Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lokalisieren und Verfolgen von Emittern in einer Probe, insbesondere nach dem MINFLUX-Prinzip oder STED-MINFLUX-Prinzip sowie ein Lichtmikroskop, insbesondere ein MINFLUX-Mikroskop oder STED-MINFLUX-Mikroskop, und ein Computerprogramm zur Durchführung des Verfahrens.

Stand der Technik

Unter dem Begriff „MINFLUX-Mikroskopie“ bzw. „MINFLUX-Verfahren“ werden bestimmte Lokalisierungs- und Trackingverfahren für vereinzelte Emitter zusammengefasst, bei denen am Fokus in der Probe eine Lichtverteilung von Beleuchtungslicht, das die Lichtemission des Emitters induziert oder moduliert, erzeugt wird, wobei die Lichtverteilung ein lokales Minimum aufweist, und bei denen die Position eines vereinzelten Emitters durch Erfassen von Lichtemissionen des Emitters bestimmt wird, wobei ausgenutzt wird, dass von dem Emitter umso weniger Licht emittiert wird, je geringer der Abstand zwischen dem Emitter und dem Minimum der Lichtverteilung ist. Aufgrund der letztgenannten Tatsache sind MINFLUX-Verfahren, insbesondere im Vergleich zu sogenannten PALM/STORM-Lokalisierungsverfahren, besonders photoneneffizient. Zusätzlich ergibt sich bei bestimmten Ausführungen des Verfahrens auch der Vorteil, dass die zu lokalisierenden oder zu verfolgenden Emitter im Vergleich zu anderen Lokalisierungsmethoden mit relativ wenig Licht beaufschlagt werden und daher weniger gebleicht werden.

Bei den vereinzelten lichtemittierenden Emittern handelt es sich insbesondere um Fluorophore und das Beleuchtungslicht ist insbesondere Anregungslicht, welches die Fluorophore anregt, woraufhin diese Fluoreszenzlicht aussenden. Alternativ kann es sich bei den Emittern z.B. auch um lichtstreuende Partikel, wie etwa Gold-Nanopartikel handeln.

Die Lichtverteilung mit dem lokalen Minimum kann insbesondere 2D-donutförmig oder 3D- donutförmig (bottle-bea m-förmig) sein. Ein Verfahren der oben beschriebenen Art wurde in der Patentanmeldung DE 10 2011 055 367 A1 für das Einzelmolekül-Tracking beschrieben. Gemäß der dort offenbarten Methode wird die Position eines einzelnen Fluorophors über die Zeit verfolgt, indem eine Anregungslichtverteilung mit lokalem Minimum dem Fluorophor so nachgeführt wird, dass die Fluoreszenzemissionsrate minimal ist.

Die Patentanmeldung DE 10 2013 114 860 A1 beschreibt insbesondere ein Lokalisationsverfahren, bei dem die Probe an Rasterpunkten mit dem lokalen Minimum einer Anregungslichtverteilung abgetastet wird, um einzelne Fluorophore zu lokalisieren.

Der Begriff „M INFLUX“ wird zum ersten Mal in der Publikation „Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynnä AH, Westphal V, Stefani FD, Elf J, Hell SW. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 2017 Feb 10;355(6325):606-612“ verwendet. Bei der dort beschriebenen Methode wird das MINFLUX-Prinzip konkret umgesetzt, indem ein einzelner Fluorophor zunächst durch Abtasten mit einer ersten gaußförmigen Anregungslichtverteilung vorlokalisiert wird und anschließend eine zweite donutförmige Anregungslichtverteilung an Punkten platziert wird, die ein symmetrisches Muster von Beleuchtungspositionen um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position des Fluorophors bilden. Aus den für die einzelnen Beleuchtungspositionen registrierten Photonenzahlen wird dann mit einem maximum-likelihood-Schä zer die Position des Fluorophors auf wenige Nanometer genau bestimmt.

Weitere Varianten und Ausführungsformen einer MINFLUX-Lokalisierung sind in den Patentanmeldungen DE 10 2016 119 262 A1 , DE 10 2016 119 263 A1 und DE 10 2016 119 264 A1 beschrieben.

Die Publikation „Gwosch KC, Pape JK, Balzarotti F, Hoess P, Ellenberg J, Ries J, Hell SW. MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells. Nat Methods. 2020 Feb;17(2):217-224“ beschreibt iterative 2D- und 3D-MINFLUX-Lokalisierungsverfahren. Dabei wird die Probe in mehreren Iterationsschritten an Beleuchtungspositionen mit dem Minimum einer donutförmigen Anregungslichtverteilung beleuchtet, wobei die Beleuchtungspositionen ein um die im jeweils vorhergehenden Schritt geschätzte Position des Fluorophors zentriertes symmetrisches Beleuchtungsmuster bilden, und wobei die Beleuchtungspositionen in jedem Iterationsschritt enger um die aktuell geschätzte Position des Fluorophors platziert werden. Hierdurch lässt sich in wenigen Schritten eine sehr hohe Positionsgenauigkeit erreichen.

Eine weiteres iteratives MINFLUX-Lokalisations- und Tracking-Verfahren unter Verwendung eines abgewandelten Positionsschätzers und auf Basis eines kommerziellen Mikroskop-Aufbaus ist in „Schmidt R, Weihs T, Wurm CA, Jansen I, Rehman J, Sahl SJ, Hell SW. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nat Commun. 2021 Mar 5;12(1):1478“ beschrieben.

Das Licht, welches die Lichtemission der Emitter induziert oder moduliert, kann z.B. auch STED (stimulated emission dep/et/Y/on)-Licht sein. So beschreiben die Patentanmeldungen DE 10 2017 104 736 A1 und EP 3 372 989 A1 MINFLUX-artige Verfahren, die auf einer Überlagerung einer Anregungslichtverteilung mit lokalem Maximum mit einer STED-Lichtverteilung mit lokalem Minimum beruhen. Die Probe wird durch Verlagerung der STED-Verteilung mit dem STED- Minimum abgetastet und aus den gemessenen Werten der Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Positionen der STED-Intensitätsverteilung wird die Position des Fluorophors bestimmt. Hierbei emittiert der Fluorophor im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen MINFLUX- Verfahren mit abnehmendem Abstand von dem lokalen Minimum mehr Licht. Solche Verfahren werden auch als „STED-MINFLUX-Verfahren“ bezeichnet.

Die Patentanmeldung WO 2020/128106 A1 sowie die Publikation „Masullo LA, Steiner F, Zähringer J, Lopez LF, Bohlen J, Richter L, Cole F, Tinnefeid P, Stefani FD. Pulsed Interleaved MINFLUX. Nano Letters 2021 , 21 (1), 840-846“ beschreiben unter anderem Ausführungsformen von MINFLUX-Lokalisierungsverfahren, bei denen die Positionen, an denen die Probe mit dem Minimum der Anregungslichtverteilung beleuchtet wird, durch Anordnungen von Lichtleitfasern fest vorgegeben sind, wobei das Anregungslicht durch einen Pulslaser erzeugt wird, und wobei einzelne Anregungslichtpulse zeitlich versetzt durch die verschiedenen Faserenden der Lichtleitfasern ausgegeben werden.

Die Veröffentlichung „Masullo LA, Lopez LF, Stefani FD. A common framework for singlemolecule localization using sequential structured illumination. Biophysical Reports 2022 2(1), 100036” beschreibt eine als RASTMIN bezeichnete Variante der MINFLUX-Technik, bei dem ein kleiner Bereich innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes, das einen einzelnen Emitter enthält, in einem kartesischen Raster mit dem Minimum einer donutförmigen Anregungslichtverteilung abgetastet wird, wobei aus den erfassten Lichtintensitäten die Position des Emitters bestimmt wird.

In der Publikation “Slenders E, Vicidomini G. ISM-FLUX: single-step MINFLUX with an array detector. bioRxiv; 2022. DOI: 10.1101/2022.04.19.488747“ ist ein MINFLUX- Verfahren beschrieben, bei dem das von einem einzelnen Fluorophor emittierte Licht mittels eines Array- Detektors positionsabhängig erfasst wird, um in einem einzigen Lokalisationsschritt nicht-iterativ, ohne Repositionierung des Beleuchtungsmusters und ohne Vorlokalisation die Position des Fluorophors zu bestimmen. Die Veröffentlichung „Brakemann, T., Stiel, A., Weber, G. et al. A reversibly photoswitchable GFP- like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol 29, 942-947 (2011). https://doi.org/10.1038/nbt.1952“ beschreibt einen Fluoreszenzemitter (eine Variante des grün fluoreszierenden Proteins), der sich durch Bestrahlung mit Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen anregen, aktivieren und reversibel inaktivieren lässt.

Bei einigen der im Stand der Technik beschriebenen MINFLUX-Verfahren wird die Probe zunächst mit Aktivierungslicht beleuchtet, um Fluorophore in einem bestimmten Bereich der Probe in den fluoreszenten Zustand zu überführen. Bei anderen bekannten MINFLUX-Methoden wird die Probe in einem Vorlokalisierungsschritt mit Beleuchtungslicht abgescannt. Wird bei diesem Verfahren ein Fluoreszenzsignal über dem Hintergrund erfasst, so wird dies als Indiz für das Vorhandensein eines Fluorophors gedeutet. An der Position, an dem die Probe mit Aktivierungslicht beaufschlagt wurde oder an der Position, an der Fluoreszenz detektiert wurde, wird die Probe dann mit der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts beleuchtet, um die Lokalisierung oder das Verfolgen eines einzelnen Fluorophors durchzuführen.

Bei diesen Methoden ist nicht feststellbar, ob sich an der beleuchteten Stelle der Probe tatsächlich ein einzelner Fluorophor oder mehrere Fluorophore befinden.

Werden nun tatsächlich zwei oder mehr Fluorophore mit einem MINFLUX-Verfahren nach dem Stand der Technik lokalisiert oder verfolgt, können hauptsächlich zwei Fälle auftreten: Entweder einer der beiden Fluorophore geht, z.B. durch Bleichen, in einen Dunkelzustand über oder diffundiert aus dem Messbereich heraus oder beide Fluorophore sind auf der Zeitskala der Messung kolokalisiert. Im ersten Fall wird einer der Fluorophore weiter lokalisiert oder verfolgt, im zweiten Fall erhält man eine mittlere Position der beiden Fluorophore.

Bei den MINFLUX-Methoden nach dem Stand der Technik werden weitere Fluorophore in der Nähe des Messbereichs nicht berücksichtigt. Die Beleuchtungssequenz ist immer nur auf einen Fluorophor abgestimmt.

Um einen steilen Intensitätsgradienten um das Minimum der Anregungslichtverteilung zu erhalten, müssen bei MINFLUX-Verfahren relativ hohe Leistungen des Anregungslichts verwendet werden. Dadurch ist die Lichtintensität am Maximum der Anregungslichtverteilung so hoch, dass Fluorophore, die in den Bereich dieses Maximums geraten, relativ schnell bleichen können. Dies betrifft insbesondere bei 3D-MINFLUX-Verfahren nicht nur Fluorophore in der Fokusebene sondern auch solche, die sich axial über oder unter der Fokusebene befinden, da die bei diesen Methoden verwendeten Lichtverteilungen (insbesondere sogenannte 3D-Donuts oder bottle beams) starke Maxima oberhalb und unterhalb des geometrischen Fokus aufweisen. Fluorophore um den Messbereich herum werden dadurch bei herkömmlichen MINFLUX- Verfahren mit hoher Wahrscheinlichkeit irreversibel gebleicht. Dies verhindert das Lokalisieren oder Verfolgen dieser Fluorophore in einem späteren MINFLUX-Schritt. Die aus mehreren MINFLUX-Schritten erhaltenen Lokalisierungskarten weisen deshalb häufig eine zu geringe Lokalisationsdichte auf, die nur unzureichend die tatsächliche Verteilung der Fluorophore in der Probe widerspiegelt.

Weiterhin kann die Anregung von Fluorophoren in der Nähe des Messbereichs durch das Maximum der Anregungslichtverteilung zur Hintergrundfluoreszenz betragen. Diese Art der Hintergrundfluoreszenz ist inhomogen verteilt und trägt somit bei der MINFLUX-Lokalisierung zu einem systematischen Fehler bei, der schwierig korrigierbar ist und die Unsicherheit der Lokalisierung erhöht.

Ein ähnliches Problem besteht bei der Mehrfarben-Lokalisierung und beim Mehrfarben- Einzelmolekül-Tracking nach dem MINFLUX-Prinzip. Hier kann die Anregung eines ersten Fluorophors mit dem Maximum der Intensitätsverteilung zu einem störenden Signal im Detektionskanal eines zweiten Fluorophors führen, wenn die Emissionsspektren des ersten und des zweiten Fluorophors überlappen. Dieses Übersprechen (auch als cross-talk bezeichnet) ist schon bei geringfügigen spektralen Überlappungen problematisch, da die Anregungsintensität am Maximum die Intensitäten in der Nähe des Minimums, mit welchen das zweite Fluorophor bei der MINFLUX-Beleuchtungssequenz angeregt wird, um ein Vielfaches übersteigt. Dies führt zu systematischen Fehlern bei Mehrfarben-MINFLUX-Verfahren.

Aufgabe der Erfindung

Hieraus ergibt sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Lokalisierung oder Verfolgung von Emittern nach dem MINFLUX-Prinzip derart zu verbessern, dass das Fotobleichen, die Hintergrund- Fluoreszenz und/oder das Übersprechen in andere Detektionskanäle reduziert ist.

Lösung

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1 (Verfahren), 19 (Lichtmikroskop) und 20 (Computerprogramm) gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 18 und werden im Folgenden beschrieben.

Beschreibung der Erfindung

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lokalisierung oder zum Verfolgen von Emittern in einer Probe, umfassend das Beleuchten der Probe mit Beleuchtungslicht, insbesondere Anregungslicht, wobei das Beleuchtungslicht Lichtemissionen von Emittern in der Probe induziert oder moduliert, das Erfassen der Lichtemissionen aus einem ersten Bereich in der Probe, das Ermitteln, ob sich in dem ersten Bereich zusätzlich zu einem ersten Emitter, der mit einer Beleuchtungssequenz mit einer Mehrzahl von Beleuchtungsschritten lokalisiert oder verfolgt werden soll, mindestens ein zweiter Emitter befindet, auf Basis der erfassten Lichtemissionen, das Durchführen der Beleuchtungssequenz, wobei die Probe in den Beleuchtungsschritten jeweils mit einer ein lokales Minimum und mindestens ein Maximum aufweisenden Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts oder eines anderen Lichts, das Lichtemissionen der Emitter induziert oder moduliert, beleuchtet wird, derart dass die Probe in den Beleuchtungsschritten an mindestens einem Punkt mit unterschiedlichen Lichtintensitäten beleuchtet wird, wobei das lokale Minimum der Intensitätsverteilung in den Beleuchtungsschritten in einem zweiten Bereich um eine vermutete Position des ersten Emitters in der Probe positioniert wird (insbesondere wobei der zweite Bereich kleiner ist als der erste Bereich), wobei Lichtemissionen des ersten Emitters für die jeweiligen Beleuchtungsschritte erfasst werden, und das Bestimmen der Position des ersten Emitters in der Probe aus den für die jeweiligen Beleuchtungsschritte erfassten Lichtemissionen. Gemäß einer ersten Alternative wird die Beleuchtungssequenz abhängig davon angepasst oder festgelegt, ob ermittelt wurde, dass sich mindestens ein zweiter Emitter in dem ersten Bereich befindet. Gemäß einer zweiten Alternative wird eine geschätzte Position des mindestens einen zweiten Emitters bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters berücksichtigt.

Unter dem Begriff „Emitter“ sind Moleküle, Molekülkomplexe oder Partikel zu verstehen, die bei Beleuchtung mit dem Beleuchtungslicht Licht emittieren. Bei dem emittierten Licht kann es sich insbesondere um Fluoreszenzlicht, Rayleigh-Streulicht oder Raman-Streulicht handeln. Ein Emitter kann dabei insbesondere bei einer beugungsbegrenzten Abbildung mit einem Lichtmikroskop als Punktlichtquelle betrachtet werden, hat also insbesondere eine Ausdehnung im Bereich der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie oder darunter. Die Emitter können z.B. einzelne Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe), mit einem oder mehreren Fluorophoren markierte Moleküle oder Molekülkomplexe oder sogenannte quantum dots sein. Die Fluoreszenzfarbstoffe können durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Moleküle gebunden sein. Biologische Makromoleküle wie Proteine werden z.B. häufig durch Bindung an Antikörper nachgewiesen, die wiederum kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen verknüpft sind. Weiterhin kann ein Emitter im Sinne der Erfindung z.B. auch ein lichtstreuendes Nanopartikel, etwa ein Gold- Nanopartikel, sein.

Die Begriffe „erster Emitter“ und „zweiter Emitter“ werden im Kontext dieser Offenbarung lediglich zur Unterscheidung verwendet, mit welchem Emitter die Beleuchtungssequenz durchgeführt wird, um ihn zu lokalisieren oder zu verfolgen und von welchen weiteren Emittern in der Probe die Position geschätzt wird, um sie im Hinblick auf das Fotobleichen, den Hintergrund und/oder das Übersprechen in andere Detektionskanäle (Cross-Talk) bei der Lokalisierung oder dem Verfolgen des ersten Emitters zu berücksichtigen. Selbstverständlich können die ersten Emitter und die zweiten Emitter derselben Spezies angehören, also insbesondere dasselbe Anregungs- und Emissionsspektrum und dieselbe Emissionslebensdauer haben. Sie können aber auch unterschiedlichen Spezies angehören. Natürlich kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Emitter, der in einem ersten Lokalisierungsschritt, in dem ein anderer Emitter lokalisiert wird, der Kategorie „zweiter Emitter“ angehört, in einem anschließenden zweiten Lokalisierungsschritt zur Kategorie „erster Emitter“ gerechnet werden, da er in diesem Schritt selbst lokalisiert wird.

Unter einer „Lokalisierung“ wird im Kontext der vorliegenden Anmeldung ein Verfahren verstanden, bei dem eine Position (in ein bis drei Dimensionen) eines Emitters in einer Probe bestimmt wird, wobei der Emitter insbesondere auf der Zeitskala des Experiments im Wesentlichen stationär in der Probe angeordnet sein kann. Bei der Lokalisierung kann sich der Emitter selbstverständlich relativ zu einem durch das Objektiv gegebenen Bezugssystem bewegen, beispielsweise durch Drift, die durch bekannte Kompensationsmethoden ausgeglichen werden kann. Durch die Position des Emitters kann bei der Lokalisierung insbesondere die Position eines mit dem Emitter markierten Moleküls, Molekülkomplexes und Partikel ermittelt werden. In der Praxis der Lokalisationsmikroskopie werden meist eine Vielzahl von Emittern in der Probe nacheinander lokalisiert und es wird aus den einzelnen Lokalisierungen ein Bild von Strukturen in der Probe berechnet.

Im Gegensatz dazu wird als „Verfolgen“ eines Emitters das Bestimmen mehrerer Positionen des Emitters über die Zeit bezeichnet, wobei sich der Emitter insbesondere relativ zu anderen Probenstrukturen bewegen kann. Durch diese auch als „Tracking“ bekannte Methode können z.B. Trajektorien einzelner mit Fluoreszenzfarbstoffen markierter Moleküle erstellt werden. So lassen sich insbesondere dynamische Prozesse untersuchen.

Die Beleuchtungssequenz umfasst mehrere Beleuchtungsschritte, in denen jeweils das Minimum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts an unterschiedlichen Positionen in dem zweiten Bereich um die vermutete Position des ersten Emitters angeordnet wird oder bei denen unterschiedliche Intensitätsverteilungen an derselben Position oder an unterschiedlichen Positionen in dem zweiten Bereich angeordnet werden. In allen beschriebenen Fällen werden gewisse Positionen in der Probe mit unterschiedlichen Lichtintensitäten beaufschlagt, insbesondere entlang eines Intensitätsgradienten. Aus mindestens zwei Messungen der Lichtemissionen und den bekannten Positionen und Verläufen der Intensitätsverteilung bzw. - Verteilungen lässt sich dann mit einem Positionsschätzer eine vermutete Lage eines Emitters errechnen.

Gemäß einer Ausführungsform wird das lokale Minimum der Intensitätsverteilung in der Beleuchtungssequenz, insbesondere nacheinander, an Beleuchtungspositionen positioniert, die ein Beleuchtungsmuster bilden, wobei die Beleuchtungspositionen des Beleuchtungsmusters in dem zweiten Bereich um die vermutete Position des mindestens einen Emitters angeordnet werden, insbesondere wobei die Beleuchtungspositionen auf einem Abtastkreis oder einer Abtastkugel um die vermutete Position angeordnet sind oder das Beleuchtungsmuster ein Raster von Beleuchtungspositionen ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Beleuchtungssequenz das sequentielle Beleuchten der Probe mit mindestens zwei unterschiedlichen Intensitätsverteilungen.

Da zur Lokalisierung oder zur Verfolgung der Emitter eine Intensitätsverteilung mit einem lokalen Minimum verwendet wird, kann es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere um ein sogenanntes MINFLUX-Verfahren handeln. Bei dem Beleuchtungslicht kann es sich um Anregungslicht handeln, das die Lichtemissionen der Emitter induziert, wobei insbesondere die Lichtemissionen der Emitter Fluoreszenzemissionen sein können, die durch Anregung der Emitter mit dem Anregungslicht auftreten. Bei dem MINFLUX-Verfahren wird dann ausgenutzt, dass die Lichtemissionen eines einzelnen Emitters umso geringer sind, je geringer der Abstand dieses Emitters von dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ist. Dies hat insbesondere den Vorteil eines besonders hohen Informationsgehalts der Lichtemissionen. Alternativ kann bei dem MINFLUX-Verfahren auch Licht als Beleuchtungslicht verwendet werden, das die Lichtemissionen moduliert, z.B. STED (stimulated emission cfep/et/on)-Licht oder Inaktivierungslicht. Dieses wird dann bei einem sogenannten STED-MINFLUX-Verfahren mit fokussiertem Anregungslicht kombiniert. In diesem Fall hängen die von dem Anregungslicht induzierten Lichtemissionen vom Abstand der tatsächlichen Emitterposition von dem lokalen Minimum des Lichts, das die Lichtemissionen moduliert, derart ab, dass umso mehr Lichtemissionen auftreten, je geringer dieser Abstand ist.

Erfindungsgemäß wird die Beleuchtungssequenz abhängig davon angepasst oder festgelegt, ob ermittelt wurde, dass sich mindestens ein zweiter Emitter in dem ersten Bereich befindet, oder es wird eine geschätzte Position des mindestens einen zweiten Emitters bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters berücksichtigt.

Bei MINFLUX-Methoden und STED-MINFLUX-Methoden nach dem Stand der Technik wird eine Vorabinformation über den Aufenthaltsort des ersten Emitters benötigt, der dann anschließend in einer oder mehreren Beleuchtungssequenzen durch Erfassen seiner Lichtemissionen lokalisiert wird. Die Vorabinformation kann dabei darin bestehen, dass eine bestimmte Stelle der Probe mit Aktivierungslicht beaufschlagt wurde oder sie kann aus einer Vorlokalisierung stammen, die z.B. durch Abtasten der Probe mit fokussiertem Anregungslicht und Erfassen der Lichtemissionen durchgeführt wird.

Erfindungsgemäß wird zusätzlich ermittelt, ob sich weitere, zweite Emitter in dem ersten Bereich befinden, welche die Lokalisierung oder das Verfolgen des ersten Emitters stören könnten. Optional wird weiterhin zumindest mit geringer Auflösung der Aufenthaltsort mindestens eines weiteren zweiten Emitters in der Probe ermittelt. Aus dieser Zusatzinformation lassen sich insbesondere Rückschlüsse darauf ziehen, wie die Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts bei der folgenden Beleuchtungssequenz relativ zu dem mindestens einen zweiten Emitter positioniert ist.

Der zweite Emitter kann dabei ein interessierender Emitter sein, dessen Position nach der Position des ersten Emitters mit möglichst hoher Genauigkeit bestimmt werden soll, um z.B. ein lokalisationsmikroskopisches Bild zu erhalten, oder der nach dem ersten Emitter verfolgt werden soll. In diesem Fall kann die Beleuchtungssequenz unter Verwendung der Zusatzinformation über die Position des zweiten Emitters insbesondere so durchgeführt werden, dass sich der erste Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisieren lässt und dennoch der zweite Emitter nicht oder nur mit geringer Wahrscheinlichkeit gebleicht wird, so dass anschließend eine Beleuchtungssequenz für den zweiten Emitter durchgeführt werden kann.

Aber selbst wenn der zweite Emitter gar nicht lokalisiert werden muss oder soll, kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens die Beleuchtungssequenz insbesondere so durchgeführt werden, dass von dem zweiten Emitter ausgehendes Hintergrundlicht minimiert ist.

Wenn es sich bei dem ersten Emitter und dem mindestens einen zweiten Emitter um unterschiedliche Emittertypen handelt, die z.B. ein unterschiedliches Anregungs- und/oder Emissionsspektrum aufweisen, kann die Beleuchtungssequenz insbesondere auch so durchgeführt werden, dass der zweite Emitter von dem Maximum des Beleuchtungslichts nicht oder nur minimal angeregt wird, so dass das Übersprechen der Lichtemissionen des zweiten Emitters in einen Detektionskanal des ersten Emitters minimiert ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Festlegen der Beleuchtungssequenz können verschiedene Parameter in Abhängigkeit davon angepasst oder festgelegt werden, ob in dem ersten Bereich mindestens ein zweiter Emitter identifiziert wurde. Beispielsweise können die Anzahl und/oder die Lage von Beleuchtungspositionen eines Beleuchtungsmusters, an denen das lokale Minimum der Intensitätsverteilung während der Beleuchtungssequenz angeordnet wird, eingestellt werden. Dabei kann z.B. auch die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters angepasst werden. Weiterhin kann die Intensitätsverteilung selbst angepasst werden, z.B. durch Anpassung der Gesamtintensität. Eine Erhöhung der Gesamtintensität führt z.B. zu einem steileren Intensitätsgradienten um das lokale Minimum herum, eine niedrigere Gesamtintensität zu einem flacheren Gradienten, aber einer geringeren Gefahr, den mindestens einen zweiten Emitter zu bleichen. Wenn die Beleuchtungssequenz in mehreren Iterationen durchgeführt wird, kann z.B. auch die Anzahl der Iterationsschritte, die Veränderung der maximalen Ausdehnung des Beleuchtungsmusters und/oder die Gesamtintensität in den einzelnen Iterationsschritten angepasst werden. Eine weitere Möglichkeit der Anpassung der Beleuchtungssequenz besteht darin, die Länge der Beleuchtungsschritte oder einen Grenzwert der erfassten Lichtemissionen (insbesondere ein Photonenlimit), nach dessen Erreichen der nächste Schritt durchgeführt wird, einzustellen. Weiterhin fällt auch die Auswahl des Bereichs in der Probe, um den ein Beleuchtungsmuster angeordnet wird, unter das Festlegen der Beleuchtungssequenz. Da bei vielen MINFLUX-Verfahren ein Beleuchtungsmuster um eine geschätzte Position eines Emitters positioniert wird, kann dies insbesondere auch die Auswahl eines von mehreren Emittern als ersten Emitter umfassen, mit dem die Beleuchtungssequenz durchgeführt wird.

Das Festlegen der Beleuchtungssequenz kann außerdem insbesondere auch darin bestehen, dass für einen bestimmten Probenbereich keine Beleuchtungssequenz durchgeführt wird. Dann kann z.B. zu einem späteren Zeitpunkt (insbesondere nach der Durchführung der Beleuchtungssequenz an einer anderen Stelle) erneut die Positionen des mindestens einen zweiten Emitters (und insbesondere auch des ersten Emitters) geschätzt werden. Unter Umständen ergibt sich zu diesem Zeitpunkt eine im Hinblick auf das Fotobleichen, den Hintergrund und das Übersprechen in andere Detektionskanäle deutlich günstigere relative Verteilung der aktiven Emitter in der Probe. Die vorab erfassten Lichtemissionen können dennoch gespeichert werden und unter Umständen bei der späteren Positionsbestimmung berücksichtigt werden.

Alternativ zu dem Festlegen der Beleuchtungssequenz kann die geschätzte Position des mindestens einen zweiten Emitters (also die vorab erhaltene Zusatzinformation) auch bei der Positionsbestimmung des ersten Emitters berücksichtigt werden. Das kann insbesondere bedeuten, dass ein Rechenverfahren, mit dem die Position des ersten Emitters bestimmt wird, angepasst wird, so dass auch die Position des mindestens einen zweiten Emitters in die Berechnung einfließt. Beispielsweise können aus der Position des mindestens einen zweiten Emitters Korrekturterme abgeleitet werden, welche den Einfluss des von dem mindestens einen zweiten Emitter ausgesendeten Hintergrundlichts oder den Einfluss eines Übersprechens der Lichtemissionen des mindestens einen zweiten Emitters in einen Detektionskanal des ersten Emitters repräsentieren. Insbesondere kann mindestens eine Zeitreihe der erfassten Lichtemissionen aufgezeichnet werden, d.h. insbesondere in einer Speichereinheit abgelegt werden. Weiter insbesondere kann für jede Beleuchtungsposition eine separate Zeitreihe der erfassten Lichtemissionen aufgezeichnet werden. Aus solchen Daten können dann, insbesondere kombiniert mit der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters, weitere Informationen gewonnen werden. Insbesondere kann in einem nach der Beleuchtungssequenz durchgeführten separaten Berechnungsschritt die Position des ersten Emitters korrigiert werden, um eine noch höhere Genauigkeit zu erhalten. Z.B. kann ein Zeitpunkt während der Beleuchtungssequenz ermittelt werden, zu dem der zweite Emitter ausgeblichen oder in einen reversiblen inaktiven Zustand übergegangen ist. Die Korrektur der von dem zweiten Emitter ausgehenden Hintergrundemission oder des Übersprechens in den Detektionskanal des ersten Emitters kann dann insbesondere nur für die Daten durchgeführt werden, die aus einem Zeitintervall der Beleuchtungssequenz stammen, in dem der zweite Emitter Licht emittiert hat.

Gemäß einer Ausführungsform wird bei dem Anpassen oder Festlegen der Beleuchtungssequenz eine Gesamtintensität des Beleuchtungslichts abhängig davon eingestellt, ob ermittelt wurde, dass sich mindestens ein zweiter Emitter in dem ersten Bereich befindet. Insbesondere kann die Gesamtintensität reduziert werden, wenn ermittelt wurde, dass sich mindestens ein zweiter Emitter in dem ersten Bereich befindet. Dies kann zwar die Geschwindigkeit der Lokalisierung reduzieren, da weniger Lichtemissionen pro Zeiteinheit induziert werden, vermindert aber vorteilhafterweise die Gefahr des Fotobleichens des mindestens einen zweiten Emitters.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Position des mindestens eines zweiten Emitters in der Probe auf Basis der aus dem ersten Bereich der Probe erfassten Lichtemissionen geschätzt, wobei die Beleuchtungssequenz auf Basis der geschätzten Position angepasst oder festgelegt wird oder wobei die geschätzte Position bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters berücksichtigt wird. Durch die Positionsschätzung des mindestens einen zweiten Emitters kann die Beleuchtungssequenz vorteilhafterweise noch besser angepasst oder günstiger festgelegt werden, um das Fotobleichen, den Hintergrund und/oder den Cross-Talk zu reduzieren.

Das Beleuchtungslicht kann zur Erfassung der Lichtemissionen zur Schätzung der Positionen des mindestens einen zweiten Emitters (und optional auch des mindestens einen ersten Emitters) z.B. im Weitfeld beleuchtet werden. Alternativ dazu kann ein Bereich der Probe z.B. mit einem regulären gaußförmigen Fokus des Beleuchtungslichts oder mit einer Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts mit lokalem Minimum gescannt werden, beispielsweise mit einem galvanometrischen Scanner oder (insbesondere bei kleinen Scanfeldern) mit elektrooptischen Deflektoren. Statt einem Scan des Lichtstrahls über die Probe (sog. beam scanning) kann natürlich auch ein Probenhalter relativ zu einem stationären Lichtstrahl bewegt werden (sog. stage scanning). Das Detektionslicht (die Lichtemissionen) kann ebenfalls entscannt werden, was aber insbesondere bei Verwendung eines Detektors mit mehreren Detektorelementen nicht notwendig sein muss.

Die Lichtemissionen zur Schätzung der Positionen des mindestens einen zweiten Emitters (und optional auch des ersten Emitters) können mit einem Detektor mit mehreren Detektorelementen oder mit einem Punktdetektor, insbesondere einem konfokalen Punktdetektor, erfasst werden. Dabei kann das Beleuchtungslicht wie oben beschrieben über die Probe gescannt werden und das Detektionslicht kann entscannt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die für die Schätzung der Positionen des mindestens einen zweiten Emitters (und optional auch des ersten Emitters) verwendeten Lichtemissionen mit einem Punktdetektor in mehreren Positionen einer Detektionsebene (insbesondere einer Bildebene bezüglich einer Fokusebene der Probe) erfasst werden, wobei das Beleuchtungslicht relativ zu der Probe stationär ist. Dabei kann insbesondere das Abbild einer konfokalen Lochblende in der Probe, z.B. auf einer Kreisbahn, gescannt werden. Dieses Verfahren kann mit zwei unabhängigen Scaneinheiten verwirklicht werden, wobei sich die erste Scaneinheit (beispielsweise ein Galvoscanner) im gemeinsamen Strahlengang des Beleuchtungslichts und des Detektionslichts befindet, also das Detektionslicht entscannt, während die zweite Scaneinheit (beispielsweise bestehend aus elekrooptischen Deflektoren) im Beleuchtungsstrahlengang positioniert ist, also das Beleuchtungslicht über die Probe scannt, aber das Detektionslicht nicht entscannt. Dann kann z.B. die erste Scaneinheit das Abbild der Lochblende in der Probe auf einer Kreisbahn scannen, während die zweite Scaneinheit die daraus resultierende Kreisbewegung des Beleuchtungslichtstrahls durch gegenläufige Auslenkung kompensiert, so dass das Beleuchtungslicht gegenüber der Probe stationär bleibt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Position des mindestens einen zweiten Emitters in einem Vorlokalisierungsschritt geschätzt, wobei in dem Vorlokalisierungsschritt weiterhin eine initiale Positionsschätzung des ersten Emitters durchgeführt wird. Insbesondere können in dem Vorlokalisierungsschritt die Lichtemissionen des ersten Emitters und die Lichtemissionen des mindestens einen zweiten Emitters mit demselben Detektor erfasst werden, weiter insbesondere mit einem Detektor, der mehrere Detektorelemente aufweist. Ein solcher Detektor erlaubt die parallele Erfassung von Lichtemissionen des ersten Emitters und des mindestens einen zweiten Emitters, inklusive mehrerer zweiter Emitter.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird auf Basis einer geschätzten Position des ersten Emitters, insbesondere der initialen Positionsschätzung, und der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters eine Lokalisierungskarte erstellt. Eine Lokalisierungskarte ist eine zwei- oder dreidimensionale Anordnung von geschätzten Positionen einzelner Emitter, die einen Teil der Probe repräsentiert. Die Lokalisierungskarte wird aus mehreren Lokalisierungen, insbesondere verschiedener Emitter in der Probe, erstellt. Eine solche Lokalisierungskarte muss nicht zwingend auf einer Bildausgabeeinheit wie einem Monitor dargestellt werden, sie kann auch lediglich in Form von Daten, mittels derer die Lokalisierungskarte darstellbar wäre, in einem Speicher abgelegt werden. Die Lokalisierungskarte kann mit verschiedenen Methoden erstellt werden, wobei diese insbesondere nicht auf dem MINFLUX- oder STED-MINFLUX-Prinzip basieren. Die Lokalisierungskarte kann also insbesondere vor der erfindungsgemäßen MINFLUX-Lokalisierung durch eine weitere unabhängige Methode erzeugt werden. Diese kann insbesondere eine im Vergleich zu der MINFLUX- oder STED-MINFLUX-Methode geringere Auflösung bzw. eine höhere Positionsunsicherheit aufweisen. Die Lokalisierungskarte kann z.B. mit einem Detektor mit mehreren Detektorelementen erstellt werden, die in einer Bildebene angeordnet sind, die eine Ebene in der Probe repräsentiert. Alternativ dazu kann die Lokalisierungskarte z.B. auch durch Abtasten eines Probenbereichs mit einer Intensitätsverteilung (z.B. einem gaußförmigen Fokus oder einer Intensitätsverteilung mit lokalem Minimum) von Anregungslicht und Erfassen von Lichtemissionen für verschiedene Abtastpositionen erzeugt werden. Die Lokalisierungskarte hat den Vorteil, dass daraus die relative Anordnung verschiedener Emitter unmittelbar und auf einfache Weise abgelesen oder bestimmt werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Lokalisierungskarte mit einem stochastischen Lokalisierungsverfahren erstellt. Unter dem Begriff „stochastisches Lokalisierungsverfahren“ ist dabei ein Verfahren gemeint, bei dem aus einer Mehrzahl von Lokalisierungen vereinzelter Partikel in der Probe eine Lokalisierungskarte der Partikel mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze (sog. Abbe-Grenze, die durch die Wellenlänge des Lichts und die numerische Apertur des Objektivs bestimmt wird) erstellt wird, wobei die Partikel oder mit den Partikeln gekoppelte Emitter stochastisch zwischen einem emittierenden Zustand und einem nichtemittierenden Zustand wechseln. Dabei können die Bedingungen insbesondere so eingestellt werden, dass diejenigen Partikel oder Emitter, die sich jeweils in einer Lokalisierung in dem emittierenden Zustand befinden, einen Abstand oberhalb der Beugungsgrenze aufweisen. Der stochastische Übergang zwischen dem nicht-emittierenden Zustand und dem emittierenden Zustand kann z.B., wie aus der sogenannten PALM-Technik (photoactivated localization microscopy) bekannt, durch Beleuchten der Probe mit Aktivierungslicht hervorgerufen werden. Alternativ können auch die chemischen Bedingungen in der Probe so eingestellt werden, dass die Partikel bzw. Emitter mit einer gewünschten Frequenz blinken, d.h. spontan zwischen dem emittierenden und dem nicht-emittierenden Zustand wechseln. Dies wird beispielsweise bei der sogenannten dSTORM-Technik (direct stochastic optical reconstruction microscopy) und bei der SOFI-Technik (superresolution optical fluctuation imaging) ausgenutzt, wobei bei der letztgenannten Technik insbesondere bei der Datenauswertung eine Autokorrelationsfunktion verwendet wird, um einzelne Emitter voneinander zu trennen. Es werden also gemäß einer Ausführungsform mehrfach nacheinander Lichtemissionen des mindestens einen Emitters erfasst, wobei anschließend aus mehreren Datensätzen die Lokalisierungskarte erstellt wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Lokalisierungskarte eine Auflösung unterhalb einer Beugungsgrenze auf. Die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie (auch als Abbe-Grenze bezeichnet) hängt von der Wellenlänge des Lichts und der numerischen Apertur des Objektivs ab. Eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze bietet die Möglichkeit, Objekte mit einer geringeren Ausdehnung als die Beugungsgrenze aufzulösen, ist also gleichbedeutend mit einer besseren Auflösung als die Beugungsgrenze.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Lichtemissionen des ersten Emitters und/oder des mindestens einen zweiten Emitters mit einem mehrere Detektorelemente aufweisenden Detektor, insbesondere einer Kamera oder einer zweidimensionalen Anordnung von Photodioden (z.B. einem sogenannten Array von APDs, avalanche photodiodes) erfasst. Dabei können die Detektorelemente die Lichtemissionen insbesondere positionsabhängig in einer Detektionsebene erfassen. Die Detektionsebene kann insbesondere konfokal zu einer Fokusebene in der Probe sein, die einen geometrischen Fokus des Beleuchtungslichts enthält, d.h. die Detektionsebene ist eine Bildebene bezüglich der Fokusebene in der Probe. Insbesondere können die Detektorelemente des Detektors einzeln auslesbar sein.

Dies hat den Vorteil, dass bei entsprechender Größe der Fläche, welche von den Detektorelementen abgedeckt ist, und bei entsprechender optischer Abbildung in die Detektionsebene die Lichtemissionen mehrerer Emitter parallel erfasst werden können. Ausgehend von diesen Lichtemissionen lassen sich parallel die Positionen mehrerer zweiter Emitter oder sowohl des ersten Emitters als auch des mindestens einen zweiten Emitters schätzen.

Die Positionsschätzung eines vereinzelten Emitters kann dabei z.B., wie aus der stochastischen Lokalisationsmikroskopie (insbesondere PALM/STORM und SOFI) bekannt, durch Bestimmen eines Zentroids einer von den Detektorelementen erfassten Verteilung von Lichtemissionen oder durch Anpassen einer Funktion (z.B. einer zweidimensionalen Gauß-Funktion) an eine solche Verteilung erfolgen. Alternativ dazu kann z.B. auch ein statistisches Moment (insbesondere das erste Moment) einer solchen Verteilung ermittelt werden oder es kann ein Positionsschätzer, z.B. ein maximum-likelihood-Sc ätzer oder ein /easf-mean-square-Schätzer, verwendet werden. Dabei können die Lichtemissionen insbesondere zu mehreren aufeinanderfolgenden Zeitpunkten erfasst werden, so dass mehrere Verteilungen von Lichtemissionen erhalten werden. Diese können z.B. unterschiedliche Zustände der Emitter widerspiegeln. So ist es z.B. möglich, mehrere Verteilungen auf einer Zeitskala aufzunehmen, auf der die Emitter blinken, d.h. spontan zwischen einem aktiven Zustand und einem inaktiven Zustand wechseln. Auf diese Weise können Emitter, die einen geringeren Abstand zueinander aufweisen als die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie, getrennt voneinander dargestellt werden. Dieses Prinzip wird auch bei bestimmten Methoden der stochastischen Lokalisationsmikroskopie (z.B. PALM/STORM) ausgenutzt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden einzelne von den Detektorelementen erfasste Photonen registriert. Dies hat den Vorteil, dass der Detektor mit der Mehrzahl von Detektorelementen nicht nur für die initiale Schätzung der Positionen des mindestens einen zweiten Emitters verwendet werden kann, sondern auch für das Erfassen der Lichtemissionen während der Beleuchtungssequenz zur Lokalisierung des ersten Emitters, also während der MINFLUX- oder STED-MINFLUX-Lokalisierung. Dadurch verringern sich Kosten und Komplexität des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden mit dem Detektor mit den mehreren Detektorelementen oder mit einer an den Detektor gekoppelten Auswerteelektronik Ankunftszeiten der einzelnen Photonen bestimmt. Hieraus lassen sich weitere Informationen ableiten. Z.B. können Zeitreihen der erfassten Photonen Aufschluss über die Anwesenheit weiterer Emitter im Bereich der Beleuchtungssequenz liefern.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die einzelnen Photonen auf Basis einer Korrelationsanalyse einzelnen Emittern in der Probe zugeordnet. Auf diese Weise lassen sich unter bestimmten Umständen mehrere Emitter parallel lokalisieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird mindestens eine Relativposition zwischen der initialen Positionsschätzung oder der vermuteten Position des ersten Emitters und der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters ermittelt, wobei die Beleuchtungssequenz abhängig von der mindestens einen Relativposition angepasst wird oder die mindestens eine Relativposition bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters berücksichtigt wird.

Solche Relativposition können z.B. als Vektoren dargestellt werden. Die Berechnung einer Relativposition zwischen der initialen Positionsschätzung des ersten Emitters und der geschätzten Position eines jeweiligen zweiten Emitters ist bereits vor der Durchführung der Beleuchtungssequenz möglich. Da die Beleuchtungspositionen der Beleuchtungssequenz üblicherweise abhängig von der initialen Positionsschätzung des ersten Emitters gewählt werden, lässt sich aus der berechneten Relativposition die Auswirkung auf den mindestens einen zweiten Emitter auf einfache Weise bestimmen. Z.B. lässt sich aus der Relativposition ableiten, wie nah das Maximum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts während einer Beleuchtungssequenz an den mindestens zweiten Emitter herankommt. Ausgehend davon lässt sich die Beleuchtungssequenz leicht anpassen, um etwa das Fotobleichen, den Hintergrund oder das Übersprechen in andere Detektionskanäle zu minimieren, oder diese Effekte lassen sich im Nachhinein bei der Positionsbestimmung des ersten Emitters berücksichtigen, insbesondere korrigieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird der erste Emitter auf Basis der erfassten Lichtemissionen, insbesondere auf Basis der geschätzten Positionen des mindestens einen zweiten Emitters, weiter insbesondere auf Basis einer Auswertung der Lokalisierungskarte, aus einer Mehrzahl von Emittern ausgewählt. Dies ist, wie weiter oben erläutert, eine mögliche Ausführung der Festlegung der Beleuchtungssequenz. Dabei kann z.B. ein erster Emitter ausgewählt werden, der einen besonders großen Abstand zu mindestens einem zweiten Emitter in der Probe aufweist. Somit wird die Auswirkung des Beleuchtungslichts auf den mindestens einen zweiten Emitter minimiert, so dass dieser z.B. mit geringerer Wahrscheinlichkeit gebleicht wird, weniger zum Hintergrund beiträgt oder weniger zum Übersprechen der Lichtemissionen in den Detektionskanal des ersten Emitters beiträgt. Die Auswahl des ersten Emitters kann automatisch erfolgen, z.B. durch einen Auswahlalgorithmus, der als Eingangsdaten eine Repräsentation der Lokalisierungskarte erhält. Der Algorithmus kann z.B. für jeden Emitter den minimalen Abstand zu benachbarten Emittern berechnen und den Emitter mit dem größten Wert auswählen oder auf Basis einer Simulation der Beleuchtungssequenz ein Optimierungsproblem lösen. Ebenfalls möglich ist die Auswahl des ersten Emitters durch einen trainierten Maschinenlernalgorithmus, z.B. ein neuronales Netzwerk. Alternativ zu der automatischen Auswahl kann die Auswahl auch manuell erfolgen. Dazu kann z.B. einem Benutzer des Lichtmikroskops die Lokalisierungskarte angezeigt werden und der Benutzer kann, etwa durch einen Mausklick einen Emitter auf der Lokalisierungskarte auswählen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der ausgewählte erste Emitter in der Probe vereinzelt.

Mit vereinzelten Emittern sind Emitter gemeint, die optisch trennbar bzw. optisch auflösbar sind. Das kann bedeuten, dass der jeweilige Emitter zu benachbarten Emittern einen Abstand aufweist, der oberhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie liegt. Alternativ ist es aber auch möglich, dass die Lichtemissionen des Emitters während eines Zeitintervalls registriert werden, in welchem ein benachbarter Emitter kein Licht emittiert, z.B. weil er sich (im Fall von Fluorophoren) in einem Dunkelzustand befindet. Auf diese Weise können z.B. Emitter, die einen Abstand unterhalb der Beugungsgrenze haben, aber asynchron blinken, lichtmikroskopisch aufgelöst werden. Dies ist beispielsweise aus stochastischen Lokalisierungsmethoden wie PALM/STORM bekannt. Schließlich ist es auch möglich, Emitter, die einen Abstand unterhalb der Beugungsgrenze aufweisen, aber Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren, durch spektrale Trennung des emittierten Lichts lichtmikroskopisch aufzulösen oder zwei Emitter mit unterschiedlichen Anregungsspektren mit unterschiedlichen Wellenlängen anzuregen, um die Emitter optisch zu trennen. Ebenso können Emitter, die eine unterschiedliche Emissionslebensdauer aufweisen, über die Messung der Lebensdauer (z.B. durch zeitaufgelöste Einzelphotonenzählung) voneinander unterschieden und somit getrennt detektiert werden. Sämtliche dieser Beispiele fallen unter den Begriff „vereinzelte Emitter“. Eine Probe mit vereinzelten Emittern kann insbesondere dadurch erhalten werden, dass die Bedingungen einer Markierung der Probe mit Fluoreszenzfarbstoffen derart angepasst werden, dass sich eine gewünschte Markierungsdichte von Einzelmolekülen in der Probe ergibt, durch gezieltes Fotoaktivieren von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder durch Einstellung der physikochemischen Eigenschaften der Probenumgebung (z.B. durch Reduktionsmittel, Oxidationsmittel und bestimmte Enzyme in der Probe), so dass eine bestimmte Blinkrate der Fluoreszenzfarbstoffe erreicht wird.

Wenn der ausgewählte erste Emitter vereinzelt ist, können benachbarte zweite Emitter betreffende Effekte wie das Fotobleichen der zweiten Emitter, zusätzlicher Hintergrund oder Übersprechen in einen dem ersten Emitter zugeordneten Detektionskanal besonders gut minimiert werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird auf Basis der erfassten Lichtemissionen ermittelt, dass sich in dem ersten Bereich zusätzlich zu dem ersten Emitter mindestens ein dritter Emitter befindet, wobei der erste Emitter und der mindestens eine dritte Emitter mittels der Beleuchtungssequenz gemeinsam lokalisiert oder verfolgt werden. Diese Möglichkeit kann sich insbesondere auf sehr eng benachbarte Emitter beziehen, die z.B. physisch und/oder bezüglich ihrer Lichtemission miteinander gekoppelt sind. Hier kann mit dem MINFLUX- oder STED- MINFLUX-Verfahren eine mittlere Position bestimmt werden. Im einfachsten Fall kann bei dieser Ausführungsform z.B. die Summe der Lichtemissionen des ersten Emitters und des mindestens einen dritten Emitters erfasst werden und daraus kann eine mittlere Position bestimmt werden. Insbesondere kann auch die Position des dritten Emitters geschätzt werden. Beispielsweise kann eine Momentanalyse der Verteilung der Lichtemissionen über die Detektorelemente des Detektors ergeben, dass bestimmte Lichtemissionen von mehreren nah benachbarten Emittern stammen. Hierfür kann z.B. eine Breite oder eine Schiefe der Verteilung bestimmt werden. Alternativ lassen sich solche Informationen natürlich auch durch Anpassung der Parameter einer geeigneten Funktion an die Verteilung der Lichtemissionen gewinnen. Wenn eine Zeitreihe der Lichtemissionen gespeichert wird, können daraus insbesondere bei einer nachträglichen Verfeinerung der Positionsbestimmung zusätzliche Information gewonnen werden, z.B. wenn einer der mindestens zwei ersten Emitter während der Beleuchtungssequenz in einen Dunkelzustand übergeht. Weiterhin kann unter Umständen ein speziell an die Lokalisierung oder das Verfolgen mehrerer Emitter angepasster Positionsschätzer verwendet werden, um die Positionen des ersten und des mindestens einen dritten Emitters simultan zu bestimmen, gegebenenfalls mit geringerer Genauigkeit als für einen vereinzelten Emitter.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen der erste Emitter und der mindestens eine dritte Emitter zueinander einen Abstand unterhalb der Beugungsgrenze auf.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Lichtemissionen des ersten Emitters und des mindestens einen dritten Emitters gekoppelt. Dabei bedeutet „gekoppelt“, dass die Lichtemissionen der Emitter zeitlich korreliert sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das lokale Minimum der Intensitätsverteilung in der Beleuchtungssequenz, insbesondere nacheinander, an Beleuchtungspositionen in einem gemeinsamen Bereich von vermuteten Positionen des ersten Emitters und des mindestens einen dritten Emitters positioniert, insbesondere wobei die Beleuchtungspositionen auf einer Abtastellipse um die vermutete Position angeordnet sein können, wobei eine Hauptachse der Abtastellipse entlang einer Verbindungslinie zwischen den geschätzten Positionen des ersten Emitters und des mindestens einen dritten Emitters verläuft. Die Verwendung eines solchen Beleuchtungsmusters kann insbesondere dazu führen, dass die Emitter während der Beleuchtungssequenz mit geringerer Wahrscheinlichkeit in den Bereich des Maximums der Intensitätsverteilung geraten. Dies kann insbesondere die Wahrscheinlichkeit des Fotobleichens vermindern.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Beleuchtungssequenz, insbesondere abhängig von der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters, so durchgeführt, dass das mindestens eine Maximum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts während der Beleuchtungssequenz einen Mindestabstand zu dem mindestens einen zweiten Emitter einhält. Dadurch wird die Anregung des mindestens einen zweiten Emitters durch das Beleuchtungslicht vermindert, was zu einer Reduzierung des Fotobleichens des mindestens einen zweiten Emitters, einer Reduzierung des durch den mindestens einen zweiten Emitters hervorgerufenen Hintergrunds und/oder des sogenannten Cross-Talks, also der von dem mindestens einen zweiten Emitter hervorgerufenen aber fälschlicherweise dem ersten Emitter zugeordneten Lichtemissionen. Das Maximum der Intensitätsverteilung kann insbesondere in allen Beleuchtungsschritten der Beleuchtungssequenz, weiter insbesondere an allen Beleuchtungspositionen des Beleuchtungsmusters, mindestens eine Entfernung von dem zweiten Emitter oder (im Fall mehrerer zweiter Emitter) allen zweiten Emittern, die dem Mindestabstand entspricht, haben. Der Mindestabstand kann ein zweidimensionaler Abstand in einer Fokusebene in der Probe oder ein dreidimensionaler Abstand sein. Insbesondere bei iterativen MINFLUX-Verfahren, in denen in jedem Iterationsschritt ein Beleuchtungsmuster auf eine zuvor ermittelte Position des ersten Emitters zentriert wird, ist die Beleuchtungssequenz nicht von Anfang an fest vorgegeben. In diesem Fall kann insbesondere zwischen Iterationsschritten überprüft werden, ob das Maximum weiterhin den Mindestabstand zu dem mindestens einen zweiten Emitter einhält, und die Beleuchtungssequenz kann entsprechend angepasst werden, um dieses Kriterium zu erfüllen. Zwischen bestimmten oder allen Iterationsschritten können insbesondere auch die Positionen des mindestens einen zweiten Emitters erneut geschätzt werden, wobei weiter insbesondere eine aktualisierte Lokalisierungskarte erstellt werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Intensitätsverteilung und/oder ein Beleuchtungsmuster von Beleuchtungspositionen, an denen das lokale Minimum der Intensitätsverteilung in der Beleuchtungssequenz, insbesondere nacheinander, positioniert wird, angepasst, so dass das mindestens eine Maximum der Intensitätsverteilung den Mindestabstand zu dem mindestens einen zweiten Emitter einhält, wobei insbesondere eine maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters angepasst werden kann. Die maximale Ausdehnung kann z.B. ein Durchmesser eines Abtastkreises sein, auf dem die Beleuchtungspositionen angeordnet sind. Eine Verkleinerung dieses Abtastkreises schränkt den Bereich ein, in dem sich das Maximum der Intensitätsverteilung bei der Beleuchtungssequenz befindet. Dasselbe gilt z.B. auch für die Breite oder Länge eines regelmäßigen Rasters von Beleuchtungspositionen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden nacheinander mehrere erste Emitter lokalisiert oder verfolgt, wobei die Beleuchtungssequenzen für die mehreren ersten Emitter in einer abhängig von der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters festgelegten Reihenfolge durchlaufen werden, so dass das mindestens eine Maximum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts den Mindestabstand zu dem mindestens einen zweiten Emitter einhält. Bei den Beleuchtungssequenzen wird die Intensitätsverteilung nacheinander in den jeweiligen zweiten Bereichen um die jeweiligen vermuteten Positionen der mehreren ersten Emitter angeordnet, wobei die jeweiligen Lichtemissionen des jeweiligen ersten Emitters erfasst werden, und wobei die Position des jeweiligen ersten Emitters aus den jeweiligen Lichtemissionen bestimmt wird. Dabei kann z.B. zunächst ein erster Emitter ausgewählt werden, der einen maximalen Abstand von allen zweiten Emittern in einem Teilbereich der Probe aufweist. Bezüglich des Schutzes vor dem Fotobleichen braucht dieser erste Emitter bei der Beleuchtungssequenz des nächsten ersten Emitters nicht mehr als zweiter Emitter berücksichtigt zu werden, da die hochgenauen Lokalisierungsdaten für den zunächst ausgewählten ersten Emitter schon vorliegen. Im Hinblick auf den Hintergrund und den Cross-Talk, also das Übersprechen der Lichtemissionen in andere Detektionskanäle, braucht der zunächst ausgewählte erste Emitter zumindest dann nicht mehr berücksichtigt zu werden, wenn dieser während der Durchführung der Beleuchtungssequenz gebleicht ist oder in einen reversiblen inaktiven Zustand übergegangen ist. Bereits aus diesen Überlegungen ist ersichtlich, dass die Reihenfolge der Positionsbestimmung für Effekte wie Fotobleichen, Hintergrund und Cross-Talk eine Rolle spielen kann. Zudem kann nach dem Abschluss der Beleuchtungssequenz des zunächst ausgewählten ersten Emitters eine andere Anordnung von aktiven Emittern in der Probe vorliegen, etwa weil einige der Emitter spontan zwischen einem aktiven Zustand und einem inaktiven Zustand gewechselt haben. Daher können insbesondere nach der Beleuchtungssequenz für den zunächst ausgewählten Emitter erneut Lichtemissionen des mindestens einen zweiten Emitters erfasst werden und die Position des mindestens einen zweiten Emitters geschätzt werden, wobei weiter insbesondere aus den erfassten Lichtemissionen eine aktualisierte Lokalisierungskarte erstellt werden kann. Dann kann insbesondere auf Basis der aktualisierten Schätzung der nächste erste Emitter ausgewählt werden. Natürlich kann die Reihenfolge der ersten Emitter, für die Beleuchtungssequenzen durchgeführt werden, alternativ auch ab initio, also vor der ersten Beleuchtungssequenz, festgelegt werden. Die Reihenfolge kann insbesondere automatisch durch einen Optimierungsalgorithmus festgelegt werden, z.B. auf Basis einer Simulation und/oder unter Verwendung eines Maschinenlernalgorithmus, z.B. eines trainierten neuronalen Netzes.

Gemäß einerweiteren Ausführungsform wird die zur Lokalisierung oder zum Verfolgen des ersten Emitters durchgeführte Beleuchtungssequenz abgebrochen oder unterbrochen oder die Lichtintensität des Beleuchtungslichts wird reduziert, wenn, insbesondere abhängig von der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters oder einer aktualisierten geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters, ermittelt wird, dass sich mindestens ein zweiter Emitter während der Beleuchtungssequenz innerhalb eines Mindestabstands von dem Maximum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts aufhält.

Der Abbruch oder die Unterbrechung kann insbesondere bei einer Lokalisierung von Emittern erfolgen. Die Messung kann insbesondere dann fortgesetzt werden, wenn eine aktualisierte Positionsschätzung des mindestens einen zweiten Emitters, insbesondere eine aktualisierte Lokalisierungskarte, ergibt, dass sich die Situation derart verändert hat, dass nun der Mindestabstand eingehalten wird, z.B. durch spontanen Wechseln einiger Emitter zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand. Die Reduzierung der Lichtintensität des Beleuchtungslichts reduziert die Wahrscheinlichkeit des Fotobleichens und hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie auch beim Verfolgen (Tracking) angewendet werden kann, ohne dass sich, wie bei einer Unterbrechung der Messung, der verfolgte erste Emitter mit hoher Wahrscheinlichkeit aus dem Messbereich heraus bewegen würde.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die in dem Vorlokalisierungsschritt durchgeführte initiale Positionsschätzung des ersten Emitters bei der Bestimmung der Position des ersten Emitters berücksichtigt, insbesondere wobei die bestimmte Position gleich der für die Erstellung der Lokalisierungskarte geschätzten Position sein kann. Das bedeutet insbesondere, dass die Position des ersten Emitters mit einer geringeren Genauigkeit bestimmt werden kann als die Position anderer Emitter, da die initiale Positionsschätzung insbesondere nicht mit einem MINFLUX-Verfahren durchgeführt wird. Diese Ausführungsform kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn keine hochgenaue Positionsbestimmung des ersten Emitters mehr durchgeführt werden kann, etwa, weil die Messung abgebrochen werden musste oder wenn der erste Emitter aus dem Messbereich herausdiffundiert ist. In diesem Fall wird eine geringere Positionsgenauigkeit zugunsten einer höheren Lokalisierungsdichte in Kauf genommen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform unterscheiden sich der erste Emitter und der mindestens eine zweite Emitter in ihrem Anregungsspektrum und/oder in ihrem Emissionsspektrum. Solche Emitter können z.B. für eine Mehrfarbenmessung verwendet werden, bei denen unterschiedliche Probenstrukturen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Für diese Konstellation ergibt sich das bereits oben diskutierte Problem, dass bei einer für einen Emitter einer ersten Spezies durchgeführten Beleuchtungssequenz das Maximum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts in die Nähe eines Emitters einer zweiten Spezies gerät. Wenn die Anregungsspektren auch nur geringfügig überlappen, führt dies zu einer Anregung der Emitter der zweiten Spezies und zu einer Lichtemission dieser Emitter. Obwohl bei der Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie häufig Emissionsfilter verwendet werden, ist es oft nicht möglich, die Lichtemissionen der ersten und der zweiten Spezies vollständig voneinander zu trennen, so dass die durch die ungewünschte Anregung der zweiten Spezies hervorgerufenen Lichtemissionen der zweiten Spezies in den für die Lichtemissionen der ersten Spezies vorgesehenen Detektionskanal übersprechen (sog. Cross-Talk). Dieser Cross-Talk ist bei der Mehrfarben MINFLUX-Mikroskopie besonders stark ausgeprägt, da häufig der Fall auftritt, dass sich ein Emitter der ersten Spezies nah am Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts befindet, während ein Emitter der zweiten Spezies in der Nähe des Maximums positioniert ist. In dieser Situation emittiert der zweite Emitter viel mehr Photonen als der erste Emitter, trägt also trotz nur geringer Überlappung des Emissionsspektrums mit dem Detektionskanal erheblich zum Cross-Talk bei. Dieser Effekt wird erfindungsgemäß dadurch reduziert, dass die Beleuchtungssequenz aufgrund der Vorabinformation über die Verteilung des mindestens einen zweiten Emitters in der Probe angepasst wird, um insbesondere den Cross- Talk zu reduzieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird, insbesondere auf Basis der geschätzten Position des mindestens einen zweiten Emitters, eine Korrektur der bestimmten Position des mindestens einen ersten Emitters durchgeführt, wobei die Korrektur einen Einfluss von fälschlicherweise dem mindestens einen ersten Emitter zugeordnete Lichtemissionen des mindestens einen zweiten Emitters auf die bestimmte Position des mindestens einen ersten Emitters berücksichtigt. Die fälschlicherweise dem ersten Emitter zugeordneten Lichtemissionen des zweiten Emitters können insbesondere dadurch entstehen, dass die ersten und zweiten Emitter so nah benachbart sind, dass der mindestens eine zweite Emitter während der Beleuchtungssequenz für den mindestens einen ersten Emitter von dem Beleuchtungslicht angeregt wird. Wenn der erste Emitter und der mindestens eine zweite Emitter derselben Spezies angehören, also dieselben Anregungs- und Emissionsspektren aufweisen, trägt dies zum Hintergrund bei. Haben der erste Emitter und der mindestens eine zweite Emitter unterschiedliche Anregungsspektren und/oder unterschiedliche Emissionsspektren, kann dies zum Übersprechen (Cross-Talk) der Lichtemissionen des mindestens einen zweiten Emitters in den Detektionskanal für die Lichtemissionen des ersten Emitters führen. Sowohl Hintergrund als auch Cross-Talk resultieren in einem systematischen Fehler bei der MINFLUX-Positionsbestimmung. Dieser Fehler wird gemäß der oben beschriebenen Ausführungsform auf Basis der Schätzung der Positionen des mindestens einen zweiten Emitters (insbesondere der Lokalisierungskarte) durch einen Korrekturalgorithmus korrigiert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Beleuchtungssequenz das Bestrahlen mindestens eines zweiten Emitters mit Inaktivierungslicht, wobei das Inaktivierungslicht mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit einen Übergang des mit dem Inaktivierungslichts bestrahlten zweiten Emitters in einen inaktiven Zustand, insbesondere einen reversiblen inaktiven Zustand, hervorruft, in welchem das Beleuchtungslicht keine Lichtemissionen des mit dem Inaktivierungslicht bestrahlten zweiten Emitters induziert oder moduliert. Auf diese Weise können Emitter gezielt ausgeschaltet werden, so dass sie bei der Positionsbestimmung des ersten Emitters nicht, insbesondere durch zusätzlichen Hintergrund oder Cross-Talk, stören. Wenn das Inaktivierungslicht nicht zum Fotobleichen sondern zum Übergang in einen reversiblen Dunkelzustand führt, können die inaktivierten Emitter gegebenenfalls nach einer spontanen Rückkehr in den aktiven Zustand in einer späteren Beleuchtungssequenz lokalisiert oder verfolgt werden.

Insbesondere kann die Intensität des Inaktivierungslichts so gewählt werden, dass der zweite Emitter in einen reversiblen inaktiven Zustand übergeht. Aus dem Stand der Technik bekannte Untersuchungen haben ergeben, dass unter geeigneten Bedingungen besonders hohe Lichtintensitäten zu einer höheren Wahrscheinlichkeit eines Übergangs in einen reversiblen Dunkelzustand führen.

Auch ein durch das Inaktivierungslicht hervorgerufener Übergang in einen permanenten inaktiven Zustand, wie das Fotobleichen, kann im Kontext der Erfindung vorteilhaft sein, insbesondere dann, wenn ein Emitter nach Abschluss der Beleuchtungssequenz und Positionsbestimmung für diesen Emitter gezielt inaktiviert wird, damit er bei nachfolgenden Beleuchtungssequenzen für weitere erste Emitter nicht stört.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird in der Probe eine Lichtverteilung des Inaktivierungslichts mit einem lokalen Minimum und mindestens einem Maximum erzeugt, wobei die Lichtverteilung so positioniert wird, dass die Intensität des Inaktivierungslichts, mit dem der erste Emitter beaufschlagt wird, unter einem Grenzwert liegt. Insbesondere kann das lokale Minimum in einem dritten Bereich um eine vermutete Position des ersten Emitters positioniert werden. Dies hat den Vorteil, dass zweite Emitter gezielt inaktiviert werden können, wobei die Gefahr eines Fotobleichens des ersten Emitters durch das Inaktivierungslicht minimiert wird. Die Lichtverteilung kann im Wesentlichen dieselbe Form haben wie die Lichtverteilung des Beleuchtungslichts, z.B. die Form eines 2D-Donuts oder eines 3D-Donuts. Dies hat den Vorteil, dass unter Umständen derselbe Lichtmodulator verwendet werden kann, um das Beleuchtungslicht und das Inaktivierungslicht zu modulieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Beleuchtungssequenz das Bestrahlen mindestens eines inaktiven oder inaktivierten Emitters mit Aktivierungslicht nach der Lokalisierung oder dem Verfolgen des ersten Emitters, wobei das Aktivierungslicht einen Übergang des mit dem Aktivierungslicht bestrahlten Emitters in einen aktiven Zustand hervorruft, in welchem das Beleuchtungslicht Lichtemissionen des Emitters induziert oder moduliert. Auf diese Weise können insbesondere inaktivierte Emitter gezielt wieder aktiviert werden, um sie mit einer nachfolgenden Beleuchtungssequenz zu lokalisieren oder zu verfolgen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird in der Probe eine Lichtverteilung des Aktivierungslichts mit einem lokalen Minimum und mindestens einem Maximum erzeugt, wobei die Lichtverteilung so positioniert wird, dass die Intensität des Aktivierungslichts, mit dem der erste Emitter beaufschlagt wird, unter einem Grenzwert liegt. Insbesondere kann das lokale Minimum in einem dritten Bereich um eine vermutete Position des ersten Emitters positioniert werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich das Inaktivierungslicht spektral von dem Beleuchtungslicht, insbesondere dem Anregungslicht. Dabei unterscheidet sich insbesondere auch das Aktivierungslicht spektral von dem Beleuchtungslicht, insbesondere dem Anregungslicht. Insbesondere kann sich auch das Aktivierungslicht spektral von dem Inaktivierungslicht unterscheiden.

Es sind eine Reihe von Fluoreszenzemittern bekannt, die sich durch Bestrahlen mit Licht ihrer Anregungswellenlänge mit geeigneter Intensität inaktivieren oder aktivieren lassen. Außerdem sind reversibel fotoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe bekannt, die sich mit Licht ihrer Anregungswellenlänge aktivieren und mit Licht einer anderen Wellenlänge inaktivieren lassen und solche, die sich mit Licht ihrer Anregungswellenlänge inaktivieren und mit Licht einer anderen Wellenlänge aktivieren lassen. Dies hat jedoch den Nachteil, dass entweder die Inaktivierung oder die Aktivierung immer mit der Anregung des Fluorophors gekoppelt ist.

Aus der Publikation „Brakemann, T., Stiel, A., Weber, G. et al. A reversibly photoswitchable GFP- like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol 29, 942-947 (2011). https://doi.org/10.1038/nbt.1952“ ist eine mit der Bezeichnung „Dreiklang“ benannte Variante des grün fluoreszierenden Proteins bekannt, das sich durch Bestrahlung mit Licht dreier unterschiedlicher Wellenlängen anregen, aktivieren und reversibel inaktivieren lässt. Die Aktivierungswellenlänge liegt bei etwa 365 nm, die Inaktivierungswellenlänge bei ca. 405 nm und das Maximum des Anregungsspektrums bei 515 nm. Das Emissionsspektrum dieses Fluoreszenzemitters hat ein Maximum bei 529 nm.

Derartige Emitter eignen sich besonders gut für das erfindungsgemäße Verfahren, da auf diese Weise zweite Emitter gezielt inaktiviert und wieder aktiviert werden können, ohne sie anzuregen und ohne den zu lokalisierenden ersten Emitter anzuregen.

Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein Lichtmikroskop zur Lokalisierung oder zum Verfolgen von Emittern in einer Probe, insbesondere nach einem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt, aufweisend eine Lichtquelle, die dazu ausgebildet ist, Beleuchtungslicht zu erzeugen, das Lichtemissionen von Emittern in einer Probe induziert oder moduliert, eine Beleuchtungsoptik, die dazu ausgebildet ist, die Probe mit dem Beleuchtungslicht zu beleuchten, einen Lichtmodulator, der dazu ausgebildet ist, in der Probe eine Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts mit einem lokalen Minimum und mindestens einem Maximum zu erzeugen, einen Detektor, der dazu ausgebildet ist, Lichtemissionen von Emittern in der Probe zu erfassen, eine Recheneinheit, die dazu ausgebildet ist, auf Basis der von dem Detektor erfassten Lichtemissionen zu ermitteln, ob sich in einem ersten Bereich in der Probe zusätzlich zu einem ersten Emitter, der mit einer Beleuchtungssequenz mit einer Mehrzahl von Beleuchtungsschritten lokalisiert oder verfolgt werden soll, mindestens ein zweiter Emitter befindet, eine Steuereinheit, die dazu ausgebildet ist, die Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik und/oder den Lichtmodulator so zu steuern, dass die Beleuchtungssequenz durchgeführt wird, wobei die Probe in den Beleuchtungsschritten jeweils mit einer ein lokales Minimum und mindestens ein Maximum aufweisenden Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts oder eines anderen Lichts, das Lichtemissionen der Emitter induziert oder moduliert, beleuchtet wird, derart dass die Probe in den Beleuchtungsschritten an mindestens einem Punkt mit unterschiedlichen Lichtintensitäten beleuchtet wird, wobei das lokale Minimum der Intensitätsverteilung in den Beleuchtungsschritten in einem zweiten Bereich um eine vermutete Position des ersten Emitters in der Probe positioniert wird, und wobei Lichtemissionen des ersten Emitters für die jeweiligen Beleuchtungsschritte erfasst werden, wobei die Recheneinheit dazu ausgebildet ist, die Position des ersten Emitters in der Probe aus den für die jeweiligen Beleuchtungsschritte erfassten Lichtemissionen zu bestimmen, und wobei die Steuereinheit dazu ausgebildet ist, die Beleuchtungssequenz abhängig davon anzupassen oder festzulegen, ob von der Recheneinheit ermittelt wurde, dass sich mindestens ein zweiter Emitter in dem ersten Bereich befindet, oder wobei die Recheneinheit dazu ausgebildet ist, eine geschätzte Position des mindestens einen zweiten Emitters bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters zu berücksichtigen.

Gemäß einer Ausführungsform des Lichtmikroskops ist die Recheneinheit dazu ausgebildet, eine Position des mindestens einen zweiten Emitters in der Probe auf Basis der aus dem ersten Bereich der Probe erfassten Lichtemissionen zu schätzen, wobei die Steuereinheit dazu ausgebildet ist, die Beleuchtungssequenz auf Basis der geschätzten Position anzupassen oder festzulegen oder wobei die Recheneinheit dazu ausgebildet ist, die geschätzte Position bei dem Bestimmen der Position des ersten Emitters zu berücksichtigen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen mehrere Detektorelemente aufweisenden Detektor auf.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Lichtmikroskops weist die Lichtquelle einen Beleuchtungslaser, insbesondere einen Anregungslaser, auf, der dazu ausgebildet ist, das Beleuchtungslicht zu erzeugen, wobei die Lichtquelle außerdem einen Inaktivierungslaser aufweist, der dazu ausgebildet ist, Inaktivierungslicht zu erzeugen, wobei das Inaktivierungslicht einen Übergang des mit dem Inaktivierungslichts bestrahlten Emitters, insbesondere zweiten Emitters, in einen inaktiven Zustand hervorruft, in welchem das Beleuchtungslicht keine Lichtemissionen des mindestens einen mit dem Inaktivierungslicht bestrahlten Emitters, insbesondere zweiten Emitters, induziert oder moduliert, insbesondere wobei das Inaktivierungslicht sich von dem Beleuchtungslicht spektral unterscheidet.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Lichtmikroskops weist die Lichtquelle einen Aktivierungslaser auf, der dazu ausgebildet ist, Aktivierungslicht zu erzeugen, wobei das Aktivierungslicht einen Übergang eines mit dem Aktivierungslicht bestrahlten zweiten Emitters in einen aktiven Zustand hervorruft, in welchem das Beleuchtungslicht Lichtemissionen des mindestens einen mit dem Aktivierungslicht bestrahlten Emitters, insbesondere zweiten Emitters, induziert oder moduliert, insbesondere wobei das Aktivierungslicht sich von dem Beleuchtungslicht spektral unterscheidet. Insbesondere kann sich auch das Aktivierungslicht spektral von dem Inaktivierungslicht unterscheiden.

Der Inaktivierungslaser kann insbesondere Licht einer anderen Wellenlänge als der Beleuchtungslaser, insbesondere der Anregungslaser, emittieren. Der Aktivierungslaser kann insbesondere Licht einer anderen Wellenlänge als der Beleuchtungslaser, insbesondere der Anregungslaser, emittieren. Der Inaktivierungslaser kann insbesondere Licht einer anderen Wellenlänge als der Aktivierungslaser emittieren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Lichtmodulator oder ein weiterer Lichtmodulator des Lichtmikroskops dazu ausgebildet ist, in der Probe eine Intensitätsverteilung des Inaktivierungslichts mit einem lokalen Minimum und mindestens einem Maximum zu erzeugen und/oder eine Intensitätsverteilung des Aktivierungslichts mit einem lokalen Minimum und mindestens einem Maximum zu erzeugen. Insbesondere kann derselbe Lichtmodulator zur Modulation des Beleuchtungslichts und des Inaktivierungslichts und/oder des Aktivierungslichts ausgebildet sein.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Lichtmikroskops ist die Steuereinheit dazu ausgebildet, die Lichtverteilung des Inaktivierungslichts und/oder des Aktivierungslichts so zu positionieren, dass die Intensität des Inaktivierungslichts bzw. des Aktivierungslichts, mit dem der erste Emitter beaufschlagt wird, unter einem Grenzwert liegt. Insbesondere kann die Steuereinheit dazu ausgebildet sein, das lokale Minimum in einem dritten Bereich um eine vermutete Position des ersten Emitters zu positionieren.

Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft ein Computerprogramm umfassend Befehle, die das Lichtmikroskop gemäß dem zweiten Aspekt dazu veranlassen, das Verfahren nach dem ersten Aspekt durchzuführen.

Weitere Merkmale des Lichtmikroskops nach dem zweiten Aspekt und des Computerprogramms gemäß dem dritten Aspekt ergeben sich aus den oben beschriebenen Merkmalen des Verfahrens nach dem ersten Aspekt.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Die beschriebenen Vorteile von Merkmalen und / oder Merkmalskombinationen der Erfindung sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.

Hinsichtlich des Offenbarungsgehalts (aber nicht des Schutzbereichs) der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents gilt Folgendes: Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten relativen Anordnungen und Wirkverbindungen - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen, was aber nicht für die unabhängigen Patentansprüche des erteilten Patents gilt.

Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.

Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Figuren beschrieben. Diese beschränken nicht den Gegenstand dieser Offenbarung und den Schutzumfang.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einem Ausführungsbeispiel;

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 5 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;

Fig. 6 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;

Fig. 7 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops;

Fig. 8 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops. Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Lokalisierung oder zum Verfolgen von Emittern E gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Verfahren umfasst einen Vorlokalisierungsschritt 101 , einen Schritt 102, in dem eine Beleuchtungssequenz 103 festgelegt wird, die Beleuchtungssequenz 103, eine Positionsbestimmung 104 und die optionale Erstellung eines Bildes 105. Weiterhin sind Knotenpunkte 106,107,108 dargestellt, an denen aufgrund einer bestimmten weiter unten erläuterten Entscheidung bestimmte Schritte des Verfahrens wiederholt werden, was durch die gestrichelten Linien und Pfeile dargestellt ist.

Das Verfahren umfasst ein MINFLUX-Verfahren, welches wiederum zumindest die Beleuchtungssequenz 103 und die Positionsbestimmung 104 sowie insbesondere auch den Vorlokalisierungsschritt 101 umfasst.

In dem Vorlokalisierungsschritt 101 werden zunächst in dem Unterschritt 101a Lichtemissionen D mehrerer Emitter E aus einem ersten Bereich 27 einer Probe 2 erfasst, die durch Beleuchten der Probe 2 mit Beleuchtungslicht B hervorgerufen werden, z.B. mit einem mehrere Detektorelemente 7 aufweisenden Detektor 5 (siehe Fig. 2). Bei dem Beleuchtungslicht B handelt es sich insbesondere um Anregungslicht, das die Emitter E (in diesem Fall Fluoreszenzemitter) anregt, so dass diese als Lichtemissionen D Fluoreszenzlicht aussenden. Anschließend werden aus den erfassten Lichtemissionen D die Positionen mehrerer Emitter E geschätzt, etwa durch Zentroidbestimmung, Momentbestimmung oder einen Funktions-Fit auf Basis einer von den mehreren Detektorelementen 7 erfassten Verteilung von Lichtemissionen D in einer Detektionsebene 8 (siehe Fig. 2). Aus diesen geschätzten Positionen kann dann eine Lokalisierungskarte 24 erstellt werden.

Anschließend wird in dem Schritt 102 eine Beleuchtungssequenz 103 auf Basis der geschätzten Positionen, insbesondere auf Basis der Lokalisierungskarte 24, angepasst oder festgelegt. Dazu wird zunächst in dem Teilschritt 102a aus den mehreren Emittern E, deren Position in dem Vorlokalisierungsschritt 101 geschätzt wurde, ein erster Emitter E1 ausgewählt, der in der folgenden Beleuchtungssequenz 103 lokalisiert oder verfolgt werden soll. In dem Teilschritt 102b können anschließend weitere Parameter der Beleuchtungssequenz 103 festgelegt werden, z.B. die Lage, Anzahl und Reihenfolge von Beleuchtungspositionen 20, an denen die Probe 2 mit einer Intensitätsverteilung 17 von Beleuchtungslicht B mit einem lokalen Minimum 18 beleuchtet wird (siehe Fig. 2), die Gesamtintensität des Beleuchtungslichts B und/oder die Form der Intensitätsverteilung 17.

Bei der Durchführung der Beleuchtungssequenz 103 wird die Probe 2 in mehreren Beleuchtungsschritten 103a, 103b, 103c mit der Intensitätsverteilung 17 gemäß den zuvor festgelegten Parametern beleuchtet. Dabei ist jeder Beleuchtungsschritt 103a, 103b, 103c einer anderen Beleuchtungsposition 20 zugeordnet, an der sich in dem jeweiligen Beleuchtungsschritt 103a, 103b, 103c das lokale Minimum 18 der Intensitätsverteilung 17 befindet. Dadurch wird die Probe 2 an einer gegebenen Position in den verschiedenen Beleuchtungsschritten 103a, 103b, 103c mit unterschiedlichen Lichtintensitäten beaufschlagt. Insbesondere bilden die Beleuchtungspositionen 20 ein Beleuchtungsmuster 21 , das um eine vermutete Position des ersten Emitters E1 angeordnet ist (siehe Fig. 2). Die vermutete Position entspricht dabei zumindest für das erste festgelegte Beleuchtungsmuster 21 der zuvor in dem Vorlokalisierungsschritt geschätzten Position des ersten Emitters E1. Insbesondere kann die vermutete Position bei iterativen MINFLUX-Verfahren auch einer in einem vorhergehenden Iterationsschritt bestimmten Position entsprechen.

In jedem Beleuchtungsschritt 103a, 103b, 103c werden die Lichtemissionen D des ersten Emitters E1 mit einem Detektor 5 erfasst, insbesondere in Form einer in einem bestimmten Zeitintervall erfassten Photonenzahl.

Aus den für die verschiedenen Beleuchtungsschritte 103a, 103b, 103c erfassten Lichtemissionen D und den zugehörigen Positionen des lokalen Minimums 18 der Intensitätsverteilung 17 wird dann im Schritt 104 eine Position des ersten Emitters E1 bestimmt, z.B. mit einem maximum-likelihood-Positionssc^ätzer oder einem least-mean-square- Positionsschätzer.

An dem ersten Knotenpunkt 106 kann bei einem iterativen MINFLUX-Verfahren entschieden werden, ob die Beleuchtungssequenz 103 für den ersten Emitter E1 wiederholt wird. Dabei wird insbesondere das Beleuchtungsmuster 21 der Beleuchtungspositionen 20 um die in Schritt 104 bestimmte Position angeordnet. Zusätzlich kann das Beleuchtungsmuster 21 angepasst werden, etwa durch Reduzierung einer maximalen Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 21 (z.B. eines Durchmessers eines Abtastkreises 22, siehe Fig. 2) und/oder durch Erhöhung einer Gesamtintensität des Beleuchtungslichts B. Auf diese Weise kann die Positionsgenauigkeit in den Iterationsschritten sukzessive gesteigert werden. Es kann z.B. eine feste Anzahl von Iterationsschritten vorgegeben sein und an dem ersten Knotenpunkt 106 kann überprüft werden, ob bereits die vorgegebene Anzahl von Iterationsschritten durchgeführt wurde und davon abhängig entschieden werden, ob ein weiterer Iterationsschritt ausgeführt wird. Alternativ dazu kann an dem ersten Knotenpunkt 106 z.B. auch überprüft werden, ob eine Gesamtzahl von erfassten und registrierten Photonen einen vorgegebenen Grenzwert überschritten hat, und ausgehend davon entschieden werden, ob ein weiterer Iterationsschritt durchgeführt wird.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren ein Lokalisierungsverfahren ist, wird in dem Schritt 105 insbesondere aus den nacheinander bestimmten Positionen mehrerer erster Emitter E1 ein lokalisationsmikroskopisches Bild erstellt. Wird mit dem Verfahren die Position eines beweglichen ersten Emitters E1 in der Probe über die Zeit verfolgt (Tracking-Verfahren), so wird in dem Schritt 105 insbesondere aus mehreren nacheinander durchgeführten Lokalisierungen desselben ersten Emitters E1 eine Trajektorie bestimmt. In beiden Fällen kann an dem zweiten Knotenpunkt 107 entschieden werden, ob noch eine weitere Lokalisierung durchgeführt wird oder ob das Bild oder die Trajektorie berechnet wird. Wird das Verfahren fortgesetzt, so kann an dem dritten Knotenpunkt 108 entschieden werden, ob erneut ein Vorlokalisierungsschritt 101 durchgeführt und insbesondere eine aktualisierte Lokalisierungskarte 24 erstellt wird, oder ob auf Basis der bisherigen geschätzten Positionen mit dem Festlegen 102 der Beleuchtungssequenz 103 fortgefahren wird. Bei dem erneuten Festlegen 102 der Beleuchtungssequenz 103 wird im Falle einer Lokalisierung insbesondere in Schritt 102a ein neuer erster Emitter E1 ausgewählt, für den anschließend die Beleuchtungssequenz 103 durchgeführt wird.

Fig. 2 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens. Mit einem mehrere in einer Detektionsebene 8 angeordnete Detektorelemente 7 aufweisenden Detektor 5 werden Lichtemissionen D von Emittern E in der Probe 2 erfasst und es wird eine Lokalisierungskarte 24 erstellt, welche die geschätzten Positionen von drei Emittern E zeigt, die durch Sterne symbolisiert sind.

Aus der Lokalisierungskarte 24 wird einer der Emitter E als erster Emitter E1 ausgewählt (siehe Fig. 2 unten, ausgefüllter Stern) und für diesen ersten Emitter E1 wird eine Beleuchtungssequenz 103 festgelegt. In diesem Fall umfasst die Beleuchtungssequenz 103 sechs Schritte, in denen das lokale Minimum 18 der Intensitätsverteilung 17 des Beleuchtungslichts B an unterschiedlichen Beleuchtungspositionen 20 in einem zweiten Bereich 28 angeordnet wird. Die Beleuchtungspositionen 20 bilden ein sechseckförmiges Beleuchtungsmuster 21 mit einer maximalen Ausdehnung L, die dem Durchmesser eines Abtastkreises 22 entspricht, auf welchem die Beleuchtungspositionen 20 angeordnet sind. Am Mittelpunkt des Abtastkreises 22 liegt die vermutete Position des ersten Emitters E1 , welche der auf der Lokalisierungskarte 24 dargestellten geschätzten Position des ersten Emitters E1 entspricht. Bei dem in Fig. 2 unten gezeigten Beleuchtungsschritt ist das lokale Minimum 18 der Intensitätsverteilung 17 an der durch ein ausgefülltes Symbol markierten Beleuchtungsposition 20 angeordnet. Das Maximum 19 der Intensitätsverteilung 17 verläuft in der Fokusebene kreisförmig um das lokale Minimum 18 herum, wie dies z.B. bei sogenannten 2D-Donuts und 3D- Donuts (auch als bottle beam bezeichnet) der Fall ist.

Die Beleuchtungssequenz 103 wird so festgelegt, dass Abstände 25 zwischen dem Maximum 19 und den geschätzten Positionen der in der Nachbarschaft des ersten Emitters E1 befindlichen zweiten Emitter E2 bei allen Beleuchtungsschritten 103a, 103b, 103c der Beleuchtungssequenz 103 einen Mindestabstand einhalten. Dazu kann die Lokalisierungskarte 24 von einer Recheneinheit 10 ausgewertet werden. Weiterhin können mithilfe der Lokalisierungskarte 24 und der Positionsschätzungen Relativpositionen 23 zwischen dem ersten Emitter E1 und jeweiligen zweiten Emittern E1 bestimmt und bei der Festlegung der Beleuchtungssequenz 103 berücksichtigt werden. Eine solche Relativposition 23 ist in Fig. 2 durch einen Vektor angedeutet.

Der Mindestabstand ist insbesondere so bemessen, dass das Fotobleichen der zweiten Emitter E2 möglichst vermieden wird. So können die zweiten Emitter E2 mit höherer Wahrscheinlichkeit in einem nachfolgenden MINFLUX-Verfahren mit hoher Genauigkeit lokalisiert oder verfolgt werden, was die Lokalisierungsdichte verbessert.

Die Einhaltung des Mindestabstands zwischen dem Maximum 19 und den geschätzten Positionen der zweiten Emitter E2 kann ebenfalls dazu dienen, dass die zweiten Emitter E2 möglichst wenig von dem Beleuchtungslicht B angeregt werden, damit möglichst wenig Lichtemissionen D der zweiten Emitter E2 auftreten, die fälschlicherweise dem ersten Emitter E1 zugeordnet werden. Wenn die zweiten Emitter E2 dasselbe Anregungs- und Emissionsspektrum haben wie der erste Emitter E1 , lässt sich auf diese Weise der Hintergrund reduzieren. Bei einem Mehrfarben-Lokalisierungs- oder Verfolgungsverfahren, bei welchem der erste Emitter E1 und die zweiten Emitter E2 unterschiedlichen Spezies angehören, deren Anregungs- und/oder Emissionsspektren sich unterscheiden, kann so das Übersprechen der Lichtemissionen D der zweiten Emitter E2 in einen für den ersten Emitter E1 vorgesehenen Detektionskanal verringert werden.

In Fig. 3 ist ein spezielles Beleuchtungsmuster 21 gemäß einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. In diesem Fall wurde aufgrund der im Vorlokalisierungsschritt 101 erfassten Lichtemissionen D ermittelt, dass sich zusätzlich zu dem ersten Emitter E1 in dessen unmittelbarer Nähe ein weiterer, dritter Emitter E3 befindet. Der dritte Emitter E3 ist insbesondere so nah an dem ersten Emitter E1 angeordnet, dass der erste Emitter E1 nicht nach einem MINFLUX-Verfahren lokalisiert oder verfolgt werden kann, ohne gleichzeitig Lichtemissionen D des dritten Emitters E3 zu induzieren. Daher wird für den ersten Emitter E1 und den dritten Emitter E3 eine gemeinsame Beleuchtungssequenz 103 durchgeführt. Hierfür wird das Minimum 18 der Intensitätsverteilung 17 des Beleuchtungslichts B an Beleuchtungspositionen 20 in einem gemeinsamen Bereich 29 um den ersten Emitter E1 und den dritten Emitter E3 angeordnet. Die Beleuchtungspositionen 20 bilden das Beleuchtungsmuster 21 und liegen hier auf einer Abtastellipse 30. Eine Hauptachse 30a der Abtastellipse 30 verläuft entlang der Verbindungslinie zwischen den vermuteten Positionen des ersten Emitters E1 und des dritten Emitters E3 und der Mittelpunkt 30b der Abtastellipse 30 liegt an einem Schwerpunkt der vermuteten Positionen des ersten Emitters E1 und des dritten Emitters E3. Die gemeinsame Positionsbestimmung des ersten Emitters E1 und des dritten Emitters E3 kann eine mittlere Position des ersten Emitters E1 und des dritten Emitters E3 liefern, die insbesondere eine geringere Positionsgenauigkeit aufweist als für einzelne Emitter. Alternativ kann es vorkommen, dass der erste Emitter E1 oder der dritte Emitter E3 während der Beleuchtungssequenz 103 bleicht. In diesem Fall kann dann der verbleibende Emitter mit höherer Genauigkeit weiter lokalisiert oder verfolgt werden.

Fig. 4A bis Fig. 4C zeigen ein weiteres Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem ein zweiter Emitter E2 durch Bestrahlung mit Inaktivierungslicht I in einen nichtemittierenden Zustand versetzt wird (Fig. 4A), anschließend die Beleuchtungssequenz 103 mit dem ersten Emitter E1 durchgeführt wird (Fig. 4B) und danach der zweite Emitter E2 durch Bestrahlung mit Aktivierungslicht A zurück in den aktiven, emittierenden Zustand überführt wird (Fig. 4C). Dadurch kann die Beleuchtungssequenz 103 für den ersten Emitter E1 durchgeführt werden, ohne dass der zweite Emitter E2 irreversibel bleicht und ohne dass der zweite Emitter E2 zum Hintergrund oder zum Cross-Talk beiträgt. Anschließend kann z.B. der wieder aktivierte zweite Emitter E2 als neuer erster Emitter E1 ausgewählt werden und die Beleuchtungssequenz 103 kann mit dem zweiten Emitter durchgeführt werden (nicht gezeigt). Ein Bleichen des ersten Emitters E1 wäre hierbei hinnehmbar, da bereits die Positionsdaten des ersten Emitters E1 vorliegen. Alternativ kann natürlich auch der erste Emitter E1 nach dem in Fig. 4C gezeigten Schritt inaktiviert werden, z.B. um den Hintergrund oder Cross-Talk bei der Lokalisierung bzw. Verfolgung des zweiten Emitters E2 zu reduzieren.

In den in Fig. 4A und Fig. 4C gezeigten Schritten wird die Probe 2 jeweils mit einer Intensitätsverteilung 17 des Inaktivierungslichts I oder des Anregungslichts A beaufschlagt, die ein lokales Minimum 18 und ein in der Fokusebene ringförmiges Maximum 19 aufweist. Das Minimum 18 wird jeweils an der vermuteten Position des ersten Emitters E1 angeordnet und das Maximum 19 befindet sich insbesondere an der vermuteten Position des zweiten Emitters E2. Dadurch wird der zweite Emitter E2 mit besonders hoher Effizienz inaktiviert bzw. aktiviert, während der erste Emitter E1 vor potenziellen Schäden durch das Inaktivierungslicht I und das Aktivierungslicht A geschützt bleibt.

Die Beleuchtungssequenz 103 umfasst, wie in Fig. 4B angedeutet, der in Fig. 2 gezeigten Beleuchtungssequenz 103, bei der ein Beleuchtungsmuster 21 aus sechs Beleuchtungspositionen 20 verwendet wird, die auf einem Abtastkreis 22 um die vermutete Position des ersten Emitters E1 angeordnet sind. Dabei wird das lokale Minimum 18 einer Intensitätsverteilung 17 des Beleuchtungslichts B an den Beleuchtungspositionen 20 angeordnet. Das Inaktivierungslicht I kann sich spektral von dem Aktivierungslicht A unterscheiden. Außerdem können sich sowohl das Inaktivierungslicht I als auch das Aktivierungslicht A spektral von dem Beleuchtungslicht B, insbesondere dem Anregungslicht, unterscheiden. Die Inaktivierung und die Aktivierung können also von der Anregung entkoppelt sein. Hierfür geeignete Emitter sind, wie oben beschrieben, aus dem Stand der Technik bekannt.

Fig. 5 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Lichtmikroskops 1 zur Lokalisierung oder zum Verfolgen von Emittern E in einer Probe 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dem Lichtmikroskop 1 handelt es sich um ein MINFLUX-Mikroskop, das eine Lichtquelle 3 mit einem Laser aufweist, der einen Beleuchtungslichtstrahl von Beleuchtungslicht B erzeugt. Der Beleuchtungslichtstrahl durchläuft eine erste Strahlverlagerungseinheit 12 und eine zweite Strahlverlagerungseinheit 13, z.B. zwei elektrooptische Deflektoren (EODs), die einen Teil einer Beleuchtungsoptik 26 bilden und den Beleuchtungslichtstrahl jeweils in einer ersten Richtung und einer zu der ersten Richtung orthogonalen zweiten Richtung in einer senkrecht zu einer Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls erstreckten Ebene ablenken (auch als x- Richtung und y-Richtung bezeichnet), wenn die erste Strahlverlagerungseinheit 12 und die zweite Strahlverlagerungseinheit 13 ein entsprechendes Steuersignal von der Steuereinheit 9 erhalten.

Weiterhin wird der Beleuchtungslichtstrahl von einem Lichtmodulator 4 der Beleuchtungsoptik 26 moduliert, insbesondere phasenmoduliert, um am Fokus in der Probe 2 eine Intensitätsverteilung 17 mit einem lokalen Minimum 18 (insbesondere einen 2D-Donut oder einen 3D-Donut) zu erzeugen (siehe Fig. 2). Der Lichtmodulator 4 kann, wie in Fig. 5 beispielhaft dargestellt, von dem Beleuchtungslichtstrahl transmittiert werden. Alternativ kann der Beleuchtungslichtstrahl auch von einem Beugungsgitter des Lichtmodulators 4 gebrochen oder einer Oberfläche des Lichtmodulators 4 reflektiert und dabei phasenmoduliert werden.

Die Beleuchtungsoptik 26 umfasst weiterhin einen dichroitischen Spiegel 14, der den phasenmodulierten Beleuchtungslichtstrahl reflektiert und eine Objektivlinse 11 , die den Beleuchtungslichtstrahl in die Probe 2 fokussiert.

Die von dem Beleuchtungslicht B angeregten Emitter E in der Probe 2 emittieren Fluoreszenzlicht (Lichtemissionen D), das den dichroitischen Spiegel 14 aufgrund seiner Wellenlänge transmittiert und zu einem Detektor 5 des Lichtmikroskops 1 gelangt. Der Detektor 5 weist eine Mehrzahl an Detektorelementen 7 auf, die in einer senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Lichtemissionen D erstreckten Detektionsebene 8 angeordnet sind.

Die Detektorelemente 7 erfassen insbesondere einzelne von dem Emitter E emittierte Photonen, die von einer Recheneinheit 10 des Lichtmikroskops 1 bzw. des Detektors 5 registriert werden. Bei dem Detektor 5 kann es sich z.B. um eine Kamera oder ein SPAD-Array handeln. Um in dem Vorlokalisierungsschritt 101 die geschätzten Positionen der Emitter E zu erhalten und insbesondere die Lokalisierungskarte 24 zu erstellen, wird die Probe 2 mit Beleuchtungslicht B, insbesondere Anregungslicht, beleuchtet. Es kann sich dabei um dasselbe Beleuchtungslicht B handeln, das auch für die Durchführung der Beleuchtungssequenz 103 verwendet wird, oder um ein anderes Beleuchtungslicht. Für den Vorlokalisierungsschritt kann insbesondere eine Weitfeldbeleuchtung der Probe 2 mittels der Lichtquelle 3 oder einer weiteren Lichtquelle (nicht gezeigt) vorgesehen sein. Alternativ kann die Probe 2 bei dem Vorlokalisierungsschritt 101 auch mit fokussiertem Beleuchtungslicht B abgetastet werden, z.B. mittels der ersten Strahlverlagerungseinheit 12 und der zweiten Strahlverlagerungseinheit 13 oder mit einem galvanometrischen Scanner (nicht gezeigt). Dabei kann wie bei der anschließenden Beleuchtungssequenz 103 die Intensitätsverteilung 17 mit dem lokalen Minimum 18 verwendet werden, oder die Probe 2 kann mit einer anderen Lichtverteilung, beispielsweise einem regulären, näherungsweise gaußförmigen Fokus, abgetastet werden. Im letztgenannten Fall ist es vorteilhaft, wenn der Lichtmodulator 4 einzeln ansteuerbare Pixel aufweist, um durch Wechsel des angezeigten Phasenmusters zwischen einer Intensitätsverteilung 17 mit lokalem Minimum 18 und einem regulären Fokus umschalten zu können.

Aus den bei dem Vorlokalisierungsschritt 101 von den Detektorelementen 7 des Detektors 5 erfassten und von der Recheneinheit 10 registrierten Photonen (Lichtemissionen D) schätzt die Recheneinheit 10 die Position der Emitter E, z.B. durch Bestimmung eines Zentroids einer Verteilung von Lichtintensitäten (bzw. Photonenzahlen), die von den Detektorelementen 7 erfasst wurden. Alternativ kann die Positionsschätzung durch die Recheneinheit 10 z.B. auch durch einen Fit einer Gaußfunktion an die Lichtintensitätsverteilung des detektierten Lichts, mittels eines Maximum-Likelihood-Schä zers oder durch Momentbestimmung erfolgen.

Die Recheneinheit 10 wertet anschließend die Lokalisierungskarte 24 aus und legt auf Basis dieser Auswertung die Beleuchtungssequenz 103 fest. Dabei wählt die Recheneinheit 10 zunächst aus mehreren Emittern E einen ersten Emitter E1 aus. Anschließend legt die Recheneinheit 10 weitere Parameter der Beleuchtungssequenz 103, wie z.B. die Art der Intensitätsverteilung 17, die Gesamtintensität des Beleuchtungslichts B, die Art des Beleuchtungsmusters 21 , die Anzahl der Beleuchtungspositionen 20 oder die maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 21 so fest, dass das Maximum 19 der Intensitätsverteilung 17 in jedem Beleuchtungsschritt 103a, 103b, 103c der Beleuchtungssequenz 103 den Mindestabstand von den geschätzten Positionen des mindestens einen zweiten Emitters E2 einhält. Dabei kann die Recheneinheit 10 insbesondere gespeicherte Relativpositionen 23 zwischen dem ersten Emitter E1 und einem jeweiligen zweiten Emitter E2 verwenden. In der folgenden Beleuchtungssequenz 103 wird die Probe 2 mit der Intensitätsverteilung 17 mit dem lokalen Minimum 18 an Beleuchtungspositionen 20 beleuchtet, die ein Beleuchtungsmuster 21 um die vermutete Position des ersten Emitters E1 bilden. Die erste Strahlverlagerungseinheit 12 und die zweite Strahlverlagerungseinheit 13 positionieren den Fokus des Beleuchtungslichtstrahls dabei in der Fokusebene in der Probe 2 an den Beleuchtungspositionen 20. Für jede Beleuchtungsposition 20 werden von den Detektorelementen 7 des Detektors 5 Lichtemissionen D erfasst. Die Recheneinheit 10 bestimmt dann aus den Lichtemissionen D die Position des ersten Emitters E.

Zusätzlich zu der ersten Strahlverlagerungseinheit 12 und der zweiten Strahlverlagerungseinheit 13 kann das Lichtmikroskop 1 eine weitere Scaneinheit (nicht gezeigt), z.B. einen galvanometrischen Scanner aufweisen, um die Intensitätsverteilung 17 des Beleuchtungslichts B über ein größeres Bildfeld gegenüber der Probe zu repositionieren.

Eine solche zusätzliche Scaneinheit kann sich insbesondere im gemeinsamen Strahlengang des Beleuchtungslichts B und des Detektionslichts befinden, d.h. zwischen der Objektivlinse 11 und dem dichroitischen Spiegel 14, so dass die Scaneinheit sowohl das Beleuchtungslicht B über die Probe 2 scannen als auch die Lichtemissionen D der Emitter E in der Probe entscannen kann.

Wenn der Detektor 5 ein Punktdetektor ist und zwischen dem dichroitischen Spiegel 14 und dem Detektor s eine Lochblende angeordnet ist, können die erste Strahlverlagerungseinheit 12, die zweite Strahlverlagerungseinheit 13 und die zusätzliche Scaneinheit so angesteuert werden, dass das Beleuchtungslicht gegenüber der Probe stationär ist, jedoch das durch die Lichtemissionen D der Emitter E erzeugte Detektionslicht an unterschiedlichen Positionen der Detektionsebene 8 erfasst wird. Z.B. kann das Abbild der Lochblende in der Probe 2 mit der Scaneinheit auf einer kreisförmigen Bahn bewegt werden, während die erste Strahlverlagerungseinheit 12 und die zweite Strahlverlagerungseinheit 13 die resultierende Kreisbewegung des Beleuchtungslichts B kompensieren, so dass dieses gegenüber der Probe 2 stationär ist. Dieses auch als „Pinhole Orbit Scanning“ bezeichnete Verfahren kann z.B. in dem Vorlokalisierungsschritt 101 durchgeführt werden, um mit einem als Punktdetektor ausgebildeten Detektor s die Lichtemissionen D mehrerer Emitter E zu erfassen. Dabei kann der Orbit Scan insbesondere nacheinander an verschiedenen Positionen des Beleuchtungslichts B relativ zu der Probe 2 durchgeführt werden.

Alternativ zur Verwendung der Strahlverlagerungseinheiten 12 kann die Probe 2 an den verschiedenen Beleuchtungspositionen 20 z.B. auch nacheinander durch unterschiedliche Lichtleitfasern mit dem Beleuchtungslicht B beleuchtet werden (nicht gezeigt), z.B. indem Lichtpulse des Beleuchtungslichts B in unterschiedlich lange Lichtleitfasern eingekoppelt werden, so dass diese einen zeitlichen Versatz zueinander aufweisen. Das Beleuchtungsmuster 21 kann in diesem Fall durch eine Scaneinheit, z.B. einen galvanometrischen Scanner relativ zu der Probe positioniert werden. Unterschiedliche Ausdehnungen des Beleuchtungsmusters 21 in der Probe 2 können beispielsweise durch eine Zoom-Optik oder durch die Ansteuerung verschiedener Gruppen von Lichtleitfasern eingestellt werden.

Fig. 6 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 (MINFLUX-Mikroskop). Dieses ist analog zu dem in Fig. 5 gezeigten Lichtmikroskop 1 aufgebaut (gleiche Bezugszeichen bezeichnen die gleichen Komponenten), weist aber im Detektionsstrahlengang einen ersten Detektor 5 und einen zweiten Detektor 6 mit jeweils mehreren, in einer Detektionsebene 8 angeordneten Detektorelementen 7 auf. Das Detektionslicht, also die Lichtemissionen D, werden dabei durch einen Strahlteiler 15 getrennt. Dabei kann es sich um einen neutralen Strahlteiler handeln, der das Detektionslicht unabhängig von dessen Eigenschaften in einem vorgegebenen Verhältnis (z.B. 1 :1) aufteilt. Alternativ kann es sich bei dem Strahlteiler 15 z.B. auch um einen Polarisationsstrahlteiler handeln. In diesem Fall kann z.B. vor dem Strahlteiler 15 ein Polarisationsschaltelement (nicht gezeigt), z.B. eine Pockels-Zelle, angeordnet werden, um das Detektionslicht durch ein Steuersignal abhängig von seiner Polarisationsrichtung selektiv zu dem ersten Detektor 5 oder dem zweiten Detektor 6 zu führen.

Beispielsweise kann der erste Detektor 5 für die Erfassung der Lichtemissionen D für die Schätzung der Positionen der Emitter E in dem Vorlokalisierungsschritt 101 optimiert sein und der zweite Detektor 6 kann für die Erfassung der Lichtemissionen D während der Beleuchtungssequenz 103 optimiert sein. Bei dem ersten Detektor 5 kann es sich z.B. um eine CCD- oder CM OS- Kam era handeln. Dies hat den Vorteil, dass relativ schnell einzelne Emitter E in einem relativ großen Bildfeld lokalisiert werden können. Der zweite Detektor 6 kann ein SPAD- Array sein. Für die Lokalisierung nach dem MINFLUX-Prinzip hat dies insbesondere den Vorteil, dass eine Einzelphotonenzählung für eine MINFLUX-Lokalisierung mit erweitertem Fangbereich möglich ist, dass also Emitter E in einem größeren Bereich eindeutig lokalisierbar sind.

Fig. 7 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 (MINFLUX-Mikroskop). Dieses ist analog zu dem in Fig. 5 gezeigten Lichtmikroskop 1 aufgebaut (gleiche Bezugszeichen bezeichnen die gleichen Komponenten), weist aber im Detektionsstrahlengang einen als Punktdetektor (z.B. ava/anc/7e-Photodiode) ausgebildeten ersten Detektor 5 und einen als Flächendetektor mit mehreren in einer Detektionsebene 8 angeordneten Detektorelementen 7 ausgebildeten zweiten Detektor 6 auf. Wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Ausführungsbeispiel wird das Detektionslicht auch hier durch einen Strahlteiler 15 zwischen dem ersten Detektor 5 und dem zweiten Detektor 6 aufgeteilt. Der Strahlteiler 15 kann ebenfalls wie oben beschrieben z.B. ein neutraler Strahlteiler oder ein Polarisationsstrahlteiler sein. Zwischen dem Strahlteiler 15 und dem ersten Detektor 5 ist eine optionale Lochblende 16 zur optischen Segmentierung (wie aus der Konfokalmikroskopie bekannt) angeordnet.

Bei dem in Fig. 7 dargestellten Ausführungsbeispiel ist insbesondere der erste Detektor 5 für die Erfassung der Lichtemissionen D des ersten Emitters E1 während der Beleuchtungssequenz 103 optimiert. Der zweite Detektor 6 ist insbesondere für den Vorlokalisierungsschritt 101 optimiert, in dem die Lichtemissionen D mehrerer Emitter E in einem ersten Bereich 27 der Probe 2 positionsabhängig erfasst werden.

In Fig. 8 ist ein Lichtmikroskop 1 (MINFLUX-Mikroskop) nach einem weiteren Ausführungsbeispiel dargestellt. Es ist im Wesentlichen analog zu dem in Fig. 5 gezeigten Lichtmikroskop 1 aufgebaut, wobei die gleichen Bezugszeichen die gleichen Komponenten bezeichnen.

Die Lichtquelle 3 des Lichtmikroskops 1 weist einen Beleuchtungslaser 31 (insbesondere einen Anregungslaser) sowie einen zusätzlichen Inaktivierungslaser 32 und einen zusätzlichen Aktivierungslaser 33 zum Bereitstellen von Aktivierungslicht A auf. Der Inaktivierungslaser 32 und der Aktivierungslaser 33 werden über jeweilige dichroitische Spiegel 14 in den Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt und durchlaufen die erste Strahlverlagerungseinheit 12, die zweite Strahlverlagerungseinheit 13 und den Lichtmodulator 4, werden an einem weiteren dichroitischen Spiegel 14 reflektiert und von der Objektivlinse 11 in die Probe 2 fokussiert. Auf diese Weise lässt sich ein Fokus oder eine Intensitätsverteilung 17 mit lokalem Minimum 18 (bei einer Modulation des Lichtstrahls durch den Lichtmodulator 4) des Inaktivierungslichts I und des Aktivierungslichts A an gewünschten Positionen in der Probe 2 erzeugen.

Der Inaktivierungslaser 32 und der Aktivierungslaser 33 sind insbesondere schaltbar, d.h., das Licht des entsprechenden Lasers kann durch ein Steuersignal von der Steuereinheit 9 ein- und ausgeschaltet (bzw. abgeschattet) werden. Dazu können z.B. akusto-optische Modulatoren vorgesehen sein (nicht gezeigt).

Mit dem in Fig. 8 gezeigten Lichtmikroskop 1 kann insbesondere das in Fig. 2 und Fig. 4 illustrierte und oben beschriebene Verfahren umgesetzt werden. Bezugszeichenliste

1 Lichtmikroskop

2 Probe

3 Lichtquelle

4 Lichtmodulator

5 Detektor, erster Detektor

6 Zweiter Detektor

7 Detektorelement

8 Detektionsebene

9 Steuereinheit

10 Recheneinheit

11 Objektivlinse

12 Erste Strahlverlagerungseinheit

13 Zweite Strahlverlagerungseinheit

14 Dichroitischer Spiegel

15 Strahlteiler

16 Lochblende

17 Intensitätsverteilung

18 Lokales Minimum

19 Maximum

20 Beleuchtungsposition

21 Beleuchtungsmuster

22 Abtastkreis

23 Relativposition

24 Lokalisierungskarte

25 Abstand

26 Beleuchtungsoptik

27 Erster Bereich

28 Zweiter Bereich

29 Gemeinsamer Bereich

30 Abtastellipse

30a Hauptachse

30b Mittelpunkt

31 Beleuchtungslaser

32 Inaktivierungslaser 33 Aktivierungslaser 01 Vorlokalisierungsschritt 1a Erfassen von Lichtemissionen mehrerer Emitter 1b Erstellen einer Lokalisierungskarte 02 Festlegen einer Beleuchtungssequenz 2a Auswahl mindestens eines ersten Emitters 2b Festlegen weiterer Parameter der Beleuchtungssequenz03 Beleuchtungssequenz 3a Erster Beleuchtungsschritt 3b Zweiter Beleuchtungsschritt 3c Dritter Beleuchtungsschritt 04 Positionsbestimmung 05 Erstellen eines Bildes oder einer T rajektorie 06 Erster Knotenpunkt 07 Zweiter Knotenpunkt 08 Dritter Knotenpunkt

A Aktivierungslicht

B Beleuchtungslicht

D Lichtemissionen

E Emitter

E1 Erster Emitter

E2 Zweiter Emitter

E3 Dritter Emitter

I Inaktivierungslicht

L Maximale Ausdehnung