以下、本願発明の一実施形態および実施例� ��、図面を参照して説明する。 
 まず、本願発明は、概説すると、図1に示す ように、
 (1)ガラス容器5(液体保持ユニット)に収容さ� ��た溶液1中に、操作したい目的粒子2とこの� �的粒子2よりも体積の小さい他の粒子3とを存 在させると共に、前記溶液1中における前記� �の粒子3の濃度が前記目的粒子2の濃度よりも 大きくなるように調整する工程と、
 (2)前記調整した溶液1の所望の箇所に、例え ば、レーザー光源4(温度勾配生成ユニット)か らレーザー光Lを照射して局所的な温度勾配� �生じさせることで、当該温度勾配の高温側� �前記目的粒子2を移動(凝集、回転、等)させ� �工程と、
 を有することを特徴とする目的粒子2を操作 する方法、およびその方法を実施するための 装置である。

 図1に示す例では、前記液体保持ユニット としてのガラス容器5は、その内面に、金属� �コーティング6が被着されており、レーザー� ��Lをこの金属膜コーティング6の近傍に集光� �せることにより、この金属膜コーティング6� ��介して、溶液1中に温度勾配を生じさせるよ うに構成されている。また、前記レーザー光 源4には移動操作ユニット8が設けられており� ��レーザー光Lの焦点の位置を溶液1またはガ� �ス容器5の方向へ、若しくはこれと直行する� ��向へ移動させることによって、生じた温度� ��配に係る温度分布を変化させ、また、その� ��うな温度勾配を生じさせる個所を移動させ� ��ことが可能なように構成されている。

 このような構成によれば、物質の性質に� ��きく依存する熱泳動現象ではなく、枯渇力/ エントロピー力を用いるマイクロマニピュレ ーションにより、目的粒子を操作することが 可能になる。

 以下、まず、この発明の原理を詳しく説� ��する。

 (粒子補足力のPEG濃度依存性) 
 図2(a)~(e)は、溶液中に混入する他の粒子(PEG( ポリエチレングリコール))の濃度を0%,1%,2%,3.5% ,5%と段階的に変化させ、中心部分にレーザー 光を照射し温度勾配を形成したときに生じる 目的粒子(直径100nmの蛍光粒子)の蛍光強度分� �を示した写真であり、図3及び図4は、それに 対応するグラフである。

 まず、PEG濃度0%では、図2(a)に示すように� ��蛍光粒子の密度は熱勾配の外側(低温側)か� �中心(高温側)に向かって減少している。PEG濃 度を1%にすると、図2(b)に示すように、まだ蛍 光粒子の捕捉は起こらないが、0%の場合と比� ��て中心付近での枯渇の程度が少なくなって� ��る。PEG濃度2%の溶液では、図2(c)に示すよう� ��、蛍光粒子の捕捉が開始され、中心付近で� ��蛍光強度は周囲に比べて約2倍程高くなって いる。そして、PEG濃度3.5%溶液及び5%溶液では 、図2(d)および(e)に示すように、中心での密� �が周辺に比べてそれぞれ10倍と100倍に増加し ている。図3のグラフは、上記図2(a)~(e)の各状 態を、蛍光粒子の位置とその位置での濃度と の関係で示したものである。

 一方、粒子密度を各点における温度上昇� ��関数で図4に示すようにプロットすると、0%� ��液の場合の結果は、熱泳動による定常状態� ��布で説明できる。一般的に、定常状態では� ��粒子密度c(x)は指数関数に従う(Duhr S,Braun D( 2006)Thermophoretic depletion follows Boltzmann distribu tion.Phys.Rev.Lett.96:168301.を参照)。

 ここで粒子のソーレ係数の温度依存性は� ��さいと仮定すると、図4のデータの直線の傾 きが、粒子のソーレ係数を与える。

 PEG濃度0%のデータから、この実施形態で� �、粒子のソーレ係数として以下の式を得た� �

 図4で重要なことは、溶液に高分子(PEG)が� ��在する場合でも粒子の密度分布が温度に対� ��て指数分布関数に従っており、その意味で� ��線の傾きが高分子存在下での実効的な以下� ��ソーレ係数を与えるということである。

 第一近似として、その傾きは高分子濃度� ��比例して増加している。したがって、上記� ��ーレ係数は、図4の挿入図のように正から負 の値へと次の式のように変化している。

 ここで最小2乗より以下の式が得られた。

 上記(2)の式中のρ _w はPEGの重量比を表す。図4の挿入図をさらに� �く見ると上記ソーレ係数の濃度依存性に非� �形性が存在する可能性も示唆されるが、そ� �に関しては後で述べることとする。

 以上により、熱泳動係数(またはソーレ係 数)の符号と大きさが高分子の濃度によって� �御できるということが実証された。

 (PEG濃度分布)
 一方、新しいマニピュレーション法のメカ� ��ズムを明らかにするため、蛍光基でラベル� ��れたPEG分子を用いて加熱点近傍におけるPEG� ��濃度分布の測定を行った。加熱中心で約3℃ 温度を上昇させた場合、PEGの濃度が中心付近 で約15%減少することを確認した(図5及び図6)� �このPEGの枯渇は、熱泳動と拡散が釣合った� �常状態の分布として次のように理解できる� �すなわち、PEG分子の流れは次の式で表され� �。

 定常状態(j _p =0)においては、密度は以下の関係を満たす。

 したがって、次の式
で定義されるソーレ係数は、以下の関係を用 いて測定することができる。

 図6の直線の傾きから本発明者らは、PEG500 0に関して以下の値を得た(実施例の欄を参照) 。

 高分子の密度は、中心で枯渇している。� ��述したように、この高分子密度が中心で枯� ��する分布が、ポテンシャル関数のように振� ��い、目的粒子のトラップを可能しているの� ��ある。

 (理論的アプローチ) 
 新しいマニピュレーションのメカニズムを� ��7(a)(b)に図示する。高分子が粒子に吸着しな いとするとその重心は粒子の表面を通過でき ないため、粒子の表面には枯渇層と呼ばれる 層が必ず存在する。枯渇力は、二つの枯渇層 が重なり合う時、すなわち2つの粒子が近接� �る場合や粒子と壁が近接する場合に生じる(� ��7(b))。しかし、もし高分子の空間分布の対� �性が破れると、孤立した粒子1個でも枯渇力� ��生じることが予想される(図7(b))。もっとも� ��このような場合に枯渇力が現れることはこ� ��まで知られていなかった。この場合に生じ� ��力を計算するため、我々は局所平衡の仮定� ��用いる。そのため、枯渇層の排除体積効果� ��よる自由エネルギーの差を求める。枯渇層� ��あることによる自由エネルギーの差は、枯� ��層の体積V _dep から排除された分子数δnを用いて以下のよう に見積もることができる。

 ここでρは高分子の濃度である(今の状況で� ��、k _B nδTの項はk _B Tδnの項に比べて十分小さいので無視できる)� ��また、高分子間の相互作用は、濃度が高分� ��の絡まりが生じる臨界濃度(今の場合、以下 の式)に比べて小さいので無視できる。

 したがって、高分子密度の非一様性によ� ��て生じる枯渇力の大きさは、次のように見� ��もられる。

 一方、粒子の熱泳動も考慮すると、粒子密� ��c(x)の流束jは、以下の拡散流
と、以下の熱泳動流
との和として以下のように書くことができる 。

 さらに、熱泳動を生じさせる力f _T を定義するとj _T は、次のように書くことができる。

 ただし、ここでμ=1/γは粒子の易動度であり 、γはストークスの摩擦係数を表す。したが� ��て、熱泳動を生じさせる力は、次のように� ��すことができ、

 これは温度勾配によって引き起こされたも� ��である(多くの場合、その原因は粒子の界面 張力や界面エネルギーの温度依存性に起因す ると考えられる)(Wurger A(2007)Thermophoresis in co mplex fluids driven by Marangoni forces.Phys.Rev.Lett.9 8:138301.及びBraibanti M,Vigolo D,Piazza R(2008) Does� �thermophoretic mobility depend on particle size? Phys .Rev.Lett.100:108303.を参照)。力は加法的なので� �粒子の正味の流束は、以下のように表せ、

 その結果次のようになる。

 ここでアインシュタイン関係式D ^b (x)=μ(x)k _B T(x)が局所的に成り立っていると仮定した。� �常状態(j=0)では、次の式が成立する。

 ただし、ここで以下の条件が付く。

 また、式(5)を直接積分すると次の式を得� ��。

 ここでc ₀ は規格化定数であり、δT(x)=T(x)-T ₀ は温度の増分、δρ(x)=ρ(x)-ρ ₀ は濃度の増分をそれぞれ表す。また、T ₀ とρ ₀ はそれぞれ基準点x ₀ における温度と密度である(実施例の欄を参� �)。

 本発明者らは高分子濃度ρ(x)をすでに測定� �ているので、理論的予測である(6)式と実験� �得られた粒子の密度分布を比較することが� �きる。V _dep を唯一のフィッティングパラメータとして図 3の密度分布を(6)式でフィットすることがで� �る。図3で理論式(6)(実線)と実験値(記号)は良 く一致している。ここで、ρ(x)を重量比で定� ��した場合、V _dep =670であり、ρ(x)を単位体積当たりの粒子数で 定義した場合は、8325nm ³ である。V _dep の最も簡単な見積もりは、粒子の表面積と枯 渇層の厚さの積であるので、V _dep =4πR ² (R _g /2)で与えられる。(ただし、R _g は高分子の慣性半径であり、Rは粒子の半径� �ある。)これより、R _g =0.6±0.1[nm]という値を得ることができる。

 より好ましくは、粒子が受ける流体力学的� ��抵抗を考慮すると、V _dep =2πRλ ² という関係式が得られる。ここでλは、高分� ��と粒子の相互作用距離であり、高分子と粒� ��の相互作用が物理的に排他的であればλは� �高分子の慣性半径R _g と考えてよい。実験結果から、λ=5.8nmとなり� ��PEG6000のR _g の値に近づく。また、粒子をトラップする力 は粒子の直径に比例する。また、さらに好ま しくは、粒子の界面での撥水性が大きい場合 には、流体的境界条件が滑りなしから滑りあ りへと変化する場合を考慮する必要がある。 その場合は、以下の関係式が得られる。

ただし、lは滑り距離と呼ばれる量で粒子表� �での流体の滑りやすさを表す。この表式を� �いるとλ=2.3nmという値が得られ、さらにPEG600 0のR _g の値に近づくだけでなく、トラップ力の粒子 の直径に対する依存性をよく表しており、粒 径が小さい場合にはほぼ直径の2乗に比例し� �粒径が大きい場合にはほぼ直径に比例して� �大するため、最初に述べた流体摩擦を無視� �た理論と流体摩擦を考慮した理論とが連続� �に繋がり、実験結果をよく説明している。

 (2)式の実効的ソーレ係数の高分子濃度依存� ��もまた説明可能である。PEGの濃度分布は、� ��下の指数分布で良く近似できたので(図5お� �び実施例の欄を参照)、

 それをさらに線形近似すると次の式が得� ��れる。

 この結果を(6)式に代入すると(2)式が得ら� ��、理論的予測として次式が得られる。

 この結果は、図4の挿入図の傾きと一致す る。

(まとめ)
 上述の結果で、高分子の慣性半径はR _g =0.6±0.1[nm]と見積もられたが、この値はPEG6000� ��子の知られている値3nmに比べ小さい。この� ��は、おそらくポリスチレン粒子表面におけ� ��PEG分子の分散的引力による部分的吸着が原� ��であると考えられる(Bechinger C,Rudhardt D,Leide rer P(1999)Understanding depletion forces beyond entrop y.Phys.Rev.Lett.83:3960.を参照)。

 好ましくは、流体の粘性散逸を考慮した滑� ��なしの境界条件を使った理論では高分子の� ��性半径R _g =5.8nmと、より実際に近い値が得られ、補足能 力の粒子直径依存性の結果をよく表している 。

 さらに好ましくは、粒子の境界条件が部分� ��な滑りを許す場合には、R _g =2.3nmとなるだけでなく、粒子系が小さい場合 と大きい場合を含めて直径依存性をさらによ く表しているため、本件の原理の本質的な部 分はこの理論で説明可能である。

 ここまでの結果をまとめると、上記した� ��論は、後で説明する実施例と良く一致して� ��る。

 したがって、この上述した結果は、熱泳� ��に駆動されたエントロピー力として全て整� ��的に説明できることになる。このモデルを� ��らに改良するには、枯渇層近傍における高� ��子の詳細な分布の情報や上の取扱いでは無� ��した分子間の相互作用などを取り入れる必� ��がある。

 ここで、図4の挿入図の
のデータを高分子濃度に関して線形で近似し たが、実際には
には濃度に対する非線形関係が示唆される。 実際、この傾向は高分子の絡み合いによる2� �式かそれ以上の高次の依存性として解釈す� �のが自然である。

 また、本願発明者らはここで述べた新し� ��マニピュレーション法がPEG以外の高分子を� ��いても実現できることを見出した。例えば� ��ポリビニルピロリジン(PVP)や塩化ポリスチ� �ンスルホン酸(NaPSS)などの水溶性高分子でも� ��現できることを確認している。ただし、こ� ��までのところPEGの場合に最も大きな効果が� ��られている。

 この発明の実施形態における有力な用途� ��、DNA分子の捕捉である。DNA分子のレーザー� ��ンセットによる捕捉は、DNAをビーズなどに� ��着させないと困難であることが知られてい� ��が、いくつかのグループがDNAをマニピュレ� ��トする新しい方法を提案している。例えば� ��対流と熱泳動を組み合わせた方法(Braun D,Lib chaber A(2002)Trapping of DNA by thermophoretic deplet ion and convection.Phys.Rev.Lett.89:88103.を参照)や高 出力のレーザー(100mW)と対流とを使用する方� �(Ichikawa M,Ichikawa H,Yoshikawa K,Kimura Y(2007)Extens ion of a DNA molecule by local heating with a lase r.Phys.Rev.Lett.99:148104.及びIchikawa M,Matsuzawa Y,Yos hikawa K(2005)Entrapping polymer chain in light well  under good solvent condition.J.Phys.Soc.Jpn.74:1958-1961� ��参照)などがある。

 しかし、本発明によれば、溶液流体の流� ��を誘発することなくDNA等の粒子を捕捉する� ��とができる。このことから、ここで述べた� ��法は、対流効果とは全く異なるメカニズム� ��よるものであることは明確である。

 繰り返しになるが、これまで熱泳動を用� ��たマニピュレーションは用途が限定されて� ��た。なぜなら熱的な力は一般に小さいから� ��ある。本願発明において本発明者らは、熱� ��動の方向と大きさを簡単で明確な手法によ� ��制御する方法を提案した。それは、枯渇層� ��加わる浸透圧に基礎を置くものであり、捕� ��しようとする粒子の数に比べ高分子の数が� ��いために力が増幅されることに起因してい� ��。

 以上、本発明のメカニズムを明らかにす� ��ため希薄溶液に関してだけ述べてきたが、P EGの濃度を上げて生物試料にとって耐えられ� ��温度範囲で温度を上げることにより、レー� ��ー照射によりPEGの局所濃度が変化し、PEGに� ��る浸透圧を数気圧変化させることが可能で� ��る。また、捕捉力の粒子サイズ依存性を利� ��するとコロイドのサイズによる分離などに� ��応用することが可能である。

 結論として、新しい光マニピュレーショ� ��の方法とそのメカニズムがこの発明によっ� ��明らかとなった。加熱された点では高分子� ��濃度が周囲より減少するため、コロイド粒� ��は中心に移動した方が枯渇層によって排除� ��れる高分子の数が少なく、結果として高分� ��の運動できる空間自由度が増加する。この� ��とにより粒子に働く力は中心に向かい、全� ��のエントロピーは増加する。また、高分子� ��度が高くなると結果として粒子のソーレ係� ��は負となる。この方法は、エントロピーに� ��礎を置いているため、従来の方法では捕捉� ��難しかった物体も含めて様々の種類のコロ� ��ド物質を捕捉することが可能である。レー� ��ーによって誘起されるエントロピー力は、� ��ロイドの操作やナノスケールの移動物体を� ��成したり、細胞や人工脂膜系における局所� ��浸透圧の制御など広い応用の可能性がある� ��

 また、本発明によれば、細胞やその他の� ��子の観察において、溶液中を浮遊する細胞� ��粒子を観察視野に捕捉または集積し、観察� ��容易にすることができる装置および方法が� ��供できる。また、この仕組みを利用して、� ��養中の浮遊細胞を経時的に自動観察する装� ��を構成することも可能である。

 さらに、本発明によれば、捕捉、移動、� ��積、濃縮、または回転した目的粒子を、隔� ��、吸引、または固定することにより、目的� ��子を分離、検出、測定、または除去するこ� ��ができる装置および方法を提供できる。そ� ��ような装置としては、たとえば、DNAチップ� ��プローブ近傍(ウェル等)に、目的粒子であ� �DNA検体を集積させ、プローブとの接触確率� �高めることにより、より効率的に検体とプ� �ーブをハイブリダイズ(つまり固定)させ、検 出または測定感度を高めることができる装置 が考えられる。さらに、プロテインチップに おいて、タンパク質を移動、集積させ、検体 とプローブ(抗体など)の反応効率を上昇させ� ��検出感度を高める装置も同様に考えられる� ��また、一般的なタンパク質等のゲル電気泳� ��を利用した分離方法において、電気泳動後� ��目的粒子(タンパク質等)のバンドを、この� �明の方法で、ゲル中において更に濃縮した� �で、ゲルを切り取り分離することで、より� �率的に目的粒子を取得することができる装� �を構成できる。

 さらに、本発明により、集積した目的粒� ��は、温度勾配に沿って大きさの順に(大から 小、または小から大)または配向して並ぶ傾� �があるため、これを利用して目的粒子の結� �化、目的粒子の大きさ(粒、体積、または慣� ��半径)の測定、目的粒子の大きさによる選別 または分離、溶液中における目的粒子の大き さの分布測定をする装置を提供することがで きる。このように、結晶化、選別、分離は、 この発明の技術分野でよく知られている様々 な方法を採用することができ、具体的には、 上記溶液保持ユニット(上記の例ではガラス� �器5)をそれらの目的に適した形状に形成し、 上記移動操作ユニット8を駆動することで目� �粒子を誘導することで行うことが可能であ� �。また、操作の目的に応じて温度勾配生成� �ニットを複数設けることで温度勾配を複数� �個所で生じさせそのことで上記目的粒子を� �らに効率よく誘導するようにしてもよい。