LEE SEUNG HWAN (KR)
SONG BONG KEUN (KR)
CHO KWANG MYUNG (KR)
LEE SEUNG HWAN (KR)
SONG BONG KEUN (KR)
| WO2005047510A1 | 2005-05-26 |
| KR100309327B1 | 2001-09-29 | |||
| US20080124770A1 | 2008-05-29 | |||
| KR20030088749A | 2003-11-20 |
이원희 (KR)
| 1) 미생물의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자를 제거하기 위해 유전자 조작을 수행하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 유전자 조작된 미생물에서 아라비노스 이성화효소를 과발현하기 위한 벡터를 제작하는 단계; 3) 상기 단계 1)의 유전자 조작된 미생물에 단계 2)의 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조방법. |
| 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 타가토오즈를 제외한 당류를 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조방법. |
| 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물은 갈락토오스 및 타가토오즈를 제외한 당류를 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조방법. |
| 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia)속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조방법. |
| 제 1항에 있어서, 단계 1)의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자는 galP 및 mglB 인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조방법. |
| 제 1항의 방법으로 제조된 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물. |
| 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 제 6항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 타가토오즈 제조방법. |
| 제 7항에 있어서, 상기 혼합당은 추가로 포도당, 자일로스, 아라비노스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 타가토오즈 제조방법. |
| 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 혼합당은 해조류 바이오매스 또는 치즈 웨이인 것을 특징으로 하는 타가토오즈 제조방법. |
| 제 6항의 재조합 미생물을 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 배양하여 타가토오즈 제조에 이용하는 용도. |
| 제 10항에 있어서, 상기 혼합당은 추가로 포도당, 자일로스, 아라비노스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도. |
| 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 혼합당은 해조류 바이오매스 또는 치즈 웨이인 것을 특징으로 하는 용도. |
본 발명은 갈락토오스 이용이 억제된 미생물을 이용한 타가토오즈 제조방법에 관한 것이다.
D-타가토오즈는 자연계에는 극미량으로 존재하는 6탄당으로서, 음료, 건강식품, 다이어트 제품 등의 저칼로리 감미료로 사용되고 있다. 갈락토오스와 금속 수산화물을 반응하여, 무기염 촉매 존재하에서 화학적으로 생산하였으나(미국특허 제 5002612호), 복잡한 분리공정이나 부산물들의 생산과 같은 단점들로 인한 문제점이 발생하였다. 생물학적인 방법으로는 Izumori 등( J Ferment Technol 66:225-227, 1988)이 아쓰로바터(Arthrobacter), 마이코박테리움(Mycobacterium), 엔테로박터(Enterobacter)등과 같이 갈락티톨 탈수소효소(galactitol dehydrogenase)를 가지고 있는 미생물을 이용하여 갈락티톨을 산화시켜 타가토오즈를 생산하는 공정을 보고하였다. 그러나 고가의 갈락티톨을 사용하여 경제성이 없는 단점이 있었다. 또 다른 방법으로는 미생물의 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase; AI)를 이용하여 갈락토오스를 타가토오즈로 전환하는 방법이 보고되었다. AI는 미생물 내에서 아라비노스를 프룩토오스로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다(미국특허 제 6057135호, 미국특허 제 2008/0124770호, Kim B-C et al. , FEMS Microbiology Letters 212:121-126, 2002; Lim BC et al. , Biotechnol. Prog. 23:824-828, 2007). 하지만 이 효소의 경우 기질특이성이 높지 않아서 갈락토오스를 기질로 타가토오즈로 전환화는 반응도 촉매하는 것으로 알려져 있다.
미생물 유래의 AI를 이용하여 높은 수율로 갈락토즈를 타가토오즈로 전환하는 공정들이 개발되었지만(대한민국 특허 제 0309327호, 대한민국 특허 제 0464061호), 이 공정의 경우 고정화된 AI나 미생물 생촉매를 제작하는 단계와 생물전환 단계의 2단계 공정이 필요하다. 또한, 생물전환 시에 전구물질로 혼합당을 사용하게 되면, 최종 산물 타가토오즈를 수득하는데 분리/정제공정이 추가되므로, 순수한 갈락토오스를 기질로 사용해야 하는 단점이 있다.
미생물이 갈락토오스와 포도당의 혼합당을 이용할 경우, 상기 갈락토오스의 세포내 유입을 통한 탄소원으로서의 이용은 억제되는 현상(Catabolite Repression)이 있는데, 실제 미생물의 배양과정에서 엄격한 제어가 이뤄지지 않아서 일부 갈락토오스의 이용이 관찰되며, 포도당이 전부 소모된 이후에는 갈락토오스가 주요 탄소원으로 활용되게 된다.
이에 본 발명자들은 미생물의 갈락토오스의 세포내 유입과 관련된 막 단백질인 GalP, MglB를 암호화하는 galP 및 mglB 유전자를 제거하여 갈락토오스 이용능을 억제하고, 갈락토오스를 타가토오즈로 전환하는 아라비노스 이성화효소를 발현하도록 미생물을 형질전환한 후, 상기 형질전환된 미생물이 갈락토오스를 제외한 당류를 탄소원으로 고갈시키며 아라비노스 이성화효소를 발현하고, 상기 효소를 이용하여 타가토오스를 제조하므로, 본 발명의 미생물이 타가토오스 제조에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 타가토오즈 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 타가토오즈 제조에 이용하는 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 유전자 조작을 수행하여 미생물의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자를 제거하는 단계;
2) 상기 유전자 조작된 미생물에 형질도입되어 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase; AI)를 과발현할 수 있는 벡터를 제작하는 단계;
3) 상기 유전자 조작된 미생물에 상기 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 타가토오즈 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 배양하여 타가토오즈 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 제조방법은 별도의 갈락토오스 분리단계 없이, 혼합당을 원료를 하여 타가토오즈를 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 미생물을 이용하여 혼합당에서 타가토오즈를 제조하는 과정을 그린 모식도이다.
본원 발명에서 인용된 문헌은 참조로 인용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 유전자 조작을 수행하여 미생물의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자를 제거하는 단계;
2) 상기 유전자 조작된 미생물에 형질도입되어 아라비노스 이성화효소를 과발현할 수 있는 벡터를 제작하는 단계;
3) 상기 유전자 조작된 미생물에 상기 벡터를 형질도입하는 단계를 포함하는 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자인 galP 와 mglB 가 유전자 조작 방법 중의 하나인 위치 지정 돌연변이(Site directed mutagenesis)에 의해 제거된 돌연변이 대장균을 제조한 후, 갈락토오스가 첨가된 LB 배지에서 배양한 결과, 야생형 대장균에 비해 갈락토오스 사용이 억제된 것을 확인하였다(표 1 참조). 또한, 상기 갈락토오스 이용능이 억제된 대장균에, 갈락토오스를 타가토오즈로 전환하는 역할을 수행하는 AI를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 형질도입하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 형질도입된 대장균을 포도당과 갈락토오스가 첨가된 배지에서 배양한 결과, 타가토오즈가 생성되는 것을 확인하였다(0.9 g/L). 이에, 본 발명의 방법은 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 타가토오즈를 제외한 당류, 더욱 바람직하게는 갈락토오스 및 타가토오즈를 제외한 당류를 탄소원으로 이용할 수 있는 것이면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia)속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물이 포함될 수 있다. 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물이며, 더욱 바람직하게는, 대장균(Escherichia coli) W3110이다.
상기 단계 1)의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자는 대장균의 경우 galP 및 mglB 등이 포함되며, 상기 유전자를 Kirill A 및 Barry LW(PNAS 97:6640-6645, 2000)의 방법으로 조작함으로써 본 발명의 미생물에서 제거될 수 있다.
단계 2)의 아라비노스 이성화효소를 암호화하는 유전자( araA )는 써모토가 마티마( Thermotoga maritima ), 대장균( E. coli ), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브실라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모노나스(Zymononas), 글루코노박터(Gluconobacter), 라이조비움(Rhizobium), 아세토박터(Acetobacter), 로도박터(Rhodobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium) 등의 미생물에서 유래한 것이 사용될 수 있고, 바람직하게는 써모토가 마티마 유래의 유전자이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균의 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자인 galP 와 mglB 가 제거되어, 야생형에 비해 갈락토오스 이용능이 억제된 대장균에(표 1 참조), AI를 발현할 수 있는 재조합 벡터를 형질도입하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 형질도입된 대장균은 포도당과 갈락토오스가 첨가된 배지에서 배양한 결과, 타가토오즈가 생성되는 것을 확인하였다(0.9 g/L). 이에, 본 발명의 재조합 미생물은 갈락토오스 이용이 억제된, 타가토오즈 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 타가토오즈를 제외한 당류, 더욱 바람직하게는 갈락토오스 및 타가토오즈를 제외한 당류를 탄소원으로 이용할 수 있는 것이면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia)속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물이 포함될 수 있다. 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물이며, 더욱 바람직하게는, 대장균(Escherichia coli) W3110이다.
본 발명의 재조합 미생물은, 바람직하게는
(i) 갈락토오스 세포내 유입과 관련된 유전자인 galP 와 mglB 가 제거되었으며,
(ii) 아라비노스 이성화효소(Arabinose isomerase; EC 5.3.1.4)의 유전자( araA )를 대장균에서 인위적으로 발현 조절되는 프로모터에 결합시킨 벡터(pHCE-AraATM)를 지니는 대장균이다.
또한, 본 발명은 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 타가토오즈 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 갈락토오스를 포함하는 혼합당을 포함하는 배지에서 배양하여 타가토오즈 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
상기 혼합당은 추가로 포도당, 자일로스, 아라비노스 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당류를 포함할 수 있고, 구체적인 예로는 해조류 바이오매스, 치즈 웨이 등이 있을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 갈락토오스 이용능이 저하된 재조합 균주의 제작
갈락토오스의 유입에 관련된 galP 와 mglB 를 절단하기 위하여 유전자 조작을 Kirill A 및 Barry LW(PNAS 97:6640-6645, 2000)의 방법으로 수행하였다.
<1-1> galP 차단
pKD4(Kirill A 및 Barry LW, PNAS 97:6640-6645, 2000)를 주형으로 하여, 서열번호 1(5'-GCATGTTATTCGGTGCCGCTGCACACGCTGCTGATACTCGCATTGGTGTAgtgta ggctggagctgcttc-3') 및 서열번호 2(5'-TCGGCCAGGTTTTTCGCCAGATCAAAGGTCGCTTTCGCCTGGTTGTTAGCcatat gaatatcctccttag-3')의 프라이머를 이용하여 하기 조건으로 PCR을 수행하였다: 변성 95℃ 1분, 어닐링 62℃ 2분, 신장 70℃ 2분의 조건으로 30 회 반복.
PCR 산물을 Gel Elution하여 정제한 후, 전기천공법(electroporation)으로 pKD46 플라스미드를 포함한 야생형 대장균 W3110에 형질도입한 후, 100 ㎍/㎖ 가나마이신이 첨가된 LB 아가 배지에 배양함으로써 galP 절단 돌연변이체 W3110 DgalP를 수득하였다.
<1-2> mglB 차단
pKD3(Kirill A 및 Barry LW, PNAS 97:6640-6645, 2000)를 주형으로 하여, 서열번호 3(5'-GCAAGAATGGGTCGTAAGCTCCATGATGTTCGGTGCGGCAGTCGGTGCGGgtgta ggctggagctgcttc-3') 및 서열번호 4(5'-GCAAGAATGGGTCGTAAGCTCCATGATGTTCGGTGCGGCAGTCGGTGCGGgtgta ggctggagctgcttc-3')의 프라이머를 이용하여 하기 조건으로 PCR을 수행하였다: 변성 95℃ 1분, 어닐링 62℃ 2분, 신장 70℃ 2분의 조건으로 30 회 반복.
PCR 산물을 Gel Elution하여 정제한 후, 전기천공법으로 상기 대장균 W3110 DgalP에 형질도입한 후, 100 ㎍/㎖ 가나마이신 및 100 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 첨가된 LB 아가 배지에 배양함으로써 galP mglB 절단 돌연변이체 W3110 DgalP DmglB를 수득하였다.
상기 선별된 균주는 LB 액체 배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
<실시예 2> 미생물의 갈락토오스 이용성 확인
실시예 1에서 제조된 galP mglB 절단 돌연변이체 W3110 DgalP DmglB의 억제된 갈락토오스 이용능을 확인하기 위해, 10 g/L의 갈락토오스가 첨가된 LB 배지에서 37℃, 250 rpm의 조건으로 24시간 배양하였다. 이때, 대조군으로는 대장균 W3110 균주의 배양 결과를 이용하였다.
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 W3110 DgalP DmglB의 갈락토오스 사용이 억제된 것을 확인하였다.
표 1
<실시예 3> 갈락토오스 이용능이 저하되고, 아라비노스 이성질화효소를 발현하는 재조합 균주의 제작
Thermotoga maritima 의 게놈 DNA(NCBI Locus Tag TM_0276)를 주형으로 하여, 서열번호 5(5'-catatgatagatctcaagcagtacga-3') 및 서열번호 6(5'-ggatcctcatcttttcaaaagccccc-3')의 프라이머를 이용하여 하기 조건으로 PCR을 수행하였다: 변성 95℃ 1분, 어닐링 62℃ 2분, 신장 70℃ 2분의 조건으로 30 회 반복.
약 1.5 kbp 크기의 PCR 산물을 Gel Elution하여 정제한 후, 제한효소 Nde I과 BamH I으로 절단하였고, Nde I으로 절단한 pHCE[(주)바이오리더스]에 연결하여, 재조합 발현벡터 pHCE-AraATM을 제조하였다.
상기 재조합 발현벡터 pHCE-AraATM을 전기천공법으로 상기 대장균 W3110 DgalP DmglB에 형질도입한 후, 50 ㎍/L 앰피실린이 첨가된 LB 아가 배지에 배양함으로써 galP mglB 절단 및 아라비노스 이성질화효소를 발현하는 돌연변이체를 수득하였다.
상기 선별된 균주는 LB 액체 배지에서 배양하여 -80℃ 냉동고에 보관하였다.
<실시예 4> 타가토오즈 생산 확인
실시예 3에서 제조된 갈락토오스 이용능이 저하되고, 아라비노스 이성질화효소를 발현하는 재조합 대장균을 LB배지에서 종배양한 후, 2.5 g/L 포도당과 10 g/L 갈락토오스를 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. 24시간 배양 후, 0.1%(v/v)의 MnCl 2 (1mM), 0.1%(v/v)의 CoCl 2 (1mM), 0.1%(v/v)의 클로로포름을 첨가하였고, 온도를 80℃로 상승시켜서 반응하였다. 12시간 동안 반응한 후, 상기 배양액을 HPLC로 분석하였다.
그 결과, 약 0.9 g/L의 타가토오즈가 생성됨을 확인하였다.