【발명의 명칭 】

코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 코어 -쉘 구조 경조직 재생용 지지체 .

【기술분야 】

본 발명은 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 코어 -쉘 구조 경조직 재생용 지지체에 관한 것으로， 코어-쉘 구조에 세포등과 같은 생체기능성 물질을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 한다. -

【배경기술 】

사고， 질병 및 노화 등으로 손실된 신체기능을 기존의 대체 ( Rep l acement ) 개념의 치료가 아닌 재생 ( Regener at i on)시켜 복원시키고자 하는 조직공학은 생명과학과 공학 둥 여러 가지 분야가 조합하여 이루어지는 다학제간 기술분야이다. 조직공학을 이루는 주요 3 요소 (세포， 지지체 및 생체활성분자) 중 지지체는 구성재료 선택과 구조제어 기술이 매우 중요하다. 즉， 지지체는 자가복구기능을 통해 손실한 조직을 재생시키기 위하여 조직과 조직을 이어주는 다리와 같은 역할을 하며， 이를 위하여

^' 조직재생이 원활히 이루어지도록 세포친화성이 뛰어나야 한다. 또한， 세포가 3 차원 적으로 잘 자라며 영양분 및 배설물 등의 교환이 잘 이루어질 수 있도록 일정한 크기영역에서 3 차원적으로 잘 연결되어 있는 기공구조를 가지고， 조직의 재생속도에 맞추어 분해되어 없어지는 생분해성과 재생되는 동안 형태를 유지시켜줄 기계적 강도를 가져야하며， 생체안전성이 뛰어나야 한다 . 뼈와 치아와 같은 경조직 재생에 있어서는 재생부위에 따른 기계적 물성확보가 중요하다. 이러한 지지체에 요구되는 기능 중

3 차원 기공구조와 기계적 물성은 지지체의 디자인 및 제조기술로， 나머지 생분해성， 생체적합성 및 기계적 물성 등은 주로 적합한 소재의 선택 및 합성기술로 제어가 가능하다. 한편， 뼈와 치아와 같은 상기 경조직 재생에 있어서， 이를 수행하기 위한 지지체를 효율적으로 제조하기 위해 등록특허 제 7051504호 및 등록특허 게 0941374호에서는 컴퓨터 제어를 통해 외부형상과 기공구조 등을 면밀히 제어할 수 있는 쾌속조형기술을 개시하고 있다. 상기 쾌속조형기술， 그 중 페이스트 압출 조형법 (Paste extruding deposition)을 이용하여 지지체를 제조하기 위해서는 조형가능한 조건의 페이스트 소재를 활용하는 것이 중요하며 이를 위하여 대부분 폴리카프로락톤과 같은 고분자 소재 흑은 고분자를 기반으로 한 유무기 복합재를 원료로 활용하고 있다 (Chemistry of Materials, 19, 29,6363-6366, 2007) . 하지만 경조직 중 뼈는 약 70 %가 하이드록시카보네이트 아파타이트로 대표되는 무기질 (세라믹 )으로 구성되어 있는 세라믹 기반 유 ^* 무기 복합체이며 , 뻐의 생체적합성， 생분해성 및 기계적 물성을 모방하여 지지체를 제조하기 위해서는 뼈와 유사한 성분을 가지는 지지체의 제조가 요구된다. 하지만， 세라믹을 기반으로 한 지지체를 쾌속조형기술로 제조하기 위해서는 기술적 제약이 따른다. 즉， 세라믹의 경우 3 차원 형상을 만들어 내기 위해서는 세라믹 분말과 유기물 바인더의 조합으로 형상을 제조한 후 고온 소결을 통하여 유기물을 제어하고 세라믹 분말 입자간 결합을 형성시켜 기계적으로 안정성을 가진 지지체를 얻거나 (Chemical Communication, 2139-2141, 2007) , 고분자로 3 차원 형상을 제조한 후 이를 주형으로 이용하여 세라믹 분말과 유기물 바인더와의 복합체를 주입한 후 고온 소성시켜 고분자 및 유기물 바인더를 제거하는 공정 (Journal of Materials Science: Mater Med, 18, 1071-1077, 2007)이 이용된다. 이와 같이， 통상적인 세라믹 복합체의 제조에는 반드시 고온소결이라는 열처리 공정이 필요하며 이는 골조성 모방형 유 ， 무기복합 지지체를 제조하거나 지지체를 열에 약한 단 질 , 약물 및 세포 등으로 기능화하는 것에 큰 제약을 가져오게 된다. 이에 세라믹 분말의 시멘트 반웅 원리를 웅용하여 열처리 공정을 필요로 하지 않는 공정이 개발되었다. 이에， 대한민국 공개특허 제 10— 2010-0013016호에서는 세라믹 분말의 시멘트 반웅 원리를 웅용하여 열처리 공정을 필요로 하지 않는 공정이 개시된 바 있으며， 상세하게는 인산마그네슘 분말을 생체안정성이 우수한 저농도의 유기물 바인더와 혼합한 페이스트를 쾌속조형기법으로 적층조형하여 3 차원 성형체를 만든 후 시멘트 용액에 침적시켜 경화시키는 공정이 개시된 바 있다. 이에 따라 제조되는 지지체는 지지체의 형상과 기공 구조 조건을 제어할 수 있고， 우수한 생체적합성을 가지며 소결공정을 거치지 않고 우수한 기계적 강도를 나타내는 등의 장점이 있다. 특히， 종래의 세라믹 지지체 제조 공정과는 달리 소결공정을 시멘트 반웅으로 대체함으로 다양한 생체기능성 물질을 첨가할 수 있어 지지체에 약물전달능력을 부여할 수 있다. 한편， 최근 보고되고 있는 생체기능성 물질을 직접 첨가하여 지지체를 제조하는 경우를 살펴보면， 대한민국 공개특허 제 10-2004- 0070346호에서는 교차결합된 폴리비닐 알코을 하이드로젤 구조체로서의 강화， 적층， 침윤된， 복합체 유사 재료가 개시된 바 있다. 상세하게는， 벌크 (비셀를러 (Non-cellular)) 또는 셀를러 (Cellular) 매트릭스 형태의 교차 결합 폴리비닐 알코을 하아드로젤 구조체 (Structures)로서의， 강화 (Reinforced)， 적층 (Laminated)， 침윤된 ( Impregnated)， 및 복합 성질을 갖는 재료에 관한 것이다 또한 , 대한민국 등록특허 제 10- 1219646호에서는 아가로스를 이용한 다공성 3차원 지지체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 3차원 지지체가 개시된 바 있다. 상세하게는， 다공성 3차원 지지체의 제조방법은 공극 유도 물질인 아가로스를 준비한 후， 이를 액체 상태로 하이드로 겔화하여 아가로스 겔을 제조한 후， 이를 지지체를 형성하는 생체재료의 주원료와 함께 성형를에 주입하여 가압성형하는 단계와 상기 성형물을 급속 냉각한 후， 동결건조시킨 다음 이를 에탄올로 고정시킨 후， 50 ^° C 이상의 물에 담구어 아가로스를 제거함으로써 다공성 및 통기성이 형성된 3차원 지지체를 제조하는 단계를 포함하는 다공성 3차원 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 그러나， 상기 3 차원 구조체는 수화겔 또는 고분자 내에 불균일한 흔합 및 배치로 인한 불안전한 기계적 물성을 가지는 문제가 있으며， 생체활성이 낮은 문제가 있다 . 또한， 3 차원 구조체 제조 후 세포를 파종 및 배양하는 경우 3 차원 구조체 전체에 균일하게 조직 재생용 세포를 배치하기 어려운 문제가 있으며， 그에 따른 부작용이 발생할 가능성이 높다는 문제가 있다. 즉， 세포와 직접 접하는 3 차원 구조체 외부로부터 세포가 증식 및 성장하는 것으로 구조체 내부까지 분포하기 어려우며， 세포를 부착하였다 하더라도 외부측 밀도가 높아 기공구조를 막는 것으로 영양분이나 배설물 등의 유통이 어려워 세포 괴사 등의 증상아 발생할 수 있는 문제가 있다. 이에 , 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있는 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 대하여 연구하던 중， 세포 또는 생체기능성 물질을 포함할 수 있는 수화겔 및 세라믹을 포함하는 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기에 넣고， 이를 압출하며 적층조형법을 통해 3 차원 구조체를 제조함으로써， 코어-쉘 구조의 경조직 재생용 지지체를 제조하는 방법을 개발하고， 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명 】

【기술적 과제 】

본 발명의 목적은 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조되는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법 】

상기 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은，

인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계 (단계 1 ) ;

수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계 (단계 2 ) ; 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고， 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 연결된 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계 (단계 3) ; 및

상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반웅을 유도하는 단계 (단계 4) ;를 포함하는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공한다 . , 또한， 본 발명은，

인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계 (단계 1 ) ;

수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계 (단계 2 ) ;

상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고， 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 연결돤 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계 (단계 3 ) ; 및

상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반웅을 유도하는 단계 (단계 4 ) ;를 포함하는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공한다. 나아가， 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조되는 코어 -쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제공한다. 【유리한 효과】

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법은 이중노즐을 가지는 압출 용기를 통해 적층조형법으로 3 차원 구조체를 제조하는 방법으로 코어-쉘 구조의 경조직 재생용 지지체를 제조할 수 있는 효과가 있다. 또한， 상온에서 제조할 수 있기 때문에 세포 또는 각종 생체기능성 물질을 포함시킬 수 있는 효과가 있다. 나아가， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 골 성분과 유사한 구성으로 기계적 물성이 높으며， 3 차원 구조체 전반에 걸쳐 세포 또는 생체기능성 물질이 균일하게 분포되어 있는 효과가 있다.

【도면의 ^' 간단한 설명 】

도 1은 본 발명에 따른 이중노즐을 가지는 압출 용기를 나타낸 모식도이고;

도 2는 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 코어- 쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 사진이고;

도 3은 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 3에서 제조된 코어- 쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 사진이고;

도 4는 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 4에서 제조된 코어- 쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 사진이고;

도 5는 본 발명에 따른 실시예 1의 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 X-선 회절 분석 (X-ray diffraction, analysis, XRD) 그래프이고;

도 6은 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 5에서 제조된 코어- 쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 사진이고;

도 7은 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조된 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 기등 단면이고;

도 8은 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조된 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체 내 담지된 세포의 시간에 따른 생존도를 나타내는 이미지이고;

도 9는 본 발명에 따른 실시예 6의 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 X-선 회절 분석 ( _X - _ra y diffraction analysis, XRD) 그래프이고;

도 10은 실시예 6의 제조과정을 나타낸 도식도이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태 】

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계 (단계 1);

수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계 (단계 2);

상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고， 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 면결된 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계 (단계 3); 및

상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반응을 유도하는 단계 (단계 4);를 포함하는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공한다. 이하， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 코어—쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 1은 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계이다.

상기 단계 1은 적층조형법 (Layer Manufacturing Process)에 사용가능한 페이스트를 제조하는 단계로써， 인산칼슘계 세라믹과 용매 및 점증제 등을 흔합하여 페이스트를 형성할 수 있다. 이때， 상기 단계 1의 제 1페이스트는 인산칼슘계 세라믹 외에도， 시멘트 반웅을 유도할 수 있는 생체세라믹， 예를 들어 생체활성유리 등이 포함될 수 있으나， 상기한 바와 같이 시멘트 반웅을 유도할 수 있는 생체세라믹 물질이라면 이에 제한되지 않고 상기 제 1페이스트에 포함될 수 있다. 구체적으로， 상기 단계 1의 인산칼슘계 세라믹은 하이드톡시아파타이트 (Hydroxyapat i te)， DCPD(Di cal c i urn phosphate dihydr ate) , MCPM(Monoca 1 c i urn phosphate monohydrat e) ,

DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous ) , a -TCP( a -Tr icalcium phosphate) 및 β -TCP( β—Tr i ca 1 c i um phosphate) 등을 사용할 수 있고 α -TCP를 사용하는 것이 바람직하다 . 일례로.， α -TCP는 하기 반웅식 1에 나타낸 것과 같이， 물과 반웅하여 칼슘부족하이드록시아파타이트 (Ca— def icirnt hydr oxyapat i t er ,

CDHA)로 시멘트 반웅을 일으킬 수 있어， 경화를 위해 산성용액 조건을 필요로 하는 β -TCP보다 세포 등과 같은 생체기능성 물질 도¾에 유리할 수 있다.

[반웅식 1]

3 α Ca ₃ (P0 ₄ ) ₂ + H ₂ 0 → Ca ₉ (HP0 ₄ )(P0 ₄ ) ₅ (0H)

또한， 상기 단계 1의 제 1 페이스트는 용매 및 점증제 등을 포함할 수 있으며， 상기 용매는 증류수 및 내지 C ₄ 알콜을 사용하는 것이 바람직하다 . 나아가, 상기 점증제는 세라믹 분말에 유동성과 성형성을 부여하고 생체적합성이 우수한 유기물을 사용할 수 있다. 예를 들면， 상기 점증제로는 하이드록시프로필메틸셀를로오즈， 젤라틴， 콜라겐， 알지네이트， 키토산 용액 등을 사용할 수 있다.

이때， 상기 단계 1의 제 1 페이스트에서 점증제의 함량은 세라믹 분말 100 량부에 대하여 0.1 내지 20 중량부를 사용할 수 있다. 만약， 상기 점증제의 함량이 세라믹 분말 100 중량부에 대하여 0.1 중량부 미만일 경우에는 유동성이 부족하여 성형이 어려을 수 있으며， 20 중량부를 초과할 경우에는 기계적 물성이 크게 저하될 수 있다.

다음으로， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 2는 수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계이다.

상기 단계 2는 적층조형법 (Layer Manufacturing Process)에 사용가능한 페이스트를 제조하는 단계로써， ,수화겔과 가교제 등을 흔합하여 페이스트를 형성할 수 있다. 구체적으로， 상기 단계 2의 수화겔은 알지네이트， 젤라틴 (Gelatin)， 콜라겐 (Col lagen) , 파이브리노젠 ( f i br inogen)， 키토산 (Chitosan)， 아가 (Agar), 마트리겔 (Matr igel ) , 스타치 (Starch), 펙틴 (Pectin), 하이드록시 에틸 셀를로오스 (Hydroxy ethyl eel lulose) 폴리비닐 알콜 (Polyvinyl alcohol) , 폴리우레탄 (Polyurethane)， 폴리에틸렌 글라이콜 (Poly(ethylene glycol)), 폴리프로필렌 글라이콜 (Poly(propylene glycol)), 메틸셀를로오스 (Methyl cellulose), 카르복시메틸셀를로오스 (Car boxymethy 1 ce 11 u 1 ose)， 히알루로난 (Hyaluronan)， 폴리비닐피를리돈 (Poly (vinylpyrro 1 i done) )， 블톡 공중합체 등을 용매에 흔합하여 사용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.

여기서 상기 수화겔에 H ₂ 0, PBS, 또는 각 수화겔을 용해할 수 있고 생체안정성이 확보된 용매를 추가하여 페이스트가 압출 및 성형하기에 적합한 유동성을 가지도록 물성제어가 필요하며， 이를 위하여 용매의 흔합물 100 중량부에 대하여 수화겔은 5-15 중량부가 바람직하며， 만약 상기 수화겔의 농도가 5 중량부보다 낮을 경우， 수화겔을 압출한 후 형상을 유지하지 못하는 문제가 있고 , 15 중량부보다 높을 경우， 점도가 높아 압출이 불가능한 문제가 있다. 또한， 수화겔은 그 물성에 따라 물리적 (ionic, stereocomplex, thermal) 및 /또는 화학적 (UV, wet-chemical)으로 가교를 유도할 수 있으며 물리적 가교법이 유리하나 이에 제한하지 않는다 . 상기 단계 2의 제 2 페이스트를 알지네이트로 선택한 경우 이온성 반웅을 통한 가교공정을 필요로 하며 이때 이온성 반웅을 위하여 염화칼슘 (CaCl ₂ ), 염화마그네슘 (MgCl ₂ ), 인산칼슘 (CaP), 탄산칼슘 (CaC0 ₂ ) 등의 가교제를 포함할 수 있다. 여기서 , 상기 가교제는 수화겔 성분을 가교시키는 역할을 하며， 성형에 적합한 물성 점도를 갖는 범위에서 사용할 수 있다. 바람직하게， 상기 가교제의 함량은 제 2 페이스트 100 중량부에 대하여 0.05-1.0 중량부， 더욱 바람직하게는 0 . 25- 1 중량부를 사용할 수 있다.

만약， 상기 가교제의 함량이 0 . 05 중량부 미만일 경우에는 수화겔의 가교가 이루어지기 힘들기 때문에， 상기 제 2 페이스트를 압출한 이후 형태가 유지되기 어려운 문제가 있으며， 1 중량부를 초과할 경우， PH가 중성영역에서 벗어나게 되어 세포 등과 같은 생체기능성 물질이 손상될 수 있는 문제점이 있다. 나아가， 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 생체 기능성 물질을 더 포함할 수 있다. 이와 같이， 본 발명에 따른 코어-쉘 경조작 재생용 지지체의 제조방법은 수화겔에 생체기능성 물¾을 직접 포함시킬 수 있는 장점이 있으며， 수화겔에 생체기능성 물질을 포함시킴으로써， 3 차원 구조체 내부까지 생체기능성 물질을 균일하게 분포시켜 조직재생을 효율적으로 유도할 수 있는 장점이 있다.

이때 , 상기 생체기능성 물질로는 세포 성장인자， 단백질， 단백질 약물， 항증식제， 항트름빈 , 면역억제제， 지질， 항지질 , 리포솜， 소염제 , 항종양제， 항혈소판제， 혈관신생제， 항혈관신생제， 비타민， 앱타머 , 항유사분열제， 메탈로프로티나아제 저해제 , NO 공여체， 에스트라디올， 항경화제 , 혈관작용제 , 베타 차단제， AZ 차단제， 호르몬， 스타틴， 항산화제， 막 안정화제， 칼슘 길항제， 레티노이드， 펩티드， 지단백질， 폴리펩티드， 폴리뉴클레오티드 인코딩 폴리펩티드， 효소 , 유전 물질， 화학 용매， 에너지 -활성화제， 림프구 저해 물질， 대식세포 저해 물질 및 이들의 흔합물 등을 사용할 수 있다.

여기서， 상기 생체기능성 물질이 세포일 경우 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 세포 배양액을 더 포함할 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 3은 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고， 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 연결된 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계이다.

종래에는 3 차원 구조체 제조 후 세포를 파종 및 배양함으로써， 3 차원 구조체 전체에 균일하게 조직 재생용 세포를 배치하기 어려운 문제가 있으며， 그에 따른 부작용이 발생할 가능성이 높다는 문제가 있다. 즉， 세포와 직접 접하는 3 차원 구조체 외부로부터 세포가 증식 및 성장하는 것으로 구조체 내부까지 분포하기 어려우며， 세포를 부착하였다 하더라도 외부측 밀도가 높아 기공구조를 막는 것으로 영양분이나 배설물 등의 유통이 어려워 세포 괴사 등의 증상이 발생할 수 있는 문제가 있다.

이를 해결하기 위하여， 상기 단계 3에서는 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트와 수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 이중노즐 형태의 압출 용기에 넣어 압출하며， 적층조형법으로 성형하여 성형체를 제조하며， 이와 같이 제조되는 경조직 재생용 지지체는 골 성분과 유사한 구성으로 기계적 물성이 높으며， 3 차원 구조체 전반에 걸쳐 세포 등과 같은 생체기능성 물질을 분포시킬 수 있는 장점이 있다. 이때， 상기 이중노즐을 가지는 압출 용기는 일례로써， 도 1에 나타낸 바와 같이 내부관 및 외부관과 연결되는 2 개의 용기로 구성될 수 있다. 내부관과 연결되는 용기에는 코어를 형성하기 위한 물질을 넣어 압출하몌 외부관과 연결되는 용기에는 쉘을 형성하기 위한 물질을 넣어 압출하여 코어-쉘 구조를 형성한다. 구체적으로， 상기 단계 3에서 이중노즐을 가지는 압출 용기를 통해 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 코어 (Cor e ) 및 상기 코어 표면에 구비되어， 상기 코어를 둘러싸는 수화겔 (Hydroge l )을 포함하는 쉘 ( She l l )로 이루어지는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 단계 3의 적층조형법은 다양한 크기의 노즐을 사용하여 지지체의 기등두께를 조절할 수 있으며， 컴퓨터 프로그램을 통해 다양한 형상 (기등간격， 기공크기， 기공형상， 지지체 형상 등)으로 성형이 가능하다.

나아가， 상기 단계 3의 압출은 다양한 방법으로 압력을 가할 수 있으나， 세라믹 페이스트를 포함하는 제 1 페이스트를 압출하는 경우에는 높은 압력을 필요로 하기 때문에 스크류압을 사용하는 것이 바람직하고， 수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 압출하는 경우에는 미세한 압력 조절을 필요로 하기 때문에 공압을 사용하는 것이 바람직하나， 이에 제한되지 않는다.

다음으로， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서 , 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반응을 유도하는 단계이다.

상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액으로 처리하기 전에는 시멘트 반웅이 일어나지 않은 상태이므로 , 상기 단계 4에서는 적층조형법으로 성형한 이후에 경화액에 침지하여 시멘트 반응을 통해 지지체를 경화시킨다. 이를 통해， 지지체의 3 차원 형상 및 기공 구조 제어를 위한 충분한 시간을 확보할 수 있어 지지체의 구조제어를 더욱 용이하게 수행할 수 있다는 장점이 있다.

여기서， 상기 단계 3 이후에 수화겔의 추가적인 가교를 위해 염화칼슘 (CaC ) , 염화마그네슘 (MgC l ₂ ) , 인산칼슘 ( CaP) , 탄산칼슘 (CaC0 ₃ ) 등의 가교제를 희석한 용액에 침지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때 , 상기 가교제 희석액의 농도는 전체 희석액 100 중량부에 대하여， 가교제 2-10 중량부를 첨가하여 조절하는 것이 바람직하다. 만약， 상기 가교제의 함량이 전체 희석액 100 중량부에 대하여 2 중량부 미만일 경우에는 가교의 진행이 늦어져， 지지체의 구조 제어가 어려운 문제가 있고， 10 중량부를 초과할 경우에는 중성영역에서 벗어나 pH가 세포에 악영향을 미치는 문제가 있다.

또한， 상기 수화겔의 추가적인 가교를 위하여 1-60 분간 침지할 수 있고， 2-20 분간 침지하는 것이 바람직하다 . 구체적으로， 상기 단계 4의 경화액은 시멘트 조성물에 따라 H ₂ 0, PBSCphosphate buffer saline), MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate) , DAHP(Di ammonium hydrogen phosphate) , NH4H2PO4 , KH2P0 ₄ K2HPO4, NaH ₂ P0 ₄ 등을 단독으로 또는 흔합하여 사용할 수 있고， 수화겔에 포함되어 있는 세포 등과 같은 생체기능성 물질에 악영향을 미치지 않도록 중성의 경화액을 사용하는 것이 바람직하다. 한편， 상기 경화액으로 MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate) , DAHP(Di ammonium hydrogen phosphate) , NH ₄ H ₂ P0 ₄ , KH ₂ P0 ₄ , ₂ HP0 _4l NaH ₂ P0 ₄ 등을 단독으로 또는 흔합하여 사용할 경우， 경화액의 농도는 0.1 내지 5.0 M인 것이 바람직하다 . 만약， 상기 경화액의 농도가 0.1 M 미만인 경우에는 경화반웅에 시간이 오래 소요되는 문제가 있고， 5.0 M을 초과할 경우에는 경화반응이 지나치게 빨리 일어나 불균일 반웅을 초래하는 문제가 있다. 또한 ' 상기 단계 4에서 성형체는 예를 들어 1 내지 24 시간 동안 경화액에 침지되어 시멘트 반웅을 유도할 수 있으며， 상기 침지되는 시간은 성형체의 코어-쉘 구조 크기 및 반응성 등을 고려하여 적절히 조절될 수 있다.

나아가， 상기 단계 4에서 성형체를 경화액에 침지하여 시멘트 반웅을 유도함과 동시에 수화겔의 가교 또한 유도 및 촉진시킬 수 있다. 여기서， 상기 경화액에 수화겔의 추가적인 가교를 위해 염화칼슘 (CaCl ₂ ), 염화마그네슘 (MgC ), 인산칼슘 (CaP), 탄산칼슘 (CaC0 ₃ ) 등의 가교제를 더 포함시킬 수 있다.

여기서， 상기 가교제의 부가적인 첨가량은 경화액과 반응하여 침전물을 생성시키지 않고 경화액의 pH 변화를 일으키지 않을 정도로 낮은 농도를 사용하는 것이 바람직하다 . 예를 들어， 상기 경화액에 가교제를 부가적으로 첨가하는 양은 경화액 및 가교제 100 중량부에 대하여 가교제 0.005-0.1 중량부를 첨가할 수 있다. 일례로， 수화겔로 사용된 알지네이트는 2가 양이온 (Ca ²⁺ , Ba ²⁺ , Sr ²⁺ 등)이 알지네이트의 Na ⁺ 이온과 치환되면서 Alg-Ca의 가교네트워크를 형성하게 되며 이 중 Ca ²⁺ 가 가장 높은 가교 효과를 기대할 수 있다. 즉， CaCl ₂ 가 알지네이트의 가교제로 작용하므로， 본 발명에서 경화액으로 사용한 PBS에 CaCl ₂ 를 흔합하여 사용하는 경우 알지네이트의 가교를 추가적으로 유도할 수 있으며， 본 발명에서는 1단계에서 낮은 농도의 CaCl ₂ 를 알지네이트에 흔합하여 1차 가교를 유도하고 성형 후， 추가적인 알지네이트의 가교를 위해 CaCl ₂ 를 희석한 용액에 침지시키는 2차 가교 단계를 더 포함할 수 있으며 , 마지막으로 지지체를 CaCl ₂ 가 흔합된 PBS 용액에 침적시키는 것으로 시멘트반웅의 유도와 동시에 알지네이트의 3차 가교를 유도할 수 있다 . 이때， 경화액으로 MCPMCMonocalcium phosphate monohydrate)을 사용할 경우， 경화액 자체적으로 Ca ²⁺ 를 포함하므로， 시멘트 반웅 유도와 동시에 알지네이트의 3차 가교를 유도할 수 있다.

또한， 본 발명에 따른 지지체의 제조방법은 상기 단계 4를 수행한 후, ' 시멘트 반응이 수행된 지지체를 세척하고 건조하거나， 또는 상기 수화겔에 생체기능성 물질로 세포가 포함될 경우에는 세척 후에 세포 배양액과 함께 포장하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이때， 상기 세척은 증류수 , 식염수， PBS 등을 이용할 수 있다. 나아가， 본 발명에 따른 지지체의 제조방법은 5-40 ^° C의 온도에서 모든 제조공정이 수행될 수 있다. 즉, 종래에 세라믹의 경화를 위한 고은에서의 열처리 공정이 필요한 것과는 달리 열처리 공정을 수행하지 않는다. 나아가， 소성을 위한 열처리 공정을 사용하지 않음에도 경조직 재생용으로 사용되기에 층분한 기계적 강도를 갖는 지지체를 제조할 수 있다.

또한， 5-40 ^° C의 온도에서 수행하기 때문에 생체기능성 물질을 직접 포함시킨 세라믹 지지체를 바로 제조할 수 있는 장점이 있다. 한편， 본 발명의 제조방법은 상기한 바와 같이 적층조형법을 통해 수행될 수 있으나， 본 발명의 제조방법은 상기 적층조형법 외에도 3D 프린팅 기술을 통해서도 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 쎄조할 수 있다.

즉， 상기 3D 프린팅 기술은 디지털화된 3차원 제품 디자인을 2차원 단면으로 연속적으로 재구성한후， 원료소재를 한 층씩 인쇄하여 제품을 제조하는 기술로써， 상기의 경조직 재생용 지지체를 코어 -쉘 구조로 디지털 설계한 후， 이를 3D 프린팅 장치에 적용함으로써， 상기 적층조형법과 동일하게 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조할 수 있다ᅳ 또한， 본 발명은

인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계 (단계 1 ) ;

수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계 (단계 2 ) ; 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고， 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 연결된 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계 (단계 3 ) ; 및 상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반응을 유도하는 단계 (단계 4);를 포함하는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법올 제공한다. 이하, 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 대하여 각 단계별로 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 1은 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트를 준비하는 단계이다.

^ 1 단계 1은 적층조형법 (Layer Manufacturing Process)에 사용가능한 페이스트를 제조하는 단계로써， 인산칼슘계 세라믹과 용매 및 점증제 등을 혼합하여 페이스트를 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 1의 인산칼슘계 세라믹은 하이드톡시아파타이트 (Hydroxyapat i te)， DCPD(Di cal c i um phosphate dihydrate) , MCPM(Monocalcium phosphate monohydr at e) ,

DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous) , a -TCP( a -Tri calcium phosphate) 및 β -TCP( β -Tr i cal c him phosphate) 등을 사용할 수 있고， α-TCP를 사용하는 것이 바람직하다. 일례로， α -TCP는 상기 반웅식 1에 나타낸 것과 같이， 물과 반응하여 칼슘부족하이드록시아파타이트 (Ca-deficirnt hydroxyapat i t er ,

CDHA)로 시멘트 반응을 일으킬 수 있어， 경화를 위해 산성용액 조건을 필요로 하는 β -TCP보다 세포나 약물전달에 유리할 수 있다. 또한， 상기 단계 1의 제 1 페이스트는 용매 및 점증제 등을 포함할 수 있으며， 상기 용매는 증류수 및 d 내지 C ₄ 알콜을 사용하는 것이 바람직하다.

나아가， 상기 점증제는 세라믹 분말에 유동성과 성형성을 부여하고 생체적합성이 우수한 유기물을 사용할 수 있다. 예를 들면， 상기 점증제로는 하이드록시프로필메틸셀를로오즈， 젤라틴， 콜라겐 , 알지네이트， 키토산 용액 등을 사용할 수 있다.

이때， 상기 단계 1의 제 1 페이스트에서 점증제의 함량은 세라믹 분말 100 중량부에 ^' 대하여 0.1 내지 20 중량부를 사용할 수 있다. 만약， 상기 점증제의 함량이 세라믹 분말 100 중량부에 대하여 0.1 중량부 미만일 경우에는 유동성이 부족하여 성형이 어려울 수 있으며，

20 중량부를 초과할 경우에는 기계적 물성이 크게 저하될 수 있다. 다음으로， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 2는 수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 준비하는 단계이다 .

상기 단계 2는 적충조형법 (Layer Manufacturing Process)에 사용가능한 페이스트를 제조하는 단계로써， 수화겔과 가교제 등을 흔합하여 페이스트를 형성할 수 있다. 구체적으로， 상기 단계 2의 수화겔은 알지네이트， 젤라틴 (Gelatin)， 콜라겐 (Col iagen)， 파이브리노젠 ( f i br i nogen)， 키토산 (Chitosan)， 아가 (Agar), 마트리겔 (Matr igel )， 스타치 (Starch), 펙틴 (Pectin), 하이드록시 에틸 셀를로오스 (Hydroxy ethyl cellulose), 폴리비닐 알콜 (Polyvinyl alcohol) , 폴리우레탄 (Polyurethane)， 폴리에틸렌 글라이콜 (Poly(ethylene glycol)), 폴리프로필렌 글라이콜 (Poly(propylene glycol)) , 메틸셀를로오스 (Methyl eel lulose) , ^]·르복시메틸셀를로오 ^ᅵ 스 (Carboxymethylcel lulose) , 히알루로난 (Hyaluronan)， 폴리비닐피를리돈 (Poly(vinylpyrrolidone) )， 블록 공중합체 등을 용매에 흔합하여 사용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.

여기서 상기 수화겔에 H ₂ 0, PBS, 혹은 각 수화겔을 용해할 수 있고 생체안정성이 확보된 용매를 추가하여 페이스트가 압출 및 성형하기에 적합한 유동성을 가지도록 물성제어가 필요하며， 이를 위하여 용매의 흔합물 100 중량부에 대하여 수화겔은 5-15 중량부가 바람직하며， 만약 상기 수화겔의 농도가 5 중량부보다 낮을 경우, 수화겔을 압출한 후 형상을 유지하지 못하는 문제가 있고， 15 중량부보다 높을 경우， 점도가 높아 압출이 불가능한 문제가 있다. 또한， 수화겔은 그 물성에 따라 물리적 (ionic, stereocomplex, thermal) 및 /또는 화학적 (UV, wet-chemi cal )으로 가교를 유도할 수 있으며 물리적 가교법이 유리하나 이에 제한하지 않는다 . 상기 단계 2의 제 2 페이스트를 알지네이트로 선택한 경우 이오닉 반웅을 통한 가교공정을 필요로 하며 이때 이은닉 반웅을 위하여 염화칼슘 (CaCl ₂ ) , 염화마그네슘 (MgCl ₂ ) , 인산칼슘 (CaP) , 탄산칼슘 (CaC0 ₂ ) 등의 가교제를 포함할 수 있다. 여기서， 상기 가교제는 수화겔 성분을 가교시키는 역할을 하며， 성형에 적합한 물성 점도를 갖는 범위에서 사용할 수 있다. 바람직하게， 상기 가교제의 함량은 제 2 페이스트 100 중량부에 대하여 0.05-1.0 중량부， 더욱 바람직하게는 0.25-1 중량부를 사용할 수 있다.

만약， 상기 가교제의 함량이 0.05 중량부 미만일 경우에는 수화겔의 가교가 이루어지기 힘들기 때문에， 상기 제 2 페이스트를 압출한 이후 형태가 유지되기 어려운 문제가 있으며， 1 중량부를 초과할 경우， pH가 중성영역에서 벗어나게 되어 세포 등과 같은 생체기능성 물질이 손상될 수 있는 문제점이 있다. 나아가， 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 생체 기능성 물질을 더 포함할 수 있다. 이와 같이， 본 발명에 따른 코어-쉘 경조직 재생용 지지체의 제조방법은 수화겔에 생체기능성 물질을 직접 포함시킬 수 있는 장점이 있으며， 수화겔에 생체기능성 물질을 포함시킴으로써 , 3 차원 구조체 내부까지 생체기능성 물질을 균일하게 분포시켜 조직재생을 효율적으로 유도할 수 있는 장점이 있다. 이때， 상기 생체기능성 물질로는 세포, 성장인자， 단백질， 단백질 약물， 항증식제， 항트롬빈， 면역억제제， 지질， 항지질， 리포솜， 소염제， 항종양제 , 항혈소판제， 혈관신생제， 항혈관신생제， 비타민， 앱타머， 항유사분열제， 메탈로프로티나아제 저해.제 , NO 공여체， 에스트라디을, 항경화제， 혈관작용제 , 베타 차단제， AZ 차단제 , 호르몬， 스타틴， 항산화제 , 막 안정화제， 칼슘 길항제， 레티노이드， 펩티드， 지단백질 , 폴리펩티드， 폴리뉴클레오티드 인코딩 폴리펩티드， 효소， 유전 물질， 화학 용매， 에너지 -활성화제， 림프구 저해 물질， 대식세포 저해 물질 및 이들의 흔합물 등을 사용할 수 있다.

여기서， 상기 생체기능성 물질이 세포일 경우 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 세포 배양액을 더 포함할 수 있다. 다음으로， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 3은 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 내부관과 연결된 용기에 넣고 , 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐을 가지는 압출 용기의 외부관과 연결된 용기에 넣어 압출하며 적층조형법으로 성형하여 성형체를 얻는 단계이다.

종래에는 3 차원 구조체 제조 후 세포를 파종 및 배양함으로써，

3 차원 구조체 전체에 균일하게 조직 재생용 세포를 배치하기 어려운 문제가 있으며， 그에 따른 부작용이 발생할 가능성이 높다는 문제가 있다. 즉， 세포와 직접 접하는 3 차원 구조체 외부로부터 세포가 증식 및 성장하는 것으로 구조체 내부까지 분포하기 어려우며 , 세포를 부착하였다 하더라도 외부측 밀도가 높아 기공구조를 막는 것으로 영양분이나 배설물 등의 유통이 어려워 세포 괴사 등의 증상이 발생할 수 있는 문제가 있다.

이를 해결하기 위하여， 상기 단계 3에서는 세라믹을 포함하는 제 1 페이스트와 수화겔을 포함하는 제 2 페이스트를 이중노즐 형태의 압출 용기에 넣어 압출하며， 적층조형법으로 성형하여 성형체를 제조하며， 이와 같이 제조되는 경조직 재생용 지지체는 골 성분과 유사한 구성으로 기계적 물성이 높으며， 3 차원 구조체 전반에 걸쳐 세포 또는 생체기능성 물질을 분포시킬 수 있는 장점이 있다.

이때， 상기 이중노즐을 가지는 압출 용기는 일례로써， 도 1에 나타낸 바와 같이 내부관 및 외부관과 연결되는 2 개의 용기로 구성될 수 있다. 내부관과 연결되는 용기에는 코어를 형성하기 위한 물질을 넣어 압출하며， 외부관과 연결되는 용기에는 쉘을 형성하기 위한 물질을 넣어 압출하여 코어-쉘 구조를 형성한다.

구체적으로， 상기 단계 3에서 이중노즐을 가지는 압출 용기를 통해 수화겔 ( Hydr oge l )을 포함하는 코어 ( Cor e ) 및 상기 코어 표면에 구비되어， 상기 코어를 둘러싸는 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 쉘 ( She l l )로 이루어지는 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조할 수 있다.

또한， 상기 단계 3의 적층조형법은 다양한 크기의 노즐을 사용하여 지지체의 기등두께를 조절할 수 있으며， 컴퓨터 프로그램을 통해 다양한 형상 (기등간격， 기공크기， 기공형상， 지지체 형상 등)으로 성형이 가능하다 .

나아가， 상기 단계 3의 압출은 다양한 방법으로 압력을 가할 수 있으나， 세라믹 페이스트를 포함하는 제 1 페이스트를 압출하는 경우에는 높은 압력을 필요로 하기 때문에 스크류압을 사용하는 것이 바람직하고， 수화겔을 포함하는 제 2 폐이스트를 압출하는 경우에는 미세한 압력 조절을 필요로 하기 때문에 공압을 사용하는 것이 바람직하나 , 이에 제한되지 않는다ᅳ

다음으로， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법에 있어서， 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액에 침지하여 세라믹의 시멘트 반웅을 유도하는 단계이다.

상기 단계 3에서 얻은 성형체를 경화액으로 처리하기 전에는 시멘트 반웅이 일어나지 않은 상태이므로， 상기 단계 4에서는 적층조형법으로 성형한 이후에 경화액에 침지하여 시멘트 반웅을 통해 지지체를 경화시킨다. 이를 통해， 지지체의 3 차원 형상 및 기공 구조 제어를 위한 충분한 시간을 확보할 수 있어 지지체의 구조제어를 더욱 용이하게 수행할 수 있다는 장점이 있다. 여기서 , 상기 단계 3 이후에 수화겔의 추가적인 가교를 위해 염화칼슘 (CaCl ₂ ), 염화마그네슘 (MgCl ₂ ), 인산칼슘 (CaP), 탄산칼슘 (CaC0 ₃ ) 등의 가교제를 희석한 용액에 침지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때， 상기 가교제 희석액의 농도는 전체 희석액 100 증량부에 대하여， 가교제 2-10 중량부를 첨가하여 조절하는 것이 바람직하다. 만약， 상기 가교제의 함량이 전체 희석액 100 중량부에 대하여 2 중량부 미만일 경우에는 가교의 진행이 늦어져， 지지체의 구조 제어가 어려운 문제가 있고, 10 중량부를 초과할 경우에는 중성영역에서 벗어나 pH가 세포에 악영향을 미치는 문제가 있다.

또한， 상기 수화겔의 추가적인 가교를 위하여 1-60 분간 침지할 수 있고， 2-20 분간 침지하는 것이 바람직하다 . 구체적으로， 상기 단계 4의 경화액은 시멘트 조성물에 따라 H ₂ 0, PBSCphosphate buffer sal ine) , MCPMCMonocalcium phosphate monohydrate) , DAHP(Di ammonium hydrogen phosphate) , NH4H2PO4 , KH2PO4 , K ₂ HP0 ₄ , NaH ₂ P0 ₄ 등을 단독으로 또는 흔합하여 사용할 수 있고， 수화겔에 포함되어 있는 세포 등과 같은 생체기능성 물잘에 악영향을 미치지 않도톡 중성의 경화액을 사용하는 것이 바람직하다. 한편， 상기 경화액으로 MCPMCMonocalcium phosphate monohydrate) , DAHPCDi ammonium hydrogen phosphate) , NH ₄ H ₂ P0 ₄₎ KH ₂ P0 ₄ , K ₂ HP0 _{4 >} NaH ₂ P0 ₄ 등을 단독으로 또는 흔합하여 사용할 경우， 경화액의 농도는 0.1 내지 5.0 M인 것이 바람직하다. 만약， 상기 경화액의 농도가 0.1 M 미만인 경우에는 경화반응에 시간이 오래 소요되는 문제가 있고， 5.0 M을 초과할 경우에는 경화반응이 지나치게 빨리 일어나 불균일 반응을 초래하는 문제가 있다. 또한， 상기 단계 4에서 성형체는， 예를 들어 1 내지 24 시간 동안 경화액에 침지되어 시멘트 반웅을 유도할 수 있으며， 상기 침지되는 시간은 성형체의 코어-쉘 구조 크기 및 반웅성 등을 고려하여 적절히 조절될 수 있다. 나아가， 상기 단계 4에서 성형체를 경화액에 침지하여 시멘트 반응을 유도함과 동시에 수화겔의 가교 또한 유도 및 촉진시킬 수 있다. 여기서， 상기 경화액에 수화겔의 추가적인 가교를 위해 염화칼슘 (CaCl ₂ ) , 염화마그네슘 (MgCl ₂ ) , 인산칼슘 (CaP) , 탄산칼슘 (CaC0 ₃ ) 둥의 가교제를 더 포함시킬 수 있다.

여기서， 상기 가교제의 부가적인 첨가량은 경화액과 반웅하여 침전물을 생성시키지 않고 경화액의 H 변화를 일으키지 않을 정도로 낮은 농도를 사용하는 것아 바람직하다. 예를 들어， 상기 경화액에 가교제를 부가적으로 첨가하는 양은 경화액 및 가교제 100 중량부에 대하여 가교제 0.005-0.1 중량부를 첨가할 수 있다. 일례로， 수화겔로 사용된 알지네이트는 2가 양이은 (Ca ²⁺ , Ba ²⁺ , Sr ²⁺ 등)이 알지네이트의 Na+이온과 치환되면서 Alg-Ca의 가교네트워크를 형성하게 되며 이 중 Ca ²⁺ 가 가장 높은 가교 효과를 기대할 수 있다. 즉， CaCl ₂ 가 알지네이트의 가교제로 작용하므로, 본 발명에서 경화액으로 사용한 PBS에 CaCl ₂ 를 흔합하여 사용하는 경우 알지네이트의 가교를 추가적으로 유도할 수 있으며， 본 발명에서는 1단계에서 낮은 농도의 CaC l ₂ 를 알지네이트에 흔합하여 1차 가교를 유도하고 성형 후 , 추가적인 알지네이트의 가교를 위해 CaC l ₂ 를 희석한 용액에 침지시키는 2차 가교 단계를 더 포함할 수 있으며， 마지막으로 지지체를 CaC l ₂ 가 흔합된 PBS 용액에 침적시키는 것으로 시멘트반웅의 유도와 동시에 알지네이트의 3차 가교를 유도할 수 있다. 이때， 경화액으로 MCPMCMonoca l c i um phosphat e monohydr at e )을 사용할 경우， 경화액 자체적으로 Ca ²⁺ 를 포함하므로 , 사멘트 반웅 유도와 동시에 알지네이트의 3차 가교를 유도할 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 지지체의 제조방법은 상기 단계 4를 수행한 후， 시멘트 반웅이 수행된 지지체를 세척하고 건조하거나， 또는 상기 수화겔에 생체기능성 물질이 포함되고 상기 생체기능성 물질이 세포일 경우에는 세척 후에 세포 배양액과 함께 포장하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이때， 상기 세척은 증류수， 식염수， PBS 등을 이용할 수 있다. 나아가， 본 발명에 따른 지지체의 제조방법은 5-40 °C의 온도에서 모든 제조공정이 수행될 수 있다. 즉， 종래에 세라믹의 경화를 위한 고온에서의 열처리 공정이 필요한 것과는 달리 열처리 공정을 수행하지 않는다. 나아가， 소성을 위한 열처리 공정을 사용하지 않음에도 경조직 재생용으로 사용되기에 충분한 기계적 강도를 갖는 지지체를 제조할 수 있다.

또한， 5-40 ^° C의 온도에서 수행하기 때문에 생체기능성 물질을 직접 포함시킨 세라믹 지지체를 바로 제조할 수 있는 장점이 있다. 또한， 본 발명은

상기의 제조방법으로 제조된 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제공한다. 이하， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체에 대하여 상세히 설명한다 . 본 발명에 1다른 코어 -쉘 구조 경조직 재생용 지지체에 있어서， 상기 코어 -쉘은 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 코어 및 상기 코어 표면에 구비되어， 상기 코어를 둘러싸는 수화겔 (Hydrogel)을 포함하는 쉘로 이루어지거나， 수화겔 (Hydrogel)을 포함하는 코어 (Core) 및 상기 코어 표면에 구비되어， 상기 코어를 둘러싸는 인산칼슘계 세라믹을 포함하는 쉘 (Shell)로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 골 성분과 유사한 구성으로 기계적 물성이 높으며 , 3 차원 구조체 전반에 걸쳐 세포 또는 생체기능성 물질이 분포되어 있는 장점이 있다. 이때 , 상기 인산칼슘계 세라믹은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite) , DCPD(Di calcium phosphate dihydrate) , MCPM(Monoca 1 c i urn phosphate monohydr at e ) ,

DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous) , a -TCP( a -Tr i ca 1 c i urn phosphate) 및 β -TCP( β -Tr icalcium phosphate) 둥을 사용할 수 있으나， 경조직 재생용 지지체로 사용되는 생체적합성 세라믹 물질이면 이에 제한되지 않고 사용할 수 있다 . 또한， 상기 수화겔은 알지네이트， 젤라틴 (Gelatin)， 콜라겐 (Collagen)， 파이브리노젠 (fibrinogen)， 키토산 (Chi tosan)， 아가 (Agar), 마트리겔 (Matrigel), 스타치 (Starch), 펙틴 (Pectin), 하이드록시 에틸 셀를로오스 (Hydroxy ethyl cellulose), 폴리비닐 알콜 (Polyvinyl alcohol) , 폴리우레탄 (Polyurethane)， 폴리에틸렌 글라이콜 (Poly(ethylene glycol)) , 폴리프로필렌 글라이콜 (Polypropylene glycol)) , 메틸셀를로오스 (Methyl eel lulose) , 카르복시메틸셀를로오스 (Carboxymethy 1 ce 1 lulose) , 히알루로난 (Hyaluronan)， 폴리비닐피를리돈 (Poly vinylpyrrol idone) )， 블록 공중합체 등을 용매에 흔합하여 —사용할 수 있으나， 이에 제한되지 않는다.

여기서 상기 수화겔에 H ₂ 0, PBS, 또는 각 수화겔을 용해할 수 있고 생체안정성이 확보된 용매를 추가하여 페이스트가 압출 및 성형하기에 적합한 유동성을 가지도록 물성제어가 필요하며， 이를 위하여 용매의 흔합물 100 중량부에 대하여 수화겔은 5-15 중량부가 바람직하며， 만약 상기 수화겔의 농도가 5 중량부보다 낮을 경우， 수화겔을 압출한 후 형상을 유지하지 못하는 문제가 있고， 15 중량부보다 높을 경우， 점도가 높아 압출이 불가능한 문제가 있다.

또한， 수화겔은 그 물성에 따라 물리적 (ionic, stereocomplex, thermal) 및 /또는 화학적 (UV I wet-chemi cal )으로 가교를 유도할 수 있으며 물리적 가교법이 유리하나 이에 제한하지 않는다. 나아가， 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 생체 기능성 물질을 더 포함할 수 있다. 이와 같이， 본 발명에 따른 코어-쉘 경조직 재생용 지지체의 제조방법은 수화겔에 생체기능성 물질、을 직접 포함시킬 수 있는 장점이 있으며 수화겔에 생체기능성 물질을 포함시킴으로써， 3 차원 구조체 내부까지 생체기능성 물질을 균일하게 분포시켜 조직재생을 효율적으로 유도할 수 있는 장점이 있다. 이때， 상기 생체기능성 물질로는 세포， 성장인자， 단백질， 단백질 약물, 항증식제， 항트름빈， 면역억제제， 지질， 항지질， 리포솜， 소염제， 항종양제， 항혈소판제， 혈관신생제， 항혈관신생제， 비타민， 앱타머， 항유사분열제， 메탈로프로티나아제 저해제， N0 공여체， 에스트라디을， 항경화제， 혈관작용제 , 베타 차단제， AZ 차단제， 호르몬， 스타틴， 항산화제， 막 안정화제， 칼슘 길항제， 레티노이드， 펩티드， 지단백질， 폴리펩티드， 폴리뉴클레오티드 인코딩 폴리펩티드， 효소， 유전 물질， 화학 용매， 에너지 -활성화제， 림프구 저해 물질 / 대식세포 저해 물질 및 이들의 흔합물 등을 사용할 수 있다. 여기서， 상기 생체기능성 물질이 세포일 경우 상기 단계 2의 제 2 페이스트는 세포 배양액을 더 포함할 수 있다 .

【발명와 실시를 위한 형태 】

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단， 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지자체의 제조 1

단계 1: β -TCP( β -Tricalcium phosphate) 분말에 에탄올 (Ethanol)을 첨가하여 볼 -밀링 (BaH-mi 11 ing)하여 50 내지 100 ^의 크기인 β— TCP를 제조하였다. 그 후， 상기 볼-밀링된 β-TCP 분말 3 g을 1 %의 하이드록시프로필메틸셀를로오즈 (Hydroxyl propyl methyl cellulose)를 30 ¾의 에탄을에 녹인 용액에 분액비 2:1로 균일하게 흔합하여 제 1 페이스트를 준비하였다. 단계 2: 소듐 알지네이트 (Sodium alginate, 80 - 120 cP) 1.5 g 및 염화칼슘 (CaCl ₂ ) 0.05 g을 20 mL의 증류수에 흔합하여 제 2 페이스트를 준비하였다. 단계 3: 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이중노즐 압출 용기 내부에 넣고， 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노즐 압출 용기 외부에 넣어 자체 제작된 적층조형기의 컴퓨터 프로그램을 통해 지지체 모양과 기공 크기를 제어한 성형체를 제조하였다. 이때， 지지체 코어 직경의 크기는 600 μ m이며， 지지체의 기공 구조는 단순격자 형태이고, 기등간 간격은 2.5 mm로 제어함으로써 기공크기가 _ᅩ 100 내지 700 μηι인 단순 격자 형태의 코어-쉘 구조 경조직 재생용 성형체를 제조하였다. 제조된 성형체는 상온에서 1 일간 건조하였다 단계 4: 상기 단계 3에서 얻은 코어-쉘 구조 경조직 재생용 성형체를 경화액인 0.1 M의 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트 (Monocalcium phosphate monohydrat e)에 침지하여. 세라믹 (β -TCP) 페이스트의 시멘트 반응 및 수화겔 (알지네이트)의 가교를 유도하고， 상기 시멘트 반응을 통해 형성된 브루사이트 (Brushite) 지지체를 증류수로 세척한 다음， 1 일간 상온에서 건조하여 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다.

<실시예 2> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 2

상기 실시예 1의 단계 3에서 이중노즐의 노즐 크기를 조절하여 지지체 코어 직경의 크기를 800 μ m로 조절한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다.

<실시예 3> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 3

상기 실시예 1의 단계 3에서 컴퓨터 프로그램을 조절하여 지지체의 기등간 간격을 3.0 mm로 제어한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 코어 -쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다.

<실시예 4> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 4

상기 실시예 1의 단계 3에서 컴퓨터 프로그램을 조절하여 지그재그 형태로 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다. <실시예 5> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 5

상기 실시예 1의 단계 3에서 제 2 페이스트를 이중노즐 압출 용기 내부에 넣고， 제 1 페이스트를 이중노즐 압출 용기 외부에 넣어 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다.

<실시예 6> α-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 1

실시예 6의 제조과정을 도 10에 나타내었다.

단계 1: a -TCP( β -Tri calcium phosphate) 분말에 에탄올 (Ethanol)을 첨가하여 볼 -밀링 (Bal mi 1 ling)하여 50 내지 100 의 크기인 α-TCP를 제조하였다.

그 후， 상기 볼-밀링된 a -TCP 분말 2 g을 1 %의 하이드록시프로필메틸셀를로오즈 (Hydroxyl propyl methyl cellulose)를 30 %의 에탄을에 녹인 용액에 분액비 2:1로 균일하게 흔합하여 제 1 페이스트를 준비하였다. 단계 2: 소듐 알지네이트 (Sodium alginate, 80 - 120 cP) 12.5 중량 %를 PBS(Phosphate buffered saline)에 첨가하여 흔합하였다. 상기 흔합된 알지네이트 용액에 0.5 중량 %의 CaCl ₂ 를 가한 후 첫번째 가교가 균일하게 반웅이 일어날 수 있도록 37 ^° C에서 10분간 흔합하였다.

이어서 , 상기 흔합물에 세포배양액인 α -MEM( a -Minimum

Essential Medium)을 1 ml첨가하여 균일하게 흔합한 후， 37 ^° C를 유지하며， C57BL16 마우스의 어린 태아의 머리뼈 조직에서 분리한 MC3T3-E1 세포 (lxlOVml)를 알지네이트페이스트에 첨가한 후， 세포가 손상되지 않도록 주의하며 흔합하여 제 2 페이스트를 준비하였다. 단계 3: 상기 단계 1에서 준비된 제 1 페이스트를 이증노즐 압출 용기 내부에 넣고, 상기 단계 2에서 준비된 제 2 페이스트를 이중노줄 압출 용기 외부에 넣어 자쎄 제작된 적층조형기의 컴퓨터 프로그램을 통해 지지체 모양과 기공 크기를 제어한 성형체를 제조하였다. 이때， 지지체 코어 직경은 600 μ m이고 쉘 직경은 1200 μ m이며， 지지체의 기공 구조는 단순격자 형태이고， 기등간 간격은 2.5 麵로 제어함으로써 기공크기가 100 내지 700 μ ηι인 단순 격자 형태의 코어- 쉘 구조 경조직 재생용 성형체를 제조하였다. 단계 4: 상기 단계 3에서 얻은 성형체를 2.5 중량 %의 CaCl ₂ 용액에 2 내지 20분간 침지시켜 가교시키고， 불필요한 CaCl ₂ 를 제거하기 위하여 PBS로 세척하였다. 또한， 세라믹 경화액으로 세포 생존률을 높이기 위해 물 대신

PBS 용액에 상기 성형체를 6시간 침지시켜， _α -TCP를 CDHA로 시멘트반웅을 유도하여 구조를 안정화 하였다. 이때， 상기 PBS 용액에 수화겔의 가교를 보충하기 위하여 0.01 중량 ¾의 CaCl ₂ 를 추가로 첨가하였다.

<실시예 7> α-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 2

상기 실시예 6의 단계 3에서 지지체 코어 직경은 600 이고 ， 쉘 직경을 1200 로 제조한 것을 제외하고는 동일하게 지지체를 제조하였다. .

<실시예 8> a -TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 3

상기 실시예 6의 단계 3에서 지지체 코어 직경은 600 /mi이고 ， 쉘 직경을 1600 로 제조한 것을 제외하고는 동일하게 지지체를 제조하였다.

<실시예 9> α -TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조 4

상기 실시예 6의 단계 3에서 제 2 페이스트를 이중노즐 압출 용기 내부에 넣고， 제 1 페이스트를 이중노즐 압출 용기 외부에 넣어 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조하였다.

<실험예 1> β -TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 관찰

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 표면 형상을 확인하기 위하여， 상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 .코어-쉘 경조직 재생용 지지체를 입체 현미경으로 관찰하였으며， 그 결과를 도 2 내지 4 및 도 6에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체인 실시예 1 및 실시예 2는 각각 상이한 코어의 직경 크기를 보여주는 것을 확인할 수 있다.

또한， 도 3에 나타낸 바와 같이， 상기 실시예 1 및 실시예 3을 비교하면， 기둥간의 간격이 조절될 수 있는 것을 확인할 수 있었고， 도 4에 나타낸 바와 같이， 상기 실시예 1 및 실시예 4를 비교하면， 직사각형의 단순 격자 구조와 지그재그 구조의 상이한 기공구조를 가짐을 알 수 있었다 .

나아가， 도 6에 나타낸 바와 같이， 실시예 1 및 실시예 5에서 세라믹을 코어로하거나， 세라믹을 쉘로 하는 경우 모두 코어-쉘 구조로 제조됨을 확인할 수 있었다. <실험예 2> β-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 X-선 회절 분석

^' 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체에서 β— TCP 페이스트의 시멘트 반응 진행에 따른 상 변화를 관찰하기 위하여 , 상기 실시예 1에서 제조된 코어 -쉘 경조직 재생용 지지체를 X-선 회절 분석법 (X-ray diffraction analysis, XRD)을 사용하여 분석 (36kV, 26mA, 5° /min)하였으며 , 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이， 상기 실시예 1에서 제조된 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조할 때 사용된 β -TCP 페이스트의 시멘트 반웅 경과 시간에 따른 X-선 회절 분석 그래프를 통해 브루사이트가 형성되었음을 확인할 수 있었다. MCPM용액 내 침적 1.5시간 후에 약한 부루사이트 피크가 형성 검출되기 시작하여 3시간 후에는 메인 피크인 (020)면의 피크가 11.6 ^° 에서 강해지기 시작하며 6시간 후에는 11.6 ^° (020)， 20.9 ^° (021)， 29.2 ^° (041)， 30.5° (-221) . 34.1° (-220) 모두가 명확히 검출되었다. 이들 피크는 24시간 침적 후에 더욱 강하게 검출되며， 일부 원료소재인 β-TCP에 해당되는 피크 (27. Γ ， 3Γ ,34.3° )가 검출되나 대부분 시멘트 반웅에 의하여 브루사이트로 치환되었음을 알 수 있다.

<실험예 3> α-TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 입체 현미경 관찰

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 기등 단면을 확인하기 위하여， 상기 실시예 6-8에서 제조된 코어-쉘 경조직 재생용 지지체를 입체 현미경으로 관찰하였으며， 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이， 본 발명에 따른 코어—쉘 구조 경조직 재생용 지지체인 실시예 6-8은 각각 상이한 코어 및 쉘의 직경 크기를 보여주는 것을 확인할 수 있다 따라서 , 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 원하는 직경으로 지지체를 제조할 수 있다.

<실험예 4> 시간 경과에 따른 지지체 내 세포의 생존도 평가 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체 내 세포의 시간에 따른 생존 유무를 확인하기 위하여 상기 실시예 6에서 제조된 코어 -쉘 경조직 재생용 지지체를 제조한 후 1 , 3， 5 시간 경과 후에 입체 현미경으로 상면과 단면을 관찰하였으며， 그 결과를 도 8에 나타내았다. 도 8에 나타난 바와 같이， 상면 관찰에서는 지지체 전체에 세포가 분포되어 있는 것으로 보이나， 기둥 단면 관찰을 통해 세포가 수화겔으로 구성된 쉘 부분에 분포하고 있는 것을 알 수 았었다. 프린팅 1시간 경과 후에는， 죽은 세포 (빨강)를 거의 관찰할 수 없었으며 , 5시간 경과 후에도 약간의 죽은 세포 (빨강)가 관찰되지만 대부분의 세포가 생존 (초록)해 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 세라믹 기반 지지체 제조와 세포프린팅을 함께할 수 있고 지지체 제조 후에도 세포 생존이 확인되므로， 조직재생을 3차원적으로 유도하는 경조직 재생용 지지체의 역할을 크게 향상시킬 수 있다. <실험예 5> α -TCP를 사용한 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 X-선 회절 분석

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체에서 a -TCP 페이스트의 시멘트 반웅 진행에 따른 CDHA ( Ca-de f i c i rnt hydr oxyapat i t er )의 생성을 관찰하기 위하여 , 상기 실시예 6에서 제조된 코어-웰 경조직 재생용 지지체를 X—선 회절 분석법 (X-ray diffraction analysis, XRD)을 사용하여 분석 (36kV, 26mA, 5° /min)하였으며， 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이， 상기 실시예 6에서 제조된 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체를 제조할 때 사용된 a -TCP 페이스트의 시멘트 반웅 결과， CDHA(Calci醒 def icirnt hydroxy apatiter)가 생성되었음을 회절 분석 그래프를 통해 확인할 수 있었다.

구체적으로， 시멘트 반웅 전， α-TCP의 고유 피크인 12.10° .， 22.89 ^° ， 24.10 ^° ， 30.71 ^° 및 34.21 ^° 가 관찰되었으며 , 시멘트 반웅 후, CDHACCalcium def icirnt hydroxy apatiter)의 고유 피크인 25.87 ^° ， 31.71 ^° ， 32.16 ^° 및 32.83° 모두가 명확히 관찰되므로， 대부분의 α-TCP가 CDHA로 시멘트 반웅이 진행되었음을 알 수 있었다. 따라서， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 고온의 열처리 없이 시멘트 반웅으로 세라믹을 경화할 수 있으므로， 경조직 재생용 지지체로 유용할 수 있다.

【산업상 이용가능성 】

본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체의 제조방법은 이중노즐을 가지는 압출 용기를 통해 적층조형법으로 3 차원 구조체를 제조하는 방법으로 코어-쉘 구조의 경조직 재생용 지지체를 제조할 수 있는 효과가 있다. 또한， 상온에서 제조할 수 있기 때문에 세포 또는 각종 생체기능성 물질을 포함시킬 수 있는 효과가 있다. 나아가， 본 발명에 따른 코어-쉘 구조 경조직 재생용 지지체는 골 성분과 유사한 구성으로 기계적 물성이 높으며， 3 차원 구조체 전반에 걸쳐 세포 또는 생체기능성 물질이 균일하게 분포될 수 있으므로， 경조직 재생용 지지체로 유용할 수 있다.