Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln einer Fluoreszenzintensität, wobei mehrere zweidimensionale Einzelbilder einer Probe mittels eines Mikroskops aufgenommen werden, wobei in jedem der Einzelbilder derselbe Probenbereich enthalten ist und während der Aufnahme der Einzelbilder unterschiedliche Emitter zur Emission von Fluoreszenz angeregt werden, so dass in mindestens einem der Einzelbilder mindestens eine

beugungsbegrenzte Intensitätsverteilung einer Fluoreszenzemission eines Emitters vereinzelt ist, und das Einzelbild mit der vereinzelten Intensitätsverteilung ermittelt und deren

Gesamtintensität ermittelt wird.

Der Begriff der Fluoreszenz soll im Sinne der Erfindung jede Art von Lumineszenz, insbesondere auch Phosphoreszenz, umfassen. Eine Intensitätsverteilung in einem

Mikroskopbild ist beugungsbegrenzt, wenn sie eine beugungsbedingte Ausdehnung aufweist, die einer Ausdehnung einer Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht. Eine Intensität ist vereinzelt, wenn sie frei von Überlappungen mit Intensitätsverteilungen anderer Emitter - soweit die Intensitätsverteilungen oberhalb des statistischen Untergrundes liegen.

Forschungsgebiete wie die Systembiologie, die mit quantitativen Modellen biologische Systeme beschreiben will, sind auf quantitative Daten angewiesen. Solche Daten können mittels der Fluoreszenzmikroskopie bisher nur mit geringer Genauigkeit ermittelt werden, beispielsweise mittels eines„Flying-Spot" -Mikroskops (Pawley:„Biological Confocal Microscopy", Springer Verlag, 3. Auflage 2006, S. 6) oder durch Kalziumbildgebung (engl. „Calcium Imaging") (Pawley, S. 529), weil eine große Anzahl von Fehler- und Rauschquellen zu Intensitätsfluktuationen führt. Eine gesuchte Größe ist beispielsweise die absolute

Intensität eines Fluoreszenzereignisses. Fehlerquellen sind beispielsweise die große Varianz der Poissonverteilung für Fluoreszenzereignisse, die Unsicherheit der Größe des

mikroskopischen Detektionsvolumens, Detektorrauschen, photophysikalische Eigenschaften wie Quanteneffizienz, Anregungs- und Effizienzspektren und Bleichverhalten der

verwendeten Fluorophore. Weitere Unsicherheiten sind Unterschiede zwischen verschiedenen Fluorophorsorten, Beleuchtungsinhomogenitäten und Hintergrund- und Autofluoreszenz der Probe. Diese Fehler sind umso größer (oder fallen mehr ins Gewicht), je kleiner die untersuchten Volumina und damit die Anzahl der untersuchten der Moleküle sind und je größer das räumliche Auflösungsvermögen des Mikroskops ist. Ein hohes Auflösungsvermögen des verwendeten Mikroskops ist jedoch für eine hohe räumliche Genauigkeit erforderlich. Das Auflösungsvermögen hängt von der sogenannten Punktübertragungsfunktion (engl.„Point Spread Function"; PSF) des Mikroskopobjektivs ab, die aufgrund der Beugung des von der Probe aufgenommen Lichts im Mikroskopobjektiv stets eine von Null verschiedene Ausdehnung (räumlich: ein von Null verschiedenes

Volumen) aufweist, so dass eine punktförmige Lichtquelle wie ein fluoreszierendes Molekül optisch auf eine endliche Fläche abgebildet wird. Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops ist daher grundsätzlich begrenzt (Abbe 1873). Im Stand der Technik sind jedoch mehrere Ansätze bekannt, um Bilder zu erzeugen, die höher aufgelöst sind, als diese grundsätzliche Grenze es zulässt (nachfolgend als„Superauflösung" bezeichnet).

Aus WO 2006/127692 A2 ist zur Erhöhung des Auflösungsvermögens die Verwendung photoschaltbarer Fluoreszenzfarb Stoffe bekannt (engl.„Photo-activated Localization

Microscopy"; PALM). Durch Licht sehr geringer Intensität bei einer Aktivierungswellenlänge wird eine äußerst geringe Anzahl zufällig verteilter Fluoreszenzfarbstoffmoleküle

(Fluorophore) in einen anregbaren Zustand transformiert (aktiviert) und anschließend auf bekannte Weise durch Licht einer Anregungswellenlänge zur Fluoreszenz angeregt. Die übrigen, nichtaktivierten Fluorophore lassen sich durch die Anregungswellenlänge nicht zur Fluoreszenz anregen. Aufgrund der zufälligen Verteilung liegen die aktivierten und angeregten Fluorophore in der Regel räumlich so weit auseinander, dass die aus den

Fluoreszenzereignissen entstehenden, beugungsbegrenzt abgebildeten Intensitätsverteilungen der Punktquellen einander nicht überlappen (also vereinzelt sind). Das gilt insbesondere auch für eine Projektion auf ein zweidimensionales Bild, in dem sich die Intensitätsverteilungen aufgrund der Beugungsverbreiterung über mehrere Bildelemente (engl,„picture elements"; Pixel) erstrecken, bevor sie im Untergrundrauschen aufgehend auslaufen. Im PALM- Verfahren wird eine Vielzahl von Einzelbildern mit einer jeweils geringen Anzahl von in der Regel nichtüberlappenden Fluoreszenzereignissen aufgenommen. Die Aktivierung wird dabei erst wiederholt, wenn die zuletzt aktivierten Fluorophore ausgebleicht oder in einen nicht fluoreszierenden Zustand transformiert worden sind. Die Ursprünge der einzelnen

Fluoreszenzereignisse werden in den Einzelbildern anhand der beugungsverbreiterten

Intensitätsverteilungen mittels einer Ausgleichsrechnung, in der eine Modellfunktion in Form einer Gaußverteilung an die gemessene zweidimensionale Intensitätsverteilung angepasst wird, mit Subpixelauflösung lokalisiert und in ein hochauflösendes Ergebnisbild eingetragen. Es sind weitere Varianten dieser individuellen Fluorophorenlokalisierung bekannt, die sich in der Vorgehensweise zur Vereinzelung unterscheiden. In der sogenannten STOR-Mikroskopie (engl.„Stochastic Optical Reconstruction Microscopy"; STORM) werden die paarweise genutzten Fluorophore beispielsweise mittels einer zweiten Lichtquelle in ihren

Ausgangszustand zurückgeschaltet (deaktiviert), sobald genügend Photonen in ein Einzelbild aufgenommen wurden. Daneben gibt es noch die Verfahren PALMIRA („PALM with independently running acquisition"), FPALM („Fluorescence PALM"), dSTORM („direct STORM") und GSDFM („Ground State Depletion and Individual Molecule return").

Die in all diesen Verfahren zur Lokalisierung genutzte Ausgleichsrechnung kann auch zur Ermittlung der absoluten Intensität eines Fluoreszenzereignisses anhand des Volumens der angepassten Modellfunktion genutzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde jedoch erkannt, dass sich hierbei systematisch eine zu niedrige absolute Intensität für das Fluoreszenzereignisses ergibt.

In der Mikroskopie ist es daneben auch bekannt, absolute Intensitäten mittels der aus der Astronomie stammenden Aperturphotometrie (engl,„aperture photometry"; AP) zu ermitteln. Sie ist beispielsweise in„Defining the Limits of Single-Molecule FRET Resolution in TIRF Microscopy" von S. J. Holden et al. in Biophysical Journal, Ausgabe 99 vom November 2010, Seite 3102, beschrieben. Die AP weist jedoch relativ große Fehler auf. Zudem erfordert ihre Anwendung eine starke Vereinzelung der angeregten Emitter mit sehr großen Abständen zueinander, um in der Umgebung einer Fluoreszenzintensitätsverteilung ausreichend statistischen Untergrund aufnehmen zu können. Das verlangsamt das Aufnahmeverfahren, da in der gesamten Probe weniger Emitter gleichzeitig angeregt werden dürfen und zum

Ausgleich mehr Einzelbilder aufgenommen werden müssen.

Ein weiteres Problem stellt bei allen superauflösenden Mikroskopierverfahren die dritte Dimension dar. Ideal wäre eine Möglichkeit, allen identifizierten Fluoreszemittern eine Position nicht nur in zwei, sondern in drei Dimensionen zuordnen zu können, ohne den Fokus des Mikroskops zeitaufwendig verstellen zu müssen. Dabei sollte axial, also längs der optischen Achse des Detektionsobjektivs, ebenfalls Superauflösung erreicht werden können. Zu diesem Zweck gibt es im Stand der Technik mehrere Ansätze. Ein erster, optisch aufwendiger Ansatz beruht auf der Formung einer eineindeutig tiefenabhängigen

Punktübertragungsfunktion des Mikroskops („PSF engineering").in Form einer Doppelhelix wie in US 2010/278400 AI . Einfachere Ansätze wie in US 2014339439 AI gehen davon aus, dass aus der Ausdehnung einer beugungsbegrenzten Intensitätsverteilung, die aus einer Ausgleichsrechnung durch Anpassung einer Modellfunktion in Form einer Gaußverteilung an die gemessene Intensitätsverteilung ermittelt wird, auf die axiale Lage des Emitters geschlossen werden kann. Aufgrund der axialen Symmetrie der PSF ist es damit jedoch nicht möglich, Emittern abseits der Fokalebene eine eindeutige axiale Position zuzuordnen, sondern nur eine eindeutige Entfernung von der Fokalebene.

Ein anderer Ansatz zur 3 D-Lokalisierung sieht die gezielte Aufprägung eines Astigmatismus vor, wobei wie in US 2011/002530 AI anhand der daraus resultierenden Deformation der Intensitätsverteilung auf die axiale Position des Emitters geschlossen wird. Dadurch wird die eindeutige Zuordnung beiderseits der Fokalebene möglich. Die mit dem Astigmatismus einhergehende Defokussierung führt jedoch zu einer Verschlechterung der lateralen

Lokalisierungsgenauigkeit. Ein dritter Ansatz ist die simultane Aufnahme zweier

unterschiedlicher Fokalebenen mit„herkömmlicher" (in axialer Richtung symmetrischer) PSF wie in US 2009/242798 AI . Hier ist gegenüber der einfachen Ermittlung der axialen Position anhand der Ausdehnung der Intensitätsverteilung der axiale Anwendungsbereich

(Schärfentiefe) vergrößert, da im Prinzip jeder Intensitätsverteilung eine eindeutige axiale Position zugeordnet werden kann.

Die Auflösung und die Genauigkeit der axialen Lokalisierung sind jedoch in all diesen Verfahren im Vergleich zur lateralen Auflösung und Genauigkeit relativ niedrig.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art und ein Mikroskop zu dessen Durchführung anzugeben, die eine Ermittlung der absoluten Intensität eines aufgenommenen Fluoreszenzereignisses mit geringem Fehler bei möglichst kurzer Messdauer ermöglichen. In einer Weiterbildung sollen sie zudem die Ermittlung einer axialen Position eines Emitters mit hoher räumlicher Auflösung und geringem Fehler und

ermöglichen. Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die in Anspruch 1 oder Anspruch 10 angegebenen Merkmale aufweist, und durch ein Mikroskop, welches die in Anspruch 17 angegebenen Merkmale aufweist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, für den Einsatz mit

superauflösenden Mikroskopierverfahren ausgelegt. Es sind dabei alle Verfahren möglich, welche die in der Probe vorhandenen Fluoreszenzemitter vereinzelt anregen, insbesondere PALM, FPALM, PALMIRA, STORM und dSTORM.

Erfindungsgemäß ist zur Lösung der Aufgabe vorgesehen, dass zusätzlich zu den eingangs genannten Schritten folgende Schritte durchgeführt werden:

- Ermitteln eines ersten Intensitätswertes Law - als Rohintensitätswert - in einem (ersten) Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten Intensitätsverteilung - soweit sie über dem statistischen Untergrund liegt -, durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des Einzelbildes,

- Ermitteln mindestens eines anderen der Einzelbilder, welches zumindest in einem dem (ersten) Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei ist von Fluoreszenzemissionen (die über dem statistischen Untergrund liegen), insbesondere frei von einer Emission des Emitters, zu dem die in dem (ersten) Teilbereich des ersten

Einzelbilds enthaltene vereinzelte Intensitätsverteilung gehört,

- Ermitteln eines zweiten Intensitätswertes IBG - als Untergrundintensitätswert - in dem Bildbereich des anderen Einzelbildes durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten betreffender Bildelemente des anderen Einzelbildes und

- Ermitteln einer bereinigten Fluoreszenzintensität I als Differenz Law-fec zwischen dem ersten Intensitätswert aw und dem zweiten Intensitätswert IBG.

Der Kern der Erfindung ist also die Verwendung von anderen Bildern einer Zeitserie zur Untergrundkorrektor anstelle der Umgebung der vereinzelten Intensitätsverteilung in demselben Einzelbild. Im Unterschied zur herkömmlichen Aperturphotometrie wird eine höhere Genauigkeit der Untergrundkorrektur erzielt, da die nicht zwangsläufig zutreffende Annahme, dass hinsichtlich des Untergrunds von einem Probenbereich auf einen anderen Probenbereich geschlossen werden kann, entfällt. Weil die Umgebung der Intensitätsverteilung im Gegensatz zur herkömmlichen Aperturphotometrie bei der

Auswertung keine Rollte spielt, wird im Vergleich zur AP das Erfordernis ausreichender Abstände zwischen vereinzelten Intensitätsverteilungen deutlich abgeschwächt, was die Vereinzelung und damit die Bildaufnahme beschleunigt. Der wichtigste Unterschied zum Stand der Technik, besteht jedoch in der höheren systematischen Genauigkeit der

erfindungsgemäß ermittelten absoluten Fluoreszenzintensitäten gegenüber der

Volumenermittlung von angepassten Modellfunktionen.

Die Vereinzelung erfolgt dabei entweder auf bekannte Weise durch Aktivierung und

Anregung wie in einem der oben beschriebenen superauflösenden Lokalisierungsverfahren, beispielsweise wie in WO 2006/127692 A2 oder in US 2009/242798 AI . Zweckmäßigerweise kann dazu vor dem Aufnahmeschritt die Probe bereitgestellt werden, wobei die Probe mit mindestens einem photoschaltbaren, photoaktivierbaren oder unter optischer Anregung blinkenden Fluoreszenzfarbstoff als Emitter markiert ist.

Alternativ zur gesonderten Aktivierung kann die Vereinzelung wie in DE 10 2015 121 920, deren Inhalt insoweit hier einbezogen wird, durch Aufnahme des Einzelbildes mit einer Belichtungsdauer, die kürzer als die mittlere Lebensdauer eines dunklen Zustandes eines in der Probe enthaltenen blinkfähigen Fluoreszenzfarbstoffs ist, erfolgen. Da auf kleinen Zeitskalen nahezu alle Fluoreszenzfarbstoffe blinken, kann mit einem

höchstlichtempfindlichen Detektor und einer entsprechend kurzen Belichtungsdauer auf besondere aktivierbare oder transformierbare Fluoreszenzfarbstoffe verzichtet werden.

Entsprechend kann auch auf einen Aktivierungsschritt verzichtet werden. Derartige

Detektoren sind jedoch aufwendig.

Vorteilhafterweise können mehrere andere Einzelbilder ermittelt werden, von denen jedes zumindest in einem jeweiligen, dem Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung entsprechenden Bildbereich frei von Fluoreszenzemissionen (abgesehen von einem

statistischen Untergrund) ist, und der zweite Intensitätswert IBG kann durch Integrieren der aufgenommenen Intensitäten der Bildelemente des betreffenden Bildbereichs jedes der anderen Einzelbilder und Dividieren durch die Anzahl der ermittelten anderen Einzelbilder ermittelt werden. Auf diese Weise kann die Genauigkeit der Untergrundintensität und damit die Genauigkeit der Ermittlung der Fluoreszenzintensität verbessert werden. Basiert die Vereinzelung alleine auf Blinken (ohne besondere Aktivierung), sollte die Bildaufnahmefrequenz vorzugsweise höher, insbesondere signifikant höher als eine

Blinkfrequenz eines oder mehrerer in der Probe enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffe sein.

Eine besonders hohe Genauigkeit der Ermittlung der Fluoreszenzintensität kann erreicht werden, wenn der Teilbereich, in dem die betreffenden Bildelemente der vereinzelten

Intensitätsverteilung und der anderen Einzelbilder integriert werden, einer diskret gerasterten Kreisfläche mit einem Radius zwischen dem einer 1.46-fachen und dem 2.26-fachen einer Halbwertsbreite der Punktübertragungsfunktion des Mikroskops, insbesondere mit einem Radius von einer 1,86-fache Halbwertsbreite der Punktübertragungsfunktion, entspricht.

Ein weitergehender Aspekt der Erfindung betrifft die Ermittlung einer Koordinate

(Lokalisierung) für einen Fluoreszenzemitter in einer dritten räumlichen Dimension, insbesondere in axialer Richtung des Mikroskopobjektivs, anhand zweidimensionaler Einzelbilder, wofür die Erfindung zusätzlich zur Ermittlung einer bereinigten ersten

Fluoreszenzintensität Ii anhand eines ersten Intensitätswerts I _ra w,i und eines zweiten

Intensitätswerts IBG,I folgende Schritte vorsieht:

- Ermitteln einer zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität I ₂ für einen zweiten Teilbereich der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand derselben Schritte wie für die erste bereinigte Fluoreszenzintensität Ii (also anhand eines eigenen ersten Intensitätswerts I _ra w,2 und eines eigenen zweiten Intensitätswerts IBG,2), wobei der zweite Teilbereich von dem ersten

Teilbereich verschieden, insbesondere kleiner als dieser und insbesondere in diesem enthalten ist, und zur Ermittlung des zweiten Intensitätswertes I ₂ entweder i) die aufgenommenen Intensitäten der Bildelemente des betreffenden Bildbereichs in dem oder den anderen

Einzelbildern integriert werden oder ii) der zweite Intensitätswert für den ersten Teilbereich auf die Fläche des zweiten Teilbereichs skaliert wird, und

- Ermitteln eines Koordinatenwertes für den Emitter anhand der ersten bereinigten

Fluoreszenzintensität und der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität, insbesondere anhand eines Quotienten I2/I1 aus der zweiten bereinigten Fluoreszenzintensität I ₂ und der ersten bereinigten Fluoreszenzintensität Ii oder anhand dessen Kehrwert.

Es werden also für zwei verschiedene Teilbereiche derselben Intensitätsverteilung die absoluten Fluoreszenzintensitäten Ii und I2 bestimmt, und zwar jeweils aus der Rohintensität und der Untergrundintensität in dem jeweiligen Teilbereich. Damit ist eine Lokalisierung des Emitters in einer dritten Raumdimension insbesondere superauflösend mit höherer Genauigkeit als im Stand der Technik möglich. Experimentell konnten axiale Positionen superauflösend mit einer Genauigkeit von 16 nm bestimmt werden. Die ermittelte Koordinate kann dabei eine absolute Position beschreiben, muss aber nicht. Es kann sich auch um eine andere, z-abhängige Größe handeln, insbesondere um eine photometrischen Kenngröße.

Vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen der erste Teilbereich und der zweite

Teilbereich identische Formen, insbesondere Kreisflächen, aber unterschiedliche Größen aufweisen, insbesondere in konzentrischer Anordnung zueinander. Das erlaubt die

Lokalisierung in der dritten Dimension mit der höchsten Genauigkeit. Es ist dabei möglich, andere Formen wie Quadrate oder Polygone höherer Ordnung (n-Ecke mit n = 5, 6, 7, 8, ...) zu verwenden. Es ist aber auch möglich, nur radiale Segmente solcher Kreisflächen beziehungsweise solcher Polygone als Teilbereiche zu verwenden.

Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten Teilbereich um einen Kreisring, in dem die bereinigte Intensität Ir vorliegt, und bei dem zweiten Teilbereich um die Kreisfläche im Inneren des Kreisrings, in welcher die bereinigte Intensität I ₂ vorliegt, so kann stattdessen auch als erster Teilbereich die Gesamtfläche des Außenkreises des Kreisrings verwendet werden, in welcher die bereinigte Intensität Ii = Ir + I ₂ vorliegt. Die resultierenden Kehrwerte der obengenannten Quotienten unterscheiden sich lediglich um den Betrag 1 voneinander:

Besonders vorteilhaft sind Ausführungsformen, in denen zwei Einzelbilder mit in der dritten räumlichen Dimension verschiedenen Fokuslagen simultan aufgenommen werden, insbesondere durch Teilung eines Detektionsstrahlengangs auf zwei Abschnitte mit unterschiedlicher optischer Weglänge bis zur Detektion, insbesondere auf verschiedenen Bereichen desselben Detektors. Mit der dadurch erzielbaren größeren Schärfentiefe ist eine hochauflösende axiale Lokalisierung in einem großen Tiefenbereich möglich. Insbesondere können für diese Art der Detektion das Verfahren und das Mikroskop aus

US 2009/242798 AI, deren Inhalt insoweit hier einbezogen wird, verwendet werden.

Experimentell konnte axiale Superauflösung in einem Tiefenbereich von mehr als 800 nm nachgewiesen werden.

Es kann vorteilhaft sein, die zweite bereinigte Fluoreszenzintensität mittels einer

Ausgleichsrechnung anhand einer Modellfunktion für die Intensitätsverteilung im zweiten Teilbereich zu korrigieren oder zu ersetzen, wobei in der Ausgleichsrechnung die ursprünglich ermittelte zweite bereinigte Fluoreszenzintensität verwendet wird. So kann auch Subpixel-Intensitätsinformation berücksichtigt werden. Das kann insbesondere vorteilhaft sein, wenn der zweite Teilbereich nur wenige ganze Pixel umfasst. Vorzugsweise wird die Ausgleichsrechnung mit einer festen (vorgegebenen) Halbwertsbreite durchgeführt.

Zweckmäßigerweise kann der Koordinatenwert anhand von vorgegebenen Kalibrierwerten ermittelt werden, insbesondere anhand einer gespeicherten Tabelle von Quotienten von Fluoreszenzintensitäten für unterschiedliche Koordinatenwerte in der dritten Dimension. Das erlaubt die Ermittlung einer absoluten Position in der dritten Dimension. Zusätzlich können die auf diese Weise ermittelten Koordinaten korrigiert werden, um Abweichungen im

Brechungsindex auszugleichen, wie in„Orientati on imaging of Single molecules by wide-field epifluorescence microscopy" von M. Böhmer & J. Enderlein in J. Opt. Soc. Am. B 20, 554- 559 (2003), oder in„Image analysis of defocused single-molecule images for three dimensional molecule orientation studies" von D. Patra et al. in J. Phys. Chem. A 108, 6836- 6841 (2004).

Auch ohne die hochgenaue Korrektur des statistischen Untergrunds der vereinzelten

Intensitätsverteilung kann erfindungsgemäß eine Lokalisierung in der dritten Dimension anhand einer photometrischen Kenngröße erfolgen. Für ein solches Verfahren zum Auswerten eines zweidimensionalen Mikroskopbildes, das Intensitätsverteilungen von

Fluoreszenzereignissen einer mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Probe enthält, wobei die Intensitätsverteilungen eine jeweilige beugungsbedingte Ausdehnung aufweisen, die einer Ausdehnung einer Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht, und zumindest eine Intensitätsverteilung eines einzelnen der Fluoreszenzereignisse vereinzelt ist, sind folgende Schritte vorgesehen:

- Ermitteln eines integrierten ersten Intensitätswertes in einem ersten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, insbesondere in der gesamten vereinzelten

Intensitätsverteilung,

- Ermitteln eines integrierten zweiten Intensitätswertes in einem zweiten Teilbereich der überlappungsfreien Intensitätsverteilung, wobei der zweite Teilbereich von dem ersten Teilbereich verschieden ist, insbesondere kleiner als der erste Teilbereich und in diesem enthalten ist, und

- Ermitteln einer photometrischen Kenngröße der vereinzelten Intensitätsverteilung anhand des ersten Intensitätswerts und des zweiten Intensitätswerts, insbesondere anhand eines Quotients der beiden Intensitätswerte.

Die ersten und zweiten Intensitätswerte können beispielsweise mittels herkömmlicher Aperturphotometrie um statistischen Untergrund bereinigt werden. Dazu kann ein

Untergrundintensitätswert in einer fiuoreszenzemissionsfreien Umgebung außerhalb der Vereinigungsmenge des ersten und zweiten Teilbereichs, beispielsweise in einem Kreisring um den ersten Teilbereich, ermittelt und, auf die Fläche des jeweiligen Teilbereichs skaliert, jeweils von den integrierten ersten und zweiten Intensitätswerten abgezogen werden, bevor die photometrische Kenngröße ermittelt wird.

Zur Lokalisierung kann der vereinzelten Intensitätsverteilung dann anhand der

photometrischen Kenngröße eine Position in einer dritten räumlichen Dimension zugeordnet werden, insbesondere mit Speicherung des Mikroskopbildes zusammen mit der zugeordneten Position. Die Position kann der Einfachheit halber der ermittelte Wert der Kenngröße selbst sein. Alternativ kann der Wert der Kenngröße anhand von gespeicherten (separat ermittelten) Kalibrierwerten in eine absolute Position umgerechnet werden.

Vorzugsweise wird zur Aufnahme des Mikroskopbildes die Probe mittels mindestens einer Lichtquelle derart bestrahlt und mittels eines Lichtempfängers beugungsbegrenzt

aufgenommen wird, dass mindestens ein Fluoreszenzereignis auftritt, das in dem

aufgenommenen Bild zumindest eine vereinzelte Intensitätsverteilung bewirkt, die eine beugungsbedingte Ausdehnung aufweist, die einer Ausdehnung einer

Punktübertragungsfunktion des Mikroskops entspricht.

Zweckmäßigerweise kann die Probe mit mindestens einer Sorte von transformierbaren Fluorophoren als Emitter markiert sein und vor der Aufnahme eines jeden der Einzelbilder zunächst eine Untermenge der transformierbaren Fluorophore derart in einen anregbaren Zustand transformiert werden, dass die transformierten anregbaren Fluorophore zumindest lokal eine geringere Dichte aufweisen als ein Kehrwert eines beugungsbedingt unauflösbaren Volumens angibt, wobei mittels einer Lichtquelle die Probe zumindest teilweise mit

Anregungslicht bestrahlt wird und zur Aufnahme der Einzelbilder von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung mittels eines Mikroskopobjektivs beugungsverbreitert auf mindestens einen Lichtempfänger abgebildet wird. Das Transformieren kann chemisch oder optisch erfolgen. Das optische Schaltverfahren wird beispielsweise in der PAL-Mikroskopie und der STOR-Mikroskopie verwendet. Nach der Aufnahme des Mikroskopbildes (oder weiterer Mikroskopbilder, also Einzelbilder) können die aktivierten Fluorophore deaktiviert (also in einen nicht anregbaren Zustand transformiert) werden, beispielsweise durch Bleichen. In einem weiteren Aufnahmezyklus kann dann erneut eine (stochastische) Untermenge der transformierbaren Fluorophore mit einer ausreichend geringen Dichte aktiviert und angeregt werden. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird zum Transformieren in den anregbaren Zustand ein Laser-Scanning-Mikroskop verwendet. Dadurch kann lokal, beispielsweise ROI-selektiv, aktiviert, also in den anregbaren Zustand transformiert werden.

In besonderen Ausführungsformen können die Fluoreszenzereignisse von spektral unterschiedlich emittierenden Fluoreszenzfarbstoffsorten stammen. Insbesondere können die Bildelemente der Einzelbilder vor der Ermittlung einer Intensität spektraler entmischt oder separiert werden. Auf diese Weise können mehrere Fluorophorsorten in einer Messung lokalisiert werden.

Zur lateralen Lokalisierung kann vorteilhafterweise ein zweidimensionaler Ort eines

Schwerpunkts einer vereinzelten Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzereignisses mittels einer Ausgleichsrechnung mit sub-beugungsbegrenzter Genauigkeit ermittelt werden. Auf diese Weise kann in allen drei Raumdimensionen Superauflösung erreicht werden.

Die Erfindung umfasst auch Steuereinheiten und Computerprogramme, insbesondere gespeichert auf einem Datenträger, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen

Verfahrens eingerichtet sind.

Insbesondere umfasst die Erfindung ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsstrahlengang mit einer Lichtquelle zur Anregung mindestens einer Art von Fluoreszenzfarbstoffen in einer Probe, insbesondere auch zum Photoaktivieren oder Photoschalten eines

Fluoreszenzfarbstoffs, einem Detektionsstrahlengang mit einem Mikroskopobjektiv und einem diesem nachgeordneten Lichtempfänger und mit einer Steuereinheit, die zur

Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet und mit der Lichtquelle und dem Lichtempfänger verbunden ist. Die Aufnahme von Einzelbildern kann insbesondere unter Anregung von Fluoreszenz ausschließlich in einer dünnen Schicht erfolgen, beispielsweise an einer totalreflektierenden Grenzfläche (TIRF -Mikroskopie).

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 schematisch ein Mikroskop zur Aufnahme von Mikroskopbildern, zur hochgenauen Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität und zur superauflösenden Lokalisierung in drei räumlichen Dimensionen.

Fig. 2 ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur hochgenauen Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität,

Fig. 3 beispielhaft derselbe Probenbereich in verschiedenen Einzelbildern in perspektivischer Darstellung,

Fig. 4 schematisch die Aufteilung einer Intensitätsverteilung zur Lokalisierung in axialer Richtung,

Fig. 5 ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Ermittlung eines axialen Koordinatenwertes P in zwei alternativen Ausführungsformen,

Fig. 6 beispielhafte Ergebnisse für axiale Koordinatenwerte P für Emitter in unterschiedlichen axialen Lagen aus drei verschiedenen Berechnungsmethoden,

Fig. 7 die Auswirkungen unterschiedlicher Größen des ersten Teilbereichs, indem die Intensitätsverteilung eines Fluoreszenzereignis integriert wird, und

Fig. 8 Kalibrierwerte zur Zuordnung absoluter axialer Positionen.

In allen Zeichnungen tragen übereinstimmende Teile gleiche Bezugszeichen. In Fig. 1 ist ein Mikroskop 1, dessen Steuereinheit 34 zur Durchführung des

erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist, schematisch dargestellt. Das Mikroskop 1 ist neben einer Lichtquelle 11 und einer Kamera 12, vor der ein Strahlteiler 13 angeordnet ist, jeweils zur Weitfeldbeleuchtung und -aufnähme zweidimensionaler Bilder auch als Laser- Scanning-Mikroskop (LSM) ausgerüstet. Das LSM ist modular aus einem

Beleuchtungsmodul L mit Lasern 23, einem Abtastmodul S (engl,„scanning module"), einem Detektionsmodul D und der Mikroskopeinheit M mit dem Mikroskopobjektiv 31

zusammengesetzt. Das Licht der Laser 23 kann durch Lichtklappen 24 und Abschwächer 25 von der Steuereinheit 34 beeinflusst werden, bevor es über Lichtleitfasern und

Koppeloptiken 20 in die Abtasteinheit S eingespeist und vereinigt wird. Über den

Hauptstrahlteiler 33 und die X- Y-Abtasteinheit 30 (engl.„Scanner"), die zwei

Galvanometerspiegel aufweist (nicht dargestellt), gelangt es durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Probe 22, wo es ein Fokusvolumen (nicht abgebildet) beleuchtet. Von der Probe reflektiertes Licht oder emittiertes Fluoreszenzlicht gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21 zur Kamera 12 oder über die Abtasteinheit 30 durch den Hauptstrahlteiler 30 in das

Detektionsmodul D. Der Hauptstrahlteiler 30 kann beispielsweise als dichroitischer Farbteiler ausgebildet sein. Das Detektionsmodul D weist mehrere Detektionskanäle mit jeweils einer Lochblende 31, einem Filter 28 und einem Photovervielfacher 32 auf, die durch Farbteiler 29 separiert sind. Anstelle von Lochblenden 31 können, beispielsweise bei linienförmiger Beleuchtung, auch Schlitzblenden (nicht abgebildet) verwendet werden. Die konfokalen Lochblenden 31 dienen der Diskriminierung von Probenlicht, das nicht aus dem

Fokusvolumen stammt. Die Photovervielfacher 32 detektieren daher ausschließlich Licht aus dem Fokusvolumen. Das konfokal beleuchtete und aufgenommene Fokusvolumen der Probe 22 kann mittels der Abtasteinheit 30 über die Probe 22 bewegt werden, um pixelweise ein Bild aufzunehmen, indem die Galvanometerspiegel der Abtasteinheit 30 gezielt verdreht werden. Sowohl die Bewegung der Galvanometerspiegel als auch das Schalten der

Beleuchtung mittels der Lichtklappen 24 oder der Abschwächer 25 werden unmittelbar von der Steuereinheit 34 gesteuert. Die Datenaufnahme von den Photovervielfachern 32 erfolgt ebenfalls über die Peripherieschnittstelle 4.

Der Abbildungsstrahlengang vor der Kamera 12 ist mittels eines Strahlteilers 13 in zwei Abschnitte A, B mit unterschiedlicher optischer Weglänge aufgeteilt, die beide nebeneinander auf unterschiedlichen Bereichen der Kamera 12 enden. Durch die unterschiedlichen optischen Weglängen nehmen diese beiden Bereiche also Bilder aus unterschiedlichen Ebenen der Probe 22 auf. Diese beiden (parallelen) Fokalebenen unterscheiden sich durch ihre Lagen in axialer Richtung. Diese Richtung wird nachfolgend als Dimension z und als z-Richtung bezeichnet.

Die Bildaufnahme mittels Lichtquelle 11 und Kamera 12 ist unabhängig von der Einstellung der Abtasteinheit 30. Die Lichtquelle 11 kann aus zwei von der Steuereinheit 34 schaltbaren Teillichtquellen bestehen, eine erste Teillichtquelle zur Aktivierung (Transformation in einen anregbaren Zustand) von Fluorophoren mit einer Aktivierungswellenlänge und zweite Teillichtquelle zur Anregung dieser Fluorophoren zur Fluoreszenz. Es ist aber auch möglich, dass die Lichtquelle 11 nur eine einzige Wellenlänge emittiert, wenn das verwendete

Vereinzelungsverfahren entsprechend ausgestaltet ist.

Die LSM-Komponenten L, S und D sind nicht notwendig, können aber beispielsweise für eine Aktivierung und Anregung in einzelnen Probenbereichen vorteilhaft sein. Entsprechend kann die Steuereinheit 34 vereinfacht aufgebaut sein, beispielsweise ohne Schnittstellen für solche Komponenten. Beispielsweise kann die Auswerteeinheit/Steuereinheit 34 ein handelsüblicher elektronischer Rechner (engl.„Computer") mit einer Schnittstelle für die Lichtquelle 11 und Kamera 12 sein.

Fig. 2 zeigt ein Flussdiagramm eines beispielhaften, von der Steuereinheit 34 ausgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens zu Ermittlung einer Fluoreszenzintensität, wobei die Schritte zur Aktivierung, Anregung, Identifizierung und 2D-Lokalisierung von Emittern nicht dargestellt sind. Dem Verständnis halber werden zunächst nur Einzelbilder betrachtet, die mit nur einer (konstanten) Fokalebene aufgenommen wurden.

Zur Aufnahme eines Einzelbildes mit ausreichend geringer Dichte von

Fluoreszenzereignissen wird zunächst eine nur geringe Zahl von Fluorophoren mittels der Lichtquelle 11 oder, ortsabhängig, mittels eines der Laser 23 durch einen schwachen

Lichtblitz mit einer Aktivierungswellenlänge in ihren anregbaren Zustand transformiert. Die Auswahl der Untermenge der tatsächlich aktivierten Fluorophore aus der Gesamtmenge aller im jeweiligen Beleuchtungsfeld liegenden Fluorophore geschieht dabei rein stochastisch. Die Dichte der aktivierten Fluorophore ist dabei„ausreichend gering", wenn sie kleiner ist als ein Kehrwert eines beugungsbedingt von dem Objektiv 21 unauflösbaren Volumens. In der Folge haben die aktivierten Fluorophore voneinander Abstände, die überwiegend größer als eine Ausdehnung der PSF des Mikroskopobjektivs 21 sind. Mittels einer von der

Aktivierungswellenlänge verschiedenen Anregungswellenlänge werden die derart

transformierten Fluorophore anschließend angeregt. Dies kann wiederum mit der

Lichtquelle 11 oder, ortsabhängig, mit einem der Laser 23 erfolgen.

Die daraufhin von den angeregten Fluorophoren emittierte Fluoreszenzstrahlung wird mittels der Kamera 12 in ein zweidimensionales Einzelbild („Mikroskopbild") aufgenommen, das vorzugsweise vor der quantitativen Auswertung gespeichert wird. Aufgrund der Beugung des einfallenden Lichts im Mikroskopobjektiv 21 wird jedes Fluoreszenzereignis mit einer Intensitätsverteilung in das betreffende Mikroskopbild abgebildet, deren Ausdehnung der Ausdehnung der Punktübertragungsfunktion des Mikroskopobjektivs 21 entspricht, also in der zweidimensionalen Projektion etwa dem Durchmesser einer Airy-Scheibe. Wegen der Abstände der aktivierten Fluorophore (überwiegend größer als eine Ausdehnung der PSF des Mikroskopobjektivs) sind die Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzereignisse im

Mikroskopbild überwiegend überlappungsfrei.

Die aktivierten Fluorophore werden anschließend durch erneutes Photoschalten oder durch Bleichen deaktiviert und es beginnt ein neuer Aufnahmezyklus mit Aktivierung und

Anregung von Emittern der Art, dass die in der Kamera 12 aufgenommenen

Intensitätsverteilungen der Fluoreszenzemissionen vereinzelt sind, und Aufnahme in ein weiteres Einzelbild. Durch Wiederholung des Aufnahmezyklus werden weitere Einzelbilder aufgenommen.

Anschließend werden die einzelnen Fluoreszenzereignisse im Mikroskopbild identifiziert. Zu diesem Zweck wird das Mikroskopbild beispielsweise zunächst in bekannter Weise mittels eines Gauß-Filters und anschließend mittels eines Laplace-Filters verarbeitet. Diese Filter können beispielsweise als Blockoperatoren (Operatormatrizen) realisiert werden, die pixelweise über das Mikroskopbild geführt werden. Ein Blockoperator bezieht zur Ermittlung einer Intensität eines gefilterten Pixels auch die Intensitäten der umliegenden Pixel ein, also beispielsweise einen Block von 5x5 Pixeln für den Gauß-Filter und insgesamt einen Block von 3x3 Pixeln für den Laplace-Filter. Der Gauß-Filter entfernt Schrotrauschen, der Laplace- Filter entfernt große zusammenhängende Gebiete. Für die Identifikation wird im allgemeinen Fall nur die Existenz eines Fluoreszenzereignisses in einer Region ermittelt, nicht notwendigerweise auch der Ort innerhalb der Region. Dies gelingt beispielsweise durch sektorweises Suchen nach einem Pixel oder einer Pixelgruppe mit einem Intensitätswert, der größer als ein vorgegebener Identifikationsschwellwert ist. Beispielsweise wird die Existenz eines Fluoreszenzereignisses in einem Pixel erkannt, wenn der aufgenommene Intensitätswert des betreffenden Pixels größer als ein Äquivalent von 50 Photonen ist.

In Fig. 3 sind zur Erläuterung des in Fig. 2 dargestellten Verfahrens vier Ausschnitte aus vier Einzelbildern einer Zeitserie dargestellt. Jeder Ausschnitt zeigt denselben Probenbereich zu verschiedenen Zeitpunkten. In allen Ausschnitten ist eine zentrale Kreisfläche Ai mit dem Radius ri (der Übersichtlichkeit halber aber nicht dargestellt) als erster Teilbereich des Einzelbildes durch eine durchgezogene Linie markiert. Diese Kreisfläche wird von einem Kreisring AEZ umgeben, dessen Außenkreis (Radius ΓΕΖ der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt) unterbrochen gezeichnet ist. Im ersten Einzelbild in Fig. 3A liegt eine

Intensitätsverteilung #1 einer anhand des oben dargestellten Lokalisierungsverfahrens identifizierten Fluoreszenzemission eines Emitters innerhalb des ersten Teilbereichs.

Ausgehend vom superauflösend lokalisierten Mittelpunkt der Intensitätsverteilung ergibt sich der erste Teilbereich als Kreisfläche um diesen Mittelpunkt, wobei ihr Radius ri das 1,86- fache der Halbwertsbreite (FWHM) der Intensitätsverteilung #1 beträgt. Durch Integrieren der Intensitäten der Bildelemente über die Fläche Ai kann der Rohintensitätswert Law der

Intensitätsverteilung ermittelt werden. Zur Bereinigung des Rohintensitätswerts I raw muss nun der statistische Untergrund der Fluoreszenzemission ermittelt werden. Dazu dienen andere Einzelbilder.

Der Radius ΓΕΖ beträgt das Doppelte des Radius n. Der durch ihn definierte Kreisring stellt eine Ausschlusszone dar, die in den anderen Einzelbildern frei von Fluoreszenzemissionen sein muss, damit diese zur Ermittlung des statistischen Untergrunds verwendbar sind. Da in dem zweiten Einzelbild in Fig. 3B ein Fluoreszenzereignis #2 die Ausschlusszone schneidet und außerdem ein weiteres Fluoreszenzereignis #3 im zentralen ersten Teilbereich liegt, kann dieses Einzelbild nicht zur Bestimmung und Korrektur des Untergrunds verwendet werden.

Das Fluoreszenzereignis #4 im dritten Einzelbild in Fig. 3C liegt jedoch außerhalb der Ausschlusszone. Auch der zentrale erste Teilbereich ist frei (schraffiert dargestellt). Das dritte Einzelbild kann daher zur Bestimmung des Untergrunds beitragen. Die Intensitäten der Bildelemente innerhalb der Fläche Ai werden daher zu einem ersten Teilwert ΙΑΙ,Ι integriert. Da auch im vierten Einzelbild in Fig. 3D sowohl die Ausschlusszone AEZ als auch der zentrale erste Teilbereich Ai abgesehen vom statistischen Untergrund frei sind, werden auch hier die Intensitäten der Bildelemente innerhalb der Fläche Ai integriert, was einen zweiten Teilwert IAI, ergibt. Aus den Teilwerten ΙΑΙ,Ι und IAI,2 wird der Mittelwert als

Untergrundintensitätswert IBG gebildet.

Schließlich wird aus dem Rohintensitätswert l _mw und dem Untergrundintensitätswert IBG der bereinigte Fluoreszenzintensitätswert Ii berechnet.

In Fig. 4 ist in schematischer Darstellung die Aufteilung einer beispielsweise bereits identifizierten und in zwei Dimensionen lokalisierten Intensitätsverteilung in zwei

Teilbereiche sowie zur Anschauung die unterschiedlichen Ausdehnungen von fiktiven Intensitätsverteilungen von Fluoreszenzemissionen aus unterschiedlichen z-Ebenen dargestellt. In diesem Beispiel werden die Teilbereiche durch konzentrische Kreisflächen mit den Radien n und r ₂ und den Flächeninhalten Ai und A ₂ gebildet.

Fig. 5 zeigt den Ablauf zur Ermittlung einer photometrischen Kenngröße P als axiale Koordinate des betreffenden Emitters. In beiden Teilbereichen der Intensitätsverteilung aus Fig. 4 werden die Intensitäten der Bildelemente in den Flächen Ai und A ₂ zu jeweiligen Rohintensitätswerten I _ra w,i und I _RAW ,2 integriert.

Wie zu Fig. 3 erläutert wird aus mehreren anderen Einzelbildern, in denen der erste

Teilbereich Ai frei von Fluoreszenzemissionen ist, der statistische Untergrund des ersten Teilbereichs in Form eines Untergrundintensitätswertes IBG ermittelt. Dieser wird genutzt, um die Rohintensitätswerte I _ra w,i und I _RAW ,2 zu bereinigen. Zu diesem Zweck wird der

Untergrundintensitätswert IBG, der für den ersten Teilbereich Ai bestimmt wurde, anhand des Verhältnisses der Flächeninhalte A ₂ /Ai auf die Größe des zweiten Teilbereichs A ₂ skaliert.

Aus den derart bereinigten ersten und zweiten Fluoreszenzintensitäten Ii und I ₂ der beiden Teilbereiche wird durch Quotientenbildung die photometrische Kenngröße P als axiale Koordinate des betreffenden Emitters ermittelt und gespeichert.

Alternativ oder zusätzlich kann photometrische Kenngröße P aus einem Quotienten bestimmt werden, in den eine mittels einer Ausgleichsrechnung ermittelte zweite Fluoreszenzintensität lFit,2 als Zähler eingeht. In dieser Ausgleichsrechnung kann, dass eine Gauß-Modellfunktion an die gemessene Intensitätsverteilungen zweiten Teilbereich A ₂ angepasst werden. Als Ausgangsparameter kann dabei die durch Integration ermittelte zweite Fluoreszenzintensität I ₂ in die Auslassrechnung einfließen.

Fig. 6 zeigt Ergebnisse für axiale Koordinatenwerte P für Emitter in unterschiedlichen axialen Lagen aus drei verschiedenen Berechnungsmethoden. Die durch eine Raute markierten Datenpunkte wurden gemäß Fig. 5 durch Integration der gemessenen Intensitäten in zwei konzentrischen Teilbereichen und Abzug des aus anderen Einzelbildern ermittelten

Untergrunds gewonnen. Die beiden anderen Kurven wurden in zwei herkömmlichen

Ausgleichsrechnungen durch Anpassung einer Gauß-Funktion an die Intensitätsverteilung in dem gesamten ersten Teilbereich Ai ermittelt. In der einen Ausgleichsrechnung (Datenpunkte als Quadrate dargestellt) wurde die Halbwertsbreite der Gauß-Funktion fest vorgegeben. In der anderen Ausgleichsrechnung (Datenpunkte als Kreise dargestellt) war die Halbwertsbreite ein freier Parameter. Erkennbar ist die systematische Abweichung des herkömmlichen Verfahrens.

In Fig. 7 ist die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung einer absoluten Fluoreszenzintensität einerseits in Abhängigkeit der Größe des ersten Teilbereichs und andererseits in Abhängigkeit der Anzahl der zur Untergrundbestimmung verwendeten anderen Einzelbilder dargestellt. Erkennbar ist, dass das beste Ergebnis bei einem Radius ri von 1,86 Halbwertsbreiten (markiert durch einen Pfeil) erreicht wird. Ab einer Anzahl von sieben zur Untergrundermittlung verwendeten Einzelbildern sinkt der statistische Fehler nicht weiter signifikant.

Um aus der photometrischen Kenngröße P (dem Quotienten der bereinigten

Fluoreszenzintensitäten in den verschiedenen Teilbereichen einer Intensitätsverteilung) eine absolute Raumposition ableiten zu können, ist eine Kalibrierung erforderlich. Fig. 8 zeigt experimentell ermittelte Kalibrierwerte für die in Fig. 6 beschriebenen unterschiedlichen Auswertungsmethoden. In Fig. 8A ist die z- Abhängigkeit (Median) der Kenngröße P als Funktion der axialen Position eines einzelnen Emitters dargestellt, die mittels eines Piezo-z- Scanners ermittelt wurde. Fig. 8B zeigt die zugehörigen relativen Fehler bei einer Größe der Bildelemente der Kamera 12 von 133 nm, einer Größe des ersten Teilbereichs von ri=6,5 Bildelementen (entsprechend dem 1.86-fachen einer Halbwertsbreite) sowie Mittelung des Untergrunds über sieben andere Einzelbilder.

Fig. 8C zeigt Kalibrierungspunkte für simultane Einzelbildaufnahmen in zwei verschiedenen Fokalebenen (nachfolgend als Kanäle bezeichnet). Sie wurden berechnet als f(chl, ch2) = (Pi- P2)/(Pi+P2), wobei die photometrische Kenngröße PI aus den Einzelbildern des ersten Kanals chl (entsprechend dem Strahlengangabschnitt A) und die photometrischen

Kenngröße P2 aus den Einzelbildern des zweiten Kanals ch2 (entsprechend dem

Strahlengangabschnitt B) ermittelt wurden. Aus einer photometrischen Kenngröße P kann durch Interpolation zwischen den Kalibrierungspunkten eine absolute Position z abgeleitet werden.

Fig. 8D zeigt die bereits interpolierten Kalibrierungskurven, die durch Anpassung von Polynomen ermittelt wurden. Die mit BP bezeichnete Kurve wurde gemäß f(chl, ch2) = -(wi- w ₂ )/(wi+w ₂ ) berechnet, worin wi und W2 für die Halbwertsbreiten der Intensitätsverteilung in Kanal eins und zwei stehen.

Schließlich zeigt Fig. 8E die rohen Kalibrierungskurven, oben für die photometrische

Kenngröße P anhand von experimentell durch bereinigte Intensitätsverhältnisse ermittelten photometrischen Kenngrößen und unten für die zugehörigen Halbwertsbreiten.

Bezugszeichenliste

1 Mikroskop

2 Mikroskopbild

11 Lichtquelle

12 Kamera

13 Strahlteiler

20 Kollimationsoptik

21 Mikroskopobj ektiv

22 Probe

23 Laser

24 Lichtklappe

25 Abschwächer

26 Faserkoppler

27 Tubuslinse

28 Filter

29 Dichroitischer Strahlteiler

30 Scannerspiegel

31 Lochblende

32 Photovervielfacher

33 Hauptstrahlteiler

34 Steuereinheit

D Detektionsmodul

M Mikroskop

L Beleuchtungsmodul

S Abtastmodul

A, B Strahlengangabschnitte