DOMAINE DE L’INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine des analyses biologiques, notamment des analyses biochimiques.

Plus précisément, l’invention se rapporte à un procédé de fabrication de puces filtrantes, pouvant éventuellement être fonctionnalisées pour réaliser des analyses biologiques.

ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Dans le domaine des analyses biologiques, il est connu d’utiliser des puces à protéines (« protein microarrays ») pour étudier l’activité biochimique des protéines. Dans de telles puces, une bibliothèque d’anticorps ou de fragments protéiques (« sondes ») - voire de protéines entières - est disposée sur une matrice telle qu’une lame en verre. Dans ce cas, un seul et même échantillon est testé sur l’ensemble des sondes déposées sur la matrice.

Des dispositifs d’analyses biologiques permettant l’analyse en parallèle de plusieurs échantillons ont aussi été développés.

Le document WO2014/053237 est un exemple dans lequel un dispositif miniaturisé permet une analyse de plusieurs échantillons biologiques simultanément (analyse « en multiplex »). Chaque échantillon peut de plus être exposé à plusieurs sondes différentes successivement. Autrement dit, le dispositif permet une analyse de type « analyse 3D ».

Le dispositif décrit par ce document comprend une pluralité de canaux, dans chacun desquels peut être injecté un échantillon en phase liquide indépendamment des autres canaux.

Chaque canal peut être formé de plusieurs portions tubulaires. Entre deux portions successives est insérée une zone d’analyse approximativement cylindrique formée dans une matrice appropriée.

Les zones d’analyse peuvent notamment être formées dans une matrice plane en nitrocellulose dont toute la surface sauf les zones d’analyse est rendue hydrophobe par une imprégnation de cire.

Les zones d’analyse peuvent être simplement constituées de nitrocellulose non traitée, de sorte qu’elles constituent des zones de filtration, ou bien de nitrocellulose fonctionnalisée par exemple au moyen d’une molécule sonde.

L’opération d’imprégnation avec de la cire permet de délimiter les zones d’analyse, mais aussi de limiter la diffusion latérale à l’intérieur de la matrice (c’est-à-dire hors d’une zone d’analyse donnée vers les autres zones d’analyse voisines) des molécules d’intérêt (molécules sondes ou molécules d’un échantillon).

Pour cette opération d’imprégnation, un procédé d’impression à encre solide est mis en œuvre, de façon à déposer sur la matrice une couche de cire dans les zones qui doivent être rendues hydrophobes. A l’issue de l’impression, la matrice est chauffée à une température supérieure à la température de fusion de la cire utilisée, puis refroidie, de façon à ce que la cire diffuse latéralement et en profondeur, dans l’épaisseur de la matrice, de manière à limiter sa diffusion ultérieure indésirable vers les zones d’analyse.

Cependant, un tel procédé ne permet pas de contrôler finement le volume d’une zone d’analyse donnée ni la forme de la surface qui délimite ce volume, comme le montrent les figures présentées dans ce document. En particulier, la circonférence de la surface supérieure d’un site de test varie d’un site à l’autre et n’est en général pas circulaire, de sorte que, dans la direction de l’écoulement, la section de la zone d’analyse n’est pas précisément identique à la section intérieure du canal dans laquelle la zone d’analyse doit être insérée.

En conséquence, la précision d’un tel dispositif est limitée du fait du procédé de fabrication utilisé pour former les zones d’analyse, et de manière concomitante, la limite de quantification reste trop élevée pour certaines analyses biologiques dans lesquelles les concentrations mises en jeu (ou leurs variations) sont particulièrement faibles.

Le document US2004/0115707 divulgue quant à lui une unité d’analyse biochimique comprenant une plaque de base présentant une pluralité de trous remplis d’un matériau poreux et adsorbant de manière à former une pluralité de zones d’analyse.

Le remplissage des trous peut être obtenu par laminage d’une feuille de matériau adsorbant sur la plaque de base préalablement percée.

Lors du laminage, la feuille de matériau d’analyse est sollicitée de manière anisotrope du fait de l’effort de traction exercé dans la direction du laminage. Les propriétés du matériau adsorbant après insertion dans les trous sont donc anisotropes. Il est même possible que l’épaisseur du matériau adsorbant varie au sein d’un même trou.

Par ailleurs, le laminage ne rompt pas la continuité de la feuille de matériau adsorbant. Le matériau adsorbant forme donc une surface continue entre deux canaux sous ou sur la plaque, comme cela peut être observé sur la figure 2b du document US2004/0115707. Les molécules d’intérêt (de l’échantillon ou sondes) risquent donc de diffuser d’un canal 3 à l’autre du fait de cette continuité.

La précision et la sensibilité d’une analyse quantitative effectuée avec une telle plaque sont donc limitées.

Dans un autre mode de réalisation décrit par US2004/0115707, le matériau adsorbant peut être dissous dans un solvant. La solution obtenue est ensuite injectée dans les trous et le solvant évaporé. Cette technique d’injection en phase liquide ne permet pas non plus un contrôle précis de l’isotropie des propriétés de la zone de test, notamment parce que le flux d’air permettant l’évaporation du solvant est nécessairement directionnel.

Par ailleurs, il peut rester des traces de solvant dans le matériau adsorbant, qui risquent d’interagir avec les molécules sondes ou à analyser. En outre, l’utilisation de solvants, notamment des solvants organiques dans le cas de la nitrocellulose, rend le procédé polluant.

Enfin, la liaison entre le matériau adsorbant, une fois solidifié, et la plaque de base n’est pas assurée de manière certaine. La qualité de cette liaison dépend notamment des compositions chimiques du matériau adsorbant et de la plaque de base. La liaison entre une zone d’analyse donnée et la plaque peut donc s’avérer fragile. En cas de circulation forcée de liquide, au moyen d’un vide relatif, ces zones d’analyse risqueraient de se détacher et d’être entraînées par le liquide circulant. Il n’est donc pas possible de pratiquer une analyse avec circulation forcée de liquide à travers les zones d’analyse obtenues par ce mode de réalisation.

D’autres procédés, mettant en œuvre différents produits chimiques ou une étape de chauffage ou une étape d’irradiation par exemple sont aussi décrits dans le document W001/19502A2, après une première étape de laminage.

Outre les inconvénients du laminage précédemment exposés, tous ces modes de réalisation présentent l’inconvénient d’entraîner des modifications physico-chimiques de la membrane filtrante qui altèrent ses propriétés essentielles pour l’analyse et donc la sensibilité et la précision de l’analyse.

Dans la mesure où la composition chimique et la structure physique de la membrane sur laquelle est mise en œuvre l’analyse influent sur les performances de la méthode d’analyse, et notamment sur la limite de quantification de cette méthode, l’invention vise donc à proposer un procédé de fabrication d’une puce d’analyse biologique permettant de contrôler finement cette composition chimique et cette structure physique.

En particulier, l’invention vise à proposer un procédé de fabrication d’une puce d’analyses à faible coût, ne nécessitant pas d’étape de traitement thermique, chimique ou d’irradiation pour la formation des sites de test dans la matrice (mis-à-part lors d’une éventuelle fonctionnalisation biochimique de ces sites postérieure ou antérieure à la formation des sites) et permettant de réaliser une analyse quantitative de précision et de sensibilité élevées et/ou une analyse biologique ou une simple filtration d’un échantillon liquide.

RÉSUMÉ DE L’INVENTION

L’invention concerne un procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique comprenant : a- on fournit deux matrices support, chacune formée dans un matériau support solide, chacune présentant une surface inférieure et une surface supérieure et dans chacune desquelles a été formé au moins un trou la traversant entre lesdites surfaces inférieure et supérieure, parmi lesquelles on définit une matrice support inférieure et une matrice support supérieure; b- on fournit au moins une feuille de matériau d’analyse solide et poreux, ladite feuille présentant une surface inférieure et une surface supérieure, c- on superpose dans cet ordre la matrice support inférieure, la feuille de matériau d’analyse et la matrice support supérieure de sorte :

- que la surface supérieure de la matrice support inférieure soit face à la surface inférieure de la matrice support supérieure,

- que l’au moins un trou traversant de la matrice support inférieure soit en regard de l’au moins un trou traversant de la matrice support supérieure,

- et que la feuille de matériau d’analyse soit intercalée entre les matrices support inférieure et supérieure ; d- on réalise un assemblage mécanique des deux matrices support et de la feuille de matériau d’analyse au cours de laquelle une force pressante de direction normale aux surfaces inférieure et supérieure des matrices support est exercée de manière à rapprocher les matrices support l’une de l’autre.

Grâce à cette disposition, au moins une portion de matériau d’analyse obture au moins un canal formé par un trou traversant de la matrice support supérieure et un trou traversant de la matrice support inférieure superposés. Une telle portion est appelée dans la suite « pastille » d’analyse. Il est possible de réaliser une fdtration ou une analyse d’un échantillon biologique sur une pastille d’analyse.

L’assemblage entre la feuille de matériau d’analyse et les matrice support n’est pas obtenu par un procédé chimique, ni par fusion d’un des matériaux de sorte que les propriétés physiques et chimiques des matériaux support et d’analyse avant l’assemblage ne sont pas ou tout au moins sont très peu altérées après l’assemblage, y compris à proximité de l’interface entre ces deux matériaux. L’assemblage est obtenu uniquement mécaniquement et par l’exercice d’une force pressante normale aux surfaces supérieure et inférieure de la matrice, de sorte que la déformation des matériaux est uniforme dans un plan normal à la direction de la force pressante. Le procédé permet donc, à la différence des procédés mettant en œuvre une étape de laminage, de ne pas introduire d’ anisotropic dans le matériau support et ou le matériau d’analyse dans une direction normale à la direction de la force pressante, ou tout au moins de minimiser les anisotropies induites. Une telle anisotropic conduirait par exemple dans le cas de tests immunologiques mettant en œuvre des réactifs fluorescent à une fluorescence inhomogène à la surface d’une pastille d’analyse, ce qui rendrait l’analyse quantitative du signal de fluorescence imprécise.

Grâce à l’ensemble de ces dispositions, la sensibilité et la reproductibilité d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique obtenue par le procédé suivant l’invention sont donc améliorées par rapport à des puces obtenues suivant les procédés de l’art antérieur. Le fait que la feuille de matériau d’analyse soit intercalée entre deux matrices support permet aussi d’obtenir une puce d’analyse d’un échantillon biologique robuste, résistant à un écoulement de liquide dont la circulation est éventuellement forcée.

Par ailleurs, les moyens nécessaires pour mettre en œuvre sont uniquement mécaniques, donc peu polluants en ce qu’ils ne comprennent pas de solvant et ils sont simples à mettre en œuvre. Selon différents aspects, il est possible de prévoir l’une et/ou l’autre des caractéristiques ci- dessous prises seules ou en combinaison.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, on fournit à l’étape b au moins deux feuilles de matériau d’analyse différentes et à l’issue de l’étape c, les au moins deux feuilles de matériau d’analyse sont juxtaposées ou superposées.

Grâce à cette disposition, il est possible de former au moins deux pastilles d’analyse dont les propriétés sont différentes de manière à réaliser deux analyses différentes sur un échantillon donné (dans le cas où les deux feuilles de matériau d’analyse sont superposées) ou deux analyses différentes sur deux échantillons différents (dans le cas où les deux feuilles de matériau d’analyse sont juxtaposées)

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, la force pressante est exercée au moyen d’un étau. Grâce à cette disposition, la force pressante exercée pour l’assemblage peut être répartie de manière homogène sur les surfaces sur laquelle elle s’exerce. Ce mode de réalisation permet de réduire au maximum l’apparition d’une anisotropic non native dans les matériaux qui constituent la puce d’analyse d’un échantillon biologique.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, le matériau support est hydrophobe et le matériau d’analyse est hydrophile ou inversement. De cette manière, il est par exemple possible de déposer sur la pastille un échantillon à tester en phase aqueuse sans qu’il ne diffùse vers le matériau support si celui-ci est hydrophobe. Inversement si le matériau support est hydrophile, le matériau d’analyse est hydrophobe et il est alors possible de déposer sur la pastille un échantillon à tester en phase organique sans qu’il ne diffùse vers le matériau support.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, on procède à la fonctionnalisation d’au moins une partie de la feuille de matériau d’analyse à l’issue de l’assemblage mécanique des deux matrices support et de la feuille de matériau d’analyse. On peut par exemple envisager une fonctionnalisation biochimique, au moyen d’un anticorps ou d’un antigène qui s’adsorbe sur la pastille. De cette manière, la puce d’analyse obtenue par le procédé permet de mettre en œuvre un test d’analyse mettant en œuvre le réactif utilisé pour la fonctionnalisation, par exemple un test immunologique sur une pastille contenue dans la partie de la feuille de matériau d’analyse qui a été fonctionnalisée. Les puces d’analyses peuvent donc être produites en série avant l’étape de fonctionnalisation et fonctionnalisées chacune à volonté au moment de l’analyse.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, on procède à la fonctionnalisation d’au moins une partie de la feuille d’analyse avant son intercalation entre les matrices support inférieure et supérieure. Grâce à cette disposition, la fonctionnalisation peut se faire sur l’ensemble d’une feuille de matériau d’analyse avant le découpage de la pastille. Cela permet un gain de temps lorsque les puces d’analyse sont préparées en série. Le contrôle de la fonctionnalisation, et notamment d’une quantité de réactif d’analyse déposé sur chaque pastille, est aussi meilleur, ce qui permet au final une meilleure précision et une meilleure reproductibilité des tests effectués avec une série donnée de puces d’analyse.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, la surface supérieure de la matrice support inférieure et la surface inférieure de la matrice support supérieure reçoivent un traitement hydrophobe avant l’intercalation de la feuille de matériau d’analyse entre les matrices support inférieure et supérieure . De cette manière, il est possible de former des pastilles d’analyse hydrophiles insérés dans des canaux bordés par deux matrices support dont l’hydrophobicité est homogène et dont le traitement hydrophobe ne peut pas diffuser de manière anisotrope vers le matériau d’analyse.

Selon un mode de réalisation du procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique, l’assemblage mécanique des deux matrices support et de la feuille de matériau d’analyse résulte en un sertissage d’au moins une portion de la feuille de matériau d’analyse par les matrices support inférieure et supérieure.

Grâce à cette disposition, la pastille sertit au moins partiellement la matrice de sorte que l’assemblage de la pastille à la matrice présentera une résistance mécanique particulièrement élevée et il ne sera pas affecté par l’écoulement d’un échantillon liquide à analyser dans la direction normale aux surfaces supérieure et inférieure de la matrice, voire par un vide relatif appliqué du côté de l’une de ces surfaces dans le but d’accélérer l’écoulement de l’échantillon liquide.

L’invention porte aussi sur une puce d’analyse d’un échantillon biologique comprenant :

- une matrice support inférieure formée dans un matériau support solide, présentant une surface inférieure et une surface supérieure et dans laquelle a été formé au moins un trou la traversant entre lesdites surfaces inférieure et supérieure;

- une feuille de matériau d’analyse solide et poreux, la feuille présentant une surface inférieure et une surface supérieure, la puce d’analyse d’un échantillon biologique comprenant en outre une matrice support supérieure formée dans un matériau support solide, présentant une surface inférieure et une surface supérieure et dans laquelle a été formé au moins un trou la traversant entre lesdites surfaces inférieure et supérieure, la feuille de matériau d’analyse étant assemblée avec et intercalée entre les matrices support inférieure et supérieure et l’au moins un trou traversant (11) de la matrice support supérieur (10a) étant en regard de l’au moins un trou traversant (11) de la matrice support inférieure

Une telle puce d’analyse d’un échantillon biologique présente l’avantage de ne pas contenir de résidu de solvant ou de zone de fusion ou de brasure qui pourraient altérer la précision d’un test réalisé avec cette puce. L’assemblage de la feuille de matériau d’analyse prise en sandwich entre les deux matrices support permet à la fois de conserver les propriétés physico-chimiques natives du matériau support et du matériau d’analyse au niveau d’une pastille d’analyse. Il permet aussi de réaliser un test avec écoulement d’un échantillon suivant l’axe du trou traversant d’un côté à l’autre de la pastille, puisque l’assemblage entre la pastille et la matrice présente une bonne résistance mécanique.

Selon un mode de réalisation de la puce d’analyse d’un échantillon biologique, le matériau support dans lequel est formé la matrice support inférieure et/ou la matrice support supérieure comprend au moins un composant choisi parmi un métal, un matériau plastique et la cellulose et en ce que le matériau d’analyse dont est formé la feuille de matériau d’analyse comprend au moins un composant choisi parmi la nitrocellulose, la cellulose et un polymère organique.

De tels matériaux sont peu coûteux et présentent les qualités nécessaires d’inertie biochimique et d’adsorption pour mettre en œuvre des analyses telles que des tests biochimiques.

Selon un mode de réalisation de la puce d’analyse d’un échantillon biologique, l’assemblage de la feuille d’analyse et des matrices support résiste au moins à un vide relatif égal à 0,100 bar. Grâce à cette disposition, il est possible de mettre en œuvre une analyse sur un échantillon s’écoulant de manière forcée à travers une pastille d’analyse sans que la pastille ne se sépare de la matrice du fait des surpressions qui s’exercent localement.

Selon un mode de réalisation de la puce d’analyse d’un échantillon biologique, au moins une partie de la feuille de matériau d’analyse est fonctionnalisée.

L’invention porte encore sur un dispositif d’analyse d’un échantillon biologique comprenant au moins une puce d’analyse d’un échantillon biologique dont au moins une partie de la feuille de matériau d’analyse est fonctionnalisée et au moins une puce d’analyse d’un échantillon biologique dont la feuille de matériau d’analyse est configurée pour assurer une filtration.

Il est ainsi possible d’analyser un prélèvement sanguin sans centrifugation préalable, les globules rouges étant retenus par la puce d’analyse filtrante tandis que le sérum ou le plasma traverse cette puce pour être ensuite analysée par la puce d’analyse fonctionnalisée.

L’invention porte encore sur un kit de diagnostic comprenant au moins une puce d’analyse d’un échantillon biologique selon l’un des modes de réalisation précédents et au moins un réactif d’analyse. Un ou plusieurs réactifs d’analyse, notamment un tampon, un solvant, un antigène, un anticorps, peuvent ainsi être fournis afin de réaliser un test, tel qu’un test immunologique, standardisé. L’invention concerne aussi l’utilisation d’une puce d’analyse suivant l’un des modes de réalisation précédents à des fins de diagnostic ou pour un test immunologique.

L’invention porte enfin sur un dispositif de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique selon l’un des modes de réalisation précédents, ledispositif de fabrication comprenant : un système d’assemblage mécanique des deux matrices support inférieure et supérieure et de la feuille de matériau d’analyse intercalée entre les deux matrices support inférieure et supérieure au moyen duquel une force pressante de direction normale aux surfaces inférieure et supérieure des matrices support inférieure et supérieure est exercée de manière à rapprocher les matrices support l’une de l’autre.

Un tel dispositif de fabrication est simple à mettre en œuvre et n’introduit qu’une déformation du matériau support et/ou d’analyse tout au plus minime et isotrope dans tout plan parallèle aux surfaces inférieur et supérieure de la matrice. Il permet donc de former des puces d’analyse à faible coût et en préservant les propriétés physico-chimiques natives des matériaux support et d’analyse.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

Des modes de réalisation de l’invention seront décrits ci-dessous par référence aux dessins, décrits brièvement ci-dessous :

La figure 1 représente une matrice support inférieure ou supérieure.

La figure 2 représente une matrice inférieure, une matrice supérieure et une feuille de matériau d’analyse en cours de positionnement en vue de leur assemblage pour former une puce d’analyse.

La figure 3 représente les éléments de la figure 1 après leur assemblage pour former une puce d’analyse.

La figure 4a représente une vue en coupe de la puce d’analyse de la figure 3 dans un plan contenant l’axe d’un trou traversant dans un premier mode de réalisation.

La figure 4b représente une vue en coupe de la puce d’analyse de la figure 3 dans un plan contenant Taxe d’un trou traversant dans un premier mode de réalisation.

La figure 5 représente une puce d’analyse vue de dessus dans un mode de réalisation particulier. La figure 6 représente une bande de matériau support avec les emplacements de découpe des matrices inférieures et/ou supérieures.

La figure 7 représente un dispositif d’analyse multiplexé comprenant deux puces d’analyse.

La figure 8 représente une matrice support inférieure ou supérieure dans un mode de réalisation particulier. La figure 9 représente une feuille de matériau d’analyse intercalée entre deux matrices support dans lesquelles des débords ont été formés juste avant l’assemblage au moyen d’un étau. Les débords ont été volontairement exagérés pour faciliter la compréhension du procédé.

Sur les dessins, des références identiques désignent des objets identiques ou similaires.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

L’invention concerne un procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 destinée à être mise en œuvre isolément ou dans un dispositif d’analyses 7. Le dispositif d’analyses 7 - ou la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 à elle seule - permet par exemple de réaliser des analyses de liquides biologiques tels que le sang ou une fraction liquide du sang (plasma, sérum), l’urine, la salive, etc.

Le liquide analysé peut aussi être un milieu réactionnel comprenant des bio-molécules telles que des anticorps ou des protéines.

La notion d’analyse d’un échantillon biologique doit donc être comprise au sens large c’est-à- dire qu’il s’agit d’une analyse impliquant au moins une biomolécule parmi le ou les réactifs et/ou le ou les analytes.

Les puces d’analyse d’un échantillon biologique 1 peuvent ainsi être utilisées pour détecter et quantifier des biomolécules complexes dans des milieux biologiques : sang, plasma, sérum, organes ou extrait d’organes, milieu réactionnel dans lequel sont produits des biomolécules complexes (anticorps, protéines).

Notamment, l’analyse biologique peut être un test immunologique tel qu’un test ELISA(« Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay »).

Les puces d’analyse d’un échantillon biologique 1 peuvent encore être mises en œuvre dans le domaine de l’agro-alimentaire pour la recherche d’agents pathogènes, par exemple à l’occasion de contrôles sanitaires.

Le procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 comprend : a- on fournit deux matrices support 10 formées chacune dans un matériau suppor, solide, qui présente une surface inférieure et une surface supérieure et dans chacune desquelles a été formé au moins un trou 11 la traversant entre les surfaces inférieure et supérieure, parmi lesquelles on définit une matrice support inférieure 10a et une matrice support supérieure 10b ; b- on fournit une feuille 13 de matériau d’analyse solide et poreux, la feuille de matériau d’analyse 13 présentant une surface inférieure et une surface supérieure, c- on superpose dans cet ordre la matrice support inférieure 10a, la feuille 13 de matériau d’analyse et la matrice support supérieure 10b de sorte :

- que la surface supérieure de la matrice inférieure 10a soit face à la surface inférieure de la matrice supérieure 10b,

- qu’au moins un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a soit en regard d’au moins un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b,

- et que la feuille de matériau d’analyse 13 soit intercalée entre les matrices inférieure et supérieure ; d- on réalise un assemblage mécanique des deux matrices support 10 et de la feuille de matériau d’analyse 13 au cours de laquelle une force pressante de direction normale aux surfaces inférieure et supérieure des matrices 10 est exercée de manière à rapprocher les matrices support 10 l’une de l’autre.

La puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 obtenue à l’issue du procédé comprend donc :

- une matrice support inférieure 10a formée dans un matériau support solide et dans lequel a été formé au moins un trou 11 traversant,

- une feuille 13 de matériau d’analyse solide et poreux,

- une matrice support supérieure 10b formée dans un matériau support solide et dans lequel a été formé au moins un trou 11 traversant .

Dans la puce d’analyse, la feuille de matériau d’analyse 13est assemblée avec et intercalée entre les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b.

Un mode de réalisation particulier d’une matrice support 10 est représenté sur la figure 1. La figure 2 représente une matrice support inférieure 10a, une feuille de matériau d’analyse 13 et une matrice supérieure 10b en cours de superposition, comme décrit à l’étape c.

La puce d’analyse 1, que l’on peut observer dans un mode de réalisation particulier sur la figure 3, comporte donc une matrice support inférieurelOa formée dans un matériau solide d’épaisseur e 1 dans lequel un ou plusieurs trous traversants 11 ont été formés, et une matrice support supérieure 10b formée dans un matériau solide d’épaisseur e’ 1 dans lequel un ou plusieurs trous traversants 11 ont été formés.

Dans un mode de réalisation particulier, les matériaux utilisés pour former les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b sont identiques. En variante, deux matériaux différents peuvent être utilisés pour former les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b.

Comme représenté sur la figure 5, une matrice support 10 inférieure ou supérieure est formée par découpe d’une pièce de base 21, de forme adéquate pour le dispositif d’analyse dans lequel elle est destinée à être utilisée ou bien pour son utilisation de manière isolée. La pièce de base 21 est par exemple un parallélépipède rectangle ou carré découpée dans une bande support 2 d’un matériau solide, appelé dans la suite « matériau support », présentant une surface inférieure et une surface supérieure plane parallèles entre elles.

Une pièce de base 21 découpée dans la bande support 2 pour former une matrice support 10 peut être un parallélépipède et avoir une largeur L1 comprise entre 5 mm (5 millimètres) et 50 mm et une longueur L2 comprise entre 5 mm et 50 mm. Dans un mode de réalisation particulier, la matrice support 10 est formée dans un matériau d’analyse d’épaisseur constante el entre la surface inférieure et la surface supérieure, ces surfaces étant dans ce cas planes et parallèles entre elles.

L’épaisseur el de la bande support 2 est alors constante et identique à celle de la pièce découpée 21. Elle est de préférence inférieure, par exemple d’au moins un facteur dix, aux autres dimensions (longueur L1 et largeur L2) de la pièce découpée 21.

La bande support 2 peut par exemple avoir une largeur L3 soit identique, soit légèrement supérieure à la largeur L1 de la matrice support 10, soit par exemple supérieure au double de la largeur Ll.

Dans ce dernier cas, il est possible de découper plusieurs pièces de base 21 dans la largeur de la bande support 2.

La largeur L3 de la bande support 2 est ainsi par exemple comprise entre 5 mm et 50 mm.

La longueur L4 de la bande support 2 peut être supérieure, voire très supérieure, à la longueur L2 de la pièce 21. La longueur L4 par exemple supérieure à 1 m voire à 10m.

De cette manière, il est possible de découper successivement plusieurs pièces de base 21 dans la bande support 2.

La découpe d’une pièce de base 21 peut par exemple être réalisée au moyen d’un emporte-pièce dans lequel on insère la bande support 2.

Si la bande support 2 est assez longue, la découpe des pièces de base 21 peut être automatisée, la bande support 2 étant translatée d’une distance adéquate entre deux découpes successives d’une pièce de base 21.

L’épaisseur el de la bande support 2 (et d’une pièce de base 21 découpée dans cette bande support 2) peut être inférieure à 1 mm, inférieure à 0,15 mm, ou encore inférieure entre 0,1 mm. Par exemple, l’épaisseur el de la bande support peut être égale à 0,06 mm.

Dans un mode de réalisation particulier, la bande support 2 a une largeur de 20 mm et une longueur de 25 m par exemple. La largeur et la longueur peuvent être changées en fonction du type de puces d’analyse 1 à fabriquer. L’épaisseur de la bande support 2 peut être égale à 0,06 mm soit la moitié de l’épaisseur actuelle des membranes fdtrantes (en général en nitrocellulose) formées dans le matériau d’analyse, mais elle pourrait aussi être de l’ordre de 0,10 mm.

Dans un mode de réalisation particulier, une pièce de base 21 est une membrane filtrante carrée de 20mm de côté.

La bande support 2 peut notamment être en métal, par exemple en acier, en cuivre ou en laiton. La bande support 2 peut, dans un mode de réalisation alternatif, être en plastique. A titre d’exemple non limitatif, le matériau plastique peut être le polyéthylène, le polychlorure de vinyle, le polystyrène, le polyméthacrylate de méthyle, le polypropylène ou tout autre matériau plastique couramment utilisé dans le domaine des analyses biochimiques. Il peut avoir subi un traitement de surface et/ou être résistant aux UV. Le matériau support peut encore contenir des fibres végétales, à titre d’exemple de la cellulose. Il peut notamment s’agir de papier.

Le matériau support est solide mais pas nécessairement rigide. La bande support 2 peut ainsi présenter une certaine souplesse, à condition que la bande support 2 ou une matrice support 10 formée à partir de cette bande support 2 puisse être manipulée et déplacée pour la préparation des puces d’analyse 1, notamment sans se déchirer, y compris dans le cas où la préparation de la matrice support 10 est automatisée. A titre d’exemple, le papier pour photocopieur Rex Copy A4 distribué par la société Mondi®, de grammage 80g/m ² , disponible à la date de priorité de la présente demande de brevet, convient pour l’invention.

Dans le cas où la bande support 2 est souple, le matériau est suffisamment rigide pour que les surfaces supérieure et inférieure soient effectivement planes lorsque la surface inférieure est, au moins localement, simplement posée sur un support plan.

Dans un mode de réalisation, le matériau support est assez rigide pour permettre le découpage d’une ou plusieurs pièces de base 21 au moyen d’un emporte-pièce.

Dans une pièce de base 21 de matériau support, on forme au moins un trou traversant 11 traversant le matériau dans son épaisseur, c’est-à-dire suivant la direction normale aux surfaces inférieure et supérieure de la pièce 21.

Dans un mode de réalisation particulier, un trou traversant 11 est formé au moyen d’un emporte-pièce, comportant un ou plusieurs poinçons identiques ou de formes différentes. Dans ce mode de réalisation, l’emporte-pièce est translaté suivant la direction de l’axe du fùtur trou traversant 11, de manière à percer la matrice support 10. Un guide de coupe dédié peut être placé sous la bande support 2.

Dans un mode de réalisation particulier, les trous traversants 11 sont formés sur les emplacements correspondants aux fùtures pièces de base 21 dans la bande support 2 avant qu’une ou plusieurs pièces de base 21 ne soient découpées.

Dans un autre mode de réalisation, les trous traversants 11 sont formés dans une pièce de base 21 déjà découpée.

En variante, les trous traversants 11 sont formés en même temps que la pièce 21 est découpée, par exemple au moyen d’un emporte-pièce de forme adaptée.

La forme des trous traversants 11 peut être choisie en fonction des besoins de l’analyse. Par exemple, la surface délimitant l’intérieur d’un trou traversant 11 est un cylindre dont la génératrice est parallèle à la direction normale aux surfaces inférieure et supérieure de la pièce 21, direction que l’on appellera dans la suite « axe du trou 11 » et que l’on notera (Z’Z) sur les figures.

Par exemple, les trous traversants 11 sont des cylindres de révolution.

Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 8, l’un des trous traversants 11 peut s’analyser comme formé de deux sous-parties traversantes de section circulaire 1 la et 11b, reliées par un canal 1 le. Une fois les pastilles de matériau d’analyse insérées comme décrit dans la suite, il sera ainsi possible de déposer l’échantillon à analyser dans le puits correspondant au premier « sous-trou » et de laisser l’échantillon diffuser de la sous-partie 1 la vers la sous-partie 11b. Dans ce cas, il est possible d’utiliser la puce d’analyse pour effectuer un test de type par flux latéral(« lateral flow »).

Les dimensions caractéristiques d’un trou traversant 11 dans une direction de la surface supérieure ou inférieure de la pièce 21 dans laquelle le trou traversant 11 est formé peuvent être inférieures à 1 mm.

Par exemple, une matrice support 10 peut comprendre 9, 12, 24, 48 ou 96 trous (aussi appelés « puits ») 11 ayant la forme de cylindres de révolution de diamètre dl de l’ordre de 300 à 800 pm (micromètres), deux trous traversants 11 successifs étant espacés d’une distance d2 de l’ordre de 100 à 250 pm.

Dans un mode de réalisation particulier, on forme 25 trous traversants 11 de 500 micromètres de diamètre espacés de 200 micromètres, contenus dans un carré de 6mm x 6mm placé au centre d’une pièce de base 21 en forme de carré de matériau support (20x20mm).

L’outil emporte-pièce comprendra donc dans ce cas 25 poinçons d’un diamètre de 500 micromètres. Pour d’autres configurations de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1, les poinçons utilisés pour tous les trous traversants 11 ou pour une partie de ces trous traversants 11 pourront avoir des diamètres différents. Le diamètre (ou une dimension caractéristique dans le cas où la section du trou traversant 11 n’est pas circulaire) de l’emporte-pièce pourra ainsi être inférieur à 1000 micromètres, inférieur à 900 micromètres, inférieur à 800 micromètres, inférieur à 700 micromètres, inférieur à 600 micromètres, inférieur à 500 micromètres, inférieur à 400 micromètres, inférieur à 300 micromètres, inférieur à 200 micromètres, inférieur à 150 micromètres, inférieur à 100 micromètres.

Optionnellement, une découpe ou une marque repère 12 est formée sur la matrice support 10 de manière à pouvoir repérer son orientation, notamment lors d’une analyse qui sera réalisée ultérieurement ou encore pour faciliter le positionnement d’une matrice support inférieure 10a en regard d’une matrice support supérieure 10b.

Cette disposition permet de différencier les trous traversants 11 les uns des autres lorsque la matrice support 10 présente des éléments de symétrie.

Dans la première étape du procédé suivant l’invention, on fournit donc :

- une matrice support inférieure 10a formée dans un matériau support d’épaisseur constante el entre une surface inférieure et une surface supérieure et dans lequel ont été percés un ou plusieurs trous 11 le traversant dans son épaisseur, et une matrice support supérieure 10b formée dans un matériau support d’épaisseur constante e’ 1 entre une surface inférieure et une surface supérieure dans lequel ont été percés un ou plusieurs trous 11 le traversant dans son épaisseur. Dans une deuxième étape, on fournit une feuille 13 d’épaisseur constante, notée e2, d’un second matériau solide poreux dit « matériau d’analyse », présentant une surface supérieure et une surface inférieure.

Le matériau d’analyse est destiné à recevoir sur l’une de ses surfaces inférieure et supérieure un échantillon liquide à analyser ou à filtrer, qui doit pouvoir ensuite s’écouler vers l’autre de ces surfaces, soit spontanément par simple diffusion, soit du fait d’une circulation forcée du liquide. Le matériau d’analyse peut donc être un matériau poreux tel que du papier, notamment du papier-filtre c’est -à-dire du papier à haute teneur en alpha-cellulose (notamment plus de 90%, 95%, voire 98% d’alpha-cellulose) .

Le matériau d’analyse peut encore être de la nitrocellulose.

La nitrocellulose présente une bonne affinité pour les petites protéines, les peptides ou les acides nucléiques. Elle est donc de ce fait particulièrement bien adaptée pour des analyses biologiques. Ces exemples ne doivent toutefois pas être considérés comme limitatifs.

Le matériau d’analyse peut être choisi notamment en fonction de sa résistance à l’humidité, sa vitesse de filtration, sa force de rupture, sa vitesse d’ascension capillaire ou encore sa résistance au passage de l’air.

Dans le cas où le liquide à analyser contient majoritairement de l’eau, le matériau d’analyse est de préférence hydrophile, de façon à ce que le liquide à analyser mouille la surface du matériau d’analyse. Dans ce cas, le matériau support de la matrice support inférieure 10a et/ou de la matrice support supérieure 10b peut être hydrophobe.

Dans toute la suite, on considérera qu’un matériau est hydrophobe si l’eau ne mouille pas le matériau, c’est-à-dire si l’angle entre une goutte d’eau et la surface du matériau sur laquelle la goutte est déposée est strictement supérieur à 90°. Dans le cas contraire, le matériau d’analyse est hydrophile.

Le matériau support peut être rendu hydrophobe avant l’étape d’assemblage d’une matrice support 10 à une feuille 13 de matériau d’analyse au moyen d’un traitement de surface, notamment par enduction avec une cire.

En variante, le matériau d’analyse peut être hydrophobe et les matériaux support hydrophiles. Le matériau d’analyse peut être une membrane filtrante isotrope ou anisotrope. En particulier, il peut s’agir d’une membrane filtrante organique, c’est-à-dire une membrane comprenant un polymère organique tel que l’acétate de cellulose, une polysulfone ou une polyamide. L’épaisseur e2 du matériau d’analyse peut être proche de l’épaisseur el du matériau support. L’épaisseur e2 peut être supérieure, égale ou inférieure à l’épaisseur el.

Dans le cas où le matériau support est de la nitrocellulose, l’épaisseur e2 du matériau d’analyse pourra ainsi être de l’ordre de quelques centaines, voire quelques dizaines de micromètres, par exemple 50 pm à 150 pm. Dans une troisième étape, on superpose dans cet ordre la matrice support inférieure 10a, la feuille 13 de matériau d’analyse et la matrice support supérieure 10b de sorte :

- que la surface supérieure de la matrice inférieure 10a soit face à la surface inférieure de la matrice supérieure 10b,

- qu’au moins un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a soit en regard d’au moins un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b,

- et que la feuille d’analyse soit intercalée entre les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b.

A l’issue de cette étape, une force pressante de direction normale aux surfaces inférieure et supérieure des matrices support 10a et 10b est exercée de manière à rapprocher ces matrices support l’une de l’autre et à obtenir l’assemblage des matrices support 10a et 10b avec la feuille de matériau d’analyse 13 et/ou entre elles.

Cette force pressante peut par exemple être exercée au moyen d’un étau dont la mâchoire inférieure 9a est placée sous la matrice support inférieure 10a et la mâchoire supérieure 9b est placée au-dessus de la matrice support supérieure 10b. L’étau peut être remplacé par un dispositif mécanique équivalent.

A l’issue du procédé, les deux matrices support 10 et la feuille de matériau d’analyse 13 sont assemblées de manière permanente, c’est-à-dire que, dans les conditions normales d’utilisation de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1, notamment du fait de l’écoulement d’un échantillon, la puce ne se désassemble pas.

Les deux matrices support 10 et la feuille de matériau d’analyse 13 forment donc un continuum. Il en résulte qu’au moins un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a se trouve donc en continuité fluidique avec un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b avec lequel il forme un canal au sein duquel est insérée une portion de la feuille de matériau d’analyse 13. De cette manière si un échantillon est injecté dans le trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b, il traversera nécessairement le matériau d’analyse 13 puis s’écoulera au travers du trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a. Il se forme donc un canal à partir de deux trous traversant 11 de la matrice support inférieure et de la matrice support supérieure superposés, obturé par le matériau d’analyse au travers duquel l’échantillon à analyser peut diffuser spontanément ou de manière forcée.

La portion de matériau d’analyse obturant un canal formé par un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b et un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a superposés sera appelée dans la suite « pastille » 3 d’analyse. C’est sur cette pastille 3 que l’analyse d’un échantillon liquide peut être effectuée.

La façon dont le matériau d’analyse 13 s’insère dans les trous traversants et entre les deux matrices support dépend de la nature des matériaux support et d’analyse utilisés ainsi que de l’intensité de la force pressante exercée. Deux modes de réalisation particulier, non limitatifs, sont représentés sur les figures 4a et 4b.

En particulier, le matériau d’analyse peut avoir tendance à s’enfoncer dans la matrice support inférieure, comme sur la figure 4b, ou se répartir vers les deux matrices support inférieure et supérieure comme sur la figure 4a.

Le matériau d’analyse peut ne pas affleurer à la surface inférieure de la matrice support inférieure 10 a et/ou à la surface supérieure de la matrice support supérieure 10b ou au contraire affleurer au niveau de ces deux surfaces simultanément.

Quel que soit le cas de figure, la force pressante exercée pour l’assemblage peut être choisie de manière à ce que la continuité de la feuille de matériau d’analyse 13 ne soit pas rompue du fait de l’insertion du matériau d’analyse dans les trous traversants 11. Dans ce cas, le maintien en place de la pastille 3 d’analyse est au moins assurée par sa liaison avec le reste de la feuille de matériau d’analyse 13.

Dans ce cas toujours, il peut être souhaitable de limiter la diffusion de l’échantillon à analyser d’une pastille 3 vers le reste de la feuille de matériau d’analyse. Si l’échantillon à analyser est en phase aqueuse, on pourra par exemple traiter les faces des matrices support 10 destinées à être en contact avec la feuille d’analyse avec un traitement de surface hydrophobe. Lors de l’assemblage, le traitement de surface hydrophobe pourra diffuser sous l’effet de la force pressante dans la feuille de matériau d’analyse 13, à l’exception de la ou des pastilles 3 d’analyse, qui se trouvent en regard des trous traversants 11. En conséquence, les pastilles 3 d’analyse resteront hydrophiles alors que le reste de la feuille d’analyse 13 sera hydrophobe, ce qui permet de limiter la diffusion latérale de l’échantillon à analyser à l’extérieur de la pastille 3 d’analyse et permet ainsi une bonne sensibilité et une bonne reproductibilité des tests réalisés sur la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

La force pressante exercée pour l’assemblage peut aussi être choisie de manière à ce que les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b sertissent la portion de feuille de matériau d’analyse 13 obturant un canal formé par un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b et un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a superposés. Dans ce cas, le maintien en place d’une pastille d’analyse 3 est au moins assuré par ce sertissage.

Si la pression exercée pour l’assemblage est suffisante, la continuité de la feuille de matériau d’analyse 13 peut être rompue par le sertissage. Dans ce cas, il n’est pas possible que l’échantillon à analyser diffuse d’une pastille 3 d’analyse vers le reste de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1. Ce mode de réalisation permet donc une bonne sensibilité et une bonne reproductibilité des tests réalisés sur la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1. La hauteur de la pastille 3 peut dans tous les cas être égale à la hauteur du canal formé par un trou traversant 11 de la matrice support supérieure 10b et un trou traversant 11 de la matrice support inférieure 10a superposés, ou encore différente de cette hauteur, ainsi qu’on l’observe sur les figures 4a et 4b.

Dans le cas où la force pressante permettant l’assemblage des matrices support 10 à la feuille de matériau d’analyse 13 est exercée au moyen d’un étau, on comprend que la force pressante peut ne pas comprendre de composante dans une direction normale à l’axe d’un trou traversant 11. Autrement dit, la direction de la force pressante est colinéaire à l’axe d’un trou traversant 11, de sorte qu’aucune anisotropic non native n’est introduite dans les matériaux support et d’analyse dans une direction non colinéaire à l’axe du trou traversant 11. Cette disposition permet notamment de contrôler avec précision la limite de quantification de la puce d’analyse.

On notera que si le trou traversant 11 a été formé dans le matériau de la matrice support inférieure 10a au moyen d’un emporte-pièce, il peut s’être formé un débord lOal à l’issue de l’étape de perçage qui peut être replié lors de l’étape d’assemblage sous la feuille de matériau d’analyse de manière à assurer son sertissage. Le même raisonnement s’applique par symétrie pour la matrice support supérieure 10b. On comprendra ce cas à l’aide de la figure 9 qui représente une feuille de matériau d’analyse intercalée entre deux matrices support dans lesquelles des débords lOal (respectivement 10b 1) ont été formés juste avant l’assemblage. A l’issue de l’assemblage les débords lOal (respectivement 10b 1) seront repliés en-dessous (respectivement au-dessus) de la feuille de matériau d’analyse.

Quel que soit le mode de réalisation choisi pour l’étape d’assemblage, aucune force non colinéaire à l’axe d’un trou traversant 11 n’est exercée, de manière à maintenir inchangées les propriétés du matériau d’analyse au cours de cette étape.

En particulier, le procédé suivant l’invention présente l’avantage de ne mettre en œuvre aucune étape qui pourrait introduire une anisotropic des propriétés de ce matériau et dégrader ainsi la précision et la sensibilité de l’analyse, comme discuté précédemment pour une étape de laminage.

L’étape d’assemblage mécanique peut donc résulter en un sertissage d’au moins une portion de la feuille de matériau d’analyse 13 (formant une pastille d’analyse 3) par les matrices support inférieure 10 a et supérieure 10b. Lors de l’étape d’assemblage, le fait de n’exercer qu’une action mécanique, celle-ci étant de plus exercée dans la direction de l’axe d’un trou traversant 11 et possiblement répartie uniformément sur les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b, permet de maintenir l’uniformité et l’isotropie des propriétés physico-chimiques du matériau d’analyse dans les plans normaux à l’axe du trou.

La pression exercée lors de cette étape d’assemblage ainsi que la durée pendant laquelle cette pression est exercée peuvent être choisies en fonction de la résistance mécanique de l’assemblage nécessaire pour les analyses.

Par exemple, il est possible d’obtenir une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 dont les pastilles d’analyse 3 restent en place lorsqu’un fluide les traverse de manière forcée au moyen d’une différence de pression entre la face amont et la face aval de la pastille inférieure à 100 mbar (millibar) ; inférieure à 200 mbar ; inférieure à 300 mbar ; inférieure à 400 mbar ; inférieure à 500 mbar ; inférieure à 600 mbar ; inférieure à650 mbar ; inférieure à 700 mbar ; inférieure à 750 mbar ; inférieure à 800 mbar ; inférieure à 850 mbar ; inférieure à 900 mbar ; inférieure à 950 mbar ; inférieure à 1.00 bar.

Les faces amont et aval sont ici comprises relativement au sens et à la direction d’écoulement du fluide.

On considère qu’une pastille d’analyse 3 « reste en place » si à l’issue de l’analyse, cette pastille d’analyse obture toujours totalement le trou traversant 11 dans lequel elle a été insérée. En particulier, un décalage de la pastille 3 dans la direction de l’axe du trou traversant du fait de la différence de pression entre ses faces amont et aval peut intervenir sans pour autant remettre en cause la qualité de l’analyse pratiquée au moyen de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

Si la pastille d’analyse 3 « reste en place » lorsqu’une différence de pression existe entre ses faces amont et aval, on dira alors que la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 « résiste » au vide relatif correspondant.

La face supérieure d’une pastille d’analyse 3 peut, dans un mode de réalisation particulier, être simplement soumise à la pression atmosphérique et la face inférieure placée en dépression. De cette manière, un dispositif d’analyse comprenant une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 peut être mis en oeuvre avec circulation forcée de fluide, ce qui permet de contrôler le temps de contact de l’échantillon à tester avec une pastille3 et donc la reproductibilité de l’analyse.

Cette disposition permet aussi de réduire les durées des analyses.

Notamment, la circulation forcée de l’échantillon à tester évite, ou au moins accélère, les étapes de lavage en général nécessaires pour éliminer la fraction de l’échantillon test qui n’a pas réagi ainsi que les molécules qui se sont adsorbées de manière non spécifique sur la membrane.

Par exemple, il est possible d’effectuer un test sanguin sur une durée de 30 minutes entre le dépôt de l’échantillon (non centrifugé) et le résultat de l’analyse. Un test ELISA conventionnel nécessite un temps beaucoup plus long, en général de 12 à 24 heures.

L’assemblage mécanique est réalisé en phase solide, et à une température inférieure aux températures de fusion des matériaux support et d’analyse. Cet assemblage ne met donc pas en œuvre de procédé de type soudure par exemple, qui pourrait dénaturer les matériaux ou modifier leur structure physique. Il ne met pas non plus en œuvre une solution dont le solvant serait à évaporer et dont les traces restantes pourraient interférer avec l’analyse.

Grâce au procédé d’assemblage suivant l’invention, il n’y a pas de possibilité de migration du matériau support ou d’un solvant vers le matériau d’analyse et réciproquement, de sorte que le matériau d’analyse conserve à l’issue des propriétés ses propriétés natives, c’est-à-dire ses propriétés avant l’assemblage au matériau support.

A l’issue de l’étape d’assemblage, il est possible de réaliser une étape de fonctionnalisation d’une ou plusieurs pastilles 3. A titre d’exemple, on peut déposer avec une pipette ou une micropipette, éventuellement de manière automatisée, un volume choisi d’une solution de molécules sonde sur une ou plusieurs pastilles 3.

La bio-fonctionnalisation d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 consiste notamment à fixer une molécule de capture (par exemple un anticorps pour détecter un antigène) ciblant la biomolécule complexe à détecter et quantifier dans le liquide biologique à analyser.

Dans un mode de réalisation particulier, un rouleau de puces d’analyse d’un échantillon biologique 1, dans lesquelles les pastilles 3 sont déjà en place, peut être mis en place sur une machine de dépôt (« spotting»). Le rouleau est déroulé pour faire défiler les barrettes de puces d’analyse 1 sur un plateau filtrant relié à une pompe à vide. La tête d’injection de la machine de « spotting » peut déposer, par exemple en 2 ou 3 injections, un volume de l’ordre de 10 pL d’une solution contenant la molécule de capture, par exemple à une concentration de 10 à 30 pg/mL.

Le vide d’aspiration peut être choisi pour permettre une filtration lente sur un temps d’environ 20 secondes des 10 pL de solution. La totalité des pastilles 3 de chaque puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 peut ainsi être traitées de la même façon. Une deuxième application peut ensuite être réalisée dans les mêmes conditions mais avec une solution de BSA (Bovine Sérum Albumine) à une concentration 100 pg/mL. Cette solution permet de saturer les sites polaires de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 filtrante pour éviter des liaisons non spécifiques entre la biomolécule qui sera détectée et la surface d’analyse, par exemple de nitrocellulose, de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

En variante, il est possible de procéder à la fonctionnalisation d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 en amont de l’assemblage. Il est ainsi possible d’intercaler plusieurs feuilles de matériau d’analyse 13 différentes, soit en superposition, soit décalées les unes par rapport aux autres, soit les deux à la fois, entre les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b.

Par exemple, on peut préparer au moins deux feuilles de matériau d’analyse 13 au départ identiques mais ayant chacun subi une étape de bio-fonctionnalisation différente, notamment par adsorption de deux antigènes différents.

Une pastille 31a sur laquelle un premier antigène a été adsorbé pourra être formée dans un premier canal obturé par une portion de la première feuille de matériau d’analyse 13, et une autre pastille 31b sur laquelle un deuxième antigène a été adsorbé pourra être formée dans un deuxième canal obturé par une portion de la deuxième feuille de matériau d’analyse 13. Dans ce cas, une découpe ou marque repère 12 optionnellement formée sur la matrice support

10 pourra permettre de repérer les positions des différents sites de test.

11 est aussi possible de superposer deux feuilles de matériau d’analyse 13 différentes, qui se retrouvent alors toutes deux l’une sur l’autre intercalées entre les matrices support inférieure 10a et supérieure 10b. De cette façon, un échantillon à tester subira successivement les deux tests correspondant aux deux feuilles de matériau d’analyse 13. Ce mode de réalisation peut par exemple être intéressant lorsque l’on souhaite extraire deux analytes différents à l’échantillon à analyser en vue de réaliser un troisième test.

Si la gestion de la bio-fonctionnalisation se fait à l’échelle de la feuille de matériau d’analyse 13, plutôt que pastille d’analyse 3 par pastille sur une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 donnée et/ou sur des puces d’analyse 1 successives, il est possible de produire en série avec un rendement élevé des puces d’analyse 1 identiques et présentant des qualités analytiques identiques, permettant de travailler dans des conditions de répétabilité, voire de reproductibilité satisfaisantes.

La limite de quantification, c’est-à-dire la plus petite concentration ou teneur de l’analyte pouvant être quantifiée, avec une incertitude acceptable, dans les conditions expérimentales décrites de la méthode, peut être considérée constante pour une série de puces d’analyse produites de manière automatisée à partir des mêmes feuilles de matériau d’analyse.

Cette limite de quantification est plus facile à contrôler dans le cas d’une feuille que dans le cas d’une pastille unique 3 dans lesquels les effets de bord vont jouer un rôle important.

Il est en outre possible d’orienter les molécules sondes utilisées pour la fonctionnalisation de manière à ce que les sites sur lesquels les molécules à tester peuvent se fixer soient orientés suivant l’axe du trou. Cette disposition permet d’accroître encore la sensibilité (ou la limite de quantification) de l’analyse. Les molécules sondes peuvent notamment être celles décrites dans le brevet EP3591024B1 (inventeurs Wong Ka-Leung, Goetz Joan et al.) déposé le 05/07/2018, à savoir des nanoparticules de lanthanide luminescentes ultrabrillantes comprenant du terbium. On parvient ainsi à des limites de quantification de l’ordre de quelques atomoles par microlitre de liquide à tester.

Dans un mode de réalisation particulier, le matériau d’analyse n’est pas fonctionnalisé et est conservé dans sa structure native au niveau des pastilles 3. De cette manière, on forme une pastille 32 dite « filtrante » dont la seule fonction est une fonction de filtration.

Si l’on superpose une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 comprenant des pastilles filtrantes 32 et une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 comprenant des pastilles fonctionnalisées 31 (3 la, 31b, etc.) de manière à ce que chaque pastille filtrante 32 soit placée au-dessus d’une pastille fonctionnalisée 31 de manière à ce que tout le fluide qui traverse une pastille filtrante 32 parvienne sur la pastille fonctionnalisée 31 correspondante, il est ainsi possible d’analyser un prélèvement sanguin sans centrifugation préalable, les globules rouges étant retenus par la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 filtrante tandis que le sérum ou le plasma traverse cette puce pour être ensuite analysée par la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 fonctionnalisée.

Cette disposition permet donc un gain de temps et de matériel important pour de telles analyses. Dans un mode de réalisation particulier, une ou plusieurs pastilles 3 peuvent être des pastilles de calibration 33 de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

Après incubation du rouleau de puces d’analyse 1, par exemple à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, les puces d’analyse 1 sont prêtes. Elles peuvent à ce stade être séparées les unes des autres avec un outil de découpe qui permette d’obtenir des puces d’analyse isolées de mêmes dimensions.

A l’issue de l’étape d’assemblage, et éventuellement après fonctionnalisation, il est ainsi possible, si cela n’a pas déjà été réalisé antérieurement, de découper les pièces de base 12 pour détacher la ou les puces d’analyse 1 de la bande support 2.

Une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 obtenue par le procédé suivant l’invention peut être conservée plusieurs mois à température ambiante, de préférence dans une atmosphère sèche (par exemple sous protection étanche à l’air et à l’eau).

Notamment, des puces d’analyse 1 peuvent être conservées à 20°C +/- 5°C pendant au moins 1 mois, au moins 2 mois, au moins 3 mois, au moins 4 mois, au moins 5 mois, au moins 6 mois, au moins 7 mois, au moins 8 mois, au moins 9 mois, au moins 10 mois, au moins 11 mois, au moins 12 mois sans altération de leurs propriétés analytiques. Notamment, un test de référence sur un échantillon biologique de référence donnera statistiquement la même concentration de l’analyte recherchée (même moyenne et même écart type) sur un lot de puces d’analyse d’un échantillon biologique 1 juste après fabrication et après conservation à 20°C +/- 5°C sous protection étanche à l’air et à l’eau (par exemple sous blister) pendant au moins 1 mois, au moins 2 mois, au moins 3 mois, au moins 4 mois, au moins 5 mois, au moins 6 mois, au moins 7 mois, au moins 8 mois, au moins 9 mois, au moins 10 mois, au moins 11 mois, au moins 12 mois.

Le procédé de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 suivant l’invention permet de contrôler les propriétés du matériau support indépendamment des propriétés du matériau d’analyse et réciproquement, à la différence des procédés de l’art antérieur.

Typiquement, si le matériau support est formé à partir d’une plaque de métal, cette plaque de métal peut être rendue hydrophobe préalablement à l’étape d’assemblage d’une matrice support 10 à une feuille de matériau d’analyse 13. Par exemple un traitement de surface, telle qu’une enduction avec une cire naturelle ou de synthèse, peut être mis en œuvre.

Dans les procédés connus, un tel traitement limite les qualités analytiques de la puce, puisque la cire peut migrer de manière incontrôlée du matériau support vers le matériau d’analyse, par exemple à l’occasion une étape de chauffage ou de traitement chimique ou de laminage. La cire (ou tout autre composé chimique utilisé pour le traitement de surface) peut alors interférer avec l’analyse. On observe entre autres des phénomènes de quenching de fluorescence, qui réduisent la sensibilité de l’analyse lorsque des molécules sondes fluorescentes sont mises en œuvre. Dans l’invention, l’étape d’assemblage n’entraîne pas une telle diffusion ou migration incontrôlée de la cire. Certains modes de réalisation permettent même d’éviter une diffusion ou une migration incontrôlée d’espèces chimiques à partir des pastilles d’analyse 3 ou vers ces pastilles 3. Le procédé suivant l’invention permet donc d’obtenir une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 dont les zones de tests (autrement dit les pastilles d’analyse 3) sont formées avec une meilleure précision qu’avec les procédés de l’art antérieur.

Cette analyse est aussi valable pour le cas où les feuilles de matériau d’analyse 13 sont fonctionnalisées avant l’étape d’assemblage mécanique.

On voit donc l’intérêt du procédé selon l’invention, qui permet de limiter les interférences entre les matériaux support et d’analyse qui la constituent, et ainsi d’obtenir une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 de limite de quantification basse.

Les étapes du procédé peuvent être réalisées au moyen d’outils simples et l’étape d’assemblage mécanique ne nécessite pas de solvant. Le procédé est donc peu coûteux, rapide, et peu polluant. Dans la mesure où l’un des matériaux parmi les matériaux support et d’analyse peut être hydrophile, on pourra dans un mode de réalisation particulier travailler dans des conditions d’hygrométrie contrôlée pour une ou plusieurs étapes du procédé, de manière à garder un contrôle précis sur la géométrie et le volume de la matrice support 10 et/ou des pastilles 3 d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

Une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 obtenue par le procédé suivant l’invention peut être mise en œuvre isolément. Dans ce cas, un échantillon à analyser peut être déposé sur une ou plusieurs des pastilles 3 de la puce. Ou encore plusieurs échantillons à analyser peuvent être déposés chacun sur une ou plusieurs pastilles 3 différentes de celles utilisées pour les autres échantillons, simultanément ou successivement.

La puce peut, pour ce faire, être placée horizontalement, de sorte qu’un échantillon liquide à analyser donné s’écoule de la face supérieure de la pastille d’analyse 3 sur laquelle il a été déposé vers la face inférieure de cette même pastille d’analyse 3, soit sous l’effet de la gravité, soit sous l’effet d’un gradient de pression, un vide relatif étant appliqué du côté de la face inférieure de la pastille d’analyse 3.

Plusieurs puces d’analyses 1, notamment fonctionnalisées de manière différente les unes des autres, peuvent être superposées dans comme décrit dans la demande W02014/053,237A1, de manière à ce que soient formés différents canaux, chaque canal contenant une seule pastille d’analyse 3 ou plusieurs pastilles d’analyse 3, chacune de ces dernières appartenant à une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 différente. Un tel dispositif d’analyse multiplexée en trois dimensions est schématiquement représenté sur la figure 7. Le dispositif d’analyse 7 consiste en un empilement de plaques support 72 solides, par exemple en Polymethacrylate de méthyle (PMMA) ou autre matériau plastique, dans lesquelles sont formés des microcanaux 71 et entre lesquelles sont intercalées des puces d’analyse 1.

Les microcanaux sont alignés les uns avec les autres et les sites d’analyse (c’est-à-dire les pastilles 3) des puces d’analyse 1 viennent s’insérer entre deux microcanaux de deux plaques support 72 consécutives. Il est aussi possible de superposer plusieurs puces d’analyses 1 entre deux plaques support 72 consécutives. Dans ce cas, si différents échantillons à analyser sont testés dans les différents canaux, il est possible d’effectuer une analyse multiplexée 3D.

Plus simplement, il est possible de prévoir un dispositif d’analyse 7 comprenant quatre piliers sur lesquels est fixée la puce d’analyse d’un échantillon biologique Ipar ses quatre coins. Ces deux exemples sont non limitatifs.

La détection d’un analyte d’intérêt peut se faire par une analyse immunologique de type ELISA : une fois le complexe molécule de capture / biomolécule d’intérêt formé sur les sites d’analyse (ou équivalemment puits) de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1, un anticorps de révélation est ajouté qui se lie spécifiquement au complexe molécule de capture / biomolécule. La fluorescence ou la couleur qui apparaît dans chaque puits est mesurée à l’aide d’un dispositif tel qu’un photomultiplicateur ou d’une caméra type CMOS, couplé à un programme informatique qui réalise les calculs.

L’invention porte donc aussi sur un dispositif d’analyse 7 comprenant au moins une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1. Le dispositif d’analyse 7 peut contenir plusieurs puces d’analyses 1, notamment superposées, comme décrit ci-dessus.

L’invention porte en outre sur un kit de diagnostic comprenant au moins une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1. Le kit de diagnostic peut aussi comprendre un support pour la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 et/ou au moins un réactif d’analyse. Le réactif d’analyse peut notamment contenir un ou plusieurs anticorps ou un ou plusieurs antigènes en vue de mettre en œuvre un test immunologique. Le réactif d’analyse peut aussi être un révélateur.

Dans le cas de la présente demande, on entend par test immunologique (« immunoassay ») un test mettant en œuvre au moins un antigène pour détecter des anticorps dirigés contre un agent pathogène dans un prélèvement ou au moins un anticorps pour détecter un antigène d'un agent pathogène dans un prélèvement.

Le réactif d’analyse peut aussi être un tampon , par exemple un tampon phosphate salé (PBS) ou encore un autre solution, par exemple un solution d’albumine de sérum bovin (BSA).

L’invention concerne l’utilisation d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 à des fins de diagnostic ou pour réaliser un test immunologique. Notamment, des test sérologiques de recherche at la quantification d’anticorps de type immunoglobulines G ou M (IgG ou IgM) peuvent être mis en œuvre après fonctionnalisations de la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 au moyen de l’antigène adéquat. La puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 peut aussi être fonctionnalisée pour rechercher et quantifier les protéines de choc thermique telles que les protéines de la famille HSP60 au moyen d’un anticorps spécifique, par exemple fluorescent. L’apolipoprotéine ApoAl ou encore des médiateurs de l’inflammation tels que la protéine C-réactive (CRP) ou la protéine stabilisatrice du pancréas PSP (« pancreatic stone protein ») peuvent être recherchés par la mise en œuvre d’une méthode enzymoimmunologique sur la puce d’analyse d’un échantillon biologique 1.

L’invention porte enfin sur un dispositif de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 suivant l’un quelconque des modes de réalisation comprenant un système d’assemblage mécanique des deux matrices support 10a et 10b et de la feuille de matériau d’analyse 13 intercalée entre les deux matrices support 10a et 10b au moyen duquel une force pressante de direction normale aux surfaces inférieure et supérieure des matrices support 10a et 10b est exercée de manière à rapprocher les matrices support(10 l’une de l’autre.

Le système de fabrication peut notamment comprendre un étau. Il peut aussi comprendre un ou plusieurs emporte-pièce comprenant chacun un ou plusieurs poinçons identiques ou non et dont la course est réglable, et une ou plusieurs contre-pièce pour le perçage des trous traversants dans le matériau support.

Le dispositif de fabrication d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 peut être entièrement automatisé.

Par exemple, la bande support 2 peut être en métal ex : acier, cuivre, laiton ou alors en matériau plastique, pourvu que le support soit assez rigide pour permettre les différentes opérations qui vont suivre.

Préalablement à la fabrication la bande support 2 peut être traitée, par exemple par pulvérisation sur de ses faces un polymère cireux ayant une caractéristique de colle légère. Puis il s’agit de réaliser un outil emporte-pièces et la contre pièce correspondante afin de pouvoir perforer convenablement la bande support 2 et ainsi réaliser les puits (ou trous traversants 11) dans la bande support 2. Cet outil peut être en acier afin que sa rigidité et sa tenue dans le temps soient garantis. Les dimensions seront adaptées aux types de membranes à réaliser. Dans un cas particulier, on forme 25 trous traversants 11 de 500 micromètres de diamètre espacés de 200 micromètres, soit un carré de 6mm x 6mm placé au centre d’une puce d’analyse d’un échantillon biologique 1 carrée de 20 mm de côté. Cet outil emporte-pièce aura 25 pitons (encore appelés « poinçons ») d’un diamètre de 500 microns. Pour d’autres membranes les poinçons pourront avoir des diamètres et des formes différents.

Cet ensemble « emporte-pièces et contre pièce » est fixé sous une presse. La bande support 2 vient se dérouler d’une manière automatique et ajustée au milieu de cet ensemble « emporte- pièce et contre pièce » afin de réaliser des puits automatiquement par simple mouvement de haut en bas à la place prévue. Le déplacement de la bande support 2 peut être calculé de façon à avoir en sortie de cet emboutissage toutes les membranes (ou puces d’analyse d’un échantillon biologique 1) de la même dimension et que chaque membrane soit bien délimitée de la suivante. Il est possible de réaliser plusieurs étapes en parallèle.

Une deuxième bande support 2 sera travaillée de la même manière pour obtenir une ou plusieurs matrices support supérieures 10b.

On peut ensuite utiliser une double alimentation par bandes superposées pour amener dans une presse dédiée les deux bandes de matière support préparées. Les bandes, optionnellement traitées avec le traitement au polymère hydrophobe, sont introduites de telle manière que le polymère sera entre les deux bandes de matériau support, en métal ou plastique par exemple. Une bande d’une membrane filtrante (ou encore feuille de matériau d’analyse 13) de même dimension, par exemple de la nitrocellulose, est positionnée pour passer entre les deux bandes de matériau support, par exemple de métal ou plastique, avant introduction dans une presse. La presse est abaissée automatiquement lors du passage du système à trois bandes avec une pression, de sorte que une fois la pression terminée on aura en sortie une membrane (ou puce d’analyse d’un échantillon biologique 1) qui sera composée de trois parties soudées. La nitrocellulose est ainsi pressée entre les deux bandes de matériau support 2, par exemple en métal ou plastique remplissant les trous traversant 11 libres et étant chargée de colle (ou de polymère hydrophobe) aux endroits non perforés. Elle est d’une part, incorporée au polymère et d’autre part, elle est poussée dans les puits des deux bandes de matériau support 2, par exemple en métal ou plastique.

L’alignement des matrices support inférieure 10a et supérieure 10b est tel que les puits des deux bandes de matériau support 2, par exemple de métal ou de plastique, soient alignées à l’entrée dans la presse. Après pressage, le système de bandes est poussé pour sortir les barrettes (comprenant une ou plusieurs puces d’analyse 1) ainsi formées et un nouveau pressage est réalisé pour former les barrettes suivantes.

En sortie de machine, on obtient un rouleau d’une bande de matière support (acier, cuivre, laiton ou plastique) sur laquelle sont reparties des puces d’analyse d’un échantillon biologique 1, comprenant par exemple des sites d’analyse de 300 à 600 micromètres de diamètre disposés de manière régulière et espacés des limites des membranes terminées.

Le rouleau peut ensuite subir une étape de bio-fonctionnalisation automatisée telle que décrite plus haut.

LISTE DES SIGNES DE RÉFÉRENCE

1 : puce d’analyse 10 : matrice support inférieure ou supérieure 10a : matrice support inférieure lOal : débord de la matrice support inférieure 10b : matrice support supérieure lOal : débord de la matrice support supérieure

11 : trou traversant une matrice support 10

1 la, 11b : sous-partie d’un trou traversant 11

1 le : canal reliant deux sous-parties 1 la et 11b

12 : découpe / marque repère

13 : feuille de matériau d’analyse : bande support 1 : pièce de base

3 : pastille d’analyse

31 a, b, c : pastille d’analyse 3 fonctionnalisée

32 : pastille filtrante

33 : pastille de calibration

7 : dispositif d’analyse multiplexé

71 : microcanal

72 : plaque support

9a : mâchoire inférieure d’un étau

9b : mâchoire supérieur d’un étau