本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种 利用全细胞生物催化生产 环磷酸腺苷的方法。 背景技术

环磷酸腺苷是人体内广泛存在的一种具有生理 活性的重要物质，作为细 胞内的第二信使， 对糖、 脂肪代谢、 核酸、 蛋白质等的合成调节起着重要的 作用。 临床上用于治疗心绞痛、 心肌梗死、 心肌炎及心源性休克； 对改善风 湿性心脏病的心悸、 气急、 胸闷等症状有一定的作用； 可提高急性白血病结 合化疗的疗效， 亦可用于急性白血病的诱导緩解； 此外， 对老年慢性支气管 炎、 各种肝炎和银屑病也有一定疗效。 环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备 二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺， 提高脂溶性， 从而发挥更有效的生理及 药理作用。 环磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加剂， 在离体条件下模拟生长激 素的作用， 促进畜禽生长， 增加优质禽产品产量。

环磷酸腺苷的制备方法主要有化学合成法、 发酵法、 酶促转化法 3种。 国内外目前全部采用化学合成法， 以腺苷一磷酸为原料， 采用高效分离柱进 行中间体分离， 操作复杂， 溶剂损耗量大， 收率低成本高， 产量小。 发酵法 是在含有（、 N源的基本培养基上添加前体物质， 通过培养微生物细胞可以 获得大量的环磷酸腺苷。 但是该方法由于存在细胞膜透性、 氧的传质、 环境 互适应机制等技术瓶颈， 离工业化还有一定的距离。 全细胞生物催化是利用 哺乳动物或微生物（节杆菌、 液化短杆菌等）来源的环磷酸腺苷合成酶系来 合成环磷酸腺苷。 由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系 统， 各种酶 又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置 ， 因此用微生物细胞直接作为 酶源进行酶催化反应， 能够迅速有效地完成多步酶催化反应， 并且可以省去 将酶从微生物细胞中提取出来的步骤。 由于其反应产物纯度高、 分离提纯容 易、 反应周期短、 无污染等特点越来越受到研究者的关注。 发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可降低 成本且操作方便的利用 全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方法。

本发明的思路是： 针对酶促反应中酶的活性容易受到损伤的缺陷 ， 可加 入多羟基的有机试剂来保护酶的活性。 由于细胞具有维持其生命活动的完整 的多酶系统， 各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特 定位置， 因此用 微生物细胞直接作为酶源进行酶催化反应， 能够迅速有效地完成多步酶催化 反应， 并且可以省去将酶从微生物细胞中提取出来的 步骤。

为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下：

一种利用全细胞生物催化生产环磷酸腺苷的方 法， 以多羟基有机试剂保 护酶的活性， 以环磷酸腺苷前体物质和磷酸根离子为底物， 以葡萄糖为能量 供体， 加入金属离子， 利用有透性的微生物菌株， 全细胞催化生产环磷酸腺 苷。

其中， 所述的多羟基有机试剂为甘露醇、 麦芽糖醇、 木糖醇、 乳糖醇、 山梨醇、 乙二醇和甘油中的任意一种或几种。

其中， 所述的环磷酸前体物质为腺嘌呤、 腺苷、 腺苷单磷酸、 腺苷三磷 酸、 肌苷、 肌苷酸或次黄嘌呤。

其中， 所述的金属离子为镁离子和铵离子中的任意一 种或几种。

其中， 所述的微生物菌株为节杆菌、 微杆菌、 液化短杆菌、 玫瑰色石蜡 节杆菌、 大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 酵母菌、 棒杆菌和产氨短杆菌属中的任 意一种。

酵母细胞的使用量为按湿菌体 10 ~ 1000g/L,优选 200 ~ 600g/L, 即对于 总体积为 1L的反应液， 需加入 10 ~ 1000g湿菌体， 优选加入 200 ~ 600g湿 菌体。

酵母的利用形式为酵母细胞的干燥物、经过发 酵培养分离离心得到的细 胞、 固定化细胞、 细胞的冻干物、 市售酵母粉、 风干酵母或废酵母泥。

其中， 有透性的微生物菌株， 是指通过化学、 物理或生物方法处理细胞 从而得到细胞膜的通透性改变的生产微生物菌 株， 具体方法为表面活性剂 法、有机溶剂法、 冻融法、 超声波处理法、 风干法、 冷冻干燥法或溶菌酶法。

表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型 表面活性剂聚环氧乙烷 胺或曲拉通 X - 100, 阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺.溴化物� � 或阴离 子表面活性剂月桂酰.肌氨酸盐，表面活性剂� �用量为 0.01 ~ 50g/L,优选 1 ~ 20 g/L, 即表面活性剂法处理生产菌株时， 将表面活性剂直接加入反应液， 对于总体积为 1L的反应液， 加入 0.01~50g, 优选加入 l~20g。

有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、 甲苯、 脂肪醇、 丙酮或乙酸乙 酯， 有机溶剂浓度为 0.01 ~ 50mL/L, 优选以 l ~ 20mL/L, 即有机溶剂法处 理生产菌株时， 将有机溶剂直接加入反应液， 对于总体积为 1L的反应液， 加入 0.01~50mL, 优选加入 l~20mL。

其它处理细胞透性的方法， 如冻融法、 超声波处理法、 风干法等， 采用 先将菌株细胞处理后， 再将处理好的菌株加入反应液的方式。

多羟基有机试剂的初始反应浓度为 0.001~10g/L, 环磷酸腺苷前体物质 初始反应浓度为 0.01~100g/L, 磷酸根离子的初始反应浓度为 0.01~100g/L, 葡萄糖的初始反应浓度为 0.01~100g/L, 金属离子的初始反应浓度为

0.001~10g/L, 微生物菌株的使用量为按湿菌体 10~1000g/L。 优选的是， 多 羟基有机试剂的初始反应浓度为 0.5~1.5g/L, 环磷酸腺苷前体物质初始反应 浓度为 2~15g/L, 磷酸根离子的初始反应浓度为 5~20g/L, 葡萄糖的初始反 应浓度为 50~80g/L, 金属离子的初始反应浓度为 2~7g/L, 微生物菌株的使 用量为按湿菌体 20~1000g/L。

上述环磷酸腺苷的生成反应在水溶液中进行， 在 pH4~10, 25~38°C条件 下反应 2-200小时， 优选在 pH6~8, 28~35°C条件下反应 5-20小时。

本发明的有益效果如下：

1、 大量的研究经验发现多羟基有机试剂的加入可 以提高酶的化学势能， 从而需要更多的自由能才能破坏酶的结构， 这从另一方面来讲使得酶的构象 更为稳定， 保护了酶的活性。

2、 本发明与酶催化相比， 由于使用的是全细胞， 胞内的酶受细胞壁 /细 胞膜的保护， 酶稳定性更好， 半衰期更长， 更易实现能量和辅酶的再生； 胞 内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥 补酶法催化中级联催化不易 实现的不足， 同时省去酶的纯化过程， 制备筒单， 成本低廉。

3、 对微生物进行预处理， 改善了微生物细胞壁的通透性， 加速反应组 分向微生物细胞的扩散、 渗透， 促进底物和酶系的接触， 可使最大转化率以 及最大得率出现的时间在一定限度内缩短。 具体实施方式

根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容 易理解， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本 发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述 的本发明。 实施例 1:

微生物菌株培养基： 葡萄糖 50g/L, 尿素 2.0g/L, 磷酸二氢钾 5.0 g/L, 硫酸镁 0.5 g/L, 生物素 0.05xlO— ³ g/L。

微生物菌株接种量 10%, 于 30°C下 120rpm摇床培养 24小时， 离心

8000rpm, 10分钟。 取菌泥， - 10°C保藏备用。 实施例 2: 利用次黄嘌呤合成环磷酸腺苷。

取 500mL烧杯，配制 4g/L次黄嘌呤由 50g/L葡萄糖、 100g 节杆菌菌泥、 8g/L磷酸二氢钾、 lg/L MgS0 ₄ 、 lg/L NH ₄ CK 4.5mL甲苯、 0.5g/L甘露醇、 0.5g/L的木糖醇和水组成的反应液 300mL, 用氢氧化钠调 pH至 6.5 , 于 30 °C条件下低速搅拌反应 8h, 反应结束后， 用 40%三氯乙酸沉淀， 用 HPLC 对环磷酸腺苷进行定量分析， 转化液中含环磷酸腺苷 4.5g/L。 实施例 3: 利用腺苷合成环磷酸腺苷。

取 500ml烧杯， 配制由 6g/L腺苷、 60g/L葡萄糖、 120g风干后的微杆 菌菌泥、 10g/L磷酸二氢钾、 10g/L磷酸氢二钾、 0.5g/L MgCl ₂ 、 2g/L NH ₄ Cl、 lg/L的甘油、 lg/L甘露醇和水组成的反应液 300mL, 用氢氧化钾调 pH至 7.0, 于 33°C条件下低速搅拌反应 6h, 反应结束后， 用 40%三氯乙酸沉淀， 用 HPLC对环磷酸腺苷进行定量分析， 转化液中含环磷酸腺苷 3.5g/L。 实施例 4: 利用腺嘌呤合成环磷酸腺苷

取 500ml烧杯， 配制由 10g/L腺嘌呤、 50g/L葡萄糖、 300g液化短杆菌、 5g/L磷酸氢二钠、 2g/L MgCl ₂ 、 2g/L NH ₄ CK 0.3mL丙酮、 lg/L的甘油和水 组成的反应液 300mL, 用氢氧化钾调 pH至 7.5 , 于 32 °C条件下低速搅拌反 应 5h, 反应结束后， 用 40%三氯乙酸沉淀， 用 HPLC对环磷酸腺苷进行定 量分析， 转化液中含环磷酸腺苷 3.2g/L。 实施例 5: 利用腺苷单磷酸合成环磷酸腺苷

取 500ml烧杯， 配制由 10g/L腺苷单磷酸、 70g/L葡萄糖、 60g棒杆菌 菌泥、 7g/L磷酸氢二钠、 3g/LMgCl ₂ 、 lg/L NH ₄ CK 15mL丙酮、 0.6g/L的甘 油和水组成的反应液 300mL, 用氢氧化钾调 pH至 8, 于 28 °C条件下低速搅 拌反应 20h, 反应结束后， 用 40%三氯乙酸沉淀， 用 HPLC对环磷酸腺苷进 行定量分析， 转化液中含环磷酸腺苷 1.2g/L。 实施例 6: 利用腺苷三磷酸合成环磷酸腺苷

取 500ml烧杯， 配制由 12g/L腺苷三磷酸、 80g/L葡萄糖、 180g节杆菌 菌泥、 5g/L磷酸氢二钠、 2g/L MgCl ₂ 、 5g/L NH ₄ CK 0.03g阳离子型表面活性 剂十六烷基三甲胺.溴化物、 1.5g/L的甘油和水组成的反应液 300mL,用氢氧 化钾调 pH至 6.5 , 于 31 °C条件下低速搅拌反应 10h, 反应结束后， 用 40% 三氯乙酸沉淀， 用 HPLC对环磷酸腺苷进行定量分析， 转化液中含环磷酸腺 苷 4.0g/L。 实施例 7: 利用肌苷合成环磷酸腺苷

取 500ml烧杯， 配调制由 6g/L肌苷、 80g/L葡萄糖、 80g产氨短杆菌、 6g/L磷酸氢二钠、 5 g/LMgCl ₂ 、 2 g/LNH ₄ Cl、 1.5g阴离子表面活性剂月桂酰-肌 氨酸盐、 lg/L的甘油和水组成的反应液 300mL, 用氢氧化钾调 pH至 7, 于 34°C条件下低速搅拌反应 18h,反应结束后，用 40%三氯乙酸沉淀，用 HPLC 对环磷酸腺苷进行定量分析， 转化液中含环磷酸腺苷 1.2 g/L。