IBARRA, Dominique (26 Rue de Madrid, Gif sur Yvette, F-91190, FR)
GIRAULT, Christel (14 Rue Claude Debussy, Voisins le Bretonneux, F-78960, FR)
IBARRA, Dominique (26 Rue de Madrid, Gif sur Yvette, F-91190, FR)
| REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication d'un produit alimentaire ou biotechnologique, mettant en œuvre une ou plusieurs étapes, l'une ou plusieurs des étapes mettant en œuvre un milieu, l'une ou plusieurs des étapes mettant en œuvre un milieu étant une étape de fermentation , au cours duquel on procède, durant au moins l'une des étapes du procédé à une opération de contrôle du potentiel redox du milieu de l'étape considérée, et se caractérisant en ce que l'on effectue la conduite du procédé de la manière suivante : - on régule à un niveau prédéterminé de consigne te potentiel redox du milieu de l'étape dont le potentiel redox est contrôlé à l'aide d'ajouts contrôlés d'un gaz de traitement dans le milieu considéré, et
- on autorise le passage à l'étape suivante de ladite étape considérée dans le procédé lorsque ladite valeur de consigne est atteinte, de façon à réaliser au moins une des dites étapes du procédé en condition réductrice et au moins une des dîtes étapes du procédé en condition oxydante.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fabrication d'un produit laitier fermenté, et en ce que la régulation du potentiel redox a lieu en plusieurs des étapes de façon à séquencer les phases d'oxydation et de réduction de la façon suivante :
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions réductrices en un ou plusieurs points du procédé situés en amont de la phase de pasteurisation ;
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions oxydantes en un ou plusieurs points du procédé situés en aval de la pasteurisation.
3. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fabrication d'un produit laitier fermenté, et en ce que la régulation du potentiel redox a lieu en plusieurs des étapes de façon à séquencer les phases d'oxydation et de réduction de la façon suivante : - on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions oxydantes en un ou plusieurs points du procédé situés en amont de la phase de pasteurisation ;
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions réductrices en un ou plusieurs points du procédé situés en aval de la pasteurisation.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que le produit laitier fermenté est un yaourt.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite conduite du procédé est réalisée de manière à ce que, pour au moins l'une des dites étapes de fermentation, des ajouts contrôlés d'un gaz de traitement permettent d'alterner des phases de la fermentation considérée en conditions réductrices avec des phases de la fermentation considérée en conditions oxydantes.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fabrication de bière, et en ce que ladite conduite du procédé permet que la régulation du potentiel redox pendant la fermentation ait lieu en deux temps : dans un premier temps, la fermentation a lieu en condition oxydante régulée et en présence d'oxygène, pour favoriser la croissance de la levure et son bon état physiologique, et dans un second temps, le potentiel redox est abaissé à une valeur optimale pour permettre d'améliorer les paramètres de fermentation, ainsi que les critères sensoriels.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de réguler le potentiel redox du milieu à différentes valeurs successives en fonction des différentes phases de la fermentation de façon à réaliser une première phase en conditions oxydantes afin de favoriser la croissance de la souche microbienne par des conditions oxydantes, et après l'obtention d'une teneur maximale en biomasse de basculer le fermenteur en conditions réductrices afin d'initier ou d'intensifier la production d'un ou plusieurs métabolites recherchés.
S. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à ta fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de réguler le potentiel redox du milieu à différentes valeurs successives en fonction des différentes phases de la fermentation, de façon à réaliser une première phase rendue légèrement réductrice qui est favorable à la croissance de certains microorganismes et donc à la production d'une biomasse importante, suivie par. une phase plus réductrice qui va permettre de favoriser la production de composés d'arômes souhaités.
9. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de modifier et réguler le potentiel redox du milieu à une valeur différente en fin de fermentation afin d'adapter le métabolisme ou la physiologie
( des micro-organismes pour les préparer à une étape ultérieure.
10. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à Ia fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la production d'un métabolite désiré pour favoriser l'excrétion du métabolite considéré dans le milieu de récupération.
11. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la production d'un précurseur d'une molécule d'intérêt pour favoriser une réaction chimique permettant l'obtention de la molécule d'intérêt recherchée.
12. Procédé selon l'une des revendications S à 11 , caractérisé en ce que le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que postérieurement à la fermentation sont réalisées :
- des étapes de centrifugation, et/ou filtration et/ou ultrafiltration visant à récupérer la biomasse produite, ou - des étapes de purification sur le milieu de fermentation pour séparer et concentrer des métabolites, et en ce que ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la séparation du milieu contenant la molécule d'intérêt de la biomasse pour favoriser la séparation sélective de la molécule d'intérêt des autres composés du milieu en privilégiant par exemple la fixation sur une résine soit sous la forme réduite soit sous la forme oxydée de la molécule d'intérêt et son élution par une solution adaptée. |
Procédé de fabrication d'un produit alimentaire ou biotechnologique mettant en œuvre une régulation du potentiel redox.
La présente invention concerne le domaine des procédés de fabrication de produits alimentaires et biotechnologiques, mettant en œuvre une ou des étapes de fermentation.
Les procédés envisagés sont très variés et peuvent être divisés en deux grandes familles :
- les procédés de fabrication de produits fermentes alimentaires tels que les produits laitiers fermentes (yaourts, fromages blancs etc.), les boissons fermentées (bières, vin etc.),
- les procédés de fabrication de biomasse (ferments lactiques, levures etc.) et de métabolites (ingrédients alimentaires, molécules d'intérêt telles que les enzymes, acides aminés, médicaments, éthanol...etc...). L'invention s'attache à proposer de nouvelles conditions opératoires permettant selon le cas considéré d'améliorer notamment les propriétés des produits ainsi fabriqués, et notamment leurs propriétés microbiologiques, sensorielles, physico-chimiques etc., ou bien les rendements, les puretés etc ... Comme on le verra ci-dessous plus en détails, la présente invention propose une nouvelle méthode de conduite de tels procédés par le contrôle et la régulation du potentiel redox du milieu considéré à un niveau donné de potentiel redox (niveau du redox défini dans chaque cas de façon à avoir un effet souhaité optimum), en un ou plusieurs points clés du procédé, ceci par des ajouts contrôlés d'un ou plusieurs gaz ou mélanges gazeux adaptés.
On peut obtenir des mesures du potentiel redox dans un milieu à l'aide de tout moyen disponible tel que par exemple les sondes redox qui permettent de faire des mesures directes et en continu dans des milieux liquides ou semi-liquides, ou encore par voie indirecte par des mesures de teneur en gaz dissous, par exemple d'hydrogène dissous dans le milieu.
Le suivi et la régulation du potentiel redox à certaines étapes clés du procédé permettent par exemple de réaliser des étapes ou phases du procédé
en conditions réductrices stables ou d'alterner durant le procédé des étapes en conditions réductrices avec des étapes en conditions oxydantes.
Une condition est considérée oxydante ou réductrice par rapport au potentiel redox du milieu avant l'ajustement par les gaz. Ainsi une condition sera dite réductrice quand le potentiel d'oxydoréduction sera inférieur à la valeur initiale avant son ajustement et sa régulation (que le potentiel atteint soit négatif ou non). Inversement, une condition sera dite oxydante quand le potentiel d'oxydoréduction sera supérieur à la valeur initiale avant son ajustement et sa régulation (que le potentiel atteint soit positif ou non). On rappellera que les oxydo-réductions sont des étapes essentielles dans les réactions de l'anabolisme et du catabolisme cellulaire, pour lesquelles le sens des échanges est déterminé par le potentiel d'oxydo-réduction (ci-après Eh). Le Eh est un paramètre d'état des fermentations ; sa variation modifie l'environnement physico-chimique des microorganismes. Les activités métaboliques et la physiologie des microorganismes sont déterminées par le pH intracellulaire (pH in ) qui va conditionner l'activité des enzymes et l'accessibilité de certains substrats et cofacteurs dans les réactions du métabolisme. Le pHj π est fonction du pH extracellulaire (pH ex ) et de l'aptitude du microorganisme à maintenir une certaine homéostasie cellulaire. La différence entre le pHj π et le pH ex va également modifier la valeur de la force proto-motrice δμhT, qui est notamment impliquée dans les échanges de la cellule microbienne avec l'extérieur. Les paramètres Eh et pHj π sont intimement liés ; ainsi l'énergie retrouvée dans les composés à haut potentiel comme d'adénosine tri-phosphate (ATP) et gagnée par le catabolisme des substrats pourra être utilisée par la cellule pour maintenir son pHj π (et donc son δpH) grâce aux ATPases membranaires.
Selon Urbach et al en 1995 (« Contribution of lactic acid bacteria to flavour compound formation in dairy products", International Dairy Journal. 5: 877-903), les bactéries lactiques sont largement impliquées dans la production des arômes des produits laitiers fermentes ; elles convertissent le lactose en acide lactique ; ceci conduit à la production de diacétyle et d'acétaldéhyde qui sont les principaux arômes des laits fermentes et des fromages frais. Le Eh est un paramètre environnemental qui va pouvoir conditionner les activités
métaboliques des microorganismes et notamment leur capacité à synthétiser des molécules d'arômes. En particulier, il a été montré pour l'emmental et le cheddar, que les fromages de bonne qualité avaient un faible potentiel d'oxydoréduction. Le Eh est un paramètre physico-chimique qui, de par sa nature, agit sur tous les milieux, pourvu que ceux-ci contiennent au moins une molécule qui puisse passer d'un état oxydé à réduit et vice versa. C'est pourquoi son effet est perceptible sur toutes les fonctions cellulaires. Son action a été montrée sur différents types de souches bactériennes, à titre illustratif : - L'ajout de réducteurs chimiques dans les milieux de culture a permis de modifier significativement la croissance et les flux métaboliques chez Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum,
Sporidiobolus ruinenii et Escherichia coli ;
Un Eh réducteur fixé par des gaz a permis de modifier les flux métaboliques chez Saccharomyces cerevisiae avec une augmentation du ratio glycérol/éthanol et l'accumulation des sucres de réserve avec augmentation de la survie des levures lors de la conservation.
En milieu industriel, le Eh est déjà indirectement pris en compte au travers de l'oxygène dont l'effet inhibiteur sur les bactéries lactiques est bien identifié. Cet effet est dû à leur incapacité à synthétiser des cytochromes et les enzymes à noyau hème.
On sait par ailleurs qu'il est aussi possible en agissant sur le Eh de modifier la survie des ferments probiotiques, les flux métaboliques, la production et/ou la stabilité des molécules d'arômes. L'ensemble de ces résultats a été obtenu suite à une modification du Eh par les microorganismes eux-mêmes, par des molécules oxydo-réductrices, ou par traitement thermique.
Dans le domaine de l'utilisation de mélanges gazeux dans les milieux de fermentation de bactéries lactiques on peut citer également les travaux de
Henriksen et al parus dans Letters in Applied Microbiology en 2000 (vol. 30 p415-418) qui se sont intéressés à la croissance de bactéries lactiques, et ont montré que lorsque les cultures étaient balayées par de l'azote la croissance était fortement ralentie, alors que l'ajout d'infimes quantités de CO2 dans ce cas faisait redémarrer la croissance sous forme exponentielle.
La présente invention concerne alors un procédé de fabrication d'un produit alimentaire ou biotechnologique, mettant en œuvre une ou plusieurs étapes, l'une ou plusieurs des étapes mettant en œuvre un milieu, l'une ou plusieurs des étapes mettant en œuvre un milieu étant une étape de fermentation, au cours duquel on procède, durant au moins l'une des étapes du procédé à une opération de contrôle du potentiel redox du milieu de l'étape considérée, et se caractérisant en ce que l'on effectue la conduite du procédé de la manière suivante : - on régule à un niveau prédéterminé de consigne le potentiel redox du milieu de l'étape dont le potentiel redox est contrôlé à l'aide d'ajouts contrôlés d'un gaz de traitement dans le milieu considéré, et
- on autorise le passage à l'étape suivante de ladite étape considérée dans le procédé lorsque ladite valeur de consigne est atteinte, de façon à réaliser au moins une des dites étapes du procédé en condition réductrice et au moins une des dites étapes du procédé en condition oxydante.
On parlera indifféremment dans ce qui suit d'étapes ou de phases constituant le procédé, ou encore de phases constituant une étape du procédé.
Le procédé selon l'invention pourra par ailleurs adopter l'une ou plusieurs des caractéristiques techniques suivantes :
- le procédé est un procédé de fabrication d'un produit laitier fermenté, et la régulation du potentiel redox a lieu en plusieurs des étapes de façon à séquencer les phases d'oxydation et de réduction de la façon suivante :
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions réductrices en un ou plusieurs points du procédé situés en amont de la phase de pasteurisation ;
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions oxydantes en un ou plusieurs points du procédé situés en aval de la pasteurisation.
- le procédé est un procédé de fabrication d'un produit laitier fermenté, et la régulation du potentiel redox a lieu en plusieurs des étapes de façon à séquencer les phases d'oxydation et de réduction de la façon suivante :
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions oxydantes en un ou plusieurs points du procédé situés en amont de la phase de pasteurisation ;
- on effectue une régulation du potentiel redox de façon à mettre en place des conditions réductrices en un ou plusieurs points du procédé situés en aval de la pasteurisation.
- le produit laitier fermenté est un yaourt. - ladite conduite du procédé est réalisée de manière à ce que, pour au moins l'une des dites étapes de fermentation, des ajouts contrôlés d'un gaz de traitement permettent d'alterner des phases de la fermentation considérée en conditions réductrices avec des phases de la fermentation considérée en conditions oxydantes. - le procédé est un procédé de fabrication de bière, et ladite conduite du procédé permet que la régulation du potentiel redox pendant la fermentation ait lieu en deux temps : dans un premier temps, la fermentation a lieu en condition oxydante régulée et en présence d'oxygène, pour favoriser la croissance de la levure et son bon état physiologique, et dans un second temps, le potentiel redox est abaissé à une valeur optimale pour permettre d'améliorer les paramètres de fermentation, ainsi que les critères sensoriels.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et ladite conduite du procédé permet de réguler le potentiel redox du milieu à différentes valeurs successives en fonction des différentes phases de la fermentation de façon à réaliser une première phase en conditions oxydantes afin de favoriser la croissance de la souche microbienne par des conditions oxydantes, et après l'obtention d'une teneur maximale en biomasse de basculer le fermenteur en conditions
réductrices afin d'initier ou d'intensifier la production d'un ou plusieurs métabolites recherchés.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et ladite conduite du procédé permet de réguler le potentiel redox du milieu à différentes valeurs successives en fonction des différentes phases de la fermentation, de façon à réaliser une première phase rendue légèrement réductrice qui est favorable à la croissance de certains microorganismes et donc à la production d'une biomasse importante, suivie par une phase plus réductrice qui va permettre de favoriser la production de composés d'arômes souhaités.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et ladite conduite du procédé permet de modifier et réguler le potentiel redox du milieu à une valeur différente en fin de fermentation afin d'adapter le métabolisme ou la physiologie des micro-organismes pour les préparer à une étape ultérieure.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la production d'un métabolite désiré pour favoriser l'excrétion du métabolite considéré dans le milieu de récupération.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la production d'un précurseur d'une molécule d'intérêt pour favoriser une réaction chimique permettant l'obtention de la molécule d'intérêt recherchée.
- le procédé est un procédé de fermentation en fermenteur visant à la fabrication de biomasse et/ou de métabolites, et en ce que postérieurement à la fermentation sont réalisées :
- des étapes de centrifugation, et/ou filtration et/ou ultrafiltration visant à récupérer la biomasse produite, ou
- des étapes de purification sur le milieu de fermentation pour séparer et concentrer des métabolites,
et ladite conduite du procédé permet de changer le niveau de potentiel redox après la séparation du milieu contenant la molécule d'intérêt de la biomasse (cellules microbiennes) pour favoriser la séparation sélective de la molécule d'intérêt des autres composés du milieu en privilégiant par exemple la fixation sur une résine soit sous la forme réduite soit sous la forme oxydée de la molécule d'intérêt et son élution par une solution adaptée.
Il est donc proposé de contrôler le potentiel redox à des endroits clés dans le procédé, à l'aide de tout moyen disponible tel que par exemple les sondes redox. Ce contrôle permet d'ajuster le potentiel redox et de maîtriser l'ajout de gaz dans le milieu, tout en déterminant avec précision le moment où il est possible de stopper le processus de modification du redox.
Il est possible d'envisager un système de régulation automatique du potentiel redox du milieu, puisque l'on sait par exemple que certains microorganismes, de par leur activité, modifient le potentiel redox d'un milieu. Il est ainsi permis de garder un redox stable pendant une période donnée d'une fermentation.
Il peut être également possible, selon le procédé considéré, d'alterner des phases de conditions réductrices et oxydantes de façon à privilégier à des moments définis dans le procédé la mise en place de réactions biochimiques et/ou biologiques qui par leur enchaînement permet l'obtention d'un produit à caractéristiques définies. Ainsi à titre illustratif, il peut être intéressant de conduire une fermentation avec une première phase rendue légèrement réductrice par ajout d'azote (chassant une partie de l'oxygène dissous) qui est favorable à la croissance de certains microorganismes et donc à la production d'une biomasse importante, suivie par une phase plus réductrice (par exemple à l'aide d'un mélange contenant de l'hydrogène) qui va permettre par exemple de favoriser la production de composés d'arômes souhaités tels que par exemple l'acétaldéhyde produit par les bactéries lactiques.
Comme on l'aura compris à la lecture de ce qui précède, le gaz de traitement devra être choisi en fonction du procédé considéré, de l'étape considérée, des conditions redox que l'on souhaite atteindre, et l'on pourra
donc envisager d'utiliser un gaz neutre tel que l'azote, l'argon, l'hélium, ou le dioxyde de carbone, mais aussi un gaz oxydant tel que l'oxygène ou l'air, ou encore un gaz réducteur tel que l'hydrogène, ou encore un mélange de tels gaz. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description suivante, donnée uniquement à titre d'exemple et faite notamment en référence à la figure 1 annexée qui illustre un exemple d'application de l'invention au cas d'une installation de fabrication de yaourts ou autres produits laitiers fermentes.
On reconnaît sur la figure 1 les éléments et étapes suivantes : - une préparation du lait qui comprend en général les additions de composants tels que matières grasses ou protéines ou encore arômes pour en fixer la composition ;
- une étape de chauffage ;
- une étape de pasteurisation (traitement thermique) ; - une homogénéisation (qui peut avoir lieu avant ou après la pasteurisation) ;
- un refroidissement jusqu'à la température à laquelle aura lieu l'ensemencement;
- l'ensemencement avec les souches souhaitées ; - selon le type de yaourt ou produit laitier fermenté considéré : une fermentation en tank suivie d'un lissage avant une mise en pot (ex : yaourts dits « brassés »), ou bien la répartition préalable du mélange ensemencé en pots où s'effectuera la fermentation (ex : yaourts dits « fermes » ou « étuvés ») ;
- un refroidissement des produits avant leur stockage.
On peut envisager selon d'effectuer une régulation du potentiel redox aux points suivants de la chaîne : i) dans le lait de départ avant standardisation, j) dans le mélange laitier résultant de l'ajout des ingrédients additionnels dans le lait ; k) avant ou après l'étape d'homogénéisation dudit mélange laitier ;
I) avant ou après l'étape de pasteurisation du mélange laitier ;
m) avant ou après l'étape d'ensemencement du mélange laitier avec une ou plusieurs souches de bactéries lactiques ; n) avant le conditionnement du produit en emballage final.
Conformément à l'invention, dans ce cas de la fabrication de yaourts ou produits laitiers fermentes on peut envisager de séquencer les phases d'oxydation et de réduction. En effet, sans être à aucun moment lié par l'explication qui suit, on peut penser que les valeurs réductrices pourront favorablement jouer sur la conformation des protéines, notamment les protéines sériques, riches en molécules soufrées. Le potentiel redox permet de jouer sur l'état de ces molécules qui se trouvent soit sous forme de groupements thiol, soit sous forme de ponts disulfures, et jouent un rôle crucial dans la formation du réseau protéique après dénaturation des protéines lors de l'étape de pasteurisation. L'utilisation de conditions réductrices en amont de la phase de pasteurisation permettra donc de coupler cet effet à l'effet de la chaleur sur les protéines ce qui aura pour conséquence de réaliser des gels protéiques de structure stable qui seront favorables notamment à une limitation des phénomènes de synérèse dans les yaourts. En aval de la pasteurisation, il sera alors avantageux de rétablir des valeurs redox moins réductrices (ou égales aux valeurs habituelles du lait) qui permettront aux bactéries ensemencées de se développer normalement sans influencer leur métabolisme et donc sans conséquence organoleptique.
Il peut également être avantageux d'ajuster une valeur cible du potentiel redox lors de la fermentation pour influencer de manière volontaire le métabolisme des ferments lactiques, et ainsi par exemple orienter la production d'arômes vers les composés souhaités.
En basculant pour finir le potentiel redox du produit fini à une valeur plus réductrice que celle de la fermentation, on pourra stabiliser microbiologiquement le yaourt et ainsi mieux le préserver du développement éventuel de certaines levures ou moisissures.
On a plus particulièrement développé dans ce qui précède les exemples de la fabrication de yaourts mais l'on peut également évoquer le cas
de la fabrication de boissons fermentées telles que la bière ainsi que le cas de productions de produits en fermenteurs. C'est ce qui sera fait ci-dessous.
Evoquons donc à présent le cas de la fabrication de la bière. On va montrer ci-dessous le fait que dans le cas de la fabrication de la bière, il est intéressant de faire en sorte que la régulation du potentiel redox pendant la fermentation ait lieu en deux temps, en deux phases. Dans un premier temps, la fermentation a avantageusement lieu en condition oxydante régulée et en présence d'oxygène, pour favoriser la croissance de la levure et son bon état physiologique. Dans un second temps, le potentiel redox est abaissé à une valeur optimale pour permettre d'améliorer les paramètres de fermentation, ainsi que les critères sensoriels (arômes, tenue de la mousse).
Rappelons que le procédé brassicole comporte typiquement deux étapes de fermentation : - La fermentation principale : après aération du moût, celui-ci est ensemencé avec une levure du genre Saccharomyces, qui va, par fermentation, transformer les sucres fermentescibles en alcool et en gaz carbonique.
- La fermentation secondaire ou « garde » : cette étape se déroule à la suite de la précédente en abaissant la température du milieu à une température proche de 0 0 C pendant une durée qui varie de quelques jours à quelques semaines. La bière jeune va se saturer en dioxyde de carbone, ce qui contribuera très fortement à son caractère moussant. C'est aussi pendant cette phase de maturation que la bière se clarifie et que sa flaveur s'affine. Les exemples qui suivent vont montrer qu'il est avantageux de fermenter le moût par moments choisis en condition oxydante et par moments choisis en condition réductrice.
Exemple 1 : Six tests de fermentation de moût, de type « Kirin », ont été réalisés en utilisant un extrait de malt (ce test est bien connu de l'homme du métier, c'est un test prédictif, autonome, i.e déconnecté du procédé global de fabrication de la bière) : 2 moûts témoins (potentiel redox moyen : 40OmV), 2 moûts dont le potentiel redox a été réduit par un bullage initial à l'azote (potentiel redox moyen : 14OmV), et 2 moûts dont le potentiel redox a été réduit
par un bullage initial avec un mélange azote/hydrogène (96/4) (potentiel redox moyen : -415mV). Les moûts ont été ensemencés par une levure sèche active à 11.10 6 cellules viables par ml_. L'objectif était de déterminer l'influence du potentiel redox sur la performance fermentaire de la levure, pendant 8 jours à 8°C.
Les paramètres suivants ont été suivis :
- la décroissance de l'extrait fermentescible pendant 8 jours,
- l'évolution de la turbidité du moût en fermentation (croissance de la levure) par la mesure de la densité optique du moût à 800nm pendant 8 jours,
- les paramètres de fermentation : extrait apparent (extrait fermentescible plus extrait non fermentescible) du moût en fin de test, atténuation apparente (pourcentage d'extrait fermentescible utilisé par la levure par rapport à l'extrait total du moût), degré d'atténuation (proportion de l'extrait fermentescible utilisé par la levure par rapport à l'extrait fermentescible total).
Les résultats (rapportés au niveau du tableau 1 ) ont montré que la baisse du potentiel redox du moût entraîne une amélioration des paramètres de fermentation: diminution de l'extrait apparent, augmentation du degré d'atténuation et de l'atténuation apparente, et augmentation de la densité optique. Ces résultats traduisent une utilisation plus importante de sucres fermentescibles et une croissance plus importante de la levure en conditions plus réductrices.
Tableau 1 : Valeurs moyennes des résultats des tests de fermentation
Exemple 2 : Six tests de micro-brassage (micro-fabrication de bière) de 30 litres ont été réalisés de la façon suivante : 2 moûts témoins aérés (potentiel redox moyen : 291 mV), 2 moûts dont le potentiel redox a été réduit par un bullage initial à l'azote (potentiel redox moyen : 216mV), et 2 moûts dont le potentiel redox a été réduit par un bullage initial avec un mélange azote/hydrogène (96/4) (potentiel redox moyen : -29OmV). Les bières ainsi obtenues ont été analysées. En résumé, le potentiel redox du moût avant chauffage est contrôlé, le reste de la chaîne de fabrication est traditionnel.
Les résultats présentés dans le tableau 2 montrent que modifier le potentiel redox permet d'améliorer la tenue de la mousse. En effet plus le potentiel redox est faible plus la mousse tient longtemps.
Par ailleurs, l'analyse sensorielle (réalisée sous forme de tests triangulaires) montre des différences significatives (au seuil de 5%) entre la bière témoin et celle obtenue après réduction du potentiel redox par le mélange N 2 /H 2 . Les descripteurs cités (oxydé, forte acidité) sur la bière témoin dénotent un certain état d'oxydation de la bière, plus prononcé que sur la bière obtenue avec le mélange N2/H2. En revanche, on note une légère tendance à l'augmentation de la teneur en SO2 des bières issues des moûts avec réduction du potentiel redox par N2 ou N2/H2. La teneur en SO2 augmente en général en fonction du mauvais état physiologique des levures. L'augmentation observée ici s'explique certainement par le manque d'aération de la levure. Les conditions réductrices ont donc amélioré la qualité sensorielle de la bière, sans toutefois améliorer les paramètres de fermentation de la façon décrite en exemple 1.
Témoin Condition N 2 Condition N 2 /H 2
Tenue de mousse (s)
266 278 293 (méthode NIBEM)
SO 2 (mg/l) < 1 < 1 < 1 3.8 < 1 2.6
Tableau 2 : Résultats d'analyse des bières (valeurs moyennes des 2 répétitions pour la tenue de mousse, et valeurs des 2 répétitions pour la teneur en SO 2 ).
On a donc bien montré par ce qui précède que dans le cas de la fabrication de la bière, il est intéressant de faire en sorte que la régulation du potentiel redox pendant la fermentation ait lieu en deux temps. Dans un premier temps, la fermentation a lieu en condition oxydante régulée et en présence d'oxygène, pour favoriser la croissance de la levure et son bon état physiologique. Dans un second temps, le potentiel redox est abaissé à une valeur optimale pour permettre d'améliorer les paramètres de fermentation, ainsi que les critères sensoriels (arômes, tenue de la mousse).
Evoquons maintenant ci-dessous le cas des productions en fermenteurs.
D'une façon générale, les productions en fermenteurs répondent à deux besoins, de façon distincte ou simultanée : la production de biomasse et/ou la production de molécules d'intérêt. Plusieurs objectifs peuvent être recherchés :
- la production de biomasse,
- la production de biomasse couplée à celle de molécules d'intérêt (métabolites primaires), - la production de molécules d'intérêt autres que celles produites en même temps que la biomasse, c'est-à-dire les métabolites secondaires,
- l'enchaînement de la production de biomasse puis de molécules d'intérêt.
Il existe différents types de culture :
- la culture discontinue ou batch pour laquelle le milieu de culture est apporté en une seule fois au début, sans qu'il y ait apport ou extraction de milieu au cours de la fermentation,
- la culture semi-continue ou « fed-batch », utilisée par exemple pour la production de biomasse sensible à l'inhibition par le substrat, et pour laquelle l'apport continu ou périodique de nutriments est couplé à la croissance, sans qu'aucun prélèvement continu de milieu ne soit réalisé,
- la culture continue, pour laquelle les microorganismes sont maintenus en phase exponentielle de croissance par l'apport continu d'un milieu neuf qui équilibre le prélèvement continu de milieu contenant les cellules en suspension. Ces fermentations, qu'elles soient aérobies ou anaérobies, ont lieu en fermenteur ou bioréacteur, avec ou sans agitation, dans un milieu dont la composition est définie de façon à orienter la fermentation vers la production voulue. De même, les paramètres de fermentation tels que le pH, la température, la pression d'oxygène dissous, la vitesse d'agitation etc .. sont en général régulés à des valeurs optimum pré-déterminées de façon à maximiser la production recherchée.
On sait que le potentiel redox peut-être en perpétuelle évolution au cours d'une fermentation pour une ou plusieurs des raisons suivantes :
- la croissance des microorganismes, - la production de molécules oxydantes ou réductrices par les microorganismes,
- l'apport de milieu de culture neuf dans le cas des cultures semi- continues et continues.
La présente invention propose alors de contrôler en permanence le potentiel redox et de le réguler à sa valeur optimum par l'utilisation d'ajouts contrôlés de gaz. Cette valeur optimum est pré-déterminée expérimentalement
de façon à optimiser la réaction recherchée à un moment donné de la fermentation.
Avantageusement, on pourra associer ou non à cette régulation un ajustement du potentiel redox du milieu de culture neuf apporté dans le cas des cultures semi-continues et continues.
Selon un des aspects de l'invention, on régule le potentiel redox du milieu à différentes valeurs successives en fonction des différentes périodes de la fermentation, de façon à piloter celle-ci pour l'orienter vers telle ou telle réaction souhaitée.
La fermentation peut ainsi être régulée en condition réductrice dans un premier temps puis être régulée en condition plus oxydante dans un second temps et inversement :
- on peut par exemple choisir de favoriser la croissance de la souche microbienne par des conditions oxydantes et après l'obtention d'une teneur maximale en biomasse basculer le fermenteur en conditions plus réductrices afin d'initier ou d'intensifier la production d'un ou plusieurs métabolites recherchés. On sait par exemple que Saccharomyces se développe mieux en conditions oxydantes et produit plus de glycérol en conditions réductrices. De même on sait que des cultures de Corynebacterium glutamicum produisent plus d'acides aminés en conditions réductrices ou que Sporidiobolus produit plus de composés d'arômes en milieu réducteur.
- il est également possible, en régulant le potentiel redox du milieu à une valeur différente en fin de fermentation, d'adapter le métabolisme ou la physiologie des micro-organismes pour les préparer à une étape ultérieure. Il peut ainsi être intéressant par exemple de produire Saccharomyces cerevisiae en présence d'oxygène et de basculer le milieu de production de cette levure à un niveau réducteur optimum afin de l'adapter à son utilisation future, comme par exemple la panification. On peut ainsi piloter la fermentation à 2 ou 3 valeurs de redox successives, voir plus selon les besoins. Ainsi on peut envisager de rechanger le niveau de régulation après la production du métabolite désiré (par exemple la production d'une enzyme pariétale) avant sa récolte ou séparation du milieu de
culture et donc en fin de fermentation, pour favoriser l'excrétion du métabolite considéré dans le milieu de récupération. Ce changement de potentiel redox peut également intervenir après la production d'un précurseur de la molécule d'intérêt qui en condition réductrice subira une réaction chimique permettant l'obtention de la molécule d'intérêt en question.
On sait par ailleurs qu'après la fermentation proprement dite, plusieurs procédés peuvent être appliqués. Des étapes de centrifugation, filtration ou ultrafiltration permettent de récupérer la biomasse produite. Des étapes de purification peuvent être réalisées sur le milieu de fermentation pour séparer et concentrer des métabolites : centrifugation, filtration, chromatographies, précipitation par ajout de sels ou solvant etc ..
L'invention propose alors de réguler le redox pour favoriser la séparation de ces molécules d'intérêt. Par exemple la production et/ou l'excrétion dans le milieu de culture a lieu en condition oxydante (ou réductrice), et on bascule en condition réductrice (respectivement oxydante) pour conduire l'étape de séparation. Ainsi par exemple, une molécule peut être retenue dans une colonne de chromatographie en se fixant à une résine en condition oxydante et être ensuite relarguée dans une solution d'élution réductrice.
Si dans les procédés visés par la présente invention, comprenant une ou plusieurs étapes de fermentation, l'ensemencement du milieu peut être effectué de façon directe, on peut également l'envisager de manière indirecte par le fait que l'on effectue au préalable une ou plusieurs pré-cultures successives afin de constituer l'inoculum qui servira à ensemencer le milieu de fermentation, et on peut alors également envisager selon la présente invention le fait de procéder à un contrôle et une régulation du potentiel redox de la préculture à l'aide d'ajouts contrôlés d'un gaz de traitement dans le milieu de pré-culture considéré.
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