Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe. Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop, insbesondere zum Ausführen eines solchen Verfahrens.

Oftmals ist es bei der Untersuchung einer Probe wichtig, ganze Probenvolumina schnell abbilden zu können. Hierzu kommt insbesondere die Verwendung eines SPIM- Mikroskops in Betracht. Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden.

Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in DE 102 57 423 AI beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung senkrecht zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik, insbesondere mit zwei separaten, zueinander senkrechten Objektiven.

Aus DE 10 2009 044 983 AI ist ein Mikroskop bekannt, das eine Beleuchtungseinrichtung aufweist, mit der ein Lichtblatt zur Beleuchtung eines Probenbereichs erzeugt wird, welches in Richtung einer Beleuchtungsachse eines Beleuchtungsstrahlenganges und in Richtung einer Querachse, welche quer zur Beleuchtungsachse liegt, annähernd flächig ausgedehnt ist. Das Mikroskop weist außerdem eine Detektierungseinrichtung auf, mit der Licht detektiert wird, welches entlang einer Detektierungsochse eines Detektierungsstrahlengangs aus dem Probenbereich abgestrahlt wird, wobei Beleuchtungsachse und Detektierungsochse sowie Querachse und Detektierungsochse in einem von Null verschiedenen Winkel aufeinander stehen, und wobei die Detektierungseinrichtung außerdem im Detektierungsstrahlengang ein Detektierungsobjektiv umfasst. Bei einem solchen Mikroskop umfasst die De†ek†ierungseinrich†ung außerdem ein von einer Frontlinse des De†ek†ierungsobjek†ivs räumlich getrennt angeordnetes und von dieser unabhängig verstellbares optisches Detektierungselement, mittels dessen die Größe eines Detektierungsbildfeldes stufenlos variierbar ist, und/oder mittels dessen eine Detektierungsfokusebene im Probenbereich stufenlos verschiebbar ist.

Aus Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F. & Huisken, J. Rapid 3D light- sheet microscopy with a tunable lens. Opt. Express 21 , 21010 (2013), ist es bekannt, zur schnellen Abbildung von Volumina, ein Light-sheet entlang der Detektionsachse schnell zu verschieben und die Schärfenebene der Detektionsoptik mit einer durchstimmbaren Linse nachzuführen.

Aus DE 10 2013 205 1 15 AI ist eine SPIM-Anordnung mit einer Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines eine Probe beleuchtenden Lichtblatts und einer einen Detektor aufweisenden Detektionseinrichtung für von der Probe ausgehendes Detektionslicht bekannt. Die SPIM-Anordnung ist im Hinblick auf eine effiziente und schonende Probenuntersuchung mit konstruktiv einfachen Mitteln derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die Detektionseinrichtung eine Einrichtung zur Zuordnung verschiedener Fokusebenen des Lichtblatts zu verschiedenen Regionen des Detektors aufweist. Die Einrichtung kann beispielsweise ein Multi-Focus-Grating oder ein Chromatic-Correction-Grating aufweisen.

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, das es erlaubt, ein Probenvolumen schnell und mit hoher Auflösung abzubilden.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Probe gleichzeitig in mehreren, voneinander verschiedenen Probenebenen jeweils entlang einer Linie (Beleuchtungslinie) mit jeweils einem Beleuchtungslichtbündel beleuchtet wird und wobei jeder entlang einer Beleuchtungslinie beleuchtete Probenbereich jeweils mit einer eigenen Detektions-PSF abgetastet und das von den beleuchteten Probenbereichen ausgehende Detektionslicht gleichzeitig und voneinander räumlich separat detektiert wird.

Es ist daher eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskop anzugeben, das es erlaubt, ein Probenvolumen schnell und mit hohem Bildkontrast und hoher Auflösung abzubilden. Die weitere Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das gekennzeichnet ist durch eine Beleuchtungsanordnung, die ein Beleuchtungsobjektiv aufweist und die dazu ausgebildet ist, eine Probe gleichzeitig in mehreren, voneinander verschiedenen Probenebenen jeweils entlang einer Beleuchtungslinie mit jeweils einem Beleuchtungslichtbündel zu beleuchten, und durch eine Detektionsanordnung, die ein Detektionsobjektiv und wenigstens einen Detektor aufweist und die dazu ausgebildet ist, dass jeder entlang einer Beleuchtungslinie beleuchtete Probenbereich jeweils mit einer eigenen Detektions-PSF abgetastet wird und das von den beleuchteten Probenbereichen ausgehende Detektionslicht gleichzeitig und voneinander räumlich separat detektiert wird.

Die Erfindung ermöglicht es bei hoher Auflösung simultan aus unterschiedlichen, insbesondere zueinander parallelen Probenebenen, Bilddaten zu erzeugen, um einen 3D-Stapel an Bilddaten zu gewinnen.

Eine Besonderheit der Erfindung liegt darin, die Probe gleichzeitig in mehreren Probenebenen jeweils entlang einer in der jeweiligen Probenebene liegenden Beleuchtungslinie zu beleuchten. Diese Vorgehensweise ermöglicht in besonders vorteilhafter Weise, die Beleuchtungslinien derart relativ zueinander zu versetzen, dass ein Übersprechen des Detektionslichts aus den einzelnen Probenebenen auf die Detektionskanäle der anderen Probenebenen wirkungsvoll vermieden ist.

Wie Figur 1 illustriert, bildet ein Detektionsobjektiv 1 den Teil des von einem entlang einer ersten Beleuchtungslinie 2 beleuchteten Probenbereich ausgehenden Detektionslichts auf einen Zeilendetektor 3 ab, der in einem keilförmigen Volumen 4 mit einem von der numerischen Apertur des Objektivs 1 abhängigen Öffnungswinkel 2a propagiert. Bezogen auf Figur 1 steht die erste Beleuchtungslinie senkrecht auf der Papierebene (z-Richtung). Die Ausbildung des Detektionsstrahlenganges und insbesondere des Detektionsobjektivs 1 definiert ein Detektionsvolumen, nämlich eine Detektions-PSF 5 (PSF: Point-Spread-Funktion), wobei das von der Detektions-PSF 5 ausgehende Detektionslicht durch das keilförmigen Volumen 4 hindurch zu dem Detektionsobjektiv 1 gelangt. Um zu vermeiden, dass das von einem andern Probenbereich, der entlang einer anderen Beleuchtungslinie beleuchtet ist, ausgehende Detektionslicht von dem „

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De†ek†ionsobjek†iv 1 auf den Zeilendefekfor 3 abgebildet wird, der dem ersten Probenbereich zugeordnet ist, wird die andere Beleuchtungslinie vorzugsweise außerhalb des keilförmigen Volumens 4 mit dem Öffnungswinkel 2a, nämlich in einem der beiden keilförmigen Bereiche 6 mit dem Öffnungswinkel 2ß angeordnet. Dies vorzugsweise derart, dass die andere Beleuchtungslinie in einer anderen Probenebene angeordnet ist, was es erlaubt, durch gleichzeitiges seitliches Verschieben der Beleuchtungslinien simultan zwei unterschiedliche Probenebenen abzutasten, ohne dass es zu einem Übersprechen kommt. Natürlich lässt sich dieses an Hand von zwei Beleuchtungslinien erläuterte Prinzip auch mit einer höheren Anzahl von Beleuchtungslinien verwirklichen, wobei jeweils benachbarte Beleuchtungslinien in der genannten Weise versetzt sind.

In vorteilhafter Weise wird ein Übersprechen dadurch vermieden, dass der Abstand zweier benachbarter Beleuchtungslinien größer ist als die Summe von Beleuchtungsbündel-Radius und dem Radius der benachbarten Detektions-PSF in der Ebene des Beleuchtungsbündels. In ganz besonders vorteilhafter Weise wird die Lage der Beleuchtungslinien so gewählt, dass die Beleuchtungsbündel jeweils nicht im Detektionskegel (der Detektions-PSF) anderer Zeilen in andern Ebenen liegen. Wie bereits erwähnt, erlaubt es die vorliegende Erfindung, mehrere, insbesondere zueinander parallele Probenebenen, simultan jeweils mit mindestens einer Beleuchtungslinie abzutasten, wobei die Beleuchtungslinien, vorzugsweise gleichzeitig, jeweils entlang der Probenebenen (also entlang eines Vektors parallel zu einer Probenebene) verschoben werden. Hierbei kann insbesondere vorgesehen sein, dass die Beleuchtungslinien in einer Richtung entlang der Probenebenen und senkrecht zur Beleuchtungslichtausbreitungsrichtung versetzt zueinander angeordnet sind. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass die Beleuchtungslinien in Richtung entlang der Probenebenen und senkrecht zur optischen Achse eines Detektionsobjektivs versetzt zueinander angeordnet sind. Wie bereits erläutert, ist es zur Vermeidung eines Übersprechens von besonderem Vorteil, wenn in dem von einem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtbündel keine andere der Beleuchtungslinien angeordnet ist.

Ein besonders hoher Bildkontrast kann dadurch erreicht werden, dass bezogen auf jede Beleuchtungslinie jeweils eine konfokale Liniendetektion erfolgt. Dies wird durch Verwendung einer zur Beleuchtungslinie konfokal angeordnete Spal†de†ek†oranordnung erreicht.

Beispielsweise kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das jeweils von einem entlang einer Beleuchtungslinie beleuchteten Probenbereich ausgehenden Detektionslicht von einem Detektor, insbesondere einem Flächendetektor, detektiert wird, dem eine Spaltblende vorgeschaltet ist. Eine solche Spaltblende kann beispielsweise durch ein optisches Element gebildet sein, bei dem eine einen Spalt freilassende Oberfläche verspiegelt ist. Die Verwendung einer mechanischen Spaltblende ist jedoch insoweit aufwendig, weil beim Verschieben der Beleuchtungslinie gleichzeitig auch ein Verschieben der Spaltdetektoranordnung oder alternativ ein Descannen des Detektionslichts, beispielsweise mittels einer im Detektionsstrahlengang angeordneten, hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung, erfolgen muss, damit das von der bewegten Beleuchtungslinie ausgehende Detektionslicht jeweils die Spaltblende treffen kann. Weitere Details hierzu finden sich insbesondere weiter unten unter Bezugnahme auf die Ausführungsbeispiele.

Insbesondere kann es sich bei der vorgeschalteten Spaltblende um einen mechanischen Verschlussvorhang, wie er in Spiegelreflexkameras Verwendung findet, handeln. Der Flächendetektor kann bei dieser Ausführung bezüglich seiner gesamten Sensorfläche, insbesondere auch während die Spaltblende synchron zu dem entlang der Beleuchtungslinien bewegten Beleuchtungslichtbündel bewegt wird, aktiv sein.

Die Spaltblende kann besonders vorteilhaft auch als nicht-mechanisches Bauteil ausgeführt sein. Beispielsweise kann die Spaltblende als abschnittsweise schaltbarer Spiegel oder als abschnittsweise schaltbarer Absorber, z.B. auf Basis von Flüssigkristallen, ausgebildet sein.

Alternativ ist es auch möglich, dass das jeweils von einem entlang einer Beleuchtungslinie beleuchteten Probenbereich ausgehende Detektionslicht von einem Detektor detektiert wird, der als Spaltdetektor fungiert, wobei der Spaltdetektor durch den jeweils aktiv geschalteten Teil eines Flächendetektors, beispielsweise eines CMOS-Detektors oder sCMOS-Detektors, gebildet ist. Es ist beispielsweise vorteilhaft möglich, lediglich einen Teil des Flächendetektors, nämlich den Teil, der gerade dem Spaltdetektor entspricht, auszulesen (aktiv geschalteter Teil), während die übrigen Teile des Flächendetektors, nämlich die Teile, die außerhalb des Spaltdetektors liegen, nicht ausgelesen werden (nicht aktiv geschalteter Teil). Auf diese Weise ist auch eine konfokale Defekfion möglich.

Bei einer solchen Ausführung sind mechanische Baufeile, wie beispielsweise eine zusätzliche mechanische Spalfblende, vermieden, was insbesondere von Vorteil ist, wenn es darum geht, den Spalfdetekfor in der Defektionsebene zu verschieben. Bei einer solchen Ausführung kann nämlich der Flächendefektor, insbesondere relativ zum Detekfionsobjektiv und/oder zum Beleuchfungsobjektiv und/oder zur Probe und oder relativ zum einfallenden Defektionslichf, ortsfest bleiben, wobei zeitlich nacheinander unterschiedliche Teile der Sensorfläche des Flächendefektors, die dann jeweils den Spalfdetekfor bilden, aktiv geschaltet werden; nämlich derart, dass jeweils ausschließlich das auf den aktiv geschalteten Teil fallende Defektionslichf defektierf wird, während Detekfionslicht, das auf die jeweils inaktiv geschalteten Teile des Flächendetekfors fällt, nicht defektierf wird.

Wenn die jeweils zeitlich unmittelbar nacheinander aktiv geschalteten Teile des Flächendetekfors jeweils räumlich unmittelbar nebeneinander liegen, resultiert im Ergebnis eine räumlich ununterbrochener Bewegung des Spalfdetekfors, ohne dass hierfür mechanische Baufeile bewegt werden müssen. Konkret kann beispielsweise ein Bereich aktiv geschalteter Pixel gleichförmig und synchron zu einem entlang einer Beleuchtungslinie beleuchtenden Beleuchtungslichfbündel an der Sensorfläche des Flächendefektors entlang laufen. Insoweit hat eine solche Ausführung den besonderen Vorfeil einer großen Langlebigkeit, weil ein bewegungsbedingfer Verschleiß, beispielsweise von mechanischen Blendenden, vermieden ist.

Bei einer besonderen Ausführung ist jedem beleuchteten Probenbereich ein eigener Detektor zugeordnet. Insbesondere können hierbei die den unterschiedlichen Probenbereichen zugeordneten Detektoren in unterschiedlichen Defektionsebenen angeordnet sein und damit dem Umstand Rechnung tragen, dass die jeweils entlang einer Beleuchtungslinie beleuchteten Probenbereich in unterschiedlichen Probenebenen angeordnet sind. Alternativ ist es auch möglich, dass jedem beleuchteten Probenbereich ein eigener Detekfionsbereich auf einem gemeinsamen Flächendefektor zugeordnet ist. Um zu erreichen, dass bei der Verwendung eines gemeinsamen Flächendefektors das Defektionslichf aller Probenbereiche in dieselbe Detekfionsebene, nämlich die Defektionsebene des Flächendefektors, fokussierf wird, können in den unterschiedlichen Detekfionsstrahlenggangzweigen unterschiedliche Elemente zur Anpassung des optischen Lichtwegs, beispielsweise unterschiedlich dicke Glasblöcke, und/oder unterschiedliche Fokussierende oder defokussierende Elemente, beispielsweise einstellbare Linsen, angeordnet sein. Bei einer besonderen Ausführung wird das von der Probe ausgehende Detektionslicht in Abhängigkeit vom Ort seiner Entstehung, also dem Ort des jeweils mit einer Beleuchtungslinie beleuchteten Probenbereichs, mittels wenigstens eines Strahlteilers auf unterschiedliche Detektionsstrahlengangzweige aufgeteilt. Das anhand der Figur 1 oben erläuterte Prinzip ist auch realisierbar, indem die Probe gleichzeitig wenigstens entlang zweier benachbarter Beleuchtungslinien, statt mit jeweils einem eigenen Beleuchtungslichtbündel, mit einem beide Beleuchtungslichtlinien gleichzeitig beleuchtenden Lichtblatt beleuchtet wird. Hierbei ist die Lichtblattebene vorzugsweise schräg, also in einem von Null Grad verschiedenen Winkel zu den Probenebenen angeordnet. Durch die Schrägstellung des Lichtblattes kann vorteilhaft ein Übersprechen des Detektionslichts der einen Beleuchtungslinie den der anderen Beleuchtungslinie zugeordneten Detektor reduziert werden. Um dies zu erreichen kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass der Parallelversatz Δχ benachbarter Beleuchtungslinien größer ist, als die Summe von Detektions-PSF-Radius und halber Ausdehnung des Lichtblattes in Richtung der Probenebene senkrecht zur Lichtausbreitungsrichtung, wie dies Figur 3 illustriert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise in der Weise ausgeführt werden, dass das Beleuchtungslicht mittels eines Beleuchtungsobjektivs fokussiert wird und dass das von der Probe ausgehende Detektionslicht ein Detektionsobjektiv durchläuft, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die optische Achse des Detektionsobjektivs in zueinander senkrechten Ebenen angeordnet sind.

Bei einer besonders flexibel ausführbaren Ausführungsform, bei der insbesondere eine gute Probenzugänglichkeit ermöglicht ist, sind die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die optische Achse des Detektionsobjektivs parallel oder koaxial zueinander ausgerichtet. Insbesondere kann dem Beleuchtungsobjektiv ein Umlenkmittel nachgeordnet sein, das das Beleuchtungslicht, nachdem es das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat, beispielsweise im rechten Winkel, umlenkt. Ein solcher Aufbau ermöglicht außerdem die Verwendung von aufrechten oder inversen Standard-Mikroskopstativen. Das erfindungsgemäße Mikroskop kann vorteilhaft auf der Basis eines Rastermikroskops, insbesondere auf der Basis eines konfokalen Rastermikroskops, aufgebaut sein. Von besonderem Vorteil ist insoweit die Verwendung eines (möglicherweise in einem Labor ohnehin vorhandenen) Rastermikroskops zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Wie bereits erwähnt, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Beleuchtungslichtbündel in den Beleuchtungsebene relativ zur Probe bewegt werden. Hierzu kann beispielsweise eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung verwendet werden. Eine solche Strahlablenkeinrichtung kann beispielsweise wenigstens einen Galvanometerspiegel aufweisen. Insbesondere kann beispielsweise auch die ohnehin vorhandene Strahlablenkvorrichtung eines Rastermikroskops, insbesondere eines konfokalen Rastermikroskops, verwendet werden; dies insbesondere wenn das erfindungsgemäße Mikroskop durch Umrüstung eines Rastermikroskops hergestellt ist oder das erfindungsgemäße Verfahren mithilfe eines Rastermikroskops ausgeführt wird.

Zur Erzeugung der entlang der Beleuchtungslinien beleuchtenden Beleuchtungslichtbündel sind viele Methoden möglich. Beispielsweise kann ein einfaches Gitter oder ein spezielles diffraktives Element, das genau die gewünschte Zahl der Strahlen erzeugt und das gleichzeitig vorzugsweise auch dafür sorgt, dass alle Beleuchtungslichtbündel gleich hell sind, in einer zur Pupille des Beleuchtungsobjektivs konjugierten Ebene angeordnet sein. Wichtig ist dabei, dass der gewünschte Strahlversatz entlang der Detektionsachse mit einem ausreichenden Versatz in Richtung der Probenebenen verbunden wird. Dies kann bei einem Gitter dadurch erreicht werden, dass die Gitterstruktur in der x-y-Ebene (also um die optische Achse des Beleuchtungsstrahlengangs) gedreht wird. Es ist, alternativ oder zusätzlich, auch eine Aufspaltung über die Polarisation mit Hilfe von doppelbrechenden Materialien oder durch Verwendung von akustooptischen Bauteilen möglich. Das Gitter kann z.B. auch flexibel durch einen SLM (Spatial Light Modulator) realisiert sein.

Des Weiteren ist es auch möglich, bei Einsatz mehrerer Fluorophore in der Probe in unterschiedlichen Probenebenen unterschiedliche Fluorophore, beispielsweise mit verschiedenen Laserlinien, anzuregen. In der Folge kann dann eine Trennung im Detektionsstrahlengang mit Hilfe von chromatischen Filtern, insbesondere chromatischen Bandpassfiltern, und/oder mit Hilfe von chromatischen Strahlteilern erfolgen.

Das erfindungsgemäße Mikroskop kann vorteilhaft eine, insbesondere elektronische und/oder computerbasierte, Steuerungsvorrichtung aufweisen, die die Bewegung des entlang der Beleuchtungslinien beleuchtenden Beleuchtungslichts und/oder die Bewegung der Spaltdetektoren oder einer descannenden Strahlablenkeinrichtung synchron steuert.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Detektionsstrahlengangs zur Erläuterung der Zusammenhänge bei der Detektion,

. 2 eine schematische Darstellung der Beleuchtung und

Detektionsstrahlengangs eines ersten Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops, eine schematische Darstellung der Beleuchtung und

Detektionsstrahlengangs eines zweiten Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops,

. 4 eine schematische Darstellung der Beleuchtung und

Detektionsstrahlengangs eines dritten Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops, eine schematische Darstellung der Beleuchtung und

Detektionsstrahlengangs eines vierten Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops eine schematische Darstellung der Beleuchtung und

Detektionsstrahlengangs eines fünften Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops,

Fig. 7 eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des _Λ „

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De†ek†ionss†rahlengangs eines sechsten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops, und

Fig. 8 schemafisch ein Beispiel einer Anordnung zum Erzeugen mehrerer Beleuchfungslichfbündel zum simultanen Beleuchten entlang mehrerer versetzter Beleuchtungslichflinien.

Fig. 2 zeigt eine schemafische Darstellung der Beleuchtung und des Defektionssfrahlengangs eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird eine Probe entlang einer ersten Beleuchfungslinie 7, die senkrecht auf der Zeichenebene steht, mittels eines ersten Beleuchfungslichtbündels 8, das sich entlang der erste Beleuchfungslinie 7 ausbreitet, beleuchtet. Das erste Beleuchfungslichtbündel 8 weist einen Beleuchtungslichfbündel-Radius p auf. Die erste Beleuchtungslinie 7 befindet sich in seiner ersten Probenebene 9. In einer zweiten Probenebene 1 0, die parallel zur ersten Probenebene 9 angeordnet ist, wird die Probe entlang einer zweiten Beleuchfungslinie 1 1 mittels eines zweiten Beleuchfungslichtbündels 1 2, das sich entlang der zweiten Beleuchfungslinie 1 1 ausbreitet, beleuchtet. Die zweite Beleuchfungslinie 1 1 ist parallel zur ersten Beleuchtungslinie 7 angeordnet. Die zweite Beleuchfungslinie 1 1 ist um den Befrag Δχ senkrecht zur optischen Achse eines Detekfionsobjektivs 1 versetzt angeordnet, wobei die erste Probenebene 9 und die zweite Probenebene 1 0 einen Absfand Ay zueinander aufweisen.

Darüber hinaus wird die Probe entlang einer dritten Beleuchtungslinie 1 3 in einer driften Probenebene 1 4 mittels eines dritten Beleuchfungslichtbündels 1 5 beleuchtet. Das von dem mittels des ersten Beleuchfungslichtbündels 8 beleuchteten Probenbereich ausgehende Detekfionslicht wird über eine Defektionsobjekfiv 1 (bzw. eine Defektionsopfik) auf einen ersten Zeilendetektor 1 6 abgebildet. Das von dem mittels des zweiten Beleuchfungslichtbündels 1 2 beleuchteten Probenbereich ausgehende Detekfionslicht wird auf einen zweiten Zeilendetektor 1 7 abgebildet. Das von dem mittels des dritten Beleuchfungslichtbündels 1 5 beleuchteten Probenbereich ausgehende Detektionslicht wird auf einen dritten Zeilendetektor 1 8 abgebildet. Die Zeilendetektoren 1 6, 1 7 und 1 8 befinden sich in unterschiedlichen Defektionsebenen, die zu den jeweiligen Beleuchfungsebenen konjugiert sind. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel erfolgt eine Beleuchtung exemplarisch mit drei Beleuchtungslichfbündeln 8, 1 2, 1 5 und eine Detekfion mit drei Zeilendetekforen 1 6, _{Λ Λ}

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1 7, 1 8. Prinzipiell gibt es jedoch keine Grenze der Zahl der verwendbaren Beleuchtungslichtbündel und der beleuchteten Probenebenen. Insoweit ist es auch möglich, die Probe geleichzeitig mit einer noch höheren Anzahl von Beleuchtungslichtbündeln in einer noch höheren Anzahl von Probenebenen zu beleuchten.

Der Versatz Δχ benachbarter Beleuchtungslinien in x-Richtung ist so gewählt, dass gilt: Δχ > δ + ρ. Hierbei ist die Größe δ der Radius der Detektions-PSF in der jeweiligen Probenebene 9, 10, 1 4 (grob δ = Aytan(a), wobei a = arcsin(NA/n) der objektseitige Öffnungswinkel, NA die numerische Apertur und n der Brechungsindex ist) und p die Strecke, die sich über die Formel p = r/cos(a) aus dem Radius r des jeweilig benachbarten Beleuchtungslichtbündels ergibt. Die von den drei Beleuchtungslichtbündeln 8, 1 2, 1 5 beleuchteten Probenbereiche werden auf Grund der gewählten Geometrie scharf auf die Detektoren in entsprechenden Bildebenen abgebildet, wobei ein Übersprechen auf die jeweils anderen Detektoren vermieden ist.

Der Versatz Ay benachbarter Beleuchtungslinien in y-Richtung wird beispielsweise so gewählt, dass die Summe der Radien r der entsprechenden Beleuchtungslichtbündel größer ist als Ay. (Dies ist in Figur 2 nicht gezeigt.)

Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des Detektionsstrahlengangs eines zweiten Ausführungsbeispiels, bei dem im Gegensatz zu dem in Figur 2 dargestellten Beispiel eine Beleuchtung der Beleuchtungslinien 7, 1 1 , 1 3 nicht mit einzelnen, räumlich separaten Beleuchtungslichtbündeln 8, 12, 15, sondern vielmehr mit einem schräg gestellten Lichtblatt 19 erfolgt. Das Lichtblatt 1 9 propagiert in Richtung der Beleuchtungslinien 7, 1 1 , 13 (also senkrecht zur Zeichenebne) . Durch die Schrägstellung der Lichtblattebene des Lichtblatts 19 relativ zu den Probenebenen

9, 10, 14 ist eine Beleuchtung entlang der in unterschiedlichen Beleuchtungsebenen 9,

1 0, 14 angeordneten Beleuchtungslinien 7, 1 1 , 1 3 möglich, wobei durch die Verwendung von Zeilendetektoren ebenfalls ein Übersprechen, zumindest bis zu einem gewissen Grad, vermieden wird. Diese Ausführung ist optisch nicht ganz so hochwertig, wie die in Figur 2 dargestellte Ausführung, weil sich ein Übersprechen nur in einem geringeren Maße vermeiden lässt, was im Wesentlichen auf die zwangsläufig größere Dicke des Lichtblattes 19 zurückzuführen ist.

Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des Detektionsstrahlengangs eines dritten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Das Beleuchtungslichtbündel 8, das einen Probenbereich entlang einer _Λ „

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Beleuchtungslinie 7 in einer ersten Probenebene beleuchtet, das zweite Beleuchtungslichtbündel 1 2, das einen zweiten Probenbereich entlang einer zweiten Beleuchtungslinie 1 1 in einer zweiten Probenebene 10 beleuchtet, und das dritte Beleuchtungslichtbündel 1 5, das einen dritten Probenbereich entlang einer dritten Beleuchtungslinie 1 3 in einer dritten Probenebene 1 4 beleuchtet, werden gleichzeitig entlang der Probenebenen 9, 10, 1 4 verschoben, um jede der Probenebenen 9, 1 0, 14 sukzessive abzutasten und um im Ergebnis einen 3D-Stapel von Daten der Probe zu erzeugen.

Der Detektionsstrahlengang weist einen Umlenkspiegel 22 auf, mittels dem das von dem ersten, mittels des ersten Beleuchtungslichtbündels 8 beleuchteten, Probenbereich ausgehende Detektionslicht auf einen ersten Flächendetektor 23 gelenkt wird. Der Detektionsstrahlengang weist darüber hinaus einen ersten Strahlteiler 21 auf, der das von dem mittels des zweiten Beleuchtungslichtbündels 12 beleuchteten Probenbereich ausgehende Detektionslicht auf einen zweiten Flächendetektor 24 umlenkt. Der Detektionsstrahlengang beinhaltet außerdem einen zweiten Strahlteiler 20, der das von dem mit dem dritten Beleuchtungslichtbündel 15 beleuchteten Probenbereich ausgehende Detektionslicht zu einem dritten Flächendetektor 25 umlenkt.

Die Flächendetektoren 23, 24, 25 sind derart angeordnet, dass es jeweils zu einer scharfen Abbildung der beleuchteten Probenbereiche kommt. Bei der Detektion wandern die Foki der jeweiligen Detektionsteillichtbündel entsprechend der Bewegung der Beleuchtungslichtbündel 8, 1 0, 15 auf der Oberfläche der Flächendetektoren 23, 24, 25 entlang. Hierbei kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass jeweils nur ein schmaler Streifen jedes Flächendetektors 23, 24, 25 aktiv geschaltet wird, während die Nachbarbereiche jeweils inaktiv geschaltet sind. Auf diese Weise ist jeweils ein Spaltdetektor realisiert, der eine konfokale Detektion erlaubt.

Durch Beschälten der Flächendetektoren 23, 24, 25 synchron zur Bewegung der Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 kann ein Mitbewegen des jeweils aktiv geschalteten Teils des jeweiligen Flächendetektors 23, 24, 25 und damit eine Art„rolling-shutter" also eine sich synchron zur Bewegung der Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 mitbewegende Spaltdetektoranordnung realisiert werden. Eine besonders vorteilhafte Unterklasse dieser Methode besteht darin, in unterschiedlichen Probenebenen unterschiedliche Fluorophore, beispielsweise mit verschiedenen Laserlinien, anzuregen. In der Folge kann dann eine Trennung im Detektionsstrahlengang mit Hilfe I

von chromatischen Filtern, insbesondere chromatischen Bandpassfiltern, und/oder mit Hilfe von chromatischen Strahlteilern erfolgen.

Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des Detektionsstrahlengangs eines vierten Ausführungsbeispiels. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist im Detektionsstrahlengang eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 26, die einen mittels eines Galvanometerantriebs drehbar gelagerten Spiegel 27 beinhaltet. Die Strahlablenkeinrichtung ist synchron zur Bewegung der Beleuchtungslichtbündel 8, 10, 12 derart gesteuert, dass die Foki des Detektionslichts, anders als bei der in Figur 4 dargestellten Ausführung, nicht auf der Oberfläche der Zeilendetektoren 1 6, 17, 18 wandern, sondern vielmehr ortsfest bleiben. Eine solche Ausführung hat den besonderen Vorteil, dass insbesondere auch feststehende mechanische Blenden verwendet werden können.

Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des Detektionsstrahlengangs eines fünften Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Im Gegensatz zu der in Figur 5 dargestellten Ausführung ist ein einziger Flächendetektor 28 vorhanden, wobei jedem beleuchteten Probenbereich ein eigener Detektionsbereich auf dem gemeinsamen Flächendetektor 28 zugeordnet ist. Um zu gewährleisten, dass sämtliche Detektionslichtbündel scharf auf dem Flächendetektor 28 abgebildet sind, ist in jedem der Teildetektionsstrahlengänge ein Mittel 29 zur Beeinflussung der optischen Weglänge angeordnet. Hierbei handelt es sich um einen ersten dünneren Glasblock 30, einen zweiten etwas dickeren Glasblock 31 und einen dritten noch dickeren Glasblock 32. Die Glasblöcke können zur Vermeidung von Aberrationen, insbesondere sphärischer Aberrationen, einen entsprechend geformte Oberfläche aufweisen.

Figur 7 zeigt eine schematische Darstellung der Beleuchtung und des Strahlengangs eines sechsten Ausführungsbeispiels. Dieses Ausführungsbeispiel beinhaltet im Detektionsstrahlengang eine weitere, hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung, um die durch konfokale Blenden 33 gefilterten Streifenbilder synchron zur Bewegung der Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 wieder zu scannen, wodurch mit jeweils einem Flächendetektor 23, 24, 25, ohne dass ein räumlich fortlaufendes Aktivschalten nötig ist, direkt konfokale Bilddaten der einzelnen Probenebenen aufgenommen werden können.

Figur 8 zeigt schematisch ein Beispiel einer Anordnung zum Erzeugen mehrerer Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 zum simultanen Beleuchten entlang mehrerer versetzter Beleuchtungslinien. Die Anordnung weist ein Gitter 34 auf, das ein primäres _{Λ Λ}

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Beleuchtungslichtbündel 35, das insbesondere von einer Laserlichtquelle erzeugt sein kann, räumlich aufspaltet. Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 durchlaufen anschließend eine Teleskopanordnung 36, die zusätzlich auch einen Filter 41 beinhalten kann. Anschließend folgt eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 37, um die Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 jeweils in ihren Probenebenen bewegen zu können. Die von der Strahlablenkeinrichtung 37 kommenden Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 passieren eine Scanlinse 38, eines Tubuslinse 39 und gelangen schließlich zum Beleuchtungsobjektiv 40. Nach dem Passieren des Beleuchtungsobjektivs 40 gelangen die Beleuchtungslichtbündel 8, 12, 15 direkt oder nach einer erneuten Umlenkung zur (hier nicht dargestellten) Probe.

Bezuqszeichenliste:

1 Objektiv

2 Beleuchtungslinie

3 Zeilendetektor

4 keilförmiges Volumen

5 Detektions-PSF

6 keilförmige Bereiche

7 erste Beleuchtungslinie

8 erstes Beleuchtungslichtbündel

9 erste Probenebene

1 0 zweite Probenebene

1 1 zweite Beleuchtungslinie

1 2 zweites Beleuchtungslichtbündel

1 3 dritte Beleuchtungslinie

1 4 dritte Probenebene

1 5 drittes Beleuchtungslichtbündel

1 6 erster Zeilendetektor

1 7 zweiter Zeilendetektor

1 8 dritter Zeilendetektor

1 9 Lichtblatt

20 Zweiter Strahlteiler

21 Erster Strahlteiler

22 Umlenkspiegel

23 erster Flächendetektor

24 zweiter Flächendetektor

25 dritter Flächendetektor

26 Strahlablenkeinrichtung

27 drehbar gelagerter Spiegel

28 Flächendetektor

29 Mittel zur Beeinflussung der optischen Weglänge

30 Erster Glasblock

31 Zweiter Glasblock

32 Dritter Glasblock

33 konfokale Blenden

34 Gitter , _

16 primäres Beleuchtungslichtbündel Teleskopanordnung

Strahlablenkeinrichtung

Scanlinse

Tubuslinse

Beleuchtungsobjektiv

Filter