本发明涉及一种分子在脑组织间液与细胞外间 隙的生理参数的测量 方法， 具体来说， 它是涉及用测量对比剂在脑细胞外间隙的脑组 织间液 中的浓度变化的方法， 来确定脑组织间液与脑细胞外间隙的生理参数 ， 进而了解对比剂的扩散、 流动与清除等情况。 背景技术

脑组织间液（"组织间液"， interstitial fluid , 后简称 ISF) 是存在于 脑细胞外间隙（"细胞外间隙"， extracellular space, 后简称 ECS) 中的 液体。 脑 ECS是指存在于脑间质组织中、 细胞膜之间的不规则且相互连 通的狭窄空隙， 有学者也称之为组织通道 （tissue channel )。 Nicholson 认为， 脑 ECS、 脑 ISF和细胞外基质 (extracellular matrix, ECM)共同构 成了脑细胞微环境 ( brain extracellular microenviroment, BEM )， 在保证 脑细胞间电信号传导的稳定性， 形成细胞与血液之间物质转运通道， 以 及神经突触重塑过程中发挥关键作用。 因此， 对脑 ISF及脑 ECS的各项 生理参数的研究是认识神经活动规律的重要课 题。

然而，关于脑 ECS的解剖结构以及脑 ISF的流动性等生理学指标的 定量测量与分析仍然是当今微循环研究领域中 的难题。 早期， 由于标本 制作和后处理的技术限制， 电镜下几乎看不到脑 ECS。 后来， 依靠新技 术的开发和应用， 人们逐渐认识到脑 ECS的存在。 应用 RTI-TMA技术 (一种以四甲基铵离子 TMA为示踪剂的实时离子导入技术）， 测量出脑 ECS约占脑容积的 20%， 间隙宽度在 38~64 nm， 且间隙宽度可变。 在 目前的脑 ECS的测量方法中，离子导入（Real-time Iontophoresis, RTI ) 与压力引射法 （Real-time pressure ejection , RTP )、 放射性示踪法 ( Radioactive tracer method )、 集成光学成像法 ( Integrative optical imaging, 101 ) 因技术成熟， 应用较多。

离子导入与压力弓 I射法通过在脑内插入两个离子选择性微电极 (一 个释放离子， 一个接收离子）， 实时监测脑组织某一区域两点间的离子扩 散情况， 根据离子在该脑区 ECS中的运动描述出脑 ECS的结构特点。 但离子导入与压力引射法只能测量某固定较小 区域内 （如 60 μηι至 100 μηι范围内） 脑 ECS中某些特定离子 （如钾离子、 钙离子等） 的扩散。

放射性示踪法， 即是在脑组织内注射放射性物质， 通过在不同时间 点切取不同部位的脑片， 进行放射性剂量检测， 以获取物质的扩散数据。 但放射性示踪法必须在每个测量时间点处死一 只动物， 且只适用于体积 较大的脑 （如狗脑、 猴脑）。

集成光学成像法， 则是将荧光物质导入脑内， 在荧光显微镜和高分 辨率 CCD照相机的帮助下， 实时记录荧光物质的荧光强度变化， 来分析 物质的扩散。 但由于荧光的穿透力较弱， 集成光学成像法只适用于监测 距脑表面 200 μ 区域内的荧光变化。

这三种方法中， 除集成光学成像法可在监测物质扩散的同时， 提供 脑浅表组织的图像外， 其余两种方法都不能实现可视化的测量。 并且， 这些方法对脑 ISF在脑 ECS中的生理参数， 如流动速率、 阻力、 压力等 方面均缺少有效测量手段。

磁共振成像 ( magnetic resonance imaging, MRI ) 是近年来最常用 的成像检测技术， 用这种技术来观察人体或动物解剖结构与生理 功能具 有实时、活体、可视、无创的优势。 MRI对比剂的使用， 更加拓展了 MRI 的应用范围。

目前， MRI 检查中主要应用两种对比剂： 一种是以钆喷酸葡胺 (Gd-DTPA) 为代表的 T1 阳性对比剂， 另一种是以铁纳米微粒为代表 的 T2阴性对比剂。 在 MRI成像中， 有些对比剂也可以作为一种生理性 示踪剂， 已有学者应用铁纳米微粒作为 MRI示踪剂对脑 ISF中代谢物的 清除途径进行了初歩研究， 证实了注入脑内的铁纳米微粒经鼻粘膜处的 淋巴最终进入颈部淋巴结清除出脑。

然而， 研究结果也显示， 由于纳米颗粒铁磁性对梯度磁场的干扰， 图像产生变形， 并导致了大面积的信号缺失， 无法清楚显示对比剂在脑 内的扩散范围。因此这种方法无法实现对脑 ISF和脑 ECS的准确观察和 定量分析。

还有研究利用磁共振扩散加权成像 （diffusion weighted imaging,

DWI )进行脑 ECS的测量。 这是一种用于测量水及体内其它分子的表观 扩散系数 （apparent diffusion coefficient, ADC ) 和组织各向异性分数 (anisotropy fraction, FA) 的 MRI技术。 该方法是基于分子扩散变化导 致组织 MRI图像信号改变的原理， 在某一方向上施加一个扩散敏感线性 梯度场， 若组织内部某一位置在此方向上的扩散明显， 则采集到的磁共 振信号强度降低， 反之， 信号强度增加。 根据不同扩散敏感梯度下得到 的不同 MRI信号强度， 可计算得到 ADC值。 通过施加六个以上不同方 向上的扩散敏感梯度， 还可获得扩散张量特征参数， 如 FA。 当被测的分 子完全处于脑 ECS中，不进入细胞内，也不发生血脑屏障的逆 向转运时， ADC和 FA间接反映分子的扩散运动以及分子所处的脑 ECS的形态等， 如因该间隙空间的狭窄所导致的分子扩散运动 受限，表现为 ADC值下降， ECS的迂曲度发生改变时，则 FA也将随之变化。然而，临床常用的 DWI , 多选用水分子作为示踪分子， 但水分子的扩散既发生在脑 ECS中， 也发 生在细胞内。这使得计算所得的 ADC值同时包括了这两部分的结果， 从 而无法准确描述脑 ECS的性质。

有报道将 TMA作为 MRI 中射频的激发对象， 通过磁共振波谱分析 ( Magnetic resonance spectroscopy, MRS)测量得到 ADC獵， 即 TMA 在 ECS中的扩散系数， 结果显示 ADC _TMA 远远低于 RTI-TMA法测量的 扩散系数， 仅约为后者的四分之一。 并且， 由于磁共振波谱分析的分辨 率较低（0.5 X 0.5 X 0.5 cm ³ ) , 无法得到示踪剂在某一具体脑区 （如小于 0.2 X 0.2 X 0.2 cm ³ ) 的扩散情况， 因此， 不能实现对不同脑区 ECS的准 确定位测量。 发明内容

为此，本发明旨在提供一种脑 ISF与脑 ECS的生理参数的测量方法， 该方法可以利用对比剂在脑 ECS中的扩散而引起的 MRI信号强度变化， 计算得到分子在脑 ECS的扩散性能， 并且可以由此了解脑 ECS的解剖 结构和生理学参数等指标， 同时还能间接反映分子在脑 ECS内因扩散而 导致的分布变化与清除过程。

本发明提供了一种脑 ISF与脑 ECS的生理参数的测量方法，该方法 将被测对象的脑部置于磁共振成像环境中， 向被测对象的脑 ECS导入磁 共振对比剂， 随后在不同时刻进行磁共振成像， 在得到的图像上测量对 比剂在不同脑区扩散后的分布情况， 及各个脑区的信号强度变化， 根据 该信号强度的变化来确定相应处的示踪剂浓度 及浓度变化率。

根据本发明所述方法的再一种具体实施方式， 所述的对比剂经立体 定位穿刺导入被测对象的脑 ECS。

在本发明另一种具体实施方式中， 所述的对比剂为钆喷酸葡胺 ( Gd-DTPA) o

本发明在磁共振成像时采用的是一种 3D-梯度回波 T1加权成像。 在本发明还一种具体实施方式中，当对比剂的 浓度处于 0至 1 mM范 围时， 示踪剂在磁共振成像环境下， 采用 3D-梯度回波 T1加权成像方法 得到的信号强度与所述示踪剂浓度之间的关系 为： 其中： W为在磁共振环境下所述示踪剂在该位置处的� �号强度，

C _ed 为所述示踪剂 Gd-DTPA在该位置处的浓度，

为一个常数， 其值介于 300至 3000之间，

s为一个常数， 其值介于 20至 200之间。

本发明采用 MRI技术， 利用对比剂的特性， 通过对比剂在该通道内 组织间液中的扩散与清除而引起的图像信号变 化来计算得到脑 ISF及其 存在通道的解剖结构和生理学参数等指标。

具体来说， 本发明即是通过对 MRI对比剂在脑 ECS的 ISF中的扩 散和清除等指标的观察与测量， 不仅可以在活体状态下， 对全脑范围内 不同脑区 ISF所存在的脑 ECS的解剖形态学以及生理学指标进行动态监 测与定量分析， 还可以用来准确的判断与对比剂的分子量和 /或极性相同 或相类似的化学物质或药物在脑 ECS的扩散与清除情况， 对脑部微循环 的研究提供有价值的分析数据。 附图说明

以下附图仅对本发明做示意性说明和解释， 并不限定本发明的范围， 其中：

图 1是在磁共振环境下脑 ECS中对比剂的浓度与 MRI获得的图像 信号强度之间的关系曲线；

图 2表示了图 1所示的曲线在对比剂的浓度在 0至 1.0 mM范围内， 对比剂的浓度与 MRI信号强度之间的线性关系；

图 3是在与图 1不同的实验条件下得到的对比剂浓度与 MRI信号强 度的拟合曲线；

图 4是实现本发明测量方法的一种具体装置的示� �图；

图 5显示了大鼠脑部的脑 ECS导入对比剂位置的示意图；

图 6是在距离图 5所示大鼠对比剂导入点不同位置处， 对比剂沿图 示方向的 MRI信号强度增量随时间的变化曲线；

图 7 (a) 至图 7 (e) 是用图 4所示的测量装置测得的大鼠脑 ECS 导入对比剂后不同时刻的 MRI图像；

图 8 (a)至图 8 (d )显示了对比剂从大鼠脑部的白质纤维区导入� �， 对比剂随时间扩散的 MRI图像。 最佳实施方式

为了对本发明的技术特征、 目的和效果有更加清楚的理解， 现对照 附图说明本发明的具体实施方式。

图 1是在 37°C时对比剂 Gd-DTPA在琼脂糖中的浓度与 MRI信号 强度之间的关系曲线。 从曲线中可以看出， 当对比剂的浓度处于 0至 5 mM 范围时， 信号强度随浓度升高而增强， 对比剂浓度与信号强度之间 呈某种对应关系。 在该曲线中， 横坐标为对比剂的浓度， 对比剂浓度的 变化可以反映出脑 ISF在脑 ECS中的流动性； 纵坐标是 MRI的信号强 度， 本领域技术人员可以理解， 这里的信号强度既可以是直接的信号强 度，也可以是由信号强度换算出的其他表示信 号强度的数值，如 T1值等。 在本示例中，对比剂是 Gd-DTPA，但对比剂也可以选用其他的无铁磁性� � 无神经毒性、 不进入细胞且具有一定的药代动力学的物质或 者化合物， 如 Gd-BOPTA等 T1阳性 MRI对比剂。

虽然在图 1所示的示例中，测量的是对比剂 Gd-DTPA在琼脂糖中的 浓度与 MRI信号强度之间的关系， 但领域技术人员可以理解， 琼脂糖和 脑组织都是 Gd-DTPA的扩散介质， 都存在允许 Gd-DTPA扩散的间隙， Gd-DTPA在这两种介质中扩散的本质， 实际上都是在这种间隙中进行的 扩散。 所不同的是， 琼脂糖间隙中充满的全部是水， 脑间隙中充满的是 脑脊液， 而脑脊液中主要成像是水， 还包括一些离子和和少量蛋白。 虽 然这些离子和蛋白有可能会对 Gd-DTPA的信号强度有一定影响，但并不 影响 MRI信号强度与对比剂浓度之间存在线性关系的 本质。

图 2是显示了对比剂 Gd-DTPA在 0至 1 mM ( mM表示 mmol/L)范 围内， 对比剂浓度与 MRI信号强度之间的线性关系， 从该图中可以看出 可以得到一条近似的直线， 该直线方程为：

其中： W为在 MRI环境下对比剂在某一位置处的信号强度，

C _ed 为对比剂 Gd-DTPA在该位置处的浓度， 单位为 mM，

^为一个常数， 是这条拟合曲线的斜率，

为一个常数， 表示无示踪剂导入时， MRI的信号强度。

表 1 提供了四个实验的数据， 表明 值和 值受磁场强度、 MRI成 像序列、 对比剂、 对比剂浓度区间等因素的影响。 这四个实验是将处于 不同浓度区间内的对比剂注入琼脂糖中， 在不同的磁场强度或成像序列 下， 测量 MRI信号强度的分布。 通过对信号强度进行对比剂的定量计算 时，应根据实验的具体条件进行线性拟合，确 定方程（1 )中的 值和 值。

表 1 实验 1 实验 2 实验 3 实验 4 磁场强度 1.5T 3T 3T 3T 成像序列 FLASH 2D FLASH 2D 3D MP-RAGE 3D MP-RAGE 对比剂 Gd-DTPA Gd-DTPA Gd-DTPA Gd-DTPA 浓度区间 0 - 1.2 mM 0 - 1.2 mM 0 - 0.5 mM 0 - 1 mM

337.434 247.834 1913.686 1174.5 值 184.344 45.323 29.662 197.732 选取不同的浓度区间进行线性拟合， 曲线的 和 值略有不同，经实 验和计算， 值介于 300至 3000之间， s值介于 20至 200之间。 浓度区 间越窄， 值越大， 值越小； 反之浓度区间越宽， 值越小， 值越大。

如图 3是表 1中实验 1所对应的拟合曲线， 即在磁场强度为 1.5T、 成像序列为 FLASH 2D、 对比剂为 Gd-DTPA、 浓度区间为 0-1.2mM时 的测量结果。 根据拟合的曲线， 值为 337.434， s值为 184.344。

图 4显示了一种用于脑 ECS性能的测量装置，该装置包括一个成像 装置 20和一个控制装置 40。成像装置可以是 CT、 MRI等各种成像装置 中的一种， 成像装置 20与一个控制装置 40相连接。

在图示的实施方式中， 大鼠 10麻醉后， 头皮正中切开， 分离骨膜， 暴露前囟，按照《大鼠脑立体定位图谱》（第 三版，人民卫生出版社， 2005) 对鼠脑尾状核进行定位： 前囟前 .0 mm, 左旁开 3 mm,， 深 4.5 mm。 随 后以 0.1 L/min的速度恒速注射 1 μΙ_向大鼠尾状核区的脑 ECS注射 MRI 的对比剂 Gd-DTPA， 注射浓度介于 5-25mM之间。 图 5中圆点所示的为 在大鼠脑部尾状核区 Gd-DTPA的注射位置， 箭头所示的方向为 X方向， 即大鼠外耳道中点连线的方向。

注射完毕后， 留针五分钟， 缓慢移出针头。 参见图 4， 麻醉后的大鼠 俯卧位固定于腕线圈 30中， 并随检查床 12送入成像装置 20中， 采用 T1WI序列进行磁共振扫描， 控制装置 40通过图像处理单元对从成像装 置 20获得的图像进行处理。

图 6是沿图 5所示的 X方向，距离注射点分别为 1 mm、2mm和 3mm 处， 对比剂 Gd-DTPA在 X方向上的信号强度增量随时间的变化曲线， 当然 MRI信号强度的增量也反映了对比剂浓度的增量 。 如图 6所示， 在 距注射点 1 mm处， MRI信号强度的增量 （也表示对比剂浓度的增量） 在接近 1小时时达到高峰， 随后缓慢下降； 在距离注射点 2 mm和 3 mm 处（此处位于皮层区）， MRI信号强度增量（也是对比剂浓度的增量）先 是缓慢上升， 随后逐渐下降。

图 7 (a) 至图 7 (e) 是用图 4所示的测量装置测得的大鼠脑 ECS 导入对比剂后不同时刻的 MRI图像。 其中图 7 (a)是注射对比剂之前的 大鼠脑内尾状核中心区的 MRI图像， 图 7 (b) 是注射对比剂 Gd-DTPA 后 1小时时大鼠脑内尾状核中心区的 MRI图像， 图 7 (c)是注射对比剂 Gd-DTPA后 5小时时大鼠脑内尾状核中心区的 MRI图像， 图 7 (d) 是 注射对比剂 Gd-DTPA后 6小时时大鼠脑内尾状核中心区的 MRI图像， 图 7 (e)是注射对比剂 Gd-DTPA后 10小时时大鼠脑内尾状核中心区的 MRI图像。

采用类似的方法， 可以获得在三个垂直方向的 MRI断层图像， 观察 对比剂注射后的一段时间内， 不同时间点的 MRI的表现， 可以获得在三 个垂直方向上与图 6类似的图线。

同样， 在对脑 ECS的性质进行测量时， 可以测量脑部各不同位置处 MRI信号内多个数据点的不同时间的 MRI信号强度值。 图 8 (a)至图 8 (d) 是将对比剂 Gd-DTPA导入大鼠脑内白质纤维区后不同时间的 MRI 图像，其中图 8 (a)是注射对比剂之前大鼠脑内白质纤维区的 MRI影像， 图 8(b)是注射对比剂 Gd-DTPA后 1小时时大鼠脑内白质纤维区的 MRI 影像， 图 8 (c) 是注射对比剂 Gd-DTPA后 3小时时大鼠脑内白质纤维 区的 MRI影像， 图 8 (d) 是注射对比剂 Gd-DTPA后 6小时时大鼠脑内 白质纤维区的 MRI影像。

通过图 7 (a) 至图 7 (e) 和图 8 (a) 至图 8 (d )， 可以看到， 采 用本发明的方法能清楚显示并定位测量每个脑 区内的 Gd 引起的信号强 度变化，也就是每个脑区的 Gd浓度变化与变化率。该方法不仅显示和定 量分析了分子在该间隙内的扩散、 流动与清除过程， 并且可以用于分析 性质与对比剂相同或接近的分子在该间隙内的 相应生理过程。

在本发明的测量方法中， 可以通过测量 MRI信号强度， 即可以计算 出在某一个时间在一个确定位置上对比剂 Gd-DTPA的浓度， 通过 MRI 成像装置的动态监测和控制装置的实时分析， 不仅可以得到任一时刻， 脑内对比剂 Gd-DTPA经过扩散而形成的脑内分布， 以及 Gd-DTPA在脑 内的整体清除情况； 同时， 从公式 （1 ) 中， 还可以了解对比剂在脑细胞 间隙中的浓度， 利用已知的方法， 计算出表示每个像素内脑组织 ECS的 其他生理性能参数， 如表明脑 ECS的迂曲度^、 大脑中 ECS与脑组织 的体积比《、 扩散系数 D等， 这样可以从对比剂的浓度扩散状况， 测量 出脑 ECS中组织间液的流动性能。 像素的大小取决于 MRI成像装置的 性能， 一般认为， 目前可达到的最小像素大小为 0.01 mm至 0.1 mm， 在 本发明的一种具体实施方式中， 像素大小为 0.5 X 0.5 X 0.5 mm。

例如， 可以采用如下的 Nicholson公式计算脑 ECS中组织间液的流 动性能：

d v. VC—腿 (2 ) di λ a a

在公式 （2 ) 中：

c 表示计算位置处对比剂的浓度；

V 表示对比剂的注射速度；

λ 表明脑 ECS的迂曲度；

a 表示体积分数， 代表整个大脑中 ECS 与脑组织的体积比， 由下 式 (3) 计算， a = ^ - ( 3)

V 公式 （3) 中， _¾Me 指脑组织的总体积， 指脑 ECS的体积， 脑 ECS在正常成人脑组织中占 15% 至 30%， 平均为 20%， 在全脑缺血 时会降至 5%;

扩散系数 £>， 是分子在无限介质 （如稀释的琼脂糖） 中的扩散方式， 具体测量方式： 采用立体定位技术将 2 μΙ_磁共振示踪剂 Gd-DTPA (浓 度为 25mM)注射入 1%的琼脂糖凝胶中， 在注射后第 30分钟 l)、 第 60分钟 2) 时采用 T1WI序列进行 MR扫描， 采用自制图像处理软件 在垂直于进针方向的层面测量对比剂扩散面积 和 C 通过如下的公式 (2) 计算出 D值；

D =- ^s ^ (4)

t2— tl

分子在具有某种迂曲度的介质中的扩散系数被 称为有效扩散系数

D*, 表示为 =^ _;

λ ²

扩散源 ρ， 表述的是单位时间内对比剂释放入 ECS的量， 由液体的 注入速度决定。 比如， 对比剂以 0.05 L/sec的速度注入 ECS, 则 ρ值也 为 0.05 L/sec, 因此 ^反映了分子被释放进入 ECS时的体积；

a

浓度梯度 VC表示因液体流动而产生的浓度梯度， VC用于描述团 流 （bulk flow) 的影响， 若两个测量点间距离较近时， 其间团流的影响 可以忽略；

清除率 Z c)，是指物质损失， 即注入的液体分子中穿过血脑屏障、 进入或被结合进细胞部分所占的比率， 它是体积分数《与注入液体浓度 c的函数， 代表脑 ECS中注入液体分子的清除， 如进入细胞、 穿过血脑 屏障、 在酶的作用下降解或其他过程中注入的液体分 子的损失， 清除率 可由公式 （5) 计算：

f(c) = k'- -c (5) 其中： ^是速率常数。

若将公式 （5) 代入公式 （2) 中， 可以得到

_ _v n (6)

若以恒定的速度将浓度为 5-25mM的磁共振对比剂 Gd-DTPA注射 入大鼠目标脑区中， 同时采用图 3所示的测量装置进行 T1WI序列进行 MR扫描， 并利用如公式 （3) 至（5) 中对迂曲度 、 体积分数"、 扩散 系数 D及速率常数 ^求解， 即可以测定分子在脑 ECS中的扩散性能。

由于本发明采取的 MRI成像方法， 因此可以在一次成像中， 既可选 择某一特定区域 （如分辨率为 0.1 X 0.1 X 0.1 cm ³ ) 单独进行分析， 又可 显示对比剂在全脑范围内的扩散， 还能提供脑的三维解剖结构信息。 而 且测量对象可以是活体动物， 不必一定是离体组织。

本发明提供的脑 ISF与脑 ECS的生理参数的测量方法，可以实现在 全脑范围内对 ECS实时、在体、可视化的定量测量， 从而准确了解 ECS 的结构及其间的 ISF的流动性等生理学参数， 有助于对脑部微循环、 药 代动力学等的研究。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本 发明的可行性实施例 的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围， 凡未脱离本发明技 艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本 发明的保护范围之内。