【발명의 명칭】

자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포의 항 암제로서의 용도

【기술분야】

본 발명은 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살 해세포의 항암제로서의 용도에 관한 것이다. 【배경기술】

종양 치료를 위해 수술, 방사선 치료， 화학요법 등의 다양한 치료법이 발전 해 왔으나， 종양에 따라서는 빈번한 재발이 심각한 문제가 되고 있다. 이에 따라 환자의 면역기능을 이용한 세포치료의 가능성이 제기되었다. 종양을 제거하는 면역반웅은 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호 작용을 통해 일어난다. 종양세포를 직접 제거하는 면역세포로는 자연살해세포 (natural killer cell , ΝΚ cell)와 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 있으몌 이들 효력세포 (effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세 포로는 수지상세포 (dendritic cellᅳ DC)나 B 세포가 있고, 이 외에 다양한 사이토 카인 (cytokine)을 분비하는 보조 T 세포 (helper T cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell) 등이 함께 작용하게 된다. 상기 면역체계를 구성하는 세포들 중 자연살해세포는 림프구의 일종으로 인 체 내 골수， 비장， 말초 림프절 및 말초 혈액에 분포하며, 말초 혈액의 경우 림프 구의 약 10%가 NK 세포인 것으로 알려져 있다 (Ann Rev Immunol. , 24： 257-286, 2006) . NK 세포는 CD56 및 CD16이 양성이나, CD3에는 음성을 나타낸다. T세포와 는 달리 NK 세포는 이전에 노출되었던 자극이나丽 C에 제한 없이 종양세포 또는 바 이러스에 감염된 세포를 살해하며 세포 클론에 따른 수용체 재배열도 나타나지 않 는다 (Trends Immunol. , 22： 633-640, 2001). NK 세포가 세포를 살해하는 과정은 파포린 (perforin) 및 그랜자임 (granzyme)을 포함하는 세포질 과립의 배출과 FasL 및 TRAIL을 포함하는 과정과 관련되어 있다. NK 세포는 다양한 사이토카인, 특히 IFN-γ , INF- α , GM-CSF 및 IL-10을 분비하고， 세포 표면에 여러 수용체를 발현하 는데 이들 수용체는 세포 흡착， 세포 살해능력의 활성화， 또는 세포 살해능력의 억 제에 관여한다. 또한， NK 세포는 MHC class I 분자를 KIRQdller i瞧 unoglobul in- like receptor)를 통하여 인지하는데， 대다수의 KIR은 세포 살해억제 수용체이고， 이러한 억제 수용체가 MHC 분자로 인지되지 않으면 세포의 살해가 일어나게 된다. 이러한 NK 세포의 살해능은 림포카인 활성세포 (lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구 (tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이 용하여 고형암 치료에 이용하거나， 공여자 임파구 주입 (donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법 (Ti lden. A.B. et al， J. Immunol., 136： 3910-3915, 1986； Bordignon C. et al. , Hematologia, 84： 1110-1149， 1999)을 수행함으로써， 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반웅을 방지하기 위한 새로운 세포치료 요 법으로 웅용이 시도되고 있다. 또한， NK 세포의 분화와 활성의 결함이 유방암 (Konjevic G. et al . , Breast Cancer Res. Treat. , 66： 255-263, 2001), 흑색종암 (Ryuke Y. et al. , Melanoma Res. , 13： 349-356, 2003) , 폐암 (Villegas FR. , et al., Lung Cancer, 35： 23-28, 2002) 둥 다양한 암 질환과 관련되어 있음이 보고되 어 이러한 질환들을 치료하기 위해 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. 그러나, 정상 상태에서 체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 비활성화 상태 (inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용으로 이용하기 위해서 는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에 정상혈액으로부터 또는 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화 시키는 연구가 활발히 진행되고 있다ᅳ

체외에서 NK 세포를 활성화시킴으로써 달성된 NK 세포의 높은 세포독성 (cytotoxicity)은 NK 세포의 면역세포 치료 가능성을 확인시켜 주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포는 다양한 암 종류， 특히 백혈병과 같은 혈액암을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여함으로써 그 치료효과를 확인한 보고 ( Cells Molecules & Disease, 33： 261-266, 2004)가 있다. 그러나， 혈액암이 아닌 고형암에 대해서는 N 세포에 대하여 아직 임상적으로 뚜렷한 치료 효과가 입증되지 않고 있다. ^' 구체 적으로 NK 세포를 종양이 생기기 전부혀 투여하여 종양의 생착을 방해할 수 있다는 보고가 있으나 (Ca cer Immunol. Immunother . , _. 56(11)： 1733-1742, 2007)， 적합한 치료모델이라고 보기 어렵고， 복강으로 ΝΚ 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 동물 실험결과도 있으나， ΝΚ 세포에 의한 효과인지 불분명하다 09reasi Cancer Res. Treat. , 104(3)： 267-275, 2007) . 또한， NK 세포를 항암 면역 세포치료로 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포 확보가 필요하다. 그러나 NK 세포는 혈액 내 림프구의 10 ~ 15%를 차지하고 있고 암 환자에서는 종종 NK 세포의 수， 분화 및 기능이 저하되어있어 사 실상 충분한 세포수의 확보가 어려운 실정이다. 그러므로 NK 세포의 증삭 또는 분 화를 통한 NK 세포의 다량 확보가 절실히 요구되고 있다.

NK 세포는 골수의 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell, HSC)로부터 유래 된다고 알려져 있다. 시험관내 ro)에서는 제대혈로부터 조혈줄기세포를 분 리하여 적당한 사이토카인들을 처리하여 배양함으로서 NK 세포로 분화시키는 방법 들이 보고되었다 (Galy et al. , Immunity 3： 459-473, 1995； Mrozek E, et al . , Blood 87:2632-2640, 1996； Sivori , S. et al. , Eur J Immunol. 33:3439-3447， 2003； B. Grzywacz, et al. , Blood 108: 3824-3833, 2006) . 즉， CD34 ⁺ HSC에 Flt-3L, IL-7, SCF 및 IL-15을 첨가하여 5주 배양 후 CD3XD56+의 NK 세포로 분화 시킬 수 있다. 그러나 이런 분화 방법은 치료에 충분한 양의 세포를 얻기 힘들고 분화하는테 시간과 비용이 많이 요구되는 등의 실제 임상 적용에 대한 어려움이 있 다. 사이토카인 (Cytokine) 수용체의 γ _c 의 발현이 결핍된 쥐에서 B세포와 T세포 는 발견이 되지만 NK 세포는 발견되지 않는 점에서 Y _c 를 지닌 수용체들이 NK 분 화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Singer, B et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 377-381, 1995). 수용체의 y _c 형태는 ILᅳ 2， IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21의 수용체이며， 이 중 IL-2는 성숙된 NK 세포의 증식과 활성화를 증진시키는 기능을 지니고 있음이 보고되고 있다 (Shibuya, A. et al .， Blood 85, 3538-3546, 1995) . IL-2가 결핍된 안간과 마우스에서는 NK 세포의 수가 현저히 감소한다는 보 고가 전해지고 있으나 (DiSanto, J. P. et al .， J. Exp. Med. 171, 1697-1704, 1990) , 한편으로는 IL-2 및 IL-2Ra 결핍은 간접적으로 NK 세포의 수와 활성화에 영 향을 미친다는 연구 결과도 있다. 게다가 IL-2R(IL-2 receptor) 사슬은 IL-15의 수용체를 형성하는데 관여한다고 알려져 ¾다.

IL-15는 NK 세포 분화에 관여하고, 이것은 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인 인터페론 -조절 인자 lGnterferon-regulating factor— 1， IRF-1)이 결핍된 쥐에 서는 NK 세포가 결핍되며 (Kouetsu et al .， Nature 391， 700-703, 1998)， IL-15 또 는 IL-15Ra가 결핍된 쥐에서 NK 세포가 발견되지 않는다는 것에 의해 알게 되었다. 이로써 IL-15는 NK 세포에서 발현되는 IL-15 수용체를 통해서 NK 세포의 성장과 분 화를 직접적으로 증진시킨다는 것이 보고되었다 (MrozekE et al. , Blood 87, 2632- 2640,1996).

IL-21은 활성화된 CD4+T 세포에 의해 분비되는 사이토카인이며 (Nature, 5:688-697， 2005) , IL-21의 수용체 (IL— 21R)는 수지상세포， M 세포， T 세포 및 B 세포와 같은 림프구에서 발현되어 있다 (Rayna Takaki , et al., J. Immonol 175： 2167- 2173, 2005). IL-21은 구조적으로 IL-2 및 IL-15과 매우 유사하며， IL-21R 는 IL-2R, IL-15, IL-7R 및 IL-4R 둥과 사슬을 공유하고 있다 (Asao et al. , J. Immunol, 167： 1-5, 2001). IL-21은 골수로부터의 NK 세포 전구체의 성숙을 유도 하는 것으로 보고되었고 (Parrish-Novak, et al. , Nature, 408： 57-63, 2000) , 특히 세포의 사이토카인 생성능 및 세포사멸능과 같은 효과기 기능 (effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었으며 (M. Strengell, et al. , J Immunol, 170： 5464-5469, 2003； J. Brady, et al .， J Immunol, 172： 2048-2058, 2004) , CD8+T 세포의 효과기 기능도 증가시킴으로써 내재， 적웅면역계의 항암반웅을 촉진 시키는 것으로 보고되었다 (Rayna Takaki , et al. , J Immunol 175： 2167-2173, 2005； A. Moroz, et al. , J Immunol, 173： 900-909, 2004). 또한， 인간의 말초혈 액에서 분리한 NK 세포를 활성화 시키며 (Parrish-Novak, et al . , Nature, 408： 57, 2000) , 제대혈에서 분리한 조혈줄기세포로부터 성숙한 ΝΚ 세포를 유도하는데 증요 한 역할을 하는 것이 보고되었다 (J. Brady, et al. , / Immunol, 172： 2048, 2004) . 한편， 상기와 같은 NK 세포의 암 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 체내 에 존재하는 NK 세포의 수가 많지 않아 이를 암 치료제로 사용하기 위해서는 체내 에서 충분한 효능을 유지할 수 있을 정도의 대량으로 이를 생산하는 기술이 필수적 이다. 러나， NK 세포는 시험관 내에서 대량 증식 및 배양이 제대로 이루어지지 않는다는 문제점이 있으며， 따라서 실제 유용한 수준으로 NK 세포를 증폭 및 배양 하는 기술의 개발이 요구되어 왔으며 이를 위한 많은 연구가 진행되고 있으나， 아 직 임상에 적용가능한 수준에는 미치지 못하고 있다. 이에， 본 발명자들은 보다 효율적이고 경제적으로 NK 세포를 대량생산하는 방법을 개발하던 중， 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포를 제거하여 CD3 음성세포를 수득한 후， 상기 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21 등의 사이토카인을 흔합처리한 후 배양하였을 때， 종래의 자연살해세포 제조방법보다 빠른시간 내에 순도 높은 NK 세 포를 대량생산할 수 있고， 상기 방법으로 제조된 NK 세포가 대장암, 폐암， 간암 및 췌장암 세포주를 이종이식한마우스 모델에서 암 세포의 성장을 억제하고， 암 세포 무게를 감소시키며， 백혈병과 같은 혈액암 내에서도 이의 치료효과를 나타내는 것 을 확인함으로써， 본 발명의 대량생산 방법으로 생산돤 NK 세포가 암 예방 및 치료 용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한， 상기 방법으로 생산된 NK세포를 이용하여 실제 암환자를 치료하기 위한 NK세포의 투여량, 투여방법 , 투 여 스케줄 등의 치료방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

[발명의 상세한 설명]

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포를 이용한 암 환자의 치료방밥을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 자연살해 세포 (natural ki l ler cel l ; NK cel l )의 대량생산 방법을 제공한다:

1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포를 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단 계; 및

2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 사이토카인을 처리한 후 배양하는 단계.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포 (natural ki l ler cel l ; NK cel l )를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공 한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 주사제를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포의 약학적으로 유 효한 양을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 및 치료 방법을 제 공한다.

아울러， 본 발명은 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다. 이하， 본 발명을 상세하 설명한다. 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 자연살해세포 (natural ki l ler cel l ; NK cel l )의 대량생산 방법올 제공한다:

1) 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포를 제거하여 CD3 음성세포를 수득하는 단 계; 및

2) 단계 1)의 CD3 음성세포에 사이토카인을 처리한 후 배양하는 단계.

상기 방법에 있어서， 단계 1)의 단핵구는 제대혈， 골수 또는 말초혈액으로 부터 유래한 것이 바람직하나， CD3 음성세포라면 어떤 종류의 세포라도 전구체로 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서， 단계 1)의 CD3 음성세포의 제조는 CD3 마이크로비드로 CD3 양성 세포에 자성을 띄게 한 후 MACS 컬럼에 통과시켜 CD3 음성세포를 분리하 는 방법， 또는 CD3 음성 T 세포를 형광 표지시킨 후 세포분별장치 (Cel l sorter) 등 의 세포분리기를 이용하여 CD3 음성세포를 분리하는 방밥을 이용하는 것이 바람직 하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서， 단계 2)의 사이토카인은 IL-2, IL-15 및 IL-21로 구성 된 군으로부터 선택된 둘 이상을 흔합처리하는 것이 바람직하고， IL-15 및 IL-21를 함깨 흔합처리하거나 IL-2 , IL-15 및 IL-21를 함께 흔합 처리하는 것이 더욱 바람 직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서， 단계 2)의 사이토카인은 인터루킨 ( inter leukin) 류에 서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고， 상기 인터루킨은 림프구, 단핵구 및 대식 세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용가능한 인터루킨으로는 IL-2 , IL-12, IL-15ᅳ IL-18 및 IL-21로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 더욱 바람직하며， 본 발명의 실시예에 의하 면 IL-15 및 IL-21을 함께 흔합처리하는 것이 가장 바람직하나, NK 세포로의 분화 를 촉진한다고 알려진 모든 공지된 물질을사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 배양은 정치배양 (stat ionary cul ture) 또는 부유배양 (suspension cul ture) 방법을 사용할 수 있고， 정치배양은 배양기에 교반 (agi tat ing) 또는 진탕 (shaking)없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며， 부 유배양은 통기 (aerat ion)나 교반 등을 통해 세포들이 반웅기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다. 또한， 정치배양을 위한 반웅기와 부유배양을 위한 반웅기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있 다. 예를 들어， 정치배양을 위한 반웅기와 부유배양을 위한 반웅기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반웅기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양 성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가 능하며 , 상이한 종류의 배양기를 사용하는 경우에는-정치배양이 완료된 후에 배양 물을 부유배양을 위한 반웅기로 옮겨 부유배양 할 수 있다.

배양시 세포의 수는 1 X 10 ⁶ cel l/ii 의 농도로 유지하여 배양하는 것이 바 람직하나， 세포의 모양 및 활성에 이상을 나타내지 않는 한 통상의 당업자가 임의 로 조절할 수 있으며， 배양기간은 10 내지 24일 동안 배양하는 것을 특징으로 하나 배양된 세포가 CD3XD56 ⁺ 의 특징을 나타내는 것을 확인함으로써 배양기간을 결정할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포 (natural killer cell; K cell)를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공 한다.

5 상기 자연살해세포는 제대혈， 골수 또는 말초혈액 단핵구로부터 유래한 것 이 바람직하나， CD3 음성세포라면 어떤 종류의 세포라도 전구체로 사용할 수 있다. 상기 자연살해세포는 프레쉬， 4°C 보관， 또는 넁동된 것을 모두 사용할 수 있으며， 프레쉬는 제조한 뒤 바로 사용하는 것을 특징으로 하고, 4°C 보관은 프레 쉬한 자연살해세포를 4 ^° C에서 12시간 보관한 것을 특징으로 하며， 냉동된 것은 프 10 레쉬한 자연살해세포를 넁동시켜 보관한 뒤 사용하는 것을 나타낸다.

상기 암은 위암， 간암, 폐암， 대장암， 유방암， 전립선암， 난소암, 췌장암， 자궁경부암, 갑상선암， 후두암， 백혈병， 뇌종양， 신경모세포종， 망막모세포종， 두 경부암， 침샘암， 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하 나 본 발명의 실시예에 의하면 대장암， 폐암， 간암， 췌장암 및 백혈병으로 구성된 15 _. 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하다.

또한， 상기 조성물은 생 세포 (live cell), 넁동된 세포， 또는 생 세포 및 넁동된 세포를 흔합하여 사용할 수 있다.

상기 조성물은 1X10 ⁴ 내지 5X10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 바람직하나, 5X10 ⁵ 내지 3X10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하고， 6 x 10 ⁶ 내지

포를 투여할 경우 약리학적 효과가 나타나지 않을 수 있고， 5X10 ⁸ 개 초과의 NK 세 포를 투여할 경우 과다하게 처리되어 이식 후 부작용이 심하게 나타나거나 활성을 나타내지 못한 채 버려지는 NK 세포가 증가함에 따라 비용이 상승하는 문제가 발생 할 수 있다. 상기 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도, 약물 형태， 투여 25 경로 및 기간에 따라 달라질 수 있고 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 상기 조성물은 주 1회. 또는 주 2회로 4주 동안 투여되는 것을 특징으로 하 고， 생 세포 및 넁동된 세포를 흔합하여 사용하는 경우 생 세포를 1회 투여한 뒤， 냉동된 세포를 3회 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있는데， 경구 직장， 정맥， 근육， 피하， 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 ( intracerebroventr icular)로 주사 또는 카테터를 이용하여 투 여될 수 있다.

또한， 본 발명은 본 발명의 NK 세포와 공지되어 있는 항암물질을 병용처리 할 수 있으며， 이때 함께 처리되는 항암물질은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 제대혈로부터 M 세포의 효 율적 생산방법을 결정하고자 제대할유래의 자연살해세포를 제조하였고 (도 1 참조)， 상기 제조된 자연살해세포의 체내 분포도를 확인 한 결과， 측정 시작부터 복부를 중심으로 자연살해세포가 분포되어 있고， 주요 장기들인 간， 비장, 신장， 심장 및 폐를 적출하여 자연살해세포의 분포도를 확인한 결과， 간， 비장 및 폐에 자연살해 세포가 높게 분포되어 있음을 확인하였다 (도 2 참조) .

또한， 본 발명자돌은 본 발명의 자연살해세포가 효능을 나타내는 최적의 세 포 투여량 및 부작용을 최소화하는 투여량을 결정， 및 이로 인한 항암활성을 확인 하기 위하여 대장암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 자연살해세포를 미정맥 투 여한 결과， 농도의존적으로 종양 성장 억제 및 종양 무게 감소 효과가 있음을 확인 하였고, 본 발명의 NK 세포를 사이토카인과 병행하였을 시 추가적 효능을 확인하기 위하여 이를 확인한 결과， IL-2를 병용처리하였을 때도 농도의존적으로 대장암에 대한 항암활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3 참조) .

또한, 본 발명자들은 본 발명의 자연살해세포의 독성을 확인하기 위해 마우 스의 체중변화 및 일반 증상을 관찰한 결과， 자연살해세포 단독 또는 IL-2와 병용 투여시 일반 증상 및 체중 감소와 같은 독성을 나타내자 않음을 확인하였다.

또한， 본 발명자들은 NK 세포의 최적 투여 수 및 투여 간격을 결정하기 위 해， 본 발명의 자연살해세포의 배양， 보관조건， 투여 스케줄에 따른 항암활성을 확 인하기 위해 대장암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 자연살해세포를 투여한 결 과， 프레쉬 (fresh) 자연살해세포의 경우 주 1회씩 4주 또는 주 2회씩 2주 동안 투 여하였을 때 유의적인 항암활성을 나타내었고， 4 ^° C 보관한 자연살해세포의 경우 주 2회씩 2주 동안 투여하였을 때 유의적인 항암활성을 나타냄을 확인하였다 (도 4 참 조 )·

또한， 본 발명자들은 NK 세포의 보관방법 및 냉장 보관 후 환자 상태에 다 른 반복 투여 가능성, 및 이로 인한 항암활성을 확인하기 위하여 대장암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 자연살해세포를 투여한 결과， 생 세포 (live cell)의 경 우 주 1회씩 4희， 냉동된 세포 (frozen cell)의 경우 주 2회씩 4희, 또는 생 세포를 주 1회씩 1회 및 넁동된 세포를 주 1회씩 3회 혼합하여 투여하였을 경우 유의적인 항암 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 5 참조).

또한， 본 발명자들은 본 발명의 자연살해세포의 폐암에 대한 항암 활성을 확인하기 위해 폐암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 자연살해세포를 투여한 결 과， 1X10 ⁷ 세포수로 투여하였을 경우 유의적인 항암 활성을 나타내고， 투여한 자 연살해세포가종양 부위로 침윤하는 것을 확인하였다 (도 6 참조).

또한， 본 발명자들은 본 발명의 자연살해세포의 폐암， 간암 및 췌장암에 대 한 항암 활성을 확인하기 위해， 폐암， 간암 및 췌장암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에 자연살해세포를 투여한 결과， 6X10 ⁶ 세포수로 투여하였올 경우 유의적인 항암 활성을 나타냄을 확인하였다 (도 7 참조).

또한， 본 발명자들은 본 발명의 자연살해세포를 조혈모세포이식 (hematopoietic cell transplantation, HCT) 후의 백혈병 환자에게 중심정맥 카테 터 (central nenous catheter)를 이용하여 투여한 결과, 심각한 부작용 없이 환자의 생존율이 증가함을 확인하였다.

따라서， 본 발명의 자연살해세포는 대장암， 폐암, 간암， 췌장암 및 백혈병 에 대해 유의적인 항암 활성을 나타냄으로써 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추 가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학 적으로 허용 가능한 담체는 식염수， 멸균수， 링거액， 완층 식염수, 덱스트로즈 용 액， 말토 덱스트린 용액， 글리세롤， 쎄탄올， 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상 을 흔합하여 사용할 수 밌으며 , 필요에 따라 항산화제 , 완충액， 정균제 둥 다른 통 상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한， 희석제， 분산제， 계면활성제， 결합제 및 윤 활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약， 캡슐， 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며， 표적 기관에 톡이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington' s Pharmaceut ical Science (최근판)， Mack Publ i shing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하 게 제제화할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 주사제를 제공한다.

상기 암은 위암， 간암, 폐암， 대장암, 유방암， 전립선암, 난소암， 췌장암， 자궁경부암， 갑상선암， 후두암， 백혈병, 뇌종양， 신경모세포종， 망막모세포종， 두 경부암， 침셈암， 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하 나， 본 발명의 실시예에 의하면 대장암， 폐암, 간암， 췌장암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하다.

상기 조성물은 1 X 10 ⁴ 내지 5 X 10 ⁸ 개의 NK세포를 포함하는 것이 바람직하나， 5 X 10 ⁵ 내지 3 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하고， 6 x 10 ⁶ 내지 1 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 가장 바람직하다. 1 X 10 ⁴ 개 미만의 NK 세 포를 투여할 경우 약리학적 효과가 나타나지 않을 수 있고， 5 X 10 ⁸ 개 초과의 NK 세 포를 투여할 경우 과다하게 처리되어 이식 후 부작용이 심하게 나타나거나 활성을 나타내지 못한 채 버려지는 NK 세포가 증가함에 따라 비용이 상승하는 문제가 발생 할 수 있다. 상기 투여량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도, 약물 형태 투여 경로 및 기간에 따라 달라질 수 있고 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다.

상기 조성물은 주 1회 또는 주 2회로 4주 동안 투여되는 것을 특징으로 하 고， 생 세포 및 넁동된 세포를 혼합하여 사용하는 경우 생 세포를 1회 투여한 뒤， 넁동된 세포를 3회 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있는데， 경구， 직장， 정맥， 근육， 피하， 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내( intracerebroventr icular)로 주사를 이용하여 투여될 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 NK 세포와 공지되어 있는 항암물질을 병용처리 할 수 있으며, 이때 함께 처리되는 항암물질은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 단핵구로부터 자연살해세포 를 제조하였고， 상기 제조된 자연살해세포가 대장암， 폐암， 간암， 췌장암 및 백혈 병에 대해 유의적인 항암 활성을 나타냄으로써 암 예방 및 치료용 주사제로 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 주사제는 적절한 처방으로 제조될 수 있으며， 주사제 처방의 유 통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용가능한 산수용액 또는 인 산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.

보다 구체적으로， 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용 수에 용해시킨 후， 멸균처리， 특히 고은감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처 리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액， 예를 들어 pH3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨 (Na¾P0 ₄ )-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고， 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.

또한， 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파아트 (sodium pyrosul f i te) , 중아황산나트륨 (NaHS0 ₃ )， 메타증아황산나트륨 (Na ₂ S2() ₃ ) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacet ic acid)을 포함하고， 용해 보조제 는 수산화나트륨 (NaOH)， 탄산수소나트륨 (NaHC0 ₃ ) , 탄산나트륨 (NaC0 ₃ ) 또는 수산화 칼륨 (K0H)과 같은 염기， 또는 염산 (HC1 ) 또는 아세트산 (CH ₃ C00H)과 같은 산을 포함 한다.

본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성， 생체적합성으로 제형화 될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서， 분산된 주사제의 분해 또 ¾ 분해 없이， 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수 분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미 한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임올 의미한다.

본 발명에 따론 주사제는 통상의 충진제, 중량제， 결합제， 습윤제， 계면활 성제 등의 회석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포의 약학적으로 유 효한 양을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 및 치료 방법을 제 공한다. 상기 자연살해세포의 약학적으로 유효한 양은 I X 10 ⁴ 내지 5 X 10 ⁸ 개의 NK 세 포를 포함하는 것이 바람직하나， 5 X 10 ⁵ 내지 3 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하고, 6 X 10 ⁶ 내지 1 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 가장 바람 직하다. 1 X 10 ⁴ 개 미만의 NK 세포를 투여할 경우 약뫼학적 효과가 나타나지 않을 수 있고， 5 X 10 ⁸ 개 초과의 NK 세포를 투여할 경우 과다하게 처리되어 이식 후 부작 용이 심하게 나타나거나 활성을 나타내지 못한 채 버려지는 NK 세포가 증가함에 따 라 비용이 상승하는 문제가 발생할 수 있다. 또한， 상기 투여는 주 1회 또는 주 2 회로 4주 동안, 정맥주사 또는 중심정맥 카테터로 투여될 수 있으나， 상기 투여량 및 투여방법은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물 형태， 투여 경로 및 기간 에 따라 달라질 수 있고 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다.

상기 암은 위암， 간암, 폐암， 대장암， 유방암, 전립선암， 난소암， 췌장암， 자궁경부암， 갑상선암， 후두암， 백혈병， 뇌종양， 신경모세포종， 망막모세포종， 두 경부암， 침샘암， 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하 나， 본 발명의 실시예에 의하면 대장암， 폐암， 간암， 췌장암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들^ 단핵구로부터 자연살해세포 를 제조하였고, 상기 제조된 자연살해세포가 대장암, 폐암， 간암， 췌장암 및 백혈 병에 대해 유의적인 항암 활성을 나타냄으로써 암 예방 및 치료방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 아울러， 본 발명은 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.

상기 자연살해세포의 약학적으로 유효한 양은 1 X 10 ⁴ 내지 5 X 10 ⁸ 개의 NK 세 포를 포함하는 것이 바람직하나， 5 X 10 ⁵ 내지 3 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 더욱 바람직하고， 6 X 10 ⁶ 내지 1 X 10 ⁸ 개의 NK 세포를 포함하는 것이 가장 바람 직하다. 1 X 10 ⁴ 개 미만의 NK 세포를 투여할 경우 약리학적 효과가 나타나지 않을 수 있고， 5X 10 ⁸ 개 초과의 NK 세포를 투여할 경우 과다하게 처리되어 이식 후 부작 용이 심하게 나타나거나 활성을 나타내지 못한 채 버려지는 NK 세포가 증가함에 따 라 비용이 상승하는 문제가 발생할 수 있다. 또한， 상기 투여는 주 1회 또는 주 2 회로 4주 동안, 정맥주사 또는 중심정맥 카테터로 투여될 수 있으나, 상기 투여량 및 투여방법은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도， 약물 형태， 투여 경로 및 기간 에 따라 달라질 수 있고 이는 당업자에 의해 선택될 수 있다.

상기 암은 위암， 간암， 폐암， 대장암， 유방암， 전립선암， 난소암， 췌장암， 자궁경부암， 갑상선암, 후두암， 백혈병， 뇌종양， 신경모세포종， 망막모세포종, 두 경부암， 침샘암, 림프종으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하 나， 본 발명의 실시예에 의하면 대장암， 폐암， 간암， 췌장암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 단핵구로부터 자연살해세포 를 제조하였고， 상기 제조된 자연살해세포가 대장암， 폐암， 간암, 췌장암 및 백혈 병에 대해 유의적인 항암 활성을 나타냄으로써 암 예방 및 치료방법으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

【유리한 효과】

본 발명의 방법인 단핵구로부터 CD3 양성인 T세포를 제거하여 CD3 음성세포 를 수득한 후， 상기 CD3 음성세포에 IL-15 및 IL-21 등의 사이토카인을 흔합처리한 후 배양하였을 때， 종래의 자연살해세포 제조방법보다 빠른시간 내에 순도 높은 服 세포를 대량생산할 수 있고， 상기 방법으로 제조된 NK.세포가 대장암， 폐암， 간암 및 췌장암 세포주를 이종이식한 마우스 모델에서 암 세포의 성장을 억제하고， 암 세포 무게를 감소시키며， 백혈병과 같은 혈액암 내에서도 이의 치료효과를 나타내 는 것을확인함으로써， 본 발명의 대량생산 방법으로 생산된 NK 세포가 암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한， 상기 방법으로 생산 된 NK 세포를 이용하여 실제 암환자를 치료하기 위한 NK 세포의 투여량， 투여방법， 투여 스케줄 등의 치료방밥을 확립하였다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 배양 후 11일 내지 21일 사이에 제대혈에서 분리된 CD3 음성세포로 부터 NK 세포로 분화가 유도된 것을 FACS로 확인한 도이다.

도 2a는 자연살해세포 (natural killer cell; NK cell)에 대한 농도별 검출 한계 측정올 위해 마우스 체내에서 자연살해세포의 검출을 확인한 도이다:

V.C(5% HAS): 용매대조군.

도 2b는 자연살해세포에 대한 농도별 검출한계 측정을 위해 마우스의 복부 내 주요 장기들을 적출하여 자연살해.세포의 검출을 확인한 도이다:

V.C(5 HAS): 용매대조군.

도 2c는 자연살해세포의 조직 내 분포를 확인하가위하여 마우스의 복부 내 주요 장기들을 적출하여 자연살해세포의 분포를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군.

도 2d는 시간에 따른 자연살해세포의 마우스 체내 분포를 확인한 도이다. 도 3a는 자연살해세포 투여에 따른 대장암에 대한 항암 효과를 확인하기 위 한 투여 스케졸을 나타내는 도^ᅵ다.

도 3b는 자연살해세포 단독 또는 IL-2와 병용처리시， 자연살해세포 수에 따 른 대장암에 대한 종양 크기 억제 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군， 및

ADR: 아드리아마이신 (adriamycin) 처리군.

도 3c는 자연살해세포 단독 또는 ILᅳ 2와 병용처리시， 자연살해세포 수에 따 른 대장암에 대한 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군， 및

ADR: 아드리아마이신 처리군.

5 도 4a는 자연살해세포의 배양， 보관조건， 투여 스케줄에 따른 항암 효과를 확인하기 위한 투여 스케줄을 나타내는 도이다.

도 4b는 자연살해세포의 배양， 보관조건， 투여 스케줄에 따른 대장암에 대 한 종양 크기 억제 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군，

10 NK-F: 프레쉬 (fresh) NK 세포 처리군，

NK-W/oR-F: 프레쉬 服 세포 (Rosettesep 없음) 처리군,

NK-4°C: 4 ^° C 보관된 NK 세포 처리군，

N -W/oR-4°C： 4 ^° C 보관된 NK 세포 (Rosettesep 없음) 처리군， 및 ADR: 아드리아마이신 처리군.

15 도 4c는 자연살해세포의 배양， 보관조건， 투여 스케줄에 따른 대장암에 대 한 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군，

NK-F: 프레쉬 (fresh) NK 세포 처리군，

N -W/oR,F: 프레쉬 M 세포 (Rosettesep 없음) 처리군，

-20- 概- ^ᅮ 보관-: 4— ᅳ보—관 NK 제 ：튁ᅳ^，

NK-W/oR,4°C보관: 4°C 보관된 NK 세포 (Rosettesep 없음) 처리군， 및

ADR: 아드리아마이신 처리군. 도 5a는 자연살해세포의 넁동 여부에 따른 항암 효과를 확인하기 위한 투여 25 스케줄을 나타내는 도이다. 도 5b는 자연살해세포의 냉동 여부에 따론 대장암에 대한 종양 크기 억제 효과를 확인한 도이다: .

V.C: 용매대조군，

NK cells-Live(4): 생 NK세포주를 4회 투여한 투여군,

NK cells-Live(l)+(3)Frozen: 생 NK 세포주를 1회 및 넁동된 세포주를 3회 흔합 투여한 투여군，

V.0(Serum free media): 무혈청 배지 대조군,

NK cells-Frozen(4): 넁동된 NK세포주를 4회 투여한 투여군,

NK cells-Frozen(8): 냉동된 NK세포주를 8회 투여한 투여군， 및

ADR: 아드리아마이신 처리군.

도 5c는 자연살해세포의 넁동 여부에 따른 대장암에 대한 종양 무게 _. 감소 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군,

NK cells-Live(4): ^' 생 NK세포주를 4회 투여한 투여군,

NK cells-Live(l)+(3)Frozen: 생 NK 세포주를 1회 및 냉동된 세포주를 3회 혼합 투여한 투여군，

V.OCSerum free media): 무혈청 배지 대조군，

NK cells-Frozen(4): 넁동된 服 세포주를 4회 투여한 투여군,

NK cells-Frozen(8): 넁동된 NK세포주를 8회 투여한 투여군， 및

ADR 아드―라아뱌어ᅳ선ᅳ처—리 . 도 6a는 자연살해세포의 세포 수에 따른 폐암에 대한 항암 효과를 확인하기 위한 투여 스케줄을 나타내는 도이다.

도 6b는 자연살해세포의 세포 수에 따른 폐암에 대한 종양 크기 억제 효과 를 확인한 도이다: V.C: 용매대조군， 및

Dox.hcl: 독소루비신. HCL

도 6c는 자연살해세포의 세포 수에 따른 폐암에 대한 종양 무게 감소 효과 를 확인한.도이다:

5 V.C: 용매대조군， 및

Dox.hcl: 독소루비신. HC1.

도 6d는 자연살해세포가 종양 부위로 침윤하는 것올 확인하기 위해 H-E 염 색을 수행한 도이다:

V.0: 무혈청 배지 대조군，

10 화살표: 죽은 암세포, 및

CA: 암 세포.

도 6e는 자연살해세포가 종양 부위로 침윤하는 것을 확인하기 위해 CD56을 확인한 도이다:

V.0: 무혈청 배지 대조군，

15 화살표: CD56 양성세포, 및

CA: 암 세포. 도 7a는 자연살해세포의 폐암, 간암 및 췌장암에 대한 항암 효과를 확인하 기 위한 투여 스케즐을 나타내는 도이다:

-2Θ-

PBL NK 세포: 말초혈액 유래 NK 세포.

도 7b는 자연살해세포의 폐암 (A549), 간암 (SNU-709) 및 췌장암 (MIA-PaCa-2) 에 대한 종양 크기 억제 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군，

25 CB NK 세포: 제대혈 유래 NK 세포， 및 PBL NK 세포: 말초혈액 유래 NK세포.

도 7c는 자연살해세포의 폐암 (A549) , 간암 (SNU-709) 및 췌장암 (MIA-PaCa-2) 에 대한 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다:

V.C: 용매대조군，

CB N 세포: 제대혈 유래 NK 세포， 및

PBL NK 세포: 말초혈액 유래 NK 세포.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용 이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> K세포의 제조

병원으로부터 연구용으로 제공받은 제대혈 (건양대학병원 산부인과 및 층남 대학병원 산부인과로부터 제공받음， 각 병원 및 한국생명공학연구원 IRB 심사통과) 을 RPMI 1640을 이용하여 2: 1로 희석하여 준비한 다음， Ficol l-Paque 상층부에서 상기 준비된 제대혈을 조심스레 놓은 후， 20, 000 rpm으로 30분간 원심분리하여 단 핵구 세포층 (mononulear cel l layer , MNC layer )을 얻었다. 상기 단핵구 세포층으 로부터 조심스럽게 취한 세포에서 적혈구를 제거하여 단핵구를 수득하였다. 상기 수득한 단핵구에 CD3 마이크로비드 (microbeads) (Mi l tenyi Biotech)를 첨가하여 표 지한 후， 이를 CS 컬럼 (column) 및 Vario MACS를 이용하여 CD3 양성세포를 제거하 고 CD3 음성세포를 수득하였다. 이는 구체적으로 CD3 마이크로비드 (Mi l tenyi Biotech)가 CD3 ε 사슬 (chain)을 인식하여 단핵구로부터 CD3 양성인 세포를 포착 하여 자성을 가지게 한 후， 단핵구중 상기 마이크로비드가 부착된 CD3 양성세포를 자석과 반웅하는 MACS 컬럼을 통과시킴으로써 CD3 양성세포는 컬럼에 남아있고 CD3 음성세포만 컬럼을 빠져나와 분리하였다. 상기 분리된 CD3 음성세포를 12-웰 플레 이트 (12-well plate, Falcon, 미국)에 lxiO ⁶ cells/ 의 농도로 접종하여 MyelocultCStem cell Technology) 완전 배지에 IL-15 및 IL-21을 함께 처리하여 37 ^° C, 5% C0 ₂ 의 조건에서 21일 동안 배양하였다. 배양하는 동안 세포의 농도가 1 5 X10 ⁶ cells/ 을 넘게되면 초기 사용한 조건의 배지를 사용하여 세포를 나누어 주 었다. 4, 8， 14, 18 및 21일에 각각 세포 수를 확인하였고， 4， 8， 14 및 21일 순 으로 CD3 및 CD56 항체로 염색하여 CD3XD56 ⁺ 인 NK 세포군의 비율을 공지된 방법으 로 FACS 분석하였다.

그 결과， 도 1에 나타난 바와 같이 배양 후 11일 내지 21일 사이에 제대혈 10 에서 분리된 CD3 음성세포로부터 NK 세포로 분화가 유도되었음을 확인하였다.

<실시예 2> K세포의 마우스에서 체내 분포도 확인

상기 <실시예 1>에서 제조된 NK 세포의 조직 내 분포도를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

15 우선, NK 세포의 분포도 확인을 위해 NK 세포에 DiR을 표지하였는데， 이는

3.5 μg/mi^\ DiR(l, l'-dioctadecyl-3,3,3' ,3'-tetramethyl indotricarbocyanine, Sigma, 미국) 염료와 0.5%에탄올이 포함된 ixPBSC hosphate buffered saline) 10 ^에 세포 1X10 ⁷ 개를 부유하고， 37°C에서 1시간 동안 반웅시킨 뒤， 반웅이 끝난 세포는 1XPBS로 2번 세척하고， 트립판 블루 (tryphan blue)로 세포를 염색하여 NK

'2 & 세 ^ᅭ 포ᅳ의ᅳ체대 분포도를ᅳ확―인하ᅳ였ᅳ다 .

상기 DiR로 표지된 NK 세포의 시간별, 날짜별 조직 내 분포도 확인을 위하 여 BALB/C 암컷 누드 마우스의 정맥에 5% HSA 또는 DiR이 표지된 NK 세포를 각각 1 X10 ³ , IX 10 ⁴ ， 5 10 ⁴ , 1X 10 ⁵ , 5 10 ⁵ , 1X 10 ⁶ 및 5X10 ⁶ eel Is의 농도가 되도록 주사하고 일정 시간 후 제조사의 프로토콜에 따라 라이브 애니멀 이미징 시스템

25 (live animal imaging system, PH0T0NE IMAGER, Biospace)을 이용하여 마우스 전체 또는 부검을 통해 적출한 주요 장기들 (간， 비장， 폐， 심장, 신장)에서 NK 세포의 분포도를 확인하였다.

DiR 표지된 NK 세포에 대한 농도별 검출 한계 측정을 위해 DiR 표지된 NK 세포 주입 24시간 후 마우스 체내에서의 분포도를 확인한 결과， 도 2A에 나타난 바 와 같이 5 X 10 ⁴ cel l s이하의 농도군에서는 DiR 표지된 NK 세포의 분포 형태가 뚜렷 하게 나타나지 않았으며, 1 X 10 ⁵ cel ls 이상의 농도군에서는 마우스 복부를 중심으 로 영상신호 정도가 농도 의존적으로 강하게 검출되었다 (도 2A) . 또한， 복부 내 주요 장기들 (간， 비장， 신장， 심장, 폐)을 적출하여 영상을 측정한 결과 5 X 10 ⁴ cel ls 이하의 농도 군에서는 폐에서만 DiR 표지된 NK 세포의 약한 분포가 확인되었 으나， I X 10 ⁵ cel l s 이상의 농도 군에서는 간, 비장， 폐에서 영상신호 정도가 농도 의존적으로 강하게 검출되었다 (도 2B) .

다음으로， DiR 표지된 NK 세포의 조직 내 분포도를 확인하기 위하여 ΓΧ 10 ⁷ eel Is을 정맥으로 투여한 뒤 30분 및 2시간 후에 이를 측정한 결과， 도 2C에 나타 난 바와 같이， 측정 시작부터 복부를 중심으로 DiR 표지된 NK 세포의 분포가 강하 게 검출되었으며， 30분 및 2시간 후에는 용매 대조군과 비교하여 각각 4 배 및 3.8 배 높은 영상신호가 측정되었다. 또한， 복부를 중심으로 하는 주요 장기들인 간， 비장， 신장， 심장 및 폐를 적출하여 영상을 측정한 결과 간， 비장 및 폐에서 DiR 표지된 NK 세포의 분포가 강하게 검출되었다 (도 2C) . 특히 간에서는 30분 및 2시 간째에 용매 대조군과 비교하여 각각 9.5배 및 5.1배 정도 높게 영상신호가 측정되 었다.

이후， DiR 표지된 NK 세포의 정맥투여 1일 후부터 DiR 표지된 NK 세포가 검 출되지 않을 때까지 1주에 3회 측정한 결과， 도 2D에 나타난 바와 같이 투여 후 14 일까지는 DiR 표지된 NK 세포가 강하게 검출되었고， 그 이후부터는 영상 신호 정도 가 약해지기 시작해서 42일째 측정한 영상에서는 DiR 표지된 NK 세포가 검출되지 않았다 (도 2D) . 상기 결과는 본 발명의 체내로 투여된 NK 세포가 생체 내에서 적 어도 30일까지 생존하며， 폐, 간, 비장 둥에 많이 분포하는 것을 나타낸다.

<실험예 1> NK세포의 투여에 따른 대장암에 대한항암효과 확인

<1-1> NK세포의 투여 수， IL-2병용에 따른 종양크기 억제 확인

상기 <실시예 1>와 방법으로 제조된 NK 세포의 항암 효과를 확인하기 위하 여 인간 유래 대장암세포주인 SW620(한국생명공학연구원， 대한민국)을 이종이식한 마우스 모델을 이용하였다.

구체적으로， SW620 세포주를 PBS에 2X10 ⁷ cells/m의 농도로 현탁한 후 마 우스당 0.3 씩 우측 견갑부와 흉벽 사이의 액와부위 ^' 피하에 주입하였다. 암 세 포주를 이식하고 2시간 뒤 NK 세포주를 3X10 ⁵ , 1X10 ⁶ , 3X10 ⁶ 및 1X10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주사를 개시하였고， 이때 IL-2는 PBS에 희석하여 10,000 u/mouse의 농도로 처리하였다. 시험기간 동안 주 1회와투여 스케줄로 총 4회 (0일 ^' ， 7일， 14일 및 21일)에 걸쳐 마우스당 0.2 m씩 미정맥 주사한 뒤, 약물투여 개시일 부터 부검일까지 총 7회 종양의 크기변화를 배리어 캘리퍼 (verier caliper)를 아용 하여 3방향을 측정한 뒤 하기의 <수학식 1>의 계산식으로 계산하여 확인하였다.

【수학식 1】 암세포부괴 二 (길이 +넓이+높이) 그 결과， 도 3Β¾ᅳ 돤 _난_반 ᅳ같으ᅵᅳ용 ᅵ 1-대조군과—비"교하여 -NKᅳ세 -포를 -3ᅳ X 10 ⁵ , IX 10 ⁶ , 3X 10 ⁶ 및 1X10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주사한 군에서 각각 23.8%， 53.4%(p<0.001), 59.4%(p<0.001) 및 76.8)(p<0.001)의 종양 성장 억제 효과가 확인 되었으며， 양성대조군인 아드리아마이신 (adriamycin)을 투여한 투여군에서는 58.3%(p<0.001)의 종양 성장 억제 효과가 확인되었다. 또한, IL-2를 병용처리하였 을 때는 NK세포를 3X10 ⁵ , 1X10 ⁶ , 3X 10 ⁶ 및 lx 10 ⁷ cells/mouse의 농도로 주사한 군에서 각각 17.0%, 33.8 (p<0.01), 49.8%(p<0.01) 및 73.5%(p<0.001)의 종양 성장 억제 효과가 확인되었다 (도 3B).

<1-2> NK세포의 투여 수， IL-2병용에 따른종양무게 감소확인

- NK 세포의 투여 수， IL-2 병용에 따른 항암효과를 확인하기 위하여 약물을 처리한 마우스에서 종양의 무게를 측정하였다.

상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 NK세포 단독， 또는 NK 세포 및 IL-2 병용처리한 뒤， 23일째 마우스를 C0 ₂ 가스를 이용하여 희생시켜 종양을 분리하여 그 무게를 화학저울 (chemical balance)를 이용하여 측정하였고， 사진 촬영 후 액체 질소에 고정하였다. 모든 측정 항목들의 값은 t-TEST 통계법을 사용하여 용매 대 조군과 투여군을 비교하여 통계학적인 유의성을 검사하였다.

그 결과， 도 3C에 나타난 바와 같이 용매 대조군과 비교하여 M세포를 3X 10 ⁵ , 1X10 ⁶ , 3X10 ⁶ 및 1X10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주사한 군에서 각각 23.4¾， 54.0%, 59.1 (p<0.05) 및 78.8%(p<0.01)의 종양무게 감소 효과를 확인하였다 (도 3C). 또한， IL-2를 병용처리하였을 때는 NK세포를 3X10 ⁵ , 1X10 ⁶ , 3X10 ⁶ 및 IX 10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주사한 군에서 각각 17.0%， 34.3%, 47.0% 및 75.6%(p<0.01)의 종양 무게 감소를 확인하였으며， 양성 대조군인 아드리아마이신을 투여한 투여군에서는 58.2%(p<0.05)의 종양무게가 감소함을 확인하였다 (도 3C). 질험 ^" ^r^iini ^rw^^확인

상기 <실시예 1>의 마우스에서 NK세포 단독 또는 IL-2와의 병용 투여에 따 른 독성을 확인하기 위하여 마우스의 체중변화 및 일반 증상을 관찰하였다.

그 결과， 용매 대조군과 비교하여 NK 세포 단독 또는 IL-2와의 병용 투여군 에서 시험기간 동안 일반 증상 없이 정상적인 체중증가가 관찰되었으나， 양성 대조 군인 아드리아마이신을 투여한 투여군에서는 21.8%(p<0.01)의 통계적으로 유의한 체중 감소가 나타났다.

결론적으로， 본 발명의 NK 세포는 단독 또는 IL-2와 병용 투여시 일반증상 및 체중감소와 같은 독성을 나타내지 않았으며， 항암 효과와 관련하여 NK 세포 단 득 투여군에서 최고 70% 이상의 우수한 종양 성장 억제 효과를 나타냈고， IL-2와 병용 투여한 군에서는 NK 세포 단독 투여군과 비교하여 첨가 또는 상승의 효과를 나타내지는 않는 것으로 확인되었다.

<실험예 3> NK세포의쎄양， 보관조건, 투여 스케줄에 따른 항암 효과 확인 <3-1> NK세포의 배양, 보관조건, 투여 스케줄에 따른 종양 크기 억제 확인 본 발명의 NK 세포의 배양방법， 보관 조건 및 투여 스케줄에 따른 항암 효 과를 확인하기 위해 종양 크기의 감소를 확인하였다.

구체적으로.， NK 세포를 배양조건에 따라 프레쉬 ( fresh) NK, 프레쉬 NK(w/o Roset tesep) , 4 ^° C 보관한 NK 및 4 ^° C 보관한 NK(w/o Rosettesep)로 나누었고， 프레 쉬 NK 세포는 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제조되었으며， 프레쉬 NK(w/o Rosettesep) 세포는 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제조되었으나， CD3 양성 세포를 제거하는 단계를 생략하였고， 4 ^° C 보관한 NK 세포는 프레쉬 NK 세포를 4 ^° C에서 12 시간 보관 후 사용한 것이며， 4 ^° C 보관한 NK(w/o Rosettesep) 세포는 CD3 양성 세 포를 제거하는 단계를 생략하고 NK 세포를 제조한 뒤， 4 ^° C에서 12시간 보관 후 사 용한 것이다. 상기 제조된 NK 세포를 마우스 모델에 투여하기 위해， 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 평균 종양 크기가 약 50.0 uurf에 도 달하였을 때, NK 세포를 3 X 10 ⁶ cel l s/mouse의 농도로 투여하였으며， 마우스당 0.2 씩 미정맥 주사하였고， 이때 투여 스케줄은 주 1회 X 4주， 주 2회 X 2주로 투여를 수행하였다 (도 4A) .

시험기간 동안 독성을 확인하기 위해 마우스의 체중변화 및 일반증상을 관 찰한 결과， 용매 대조군과 비교하여 NK 세포를 주 1회 X 4주 [프레쉬 NK, 프레쉬 NK(w/o Rosettesep)] 및 주 2회 x2주 [프레쉬 N , 프레쉬 NK(w/o Rosettesep), 4 ^° C 보관한 NK, 4 ^° C 보관한 NK(w/o Rosettesep)] 투여군에서 시험기간 동안 일반증상 없이 정상적인 체중의 증가를 관찰하였으나， 양성 대조군인 아드리아마이신을 투여 한 투여군에서는 2수의 사망동물 및 31.5%(ρ<0·001)의 통계적으로 유의한 체중감소 가 나타났다.

또한， ΝΚ 세포의 배양, 보관조건， 투여 스케줄에 따른 항암 효과를 확인하 기 위하여 종양의 크기변화를 확인한 결과， 도 4Β에 나타난 바와 같이 주 1회 Χ4주 스케줄로 프레쉬 ΝΚ 및 프레쉬 NK(w/o Rosettesep)를 3xl0 ⁶ eel ls/mouse의 농도로 투여하였을 때 용매 대조군과 비교하여 각각 50.8%(p<0.001) 및 32.7%(p<0.05)의 종양성장 억제 효과가 나타났고， 주 2회 X2주 스케줄로 프레쉬 NK, 프레쉬 NK(w/o Rosettesep) 및 4 ^° C 보관한 NK 세포를 투여하였을 때 각각 35.4%, 10.8% 및 33.0% 의 종양 성장 억제 효과가 나타났으나, 4 ^° C 보관한 NK(w/o Rosettesep) 세포를 투 여한 투여군에서는 종양 성장 억제 효과가 나타나지 않았으며， 양성 대조군인 아드 리아마이신을 투여한 투여군에서는 71.7%(p<0.01)의 종양 성장 억제 효과를 나타내 었다 (도 4B).

<3-2> K세포의 배양， 보관조건， 투여 스케줄에 따른종양무게 감소확인 본 발명의 NK 세포의 배양방법， 보관 조건 및 투여 스케줄에 따른 항암 효 과를 확인하기 위해 종양 무게의 감소를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실험예 <1-1〉과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 상 기 실험예 <3_1〉과 동일한 조건으로 NK 세포를 투여한 뒤， 약물 투여 후 27일째 종 양을 절제하여 무게를 측정하였다.

그 결과， 도 4C에 나타난 바와 같이 주 1회 X4주 스케줄로 프레쉬 NK 및 프 레쉬 NK(w/o Rosettesep)를 3><10 ⁶ eel ls/mouse의 농도로 투여하였을 때 용매 대조 군과 비교하여 각각 49.0%(ρ<0·001) 및 33.1%(ρ<0.05)의 종양무게 감소 효과가 나 타났고， 주 2회 X2주 스케줄로 프레쉬 NK, 프레쉬 NK(w/o Rosettesep) 및 4 ^° C 보관 한 NK 세포를 투여하였을 때 각각 30.3%, 7.2% 및 29.0%의 종양무게 감소 효과가 나타났으며， 양성 대조군인 아드리아마이신을 투여한 투여군에서는 70·2%(ρ<0.05) 의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도 4C).

· 결론적으로， 상기 결과로부터 주 1회 Χ4주 스케줄로 투여하였올 때 프레쉬

Ν 배양조건에서 배양한 ΝΚ 세포를 3X10 ⁶ eel ls/mouse의 농도로 투여하였을 때 우 수한 항암 효과를 나타내었고， 주 2회 X2주 스케줄로 투여한 경우에는 프레쉬 NK(w/o Rosettesep) 및 4 ^° C 보관한 NK(w/o Rosettesep) 세포주보다 프레쉬 NK 및 4 ^° C 보관한 NK 세포주에서 높은 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

<실험예 4> NK세포의 냉동 여부에 따른 항암효과 확인

<4-1> NK세포의 넁동 여부에 따른 종양크기 억제 확인

본 발명의 NK 세포의 넁동 여부에 따른 항암 효과를 확인하기 위해 종양 크 기의 감소를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 평 균 종양 크기가 약 50.0 uiiii에 도달하였을 때， NK 세포를 3X10 ⁶ eel Is/mouse의 농 도로 투여하였으며， 마우스당 0.2 ^씩 미정맥 주사하였고, 이패 생 세포 (주 1회 X 4주, 총 4회)， 냉동된 세포 (주 1회 X4주， 총 4회)， 냉동된 세포 (주 2회 X4주， 총 8 희)， 및 생 세포 (주 1회 XI주) +넁동된 세포 (주 1회 X3주， 총 3회)의 조건으로 투여 ᅳ하였디： 용 H ^' ^;^^ l W¥¥ 배지 (serum free media)를 투여하였 고， 양성 대조군으로는 아드리아나마이신을 2 mg/kg의 용량으로 격일 복강 투여하 였다 (도 5A).

시험기간 동안 독성을 확인하기 위해 마우스의 체중변화 및 일반증상을 관 찰한 결과， 용매 대조군과 비교하여 모든 NK 세포 투여군에서 시험기간 동안 일반 증상 없이 정상적인 체중의 증가를 관찰하였으나, 양성 대조군인 아드리아마이신을 투여한 투여군에서는 2수의 사망동물 및 32.1%(p<0.001)의 통계적으로 유의한 체중 감소가 나타났다.

또한， NK 세포의 냉동 여부에 따른 항암 효과를 확인하기 위하여 27일째의 종양의 크기변화를 확인한 결과， 도 5B에 나타난 바와 같이 생 세포 (총 4회)， 냉동 5 된 세포 (총 8회)， 및 생 세포 (총 1회 )+넁동된 세포 (총 3회)을 투여한 투여군에서 각각 58.8%(p<0.001) , 45.2%(p<0.001) 및 19.2%의 종양 성장 억제 효과를 확인하였 고, 양성대조군에서는 60· 1¾(ρ<0.01)의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도 5Β) .

<4-2> Κ세포의 넁동 여부에 따른종양무게 감소확인

10 본 발명의 ΝΚ 세포의 넁동 여부에 따른 항암 효과를 확인하기 위해 종양 무 게의 감소를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 상 기 실험예 <4-1>과 동일한 조건으로 ΝΚ 세포를 투여한 뒤， 약물 투여 후 27일째 종 양을 절제하여 무게를 측정하였다.

15 그 결과 도 5C에 나타난 바와 같이， 생 세포 (총 4회)， 냉동된 세포 (총 8회)， 및 생 세포 (총 1회) +넁동된 세포 (총 3회)을 투여한 투여군에서 각각 58.5%(ρ<0.001) , 46.2 (ρ<0.01) 및 19.5%의 종양 무게 감소 효과를 확인하였고， 양 성대조군에서는 60.5%(ρ<0.05)의 종양 무게 감소 효과를 나타내었다 (도 5Β) .

결론적으로， 상기 결과로부터 생 세포 (주 1회 Χ 4주， 총 4회)， 넁동된 세포 i s/mouse의 농도로 투여 시 일반증상 및 체중 감소와 같은 독성 증상 없이 현저한 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

<실험예 5> K세포수에 따른 폐암에 대한항암효과확인

<5-1> NK세포수에 따른종양성장 억제 및 종양무게 감소효과확인

25 본 발명의 NK 세포 수에 따라 인체 유래 폐암 세포주인 NCI-H460(한국생명 공학연구원， 대한민국)을 이종이식한 마우스 모델을 이용하여 NK 세포주의 용량별 반복 정맥주사를 통한 항암효과를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 평 균 종양 크기가 약 50.0 uiiii에 도달하였을 때， ΝΚ 세포를 3X10 ⁵ , IX 10 ⁶ ， 3X10 ⁶ 및 5 1X10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주사를 개시하였고， 시험기간 동안 주 1회의 투여 스 케줄로 총 4회 (주 1회)에 걸쳐 마우스당 0.2 씩 미정맥 주사하였다. 용매 대조 군으로는 5% HSA를 투여하였고 양성 대조군으로는 독소루비 신. HCL(doxorubicin.HCL)을 2 mg/kg의 용량으로 격일 복강 투여하였다 (도 6A). 시험기간 동안 독성을 확인하기 위해 마우스의 체중변화 및 일반증상을 관 10 찰한 결과， 용매 대조군과 비교하여 모든 용량와 NK 세포 투여군에서 시험기간 동 안 일반증상 없이 정상적인 체중의 증가를 관찰하였으나, 양성 대조군인 독소루비 신. HCL을 투여한 투여군에서는 43·3%(ρ<0.001)의 통계적으로 유의한 체중감소가 나 타났다.

항암 효과 확얀을 위해， 상기 <실험예 1>의 방법으로 개시일부터 부검일까 15 지 총 11회에 걸쳐 종양 크기를 확인하였고， 최종일 (26일)에 마우스를 희생시켜 종 양을 분리한 후 이를 측정하여 종양 성장 억제 효과를 확인한 결과, 도 6Β에 나타 난 바와 같이 ΝΚ 세포를 IX 10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 투여한 투여군에서 용매 대 조군과 비교하여 47.9%(p<0.001)의 유의한 종양 성장 억쎄 효과를 확인하였고， 3X 10 ⁵ , 1X 10 ⁶ 및 3X10 ⁶ cells/mouse의 농도로 투여한 투여군에서는 투여 후 10일까

^ᅳ^ Γ종 정 W^ F ^l 확인되 으나， 그 이끼는 억 ^감소함에 띠「 라 종양의 성장이 증가하는 경향을 나타내었으며， 양성 대조군에서는

53.8%(p<0.001)의 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도 6B).

또한， 종양 무게 감소 효과를 확인한 결과， 도 6C에 나타난 바와 같이 NK 세포를 1X10 ⁷ cells/mouse의 농도로 투여한 투여군에서 용매 대조군과 비교하여 25 46.5%(p<0.001)의 유의한 종양 무게 감소 효과를 확인하였고 양성 대조군에서는 52.4%(p<0.001)의 종양 무게 감소 효과를 나타내었다 (도 6C).

<5-2>종양부위로의 K세포 침윤 효과 확인

상기 실험예 <5-1>의 조건으로 NK 세포를 투여하였을 때, 얼마나 많은 NK 5 세포가 침윤하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로， 마우스의 암 조직을 10% 포르말린 용액에 넣고 4°C에서 12시간 동안 고정을 하였다. 상기 고정된 조직을 얇게 절편을 만들어 PBS 용액에 담근 뒤 NK 세포의 면역조직화학 염색을 위해 상기 조직 절편을 30분 동안 3% 과산화수소 용액에 담근 후， 상기 절편올 다시 0.1 M PBS(pH 7,4), 0.1% 트라이톤 X- 10 lOOCtriton X-100)， 소혈청알부민 (serum bovine albumin) 및 CD56 항체 (1:500， PharMigen, 미국)가 포함된 용액에 넣고 4 ^° C에서 12시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 절편을 상온에서 1시간 동안 형광표지 항 마우스 IgG(l:200, PharMigen, 미국)가 포함된 용액에 넣고 배양한 뒤 현미경으로 관찰하였다. 또는， 상기 고정 된 조직을 바로 H— E(Hanatoxylin and Eosin) 염색을 수행하여 이를 현미경으로 관 15 찰하였다.

그 결과， 도 6D 및 5E에 나타난 바와 같이 NK세포주를 3><10 ⁵ ， lxlO ⁶ 및 3 X10 ⁶ cells/mouse의 농도로 1차 투여하였을 때 죽은 암세포의 수 (화살표)가 NK 세 포를 주입한 개수에 의존적으로 증가하였고 (도 6D), NK 세포 마커인 CD56 양성세포 수 (화살표)는 정상 대조군으로 용매를 1차 투여한 대조군과 비교하여 현저하게 증 ¾ ^F¾f¾—으며， CD56 양성 세포들이 주로 암조직 주변에 침윤함을 확인하였다 (도 6E).

결론적으로， NK 세포를 IX 10 ⁷ eel ls/mouse의 농도로 주 1회씩 4주간 마우 스의 미정맥 주사시， 일반증상 및 쎄중 감소와 같은 독성 증상 없이 인체 유래 폐 암에 대해 현저한 종양 억제 효과가 있음을 확인하였다.

25 <실험예 6>폐암， 간암 및 췌장암에 대한 NK세포의 항암효과확인 다양한 암종에 대한 본 발명의 NK 세포의 항암 효과를 확인하기 위하여， 인 간 유래 폐암 세포인 A549(한국생명공학연구원， 대한민국)， 간암 세포인 SNU- 709(한국생명공학연구원， 대한민국) 및 췌장암 세포인 MIA-Paca-2(한국생명공학연 구원, 대한민국) 세포주를 이종이식한 마우스 모델을 이용하여 NK 세포주의 반복 5 정맥주사를 통한 항암효과를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 암세포를 이식한 후， 평 균 종양 크기가 약 50, 0 imtf에 도달하였을 때， NK 세포를 6 X 10 ⁶ eel l s/mouse의 농 도로 주사를 개시하였고, 시험기간 동안 주 1회의 투여 스케줄로 총 4회 (주 1회)에 걸쳐 마우스당 0.2 ^씩 미정맥 주사하였으며， 용매 대조군으로는 5% HSA를 투여하 10 였다 (도 7A) .

시험기간 동안 독성을 확인하기 위해 마우스의 체중변화 및 일반증상을 관 찰한 결과， 용매 대조군과 비교하여 모든 용량의 NK 세포 투여군에서 시험기간 동 안 일반증상 없이 정상적인 체중의 증가를 관찰하였다.

항암 효과 확인을 위해 , 상기 <실험예 1>의 방법으로 개시일부터 부검일까 15 지 총 11회에 걸쳐 종양 크기를 확인하였고， 최종일 (25일)에 마우스를 희생시켜 종 양을 분리한 후 이를 측정하여 종양 성장 억제 효과를 확인한 결과， 도 7에 나타난 바와 같이 용매 대조군과 비교하여 폐암 마우스 모델에서 제대혈 유래 NK 세포주 및 말초혈액 유래 NK 세포주를 투여한 경우 각각 24.7%(p<0.05) 및 9.0%의 종양 성 장 억제 효과를 나타내었고， 간암 마우스 모델에서는 제대혈 유래 NK 세포주를 투 ᅳ _2(r —여 -한—경ᅳ우—^ zK^ DT^^^^^F ^^ T^ r^!^ir i ir^포주를 투여한 경우 28.2%(p<0.01)의 유의한 종양 성장 억제 효과를 나타내었다 (도 7B) .

또한, NK 세포 투여 후 25일째 종양 무게 감소 효과를 확인한 결과， 도 7C 에 나타난 바와 같이 용매 대조군과 비교하여 폐암 마우스 모델에서 제대혈 유래 N 세포주 및 말초혈액 유래 NK 세포주를 투여한 경우 각각 20.4%(p<0.01) 및 25 10.8%의 종양 성장 억제 효과를 나타내었고， 간암 마우스 모델에서는 제대혈 유래 NK 세포주를 투여한 경우 37·6%(ρ<0.01), 및 췌장암 마우스 모델에서는 제대혈 유 래 ΝΙΓ세포주를 투여한 경우 23.9%(ρ<0.01)의의 종양 무게 감소 효과를 나타내었다 (도 7C)..

결론적으로， 본 발명의 ΝΚ 세포는 6X10 ⁶ eel ls/mouse의 농도로 주 1회씩 4주간 마우스의 미정맥 주사시， 일반증상 및 체중 감소와 같은 독성 증상 없이 인 체 유래 폐암, 간암 및 췌장암에 대해 현저한 종양 억제 효과가 있음올 확인하였다.

<실험예 7 백혈병 (leukemia) 환자에서 NK세포의 치료 효과 확인

<7-1>환자 및 공여자 (donor)의 통계

실험을 위한 전체 환자의 평균 나이는 47 세이고， 32명의 급성 골수성 백혈 병 환자， 7명의 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia) 환자, 1명의 골수이형성증후군 (MyeloDysplastic Syndrome) 환자 및 1명의 미만성 큰 B 세포 림 프종 (diffuse large B cell lymphoma) 환자가 참여하였다. 조혈모세포이식 (hematopoietic cell trans lantation, HCT) 시， 활성화된 혈액 종양 (hematologic malignancy)을 갖는 40명꾀 환자 중 37명은 난치성이었다; 골수에 35명， 연막 (leptomeninges) 및 폐 (lung)에 각각 1명.

N 세포를 위한 공여자의 평균 나이는 32세 (7 내지 62세의 범위)였고， 이식 편 숙주반응 (graft-versus-host) 방향에서 8 HLA-A, -B, -C 및 -DRB1 대립유전자 (allele)의 공여자와 환자 불일치의 평균은 3.38이고， 거부방향 (rejection direction)에서 8 대립유전자의 불일치 평균은 3.68이었다. 평가된 기증자-공여자 (donor-recipient) 쌍 40명 중 7명 (18%)은 KIR 리간드 부적합성 (ligand incompatibility)에 따른 분류 시 NK 세포 알로반웅성 (al loreactivity)이 나타났다.

<7-2>조혈모세포의 이식 및 NK세포의 투여 및 이의 효과 확인

상기 실시예 <7-1>의 공여자로부터 수득한 조혈모세포를 환자에게 이식한 뒤， 일부 조혈모세포로부터 상기 <실시예 1>의 NK 세포 제조방법으로 활성이 증가 된 NK 세포를 제조하여 이를 환자에게 투여하였다.

구체적으로， 투여는 도 8a에 나타난 투여 스케줄대로 수행하였고， HLA-동일 단배체의 HCT후， NK 세포를 투여하였다. 투여 프로토콜은 아산병원 윤리심의위원 회 및 식품의약품 안전관리본부의 승인을 받아 수행하였다. 조건요법

(condi t ioning regime)을 위해 환자들에게 HCT 7일과 6일 전에 부설판 (busul fan)을 3.2 nig/kg/day, 7일과 2일 전에 플루다라빈 ( f ludarabine)을 30 nig/mVday, 및 4일 과 1일 전 또는 3일과 1일 전에 티모글로불린 ( thymoglobul in) 3 nig/kg/day을 정맥 주사하였다. G-CSF( granulocyte cokg 1 ony-s t i mu 1 at i ng factor ) 450 βg r 5일 후부 터 절대적인 호중구 (nutrophi l ) 개수가 3000/ 로 회복될 때까지 매일 정맥 주사 하였다. 3명의 불치의 급성 백혈병 환자는 백혈구 수치가 빠르게 증가하여 조건치 료 (condi t ioning therapy) 전 2주 내에 2 내지 5일 동안 아라 -C(ara-C) 200 내지 500 nig/mVday로 정맥 투여하였다. 이식편 숙주반웅 질환 (graft— versus-host di sease , GVHD)를 예방하기 위하여 모든 환자들은 사이클로스포린 (cyclospor ine)을 투여받았다. 추가적으로， 28명의 환자는 메토트렉사트 (methotrexate)를 마지막 공 여세포 투입 후 첫날에 15 mg/irf로, 3일， 6일 및 11일째에는 10 mg/nf로 투여받았 으며， 13명의 환자는 간 기능의 이상， 패혈증， 또는 의사의 판단에 의해 메토트렉 사트를 투여받지 않았다.

NK 세포 투여 3일 전에 각각의 조혈모세포 공여자에게 G-CSF 10 / /kg를 5 ᅳᅳ내 厂6 ^" ^ Jᅳ데 ¾^ F^f ^ ^ 5^ ᅳ ᅳ3ᅳ 안 백 ¾ 구분리반출법 ( leukapheresi s)을 사용하여 공여자로부터 조혈구세포를 수득하였다. 2 내지 3일에 수득된 조혈모세포는 같은 날 중심정맥 카테터 (central nenous catheter )를 이용하여 환자에게 이식되었고， 마지막날 수득 된 조혈모세포는 NK 세 포의 제조를 위하여 식품의약품 안전관리본부의 점검을 받는 실험실로 운반되었다.

이렇게 수득된 단핵구로부터 본 발명의 NK 세포 제조방법으로 제조된 NK 세포를 환자에게 투여하였으며， 최소 3명의 환자 집단을 한 군으로 각각 0.2X10 ⁸ , 0.5X10 ⁸ , 1.0X10 ⁸ 및 1.0X10 ⁸ 개 이상의 NK 세포주 /kg로 HCT 후 2주 및 3주째에 한 번씩 총 두 번 투여하였다. N 세포의 투여는 중심정맥 카테터로 한 시간 이상 투여되었으며， 투여 30분 전에 페니라민 (pheniramine) 45.5 m을 정맥으로 주사하 였다.

0.2X10 ⁸ , 0.5X10 ⁸ cell/kg로 NK 세포주를 투여받은 6명의 환자들은 모두 어떠한 급성 독성 또는 3급 급성 GVHD를 경험하지 않았으나, 1.0> 10 ⁸ 0611/1 로 NK 세포주를 투여받은 8명의 환자 중 2명은 3급 이상의 급성 GVHD를 경험하였다. 이후 등록된 환자를 위해서， 제조된 세포의 양에 따라서 NK 세포의 투여량이 결정 되었다: 예를 들어， 2주째에 투여하는 경우， 1 내지 2X10 ⁸ cell/kg 또는 세포배양 산물의 절반을 투여하고， 3주째에 투여하는 경우, 남은 세포 배양 산물을 투여하였 다.

그 결과， HCT 이식 후 8 내지 43일 동안에 NK세포를 투여받은 35명의 환자 의 호증구 개수가 50Q/iiL 이상을 달성하였고， 이의 중간값은 13일아다 (누적 발생 율: 85%; 95%신뢰구간， 75~97%). 한 명의 환자 (UPN 1093)는 1차 이식에 실패하였 고， 남은 5명의 환자는 초기 백혈병 진행 또는 이식관련 사망율 (transplantation- related mortality)을 경험하였다. HCT이식 후 8 내지 77일 동안에 NK세포를 투 여받은 31명의 환자의 혈소판 개수는 20,000/ iL 이상을 달성하였고， 이의 중간값 은 16일이다 (누적 발생율: Wo) . 백혈병 진행， 이식관련 사망을 또는 이식 실패가 나타나지 않은 33명의 환자는 모두 HCT 30일 후까지 90%를 넘는 공여자 말초 혈액 단핵구 키메라 현상 (chimerism)을 달성하였다. 한명의 환자 (UPN 1093)는 HCT 2달 후 2차 이식에도 실패하였다. 또한， 9명의 환자가 HCT후 0.5 내지 1.7개월 동안 급성 GVHD를 경험하였고， 이의 중간값은 0.8개월이다 (누적 발생율: 22%; 95%신뢰구간， 1239%). 이들 중 7 명의 환자는 2 내지 4급의 급성 GVHD였고 (누적 발생율: 17))， 5명의 환자는 3또는 4급의 급성 GVHD였다 (누적 발생율: 17%) . HCT 후 2.6 내지 4.6개월 동안 10명의 환자에서 만성 GVHD가 발생하였고， 이의 중간값은 3.3개월이었으며 (누적 발생율: 24%； 95% 신뢰구간， 14~4¾)， 이들 중 6명의 환자는 심각한 만성 GVHD를 경험하였 다 (누적 발생을: 15%) . 전체적으로， 11명의 환자가 악성화 또는 골수이형성증후군 의 진행이 없이 27%의 누적 이식관련 사망율 발생에 의해 사망하였다 (95% 신뢰구간， 16-45%) .

또한， 이들 31명의 환자 집단의 호증구 투여의 누적 발생율， 혈소판 투여， 2 내지 4급 급성 GVHD , 중간부터 심각한 만성 GVHD 및 이식관련 사망율은 각각 87%， 77%, 16% , 10% 및 19%로 HCT에 의한 결과와 유의적인 차이 1： 나타내지 않았다.

또한， HCT를 이식할 때， 난치의 급성 백혈병 또는 림프종 ( lymphoma)이었던

37명의 환자는 HCT 및 NK 세포의 투여 후에 68%인 25명이 완전 완화 (compl ete remi ss i on)을 달성하였다; 완전완화율은 급성 골수성 백혈병 환자에서 72% 및 모든 /림프종 환자에서 50%로 나타났다. 전체적으로， 17명의 환자가 질병의 진행을 경 험하였고 (누적 발생율: 46¾)， 급성 골수성 백혈병 환자에서 38% 및 모든 /림프종 환 자에서 75%로 나타났다.

아울러， 치의 급성 골수성 백혈병 환자에서 누적된 악화되지 않은 생존율 (event -free surviva l rate) 및 전체 생존율 (overal l survival rate)은 각각 31% 및 35%로 나타났고， 모든 /림프종 환자에서 누적된 악화되지 않은 생존율 및 전체 생존율은 모두 0%로 나타났다.