serotonina, acompanhada frequentemente de histamina e taquicininas, sendo agressivos e localizados predominantemente no tubo digestivo, pâncreas ou pulmão. Seu quadro clínico inclui: rubor, diarréia, broncoconstrição, insuficiência cardíaca direita, palpitações, emagrecimento e hipoalbuminemia (Czepielewsky MA, Colli M, Harlos T, Silveiro, SP, Maraschin J, Copette F, Leitão, CB, Rollin, GAFS. Octreotide-LAR + adrenalectomia bilateral no manejo de tumors carcinóides produtores de ACTH. Arq Bras Endocrinol Metab. 2005;49:791-796; Kulke MH, Mayer RJ. Carcinoid tumors. N Engl J Med. 1999;340:858-868; Oberg K. Carcinoid tumors, carcinoid syndrome and related disorders. In: Larsen PR, Kronenberg HM, Melmed S, Polonsky KS (eds), Williams Textbook of Endocrinology. 10 ^th ed. 2003;1857-1876). Existem alguns estudos, em fase inicial, utilizando a cintilografia com 1 1 1-ln-pentreotide para avaliação da resposta ao tratamento de tumores carcinóides, porém os protocolos ainda não foram bem estabelecidos.

A importância da utilização dos análogos de somatostatina na avaliação de tumores advém do fato de que existem receptores presentes em várias linhagens tumorais. Em torno de 50-75% de tumores de mama possuem receptores positivos para somatostatina (SSTR) e expressam predominantemente SSTR do subtipo 2 (Wang F, Wang Z, Wu J, Qu W, Yao W, Zhao J, Liu Z. The role of technetium-99m-labeled octreotide acetate scintigraphy in suspected breast cancer and correlates with expression of SSTR. Nucl Med Biology. 2008;35:665-671). A maioria dos tumores pancreáticos endócrinos, expressa somatostatina. Nos carcinomas medulares de tireóide, produtores de calcitonina, também estão expressos receptores de somatostatina (Kwekkeboom DJ, Reubi JC, Lamberts SWJ, Bruining HA, Mulder AH, Oei HY, Krenning EP. In vivo somatostatin receptor imaging in medullary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 1993;76:1413-1417; Tisell LE, Ahlman H, Wangberg B, Hansson G, Moine J, Nilsson O, Lindstedt G, Fjãlling M, Forssell-Aronsson E. Somatostatin receptor scintigraphy in medullary thyroid carcinoma. Br J Surg. 1997;84:543-547). São também observados receptores de somatostatina em tumores pulmonares de pequenas células, linfomas, dentre outros.

Imagens "in vivo" de tumores que apresentem receptores de somatostatina têm sido avaliados com 1 1 1 lndio-DTPA-octreotida (Schulz S, Helmholz T, Schmitt J, Franke K, Otto HJ, Weise W. True positive somatostatin receptor scintigraphy in primary breast cancer correlates with expression of sst2A and sst5. Breast Cancer Res Treat. 2002;72:221-226). Porém, a marcação com tecnécio oferece vantagens quando comparada com a marcação com índio-1 1 , incluindo a energia, maior disponibilidade, visualização mais rápida em protocolo de um dia {Wang F, Wang Z, Wu J, Qu W, Yao W, Zhao J, Liu Z. The role of technetium-99m-labeled octreotide acetate scintigraphy in suspected breast câncer and correlates with expression of SSTR. NucI Med Biology. 2008;35:665- 671).

Estudos realizados com ln-1 1 -DTPA-octreotida demonstraram que a sensibilidade deste exame varia entre 60-90% em pacientes com gastrinoma, sendo que essa discrepância deve-se, provavelmente, a técnica de aquisição de imagem (curto tempo de aquisição), a não realização de cortes tomográficos (SPECT), ou injeção de doses relativamente baixas de In1 1-DTPA-octreotida {Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin NucI Med. 2002;32:84-91). Nestes estudos foram verificados similares valores de sensibilidade entre a cintilografia e outras técnicas de imagem como: ultra- sonografia, tomografia computadorizada, ressonância nuclear, angiografia ou a combinação destes, localizando aproximadamente 50% dos casos. Receptores dè somatostatina demonstraram sensibilidade, simplicidade e baixo-custo, porém, estes estudos estão em fase inicial, e a continuidade dos testes determinará as condições ideais para a realização da cintilografia com análogos da somatostatina {Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin NucI Med. 2002;32:84-91). Os carcinomas medulares de tireóide podem, . também, ser localizados através da cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA- octreotida. Em alguns estudos verifica-se uma sensibilidade para a detecção destes tumores, através deste método, de 50-70%. A relação da calcitonina e dos níveis de antígeno carcinoembriogênico foi significativamente alta em pacientes nos quais foi realizada a cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA-octreotida. Isto implica que receptores para somatostatina podem ser detectados "in vivo" para diferentes formas de carcinoma medular de tireóide {Kwekkeboom DJ, Reubi JC, Lamberts SWJ, Bruining HA, Mulder AH, Oei HY, Krenning EP. In vivo somatostatin receptor imaging in medullary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 1993;76:1413-1417; Tisell LE, Ahlman H, Wangberg B, Hansson G, Moine J, Nilsson O, Lindstedt G, Fjâlling M, Forssell-Aronsson E. Somatostatin receptor scintigraphy in medullary thyroid carcinoma. Br J Surg. 1997;84:543- 547).

Embora tumores de tireóide anaplásicos, foliculares, papilares, além dos carcinomas de células de Hurthle não pertençam ao grupo clássico de tumores neuroendócrinos, a maioria dos pacientes com este tipo de câncer, ao realizarem cintilografia com 1 1 1 1n-DTPA-octreotida, mostram áreas de hipercaptação em topografia dos tumores (Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin NucI Med. 2002;32:84-91).

Carcinomas trabeculares da pele ou tumores de células de Merkel são neoplasmas agressivos. Frequentemente esses tumores provocam metástases e apesar da terapia, a mortalidade é alta. A maioria destes tumores possui características neuroendócrinas. Em 4 de 5 pacientes estudados com 1 1 1 1n-DTPA-octreotida em que os tumores foram detectados por tomografia computadorizada, ultra-sonografia ou ambos, estes sítios foram reconhecidos na cintilografia. Em 2 pacientes, a cintilografia detectou previamente metástases {Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin NucI Med. 2002;32:84-91).

O câncer pulmonar de pequenas células representa 20-25% dos tumores malignos pulmonares. Muitos estudos usam meta-iodobenzilguanidina (MIBG), mas os resultados não são satisfatórios. Estudos preliminares utilizando a cintilografia com 1 1 1 1n-DTPA-pctreotida demonstraram, além de tumores primários, nódulos metastáticos abdominais e metástases ósseas (Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin NucI Med. 2002;32:84- 91; Bombardieri E, Crippa F, Cataldo I, Chiti A, Seregni E, Soresi E, Boffi R, Invernizzi G, Buraggi GL. Somatostatin receptor imaging of small cell lung câncer (SCLC) by means of 111-ln-DTPA octreotide scintigraphy. Eur J Cancer. 1995; 31A:184-188).

Em muitos pacientes com linfomas não-Hodgkin's uma ou mais lesões podem ter receptores positivos para somatostatina. Além disso, a detecção de linfomas através da cintilografia com 111 In-DTPA-octreotida é mais restrita quando comparada a sua utilização em tumores neuroendócrinos. Em 20% dos pacientes, a cintilografia revelou lesões que não foram demonstradas por procedimentos convencionais como, tomografia computadorizada, ultra- sonografia, sendo importante o seu uso no diagnóstico e estadiamento desta doença (Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin Nucl Med. 2002;32:84-91).

Em aproximadamente 90% dos pacientes com neuroblastomas, foram identificados receptores de somatostatina, tal fato favorece significativamente o prognóstico, uma vez que a sobrevida destes pacientes é muito maior se comparados com os que não apresentam receptores para somatostatina (Rufini V, Calcagni ML, Baum, RP. Imaging of neuroendocrine tumors. Seminars in Nuclear Medicine. 2006; 228-247; Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin Nucl Med. 2002;32:84-91).

Feocromocitomas são tumores de células crómafins que produzem, armazenam, metabolizam e secretam catecolaminas. São tumores raros que implicam em elevada morbi-mortalidade. A maioria destes tumores (90%) localiza-se na medula adrenal, enquanto que 10% são extra-adrenais, sendo classificados como paragangliomas (Rufini V, Calcagni ML, Baum, RP. Imaging of neuroendocrine tumors. Seminars in Nuclear Medicine. 2006; 228-247). A cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA-octreotida apresenta mais acurácia para paragangliomas não funcionantes da cabeça e pescoço, onde a cintilografia com MIBG usualmente falha. Nesses pacientes, sítios adicionais são frequentemente encontrados (Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin Nucl Med. 2002;32:84-91; Kwekkeboom DJ, Van Urk H, Pauw BKH, Lamberts SW, Kooij PP, Hoogma RP, Krenning EP. Octreotide scintigraphy for detection of paragangliomas. J Nucl Med. 1993;34:873-878).

A osteomalacia é uma doença metabólica caracterizada pela diminuição da mineralização óssea, em que ocorre um comprometimento do osso cortical e trabecular, com acúmulo de tecido osteóide não mineralizado. A osteomalacia induzida por tumor (TIO) é uma desordem rara devido à perda de fosfato secundária a secreção de fosfatoninas, na qual o fator de crescimento de fibroblasto 23 (FGF-23) é o fator que participa desta patogênese apresentando uma produção excessiva ou clivagem protéica comprometida {Weidner N, Santa > Cruz D. Phosphaturic mesenchymal tumors: a polymorphus group causing osteomalacia or rickets. Câncer. 1987;59:1442-1454; Foípe AL, Fanburg-Smith JC, Billings SD Most osteomalacia-associated mesenchymal tumours are a single histopathology entity. Am J Surg Pathol. 2004; 28:1-30; Duet M, Kerkeni S, Sfar R, Bazille C, Lioté F, Orcei P. Clinicai impact of somatostatin receptor scintigraphy in the management of tumor-induced osteomalacia. Clin Nucl Med. 2008;33:752-756). Tentativas para identificar estes tumores por exames físicos e/ou métodos convencionais de imagem como, exame radiológico e ultra- sonografia nem sempre são bem sucedidos. A cintilografia com receptores de somatostatina, octreotida ou penteotride marcados com 1 1 1-ln, está sendo bem sucedida, já que as células mesenquimais expressam receptores de somatostatina do tipo 2 (Duet M, Kerkeni S, Sfar R, Bazille C, Lioté F, Orcei P. Clinicai impact of somatostatin receptor scintigraphy in the management of tumor-induced osteomalacia. Clin Nucl Med. 2008;33:752-756).

Tumores endócrinos pancreáticos em sua maioria demonstram hiperplasia de múltiplos tipos celulares e produz vários peptídeos e aminas biogênicas. Entre estes tumores podem ser citados: gastrinomas, insulinomas, glucagonomas, vipomas e tumores caracterizados pela produção de fator liberador de GH. Estes tumores expressam receptores de somatostatina e podem ser visualizados através da cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA-octreotida (Kwekkeboom DJ, Krenning EP. Somatostatin receptor imaging. Semin Nucl Med. 2002;32:84-91; Portela-Gomes GM, Stridsberg M, Grimelius L, Ôberg K, Janson ET. Expression of the five different somatostatin receptor subtypes in endocrine cells of the pâncreas. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2000;8:126-132; Oda Y, Tanaka Y, Naruse T, Sasanabe R, Tsubamoto M, Funahashi H. Expression of somatostatin receptor and effects of somatostatin analog on pancreatic endocrine tumors. Surg Today. 2002;32:690-694).

O osteossarcoma é o mais frequente tumor primário ósseo. Exibem receptores de somatostatina, usualmente detectados em tumores primários, mas não em lesões metastáticas. Essa diferença de expressão de receptores de somatostatina observadas poderia indicar uma possível relação entre receptores de somatostatina e o comportamento biológico do tumor. A presença de receptores de somatostatina em pacientes com osteossarcoma pode ser verificada através da cintilografia com 1 1 1 ln-pentreotide (Ferrari S, Dondi M, Fanti S, Zoboli S, Giacomini S, Mercuri M, Bacci G. Somatostatin receptor (SSTR) scintigraphy in patients with osteosarcoma. Câncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 2003;18:847-851).

Estudos com análogos de somatostatina, 1 1 1-ln-DTPA-octreotida têm sido realizados também para tumores como meningiomas e adenomas de hipófise que embora sejam geralmente tumores benignos e não-metastáticos podem ocasionar graves transtornos após o tratamento inicial e invasões locais devido a recorrências em áreas como o clivus ou seio cavernoso. Apesar dos avanços em cirurgias do crânio o tratamento de tumores nesta área ainda apresenta algumas questões não resolvidas. Os meningiomas, localizados fora da barreira hematoencefálica são visualizados através da cintilografia com 99mTc-octreotida (Schmidt M, Scheidhauer K, Luyken C, Voth E, Hildebrandt G, Klug N, Schicha H. Somatostatin receptor imaging in intracranial tumours. Eur J Nucl Med 1998; 25:675-686) .

Doenças Neurológicas

Alterações da somatostatina no fluido cerebroespinhal podem ser usadas em diagnóstico refletindo diferentes perfis nas doenças degenerativas neurológicas (Hartíkainen P, Reinikainem KJ, Soininen H, Sirvio J, Soikkeli R, Riekkinen PJ. Neurochemical markers in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis and normal controls. J neural Transm Park Dis Dement Sect. 1992;4:53-68; Shults C, Steardo L, Barone P, Mohr E, Juncos J, Serrati C, Fedio P, Tamminga CA, Chase TN. Huntington's disease : effect of cysteamine, a somatostatin-depleting agent. Neurology. 1986;36:1099-1102; Roca CA, Su TP. Elpern S, McFarland H, Rubinow PR. Cerebrospinal fluid somatostatin, mood, and cognition in multiple sclerosis. Biol Psychiatry. 1999; 46:551-556). A utilização de análogos da somatostatina marcados com 99m-Tc poderá contribuir no estudo destas doenças.

Outras Doenças

Foi demonstrado que doenças granulomatosas como sarcoidose e doenças auto-imunes como artrite reumatóide e artrite psoríatica, expressam somatostatina e, a cintilografia 1 1 1 ln-DTPA-octreotida pode ser usada no diagnóstico, estadiamento e acompanhamento destas doenças (Da/m VA, Van Hagen PM, krenning EP. The role of octreotide scintigraphy in rheumatoid arthritis and sarcoidosis. Q J Nucl Med. 2003;47:270-278).

Na artrite reumatóide, a proliferação da membrana sinovial, angiogênese e atividade imunológica desregulada provocam a erosão e deètruição da articulação (Paran D, Paran H. Somatostatin analogs in rheumatoid arthritis and other inflammatory and immune-mediated conditions. Curr Opin Investig Drugs 2003;4: 578-582). A sarcoidose é uma doença granulomatosa multisistêmica de origem desconhecida, podendo envolver hilo, pulmões, pele e olhos. A terapia em pacientes com sarcoidose é sintomática. Devido à alta taxa de remissão espontânea dependendo do estágio da doença, o tratamento com corticóides é reservado para pacientes com estágio ativo II e III de sarcoidose pulmonar e, pacientes com funções pulmonares deficientes, dispnéia, tosse, dor torácica, hipercalcemia ou envolvimento de órgãos extrapulmonares (Kwekkeboom DJ, Krenning EP, Kho GS, Breeman WAP, Van Hagen PM. Somatostatin receptor imaging in patients with sarcoidosis. Eur J Nucl Med. 1998;25:1284-1292).

As doenças granulomatosas, podem ser visualizadas com 1 1 1n-

DTPA-octreotida, demonstrando a atividade da doença. Estes estudos estão em fase inicial e a continuidade do mesmo fornecerá dados mais pertinentes (Kwekkeboom DJ, Krenning EP, Kho GS, Breeman WAP, Van Hagen PM. Somatostatin receptor imaging in patients with sarcoidosis. Eur J Nucl Med. 1998;25:1284-1292; Vanhagen PM, krenning EP, Reubi JC, Kwekkeboom DJ, Bakker WH, Mulder AH, Laissue I, Hoogstede HC, Lamberts SWJ. Somatostatin analogue scintigraphy in granulamatous diseases. Eur J Nucl Med 1994;21:497- 502).

A Síndrome de Sjõgren é uma doença sistémica crónica que afeta inicialmente as glândulas salivares e lacrimais. A patogênese da Síndrome de Sjõgren é desconhecida. Presume-se que a redução da atividade da somatostatina é um importante fator que favorece a desregulação imune em pacientes afetados pela Síndrome de Sjõgren. A atividade da somatostatina é baixa em pacientes afetados e isso contribui significativamente na observação da doença (Baccaglini L, Pillemer SR, Baum BJ. Sjogren's syndrome: a possible pathogenetic mechanism involving somatostatin. Oral Dis. 2000;6:264-6).

A miastenia gravis é uma doença auto-imune de transmissão neuromuscular; associada a anormalidades no timo. Até 30% dos pacientes com miastenia gravis tem tumor no timo e mais de 75%, hiperplasia do timo. Diagnósticos de doenças do timo têm grande implicação no tratamento de pacientes com miastenia gravis. A timectomia precoce pode resultar em melhoria ou remissão da doença (Gao ZR, Kornblum C, Flacke S, Logvinski T, Yuksel M, Na R, Klockgether T, Biersack HJ, Ezziddin S. Somatostatin receptor scintigraphy in the follow-up of myasthenia gravis. Neurol Sei. 2007;28:175-180). Neste contexto a cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA-octreotida é útil na diferenciação de tumor e hiperplasia do timo. Os tumores são avidamente captados pelo radiotraçador, o que não ocorre na hiperplasia (Gao ZR, Kornblum C, Flacke S, Logvinski T, Yuksel M, Na R, Klockgether T, Biersack HJ, Ezziddin S. Somatostatin receptor scintigraphy in the follow-up of myasthenia gravis. Neurol Sei. 2007;28:175-180; Lastoria S, Vergara E, Palmieri G, Acampa W, V arrelia P, Caracò C, Bianco RA, Muto P, Salvatore M. In vivo detection of malignant thymic masses by indium-111-DTPA-D-Phe1-octreotide scintigraphy. J. Nucl. Med. 1998;39:634-639).

A síndrome de Cushing pode ser iatrogênica ou exógena. A iatrogenia resulta de quantidades excessivas de glicocorticóides. No caso da exógena, a causa mais frequente é o adenoma hipofisário secretor de adrenocorticotropina (ACTH - doença de Cushing), neoplasias adrenocorticais secretoras de cortisol e neoplasias viscerais que secretam ACTH. Análogos de

i

somatostatina regulam a secreção de ACTH, sendo possível a avaliação da doença através de cintilografia com 1 1 1 ln-DTPA-octreotida (Hofland LH. Somatostatin and somatostatin receptors in Cushing's disease. Mol and Celi Endocrinology. 2008;286:199-205).

Receptores de somatostatina têm sido descritos em outras condições não tumorais. Essas condições incluem tuberculose, doença celíaca, tireoidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, aspergilose, lúpus eritematoso sistémico, púrpura Henoch-Schonlein e doença de Crohn. A descoberta de alterações na expressão dos receptores de somatostatina em diversas doenças é de interesse na exploração do estágio evolutivo através da cintilografia com análogos de somatostatina (Marko J, Lamba R, Miller F, Buchman A, Spies S, Nikolaidis P. Octreoscan positive Crohn's disease mimicking an ileal carcinoid tumor. J Clin Gastroenterol. 2008;42:66-68).

Desta forma, em face do exposto, o princípio desta invenção baseia-se na premissa de que como os análogos da somatostatina se ligam aos receptores desta, o exame apresentará alta sensibilidade e especificidade em diversas afecções clínicas e oncológicas.

Todos os estudos citados foram realizados com análogos de somatostatina marcados com 11 1-ln. O 1 1 -In é um radionuclídeo que possui meia vida de 3 dias, energia 245 KeV, emissor de radiação γ. O desenvolvimento de um método de marcação com o 99m-Tc representa um grande avanço, pois o 99m-Tc é um radionuclídeo que possui uma meia-vida de 6h, energia de 140 KeV, emite radiação γ, de fácil obtenção (gerador 99Mo/99mTc), sendo, portanto, um método extremamente atrativo para uso de rotina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para desenvolvimento do processo desta invenção definiram-se concentrações e volumes ótimos do análogo da somatostatina, do agente redutor e do radionuclídeo, empregados, sendo estes, em especial, respectivamente, a octreotida, o cloreto estanoso e o tecnécio-99m (Tc-99m).

Para isso, foram utilizadas alíquotas do análogo da somatostatina, especificamente a octreotida, em várias concentrações 0,01 ; a 0,5 mg/mL, especialmente 0,1 mg/mL, em um volume de 10 a 1000 μΐ_, especialmente 200 μΙ_. As alíquotas foram incubadas, por 2 a 25 minutos, especialmente 10 minutos, à temperatura ambiente, com soluções de um agente redutor, particularmente o cloreto estanoso nas concentrações de 10 a 400 Mg/mL, em especial 50 g/mL, num volume que variou de 10 a 1000 μί, especificamente 100 μΙ_. Depois, foram adicionados volumes de 50 a 1000 μΙ_ de um radionuclídeo, em especial 300 \ L de Tc-99m, com atividade de 20 pCi a 40 mCi, recentemente eluídos de um gerador de Mo-99 Tc-99m (IPEN-CNEN), particularmente 100 pCi para ensaios "in vitro" e 10 mCi para avaliação "in vivo", seguindo-se de uma incubação de 5 a 40 minutos, particularmente 20 minutos, à temperatura ambiente.

Os tubos do experimento estavam sob baixa pressão atmosférica, que foi obtida pela aspiração de ar com auxílio de uma seringa. A solução resultante apresentava-se límpida, incolor, estéril e apirogênica.

A eficiência da marcação foi determinada por cromatografia em papel Whatman n° , utilizando acetona como solvente.

Foram realizados experimentos utilizando filtro millipore 0,22μΐτι para retirada de possíveis colóides. Obteve-se como resultado final, o análogo de somatostatina marcado com tecnécio-99m, utilizando-se o método descrito nesta invenção, sob a forma do reagente.

Um segundo aspecto da invenção está relacionado ao reagente para diagnóstico obtido, que apresenta as seguintes características: volume final variando de 70 a 3000 μΙ_, uma solução translúcida com eficiência de marcação de superior a 95%.

Outro aspecto a ser ressaltado na presente invenção está relacionado ao método diagnóstico "in vivo" onde a aquisição de imagens cintilográficas com o reagente diagnóstico da presente invenção, deve obedecer a um protocolo específico para cada doença que está sendo diagnosticada. A seguir está descrito um dos protocolos, por nós realizado, utilizado para os pacientes com oftalmopatia de Graves.

Para a aquisição das imagens os pacientes com doença de Graves serão posicionados, em decúbito dorsal, com o colimador de baixa energia no detector da câmara de cintilação direcionado, em incidência anterior, na cabeça do paciente estando a mesma em ângulo de 90 graus com o solo, 5, 10, 15 e 30 minutos, 1 , 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas após a injeção intravenosa de 370MBq (10 mCi) do tecnécio-99m-octreotida. O tempo dè obtenção das imagens planares será de 5 minutos cada, em matriz de 256 X 256 e 13 minutos no caso de cortes tomográficos (SPECT), com matriz de 256 X 256.

No processamento das imagens, é construída a área de interesse, e feito, pelo computador, o cálculo da contagem radioativa destas áreas. Com base neste cálculo, faz-se uma comparação entre os resultados obtidos nas diferentes aquisições, para verificação de um possível acúmulo do radiofármaco, ao longo do tempo.

O método acima descrito não é exaustivo, pode ser aplicado em outras afecções tais como outras doenças endocrinológicas, doenças neurológicas, doenças auto-imunes, doenças granulomatosas, doenças pulmonares, tumores neuroendócrinos, tumores cerebrais, além de toda e qualquer doença que envolva receptores de somatostatina. Um último aspecto da invenção relaciona-se a um kit de diagnóstico a base do radiofármaco acima descrito.

Seria um kit para uso em cintilografias. Seriam jogos de reativos liofilizados, estéreis e apirogênicos, em atmosfera de nitrogénio contendo cada um: 20 μg do peptídeo, especialmente a octreotida e 5 μ9 do agente redutor, especialmente o cloreto estanoso. Para o preparo dos jogos de reativos é necessária a adição de tecnécio-99m que é facilmente obtido através de geradores de Mo-99/Tc-99m com tecnologia plenamente dominada pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN) da Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN), que distribui este sistema para todos os Serviços de Medicina Nuclear do país, possibilitando uma disponibilidade deste radionuclídeo a custo reduzido. As características da solução após o preparo são; solução límpida, incolor, estéril e apirogênica, com eficiência de marcação superior a 95% e estabilidade até 24 h após a marcação.

Para melhor compreensão da presente invenção seguem-se os seguintes exemplos ilustrativos:

EXEMPLO I: PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANÁLOGO DA SOMATOSTATINA COM o RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M

Alíquotas do peptídeo octreotida em concentração de 0,1 mg/mL em volume de 200 μί foram incubadas com 50 μg/mL do agente redutor cloreto estanoso em um volume de 100 μΐ obtendo-se uma solução límpida e incolor após incubação por dez minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m num volume de 300 μΙ_ com atividade de 100μΟί em ensaios "in vitro"e 10 mCi em ensaios "in vivo", obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, incolor, estéril e apirogênico a base do análogo de somastotatina marcado com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro millipore de 0,22μιη.

EXEMPLO II: PROCESSO DE MARCAÇÃO DO ANÁLOGO DA SOMATOSTATINA COM O RADIONUCLÍDEO TECNÉCIO 99M - ESTUDO DA CONCENTRAÇÃO IDEAL DO CLORETO ESTANOSO UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL WHATMAN N° 1

A concentração de cloreto estanoso é um fator de relevância no processo de marcação de moléculas com Tc-99m. Foram avaliadas diversas concentrações do cloreto estanoso (10, 20, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL) a fim de verificar a eficiência de marcação do análogo da somatostatina com Tc-99m. Nesta etapa as soluções foram filtradas com milipore 0,22μιη. Assim, observou- se que a melhor concentração de SnCI ₂ .H ₂ 0 para a marcação do análogo da somatostatina é de 50 μg/mL e que o melhor solvente foi a acetona. EXEMPLO III: Processo de Marcação da Octreotida com o Radionuclídeo TECNÉCIO 99m - Estudo da Estabilidade da Marcação Utilizando Cromatografia em Papel WHATMAN N°1

Com este método, verificou-se através da realização de sucessivos ensaios cromatográficos, a estabilidade de marcação do complexo 99mTc- octreotida, tendo sido esta estável até pelo menos 24 horas.

Exemplo IV: Processo de Marcação da Octreotida com o Radionuclídeo

TECNÉCIO 99m - Estudo Cintiloqráfico em Ratos

Para estabelecimento do mapeamento cintilográfico o 99m-Tc- octreotida, foi injetado em ratos Wistar. Na figura 1 é mostrada uma cintilografia feita com 99m-Tc-octreotida, através da técnica por nós desenvolvida. O radiofármaco marcado distribuiu-se em rins e bexiga.