本发明涉及一种细胞核雄性不育系的保持方法 和杂交小麦的培育方法， 具体属于植物遗 传育种领域。

背景技术

与作物细胞质雄性不育 "三系"杂交优势利用技术相比较， 作物细胞核雄性不育性不存 在特殊的恢复、 保持关系， 因此， 核不育作物杂交优势利用的最大优点， 是可用于选育优良 不育系、 保持系和父本系的亲本材料极为丰富， 有利于选育强优势杂交组合。 但是， 用常规 方法难以实现核不育性的有效保持， 即难以生产大量纯合不育系种子。 用小麦细胞遗传学的 理论， 通过小麦染色体工程技术， 设计某种特殊细胞遗传机制， 可实现核不育系的保持。 其 遗传育种原理是： 在纯合雄性不育基因型中， 附加一条外缘染色体或一条工程化染色体 (Engineered Chromosome) , 或称修饰染色体 ( Modified Chromosome ) , 它是用有关属、 种的 部分同源染色体为目标材料， 人工加工培育 （合成） 而成， 这条外缘或工程化染色体必需具 备以下特殊遗传功能： 一、 可以在普通小麦遗传背景中独立遗传传递、 表达， 而不与普通小 麦 ABD基因组的任何部分同源染色体在减数分裂期 发生配对； 二、携带显性同源（部分同源） 雄性可育基因 Ms和显性标记基因 Ma ; 三、 不能够通过雄配子途径传递， 而仅以雌配子途径 传递。 因此， 这个带有纯合核不育基因 m画 的单体异附加系小麦， 自交可结实， 后代种 子（植株）有两种基因型个体，一是不携带异 源染色体的具有纯合 基因型小麦的整倍体， 植株表现完全雄性不育， 二是带有一条异源染色体的具有纯合 ms s基因型小麦的单体异附加 系自身。 通过附加染色体携带的显性标记基因的表达， 将上述整倍体雄性不育的种子或植株 与雄性可育单体异附加系的种子 （种子标记性状） 或植株 （植株标记性状） 相区分。 将正常 整倍体雄性不育系和另一个普通小麦纯系杂交 ， 生产杂交 F^†子用于生产； 将单体异附加系 通过自交或与整倍体不育系杂交， 用于繁殖整倍体雄性不育系和其自身。 由此实现了小麦细 胞核雄性不育性的保持， 并将其应用于杂交小麦开发上。 根据上述细胞遗传理论设计原理， 国内外公开报道了数例成功实例 （包括本发明公开的内容）。

Driscoll等（ 1972 )将黑麦的 5R染色体导入小麦细胞核雄性不育突变体 Cornerstone (mslc) 上， 获得了 XYZ杂交小麦生产体系： X系、 Y系和 Z系分别是 msms基因型小麦 5R二体异 附加系 （2n=42W(msms)+5R" =44)、 5R单体异附加系 （2n=42W(msms)+5R =43 )禾卩 msms 基因型小麦整倍体 （2n=42W(m _S m _S )=42)。 5R染色体上携带有部分同源等位的显性雄性可� �� 说 明 书

基因 Ms和穗茎有绒毛显性标记基因， 5R染色体在减数分裂时不与普通小麦的染色体� ��生配 对， 而是独立遗传的。 用 Z系做母本与 X系杂交生产 Y系， 再由 Z系做母本和 Y系杂交繁 殖 Z系， 再由 Z系和父本系杂交生产杂交种用于生产。 XYZ体系开创了小麦核不育杂交优势 利用的新途径、 新方法。 但是， 由于 5R染色体在 Y系中能以一定的传递率通过花粉传递， 同时， X系中两个 5R染色体间常常发生不配对的现象。 为此， 后来 Driscoll ( 1985 ) 提出了 改良 XYZ体系， 其将原系统中 5R染色体改换为 5R等臂染色体， 改良系统中的外缘染色体， 通过雄配子途径的传递率有所减少， 但仍然能传递， 意味着系统仍然不能够生产纯合度高的 核不育系种子， 由此限制了它的生产应用。 另外， 区分可育与不育， 是根据植株穗茎有绒毛 (可育株 Y系）和无绒毛（不育株 Z系） 实现的， 这需要等到抽穗后进行， 由此增加了不育 系繁殖成本。

黄寿松等（1991 )将长穗偃麦草的 4E染色体附加到一份隐性核不育小麦上，获得� �� "蓝 标型小麦核雄性不育、 保持系"， 是带有纯合核不育基因的小麦的 4E染色体单体异附加系， 它自交可结实， 后代可分离出三种粒色的种子： 一种为白粒（正常小麦粒色）， 约占 64%， 表 现雄性不育， 可用于 F1制种； 另一种为浅蓝粒， 约占 33%， 自交可结实， 后代可永久分离出 白粒不育和蓝粒可育种子；第三种为深蓝粒， 占 3%， 自交可结实，后代仅为深蓝粒亲本自身。

但是， 要将上述蓝标型小麦雄性不育、保持系应用于 生产， 还有一些问题， 一是深蓝粒 和浅蓝粒有时粒色色差有限， 谷物光电色选机对深蓝和浅蓝粒间的的色选精 度不够， 无法将 深蓝粒完全剔除， 而深蓝粒自交后代只产生其深蓝粒自身，而不 直接分离出白粒不育系后代， 加之白粒不育系种子逐年逐代的被分出用于 制种， 在浅蓝粒自交繁殖群体中将发生深蓝粒 的累加， 从而造成浅蓝粒系自交繁育白粒核不育系的效 率降低； 二是虽然浅蓝粒中附加的 4E 染色体使其表现为雄性可育， 自交结实， 粒色蓝、 白分离， 同时具备白粒核不育系的 "自交" 繁育和浅蓝粒保持系自身繁殖的双重功能， 但浅蓝粒种子植株的平均自交结实率只有 30-70% , 影响浅蓝粒自交繁殖白粒不育系种子的生产效 率， 增加了生产应用中的种植成本。

此外， 1993年， 由澳大利亚 Smart等发明的 PCT/AU93/00017 (W093/13649)国际专利 ( Genetically modified wheat plants and progeny and method for production of hybrid wheat) , 日 本 T.R. Endo提出的将杀配子基因 Gel与雄性不育基因 m _S 连锁的方法， 1998年和 2003年由 以色列著名的小麦学者 Moshe Feldman教授等发明的 PCT/IL98/00220(WO98/51142， Methods for production of hybrid wheat) , PCT/US02/41852 (WO03/057848A2, A method to maintain a genie male- sterile parental line of wheat through selfing of the maintainer line)两项国际专禾 ίΙ等都 是对杂交小麦生产体系进行的改良。 这些发明的核心目的是实现细胞核不育性的高 效保持， 说 明 书

采取的核心技术措施是构建一条功能较为齐 全、 完美的特殊人工重组外源染色体 （臂） 或转 基因外源染色体（臂）。这些研究为实现阻遏 重组外源染色体通过花粉途径传递的遗传育种 目 标及提高核不育系的生产繁殖效率做出了有益 的尝试。 但是， 针对高效保持亲本系的要求， 上述杂交小麦生产体系都存在一定的缺陷， 主要是由于不能产生高纯度的雄性不育系、 或由 于基于标记基因的不育系保持程序太复杂、或 由于保持系在遗传上尚不稳定、 或由于保持系 的繁殖和用其生产不育系太费力、 导致杂交种的生产成本太高。 因此， 这些体系并没有在生 产上得到大规模应用。

发明内容

本发明中涉及的小麦细胞核雄性不育突变体材 料是在春小麦品种间杂交组合的杂种1¾ 代群体中发现的自发突变体材料， 系统的研究表明， 该突变体是一个单基因控制的隐性核雄 性不育突变体， 不育性遗传稳定， 不受外界光、 温环境因子的影响， 其不育性受位于 4B染色 体短臂上一对等位纯合隐性不育基因控制， 基因位点与前人已经报道的 位点上的其它六 个突变体 ( Pugsley's (msla) , Probus's (mslb) , Cornerstone (mslc) , FS2 (msld), FS3 (msle) 禾口 FS24 (mslf), ) 等位。

作为普通小麦第 4同源群的部分同源染色体， 来自长穗偃麦草 g.ekmgat 的 4E染 色体， 除携带与本发明所涉及的雄性不育突变体中突 变的育性基因部分同源的显性雄性育性 可育基因 M5 ^£ 外， 还携带显性蓝色糊粉层标记基因 α。 ¾ί基因具有明显的剂量效应， 蓝色胚 乳基因的遗传是稳定而独立的， 可以根据胚乳的颜色推断胚的色素基因型及其 后代籽粒颜色 的变化。 小麦的受精过程是双受精 （double fertilization) , 即雄配子体形成的两个精子， 一个 与卵融合形成二倍体的合子， 另一个与中央细胞的两个极核融合形成三倍体 的胚乳。 糊粉层 属于胚乳组织， 故蓝色糊粉层标记基因 i¾具有胚乳组织的三倍体遗传特征。 如果雌雄配子体 都带有蓝色糊粉层标记基因 基因， 所形成的小麦种子的胚乳细胞中就带有 3个 «基因， 胚 乳呈深蓝色； 如果只有雌配子体带有蓝色糊粉层标记基因¾� ��因， 所形成的小麦种子的胚乳 细胞中就带有 2个5^基因， 胚乳呈中蓝色； 如果只有雄配子体带有蓝色糊粉层标记基因 基 因， 所形成的小麦种子的胚乳细胞中就带有 1个^¾？基因， 胚乳呈浅蓝色。

本发明所述普通小麦第 4同源群指普通小麦 4Α、 4Β和 4D染色体所组成的同源群。 以本发明所提到的小麦细胞核雄性不育突变体 材料为母本， 以 4Ε附加系蓝粒小麦为父本 杂交， 经 6个世代的系统鉴定选择， 获得的 基因型小麦 4Ε单体异附加系的种子为蓝粒， 其基因型为： (浅 蓝粒） （图 1 )。 说 明 书

异附加系， 指通过人工远缘杂交， 然后自交或回交， 使作物的染色体组添加了异种或异 属的一条或一对同源染色体的植物新系统。 4E附加系蓝粒小麦是李振声等用普通小麦与长� �� 偃麦草远缘杂交获得的， 附加的外源 4E染色体在普通小麦遗传背景中是独立遗传和� ��达的。

上述 msms基因型小麦 4E单体异附加系小麦自交可正常结实， 4E染色体在雌雄配子中 的传递率均为 20%， 后代有四种粒色（基因型）种子 （图 2)， 四种粒色种子的具体描述和相 关特征描述如下：

1、 白粒种子 （实际与正常小麦的白粒或红粒颜色相似， 为了和蓝粒种子区分， 统称为白粒 种子）， 在 基因型小麦 4E单体异附加系小麦的自交繁殖所收获的种子� ��占 64%左右， 基因型为： 2n=42 ( msms ) =42， 所繁殖出的植株表现为近 100%的雄性不育度和雄性不育 株率， 可将其作为母本和其它作为父本的正常普通小 麦品种杂交， 生产商用的小麦 杂交 种子。 本发明所述雄性不育度指在雄性不育系套袋自 交时未结实小花占所有小花的比例。 如果雄性不育系套袋自交时所有小花均未结实 ， 则雄性不育度为 100% ; 如果雄性不育系 套袋自交时 40朵小花中有 1个小花结实， 则雄性不育度为 97.5%。

2、 浅蓝粒种子， 糊粉层中带有一个来自于雄配子体的蓝色糊粉 层标记基因¾基因， 在

基因型小麦 4E单体异附加系小麦的自交繁殖所收获的种子� ��占 16%左右， 基因型为： 2n=42 ( msms) +4E ( BaMS ^E =43 , 自交可结实， 自交后代可永久分离出 64%白粒不育系 种子和 16%浅蓝粒种子 （携带一个来自雄配子体的蓝色糊粉层标记基 因 基因）、 16%中 蓝粒种子（携带两个来自雌配子体的 α基因）、 4%深蓝粒种子（携带三个 2¾基因， 一个来 自雄配子体， 两个来自雌配子体）， 该浅蓝粒种子可作为繁殖不育系的保持系使用 ；

3、 中蓝粒种子， 糊粉层中带有两个来自雌配子体的蓝色糊粉层 标记基因 基因， 在《^ ^基 因型小麦 4Ε单体异附加系小麦的自交繁殖所收获的种子 中占 16%左右，基因型为： 2η=42

( msms ) +4E ( BaBaMS ^E ) =43， 自交可正常结实， 自交后代可永久分离出 64%白粒不育 系种子和 16%浅蓝粒种子 （携带一个来自雄配子体的蓝色糊粉层标记基 因 基因）、 16% 中蓝粒（携带两个来自雌配子体的 基因）、 4%深蓝粒种子（携带三个 i¾基因， 一个来自 雄配子体， 两个来自雌配子体）， 该中蓝粒种子也可作为繁殖不育系的保持系使 用；

4、 深蓝粒种子， 携带三个 基因， 一个来自雄配子体， 两个来自雌配子体， 在 msms基因型 小麦 4E单体异附加系小麦的自交繁殖所收获的种子� ��占 4%左右， 2n=42 ( msms ) +4E"

(BaBaBaMS ^E MS ^E ) -44 , 自交可正常结实， 自交后代 100%是深蓝粒自身， 对繁殖白粒核 不育系无直接利用价值， 需要剔除。 说 明 书

在 m 基因型小麦 4E单体异附加系小麦自交繁殖得到的株系中， 其中可以用白粒核不 育系与其它正常普通小麦品种作为父本系杂交 生产商用 F1种子;用浅、中蓝粒系作为保持系， 用于自交繁殖白粒核不育系和浅、 中蓝粒保持系种子； 用光电色选机分拣蓝粒保持系自交繁 殖生产的蓝、 白粒色混合种子群体中的白粒种子和蓝粒种子 ， 再在蓝粒种子群体中分检出深 蓝粒剔除。 这样， 实现了一种基于细胞核雄性不育杂交小麦培育 的新方法、 新途径的建立。

但是， 由于在某些小麦栽培环境下， 在某种小麦品种遗传背景（种皮厚薄及其基质 不同） 下， 个别浅蓝粒种子的蓝色糊粉层标记性状表现不 充分， 难以和白粒不育系相区分； 同时， 在某种遗传和环境下， 中蓝粒和深蓝粒之间的粒色色差有限， 难以相互区分。 用光电色选机 等物理方法， 由于难以实现浅蓝粒与白粒之间 100%的分拣， 将影响白粒核不育系的纯度； 用 光电色选机等物理方法， 由于难以实现深蓝粒与中蓝粒之间的 100%的分拣，将影响蓝粒保持 系繁殖白粒不育系和蓝粒保持系自身的生产效 率。

浅蓝或中蓝粒保持系的遗传本质是 m 基因型小麦 4E单体异附加系 （2n=42+4E=43)， 其自交后可产生两种基因型的配子： 一种是正常配子 n=21， 另一种是异型配子 n=21+4E=22。 蓝粒保持系自交后代中浅蓝粒和深蓝粒后代的 发生， 是由于异型雄配子具有遗传传递能力所 引起的。 如何使蓝粒保持系自交过程中， 产生的异型雄配子 n=21+4E=22不能够传递， 由此 实现蓝粒保持系自交后代中无浅蓝粒和深蓝粒 发生， 后代中永久为中蓝粒和白粒两种基因型 后代， 是实现这一蓝粒标记细胞核雄性不育杂交小麦 培育方法的遗传育种改良的理想目标。 由于中蓝粒自交过程中可形成两种基因型雄配 子， 一种是正常配子 _n =21 , 另一种是异型配子 n=21+4E=22, 在雄配子 （花粉） 的发生、 发育及授粉等系列生命过程中， 异型配子的竞争力 不如正常配子（图 2)， 如果人为创造胁迫环境， 可进一步削弱本来处于劣势竞争地位的异型 雄配子的遗传传递功能。 根据这种两种基因型雄配子竞争力的天然差异 ， 本发明通过对蓝粒 保持系幼苗， 实施化学胁迫的途径， 实现了阻滞其自交产生的异型雄配子基本不能 遗传传递 到后代的目标， 同时又不明显降低蓝粒保持系自交结实率。经 过大量筛选和试验发现， 用 0.4 公斤 /公顷剂量的小麦化学杂交剂 SQ- 1 (西北农林科技大学生产并拥有知识产权， 目前在生产 上大量利用）， 在蓝粒保持系的苗期喷施后， 可以使异型雄配子的遗传传递率下降到 0.2%， 即， 使蓝粒保持系自交后代中浅蓝粒和深蓝粒的发 生率下降到 0.16%和 0.04% , 同时， 蓝粒 保持系的自交结实率没有明显降低 （图 3)。 由此实现了基于细胞核雄性不育杂交小麦培育 新 方法的建立。

本发明所述正常雄配子指携带 21条普通小麦染色体的雄配子； 异型雄配子指携带 21条 普通小麦染色体和 1条长穗偃麦草 4E染色体的雄配子。 说 明 书

本发明与已有的现有技术相比， 其进步之处在于： 1 )本发明所采用的细胞核雄性不育材 料突变体是一单隐性核基因突变而致，不育性 遗传稳定，不受外界光、温环境因子的影响； 2) 本发明所提供的中蓝粒系的自交结实率高， 几乎接近正常小麦品种的结实率（85%以上）， 而 黄寿松等报道的 "蓝标型小麦核雄性不育、 保持系"（相当于本发明的蓝粒系） 的结实率约为 40-50% , 相比之下， 本发明在生产育种上有了更大的进歩； 3 ) 本发明涉及的蓝粒系自交后 代蓝、 白粒的分离比率与 "蓝标型小麦核雄性不育、 保持系"不同， 本发明的蓝粒系中自交 后代分离出的白粒不育系种子可以达到 80%左右， 而 "蓝标型小麦核雄性不育、 保持系" 自 交后代分离出的白粒不育系种子只有 64%左右， 从而使得可以繁殖更多的白粒不育系以用于 杂交育种。 附图说明

图 1是蓝粒保持系的选育图解。

图 2是蓝粒保持系 2n=42W(m«ra)+4E(fia¾ ? )=43自交后代遗传分离原理图。

图 3是不同浓度化学杂交剂 SQ-1处理蓝粒保持系 2n=42W m +4Ε(βββίϊ ? ^£ )=43对异 型雄配子的化杀效果。

图 4是蓝粒保持系 2n=42W( «ra)+4E( afia S ^£ )=43被 SQ-1 (0.4 kg/hm ² )处理后自交后代 遗传分离结果图。

具体实施方式

实施例 1、 蓝粒保持系的选育

以细胞核雄性不育突变体为母本， 以 4E附加系蓝粒小麦为父本杂交， 代种子为浅蓝粒; F ₂ 代淘汰所有白粒种子， 仅将蓝粒种子点播； 将 F3代种子分单株分蓝、 白粒后成对行种植， F ₃ 代及其以后时代， 出现不育株率为 100%的白粒行和自交结实的相应蓝粒行的成对� �系， 说 明该家系的核不育基因已纯合， 再将其相应的可育蓝粒株继续自交选育 3代， 直至形成稳定 的蓝粒保持系 （见图 1示）。

实施例 2、 蓝粒保持系最佳化学杂交剂 SQ-1处理浓度和处理时期的筛选试验

按小区种植稳定的蓝粒保持系 2η=42λν(«¾«¾)+4Ε(¾ιββ ? ^£ )=43， 在所有植株处于 Feeks 8.0-9.0 (旗叶抽出至平展） 时， 设置 0.1、 0.2、 0.4、 0.7和 1.0公斤 /公顷的若干 SQ-1喷施浓 度， 用自动喷雾器对小麦进行一次叶面喷施处理。 喷药处理后， 每小区内随机套袋 20穗， 其 中 10穗扬花后作为父本给普通小麦授粉，收获的� ��子中蓝粒种子占所有种子的比例即为异型 雄配子 （n=21W(m^ra)+4E( ? ^£ )=22) 的传递率； 另外 10穗套袋自交结实， 与对照组 （未 说 明 书

经化学杂交剂 SQ-1 处理） 的自交结实率进行比较， 计算自交结实率下降比例 （（对照组自交 结实率 -处理组套袋自交结实率） /对照组自交结实率 X 100%) ; 将处理组套袋自交结实的种子 种下， 调查其深蓝粒种子的发生率 （深蓝粒种子种子种出的植株所结种子全部为 蓝粒， 不发 生蓝白分离）。

结果如图 3所示， SQ-1处理剂量为 0. 4 kg/hm ² 时， 异型雄配子的传递率下降至 0. 2%， 深 蓝粒发生率下降至 0. 04%, 自交结实率仅下降 10. 7%； 当 SQ-1处理剂量低于 0. 4 kg/hm ² 时， 异型雄配子仍有较高的传递率，相应的深蓝粒 发生率也较高；当 SQ-1处理剂量高于 0. 4 kg/hm ² 时， 异型雄配子的传递率为 0， 但自交结实率下降比例较大，不适合生产应用 ； 因此， 最佳的 SQ-1处理剂量为 0. 4 kg/hm ² 。

实施例 3、 蓝粒保持系的繁殖和白粒不育系的分离

设置隔离区， 种植蓝粒保持系 2n=42W(m ww)+4ECSaBflM )=43， 在所有植株处于 Feeks 8.0-9.0 (旗叶抽出至平展）时，用最佳的化学杂交剂 SQ-1的使用浓度 0.4kg/hm ² ，进行喷施； 其自交后代遗传分离如图 4所示。 对收获的种子进行光电籽粒色选机色选， 选出白粒不育 系和蓝粒可育系。

实施例 4、 白粒不育系在杂交育种中的应用

2010年春季甘肃武威制种， 面积 2.0亩。 父本为陇春 8139， 母本为白粒不育系； 父本和 母本 3月 10日同时播种， 父母本行比 3:6; 父本 6月 5日抽穗， 母本 6月 3日抽穗。 母本开 花第一天即取花粉镜检， 经 I ₂ -KI染色， 花粉 100%为典型败育； 套袋自交结实率为 0。 母本开 花早， 花时较集中， 父母本花时相遇良好； 收获杂交种子 330公斤； 2010年冬季云南元谋鉴 定纯度为 98.0%。