Verfahren zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in Zellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veränderung des ATP/ADP-Verhältnisses in einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze durch änderung der Hemprotein Aktivität in der Zelle sowie dessen Verwendung.

Adenosintriphosphat (ATP) wird sowohl im Prozeß der Photosynthese als auch bei der Atmung aus ADP (Adenosindiphosphat) und energiereichen Phosphatsbindungen gebildet. Dabei handelt es sich um endergonische Reaktionen. Das energiereiche ATP wird mittels ATPasen hydrolisiert, wobei Energie frei wird. Da die meisten Prozesse in der Zelle endergonisch verlaufen werden sie erst durch die Kopplung mit einer zweiten exergonischen Reaktion möglich, bei der es sich in den meisten Fällen die Hydrolyse von ATP handelt.

Die Hydrolyse von ATP zu ADP dient dabei als treibende Kraft bei vielen biochemischen Prozessen wie z. B. aktiver Transport durch Membranen, Biosynthese von Lipi- den, Proteinen, Kohlenhydraten oder Nukleinsäuren.

Somit ist ATP in der Zelle ein Energieüberträger der die Energie für letztendlich jede Aktivität der Zelle oder des Organismus liefert . Jeder Organismus verwendet somit ATP als primäre Energiequelle. Dadurch kommt ATP eine Schlüsselrolle in den Stoffwechsel der Zelle zu. ATP hat aber andererseits eine sehr kurze Halbwertszeit ("Lebensdauer") und deshalb praktisch keine Speicherkapazität.

Das ATP-ADP-Verhältnis ist ein wichtiger Parameter des Energiemetabolismus. Ein hohes ATP-ADP-Verhältnis bedeutet einen Energieüberschuß. Bei Energiemangel in der Zelle verbrauchen sich die intrazellulären ATP Reserven und das ATP-ADP- Verhältnis wird in Richtung ADP verschoben.

Die Expression von Hemoglobin oder verwandter Proteine ist aus dem Stand der Technik bekannt.

Aus dem US Patent 6,372,961 ist die Expression von Genen kodieren für Hemoglobin bekannt, wodurch der Sauerstoff Metabolismus in Pflanzen erhöht wird. Dieser erhöhte Sauerstoff oder ATP Gehalt kann die Biosynthese in den Pflanzen beeinflussen.

Aus der WO 98/12913 ist ein Verfahren zur Erhöhung der Sauerstoff-Assimilation bekannt welches auf Expression von Hemoglobin - Proteinen basiert. Ferner wird in dieser Druckschrift offenbart, daß eine Erhöhung der Produktion von Sekundärmetaboliten

auf einer gleichzeitigen Erhöhung der ATP-Konzentration zurückgeführt werden kann. Des weiteren ist aus der WO 00/00597 bekannt, daß die Expression von nichtsymbioti- schen Hemoglobin in Zellen zu einer Erhöhung des ATP - Gehalts führt. Die Expression von Hemoglobin und Verwandtenproteinen wurde gemäß WO 99/02687 A eingesetzt um den Eisengehalt in Zellen zu erhöhen.

In der WO 2004/057946 A wird durch die Expression von Leghemoglobin ein höherer Ertrag von Stärke und öl in Pflanzen erreicht.

Aus der Druckschrift WO 2004/087755 ist ein Verfahren bekannt zur Erhöhung der Streßresistenz von Pflanzen und der daraus gewonnenen Ausbeute beruhend auf der Expression von pflanzlichen der Klasse zwei.

Die Expression von Leghemoglobin in Pflanzenzellen ist ferner aus Barata et al: (Plant Science; Vol.155; June 2000, 193-202) bekannt, worin die Sauerstoff-Verfügbarkeit untersucht wird.

Eine Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses ist aus dem Stand der Technik nicht be- kannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen, durch welches der Zelle bzw. dem Organismus mehr ATP und somit mehr Energie zur Verfügung steht. Insbesondere sollte ATP auch als Energiespeicher genutzt werden, das heißt es soll eine Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses erzielt werden. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es die so zur Verfügung gestellte Energie gezielt für die Synthese von Fettsäuren, insbesondere alpha-Linolensäure (eis, eis, cis-9,12,15-Octadecatriensäuere)

Diese Aufgaben werden dadurch gelöst, daß im erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung des ATP-ADP-Verhältnisses in einer Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorga- nismus oder Pflanze die Aktivität mindestens eines Hemproteins verändert wird.

überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß durch die Veränderung der Aktivitäten mindestens eines Hemproteins Zellen, Organe, Gewebe, Mikroorganismen oder Pflanzen hergestellt werden, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.

Unter dem ATP-ADP-Verhältnis ist das Verhältnis der Konzentration von ATP zu der Konzentration von ADP zu verstehen. Die Konzentrationen können mit den gängigen, dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden, z.B. mittels 31 -P-NMR- Spektroskopie in intrazellulärer Messung oder wie nachfolgend in den Beispielen beschrieben.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff Zelle: Zellen, Teile von Pflanzen wie Organe oder Gewebe so wie ganze Pflanzen und Mikroorganismen.

Hemproteine sind Proteine die in der Lage sind Sauerstoff über eine prosthetische Gruppe zu binden, wie zum Beispiel nichtsymbiontisches Hemoglobin, Myoglobin oder Leghemoglobin, bevorzugt Leghemoglobin und nichtsymbiontisches Hemoglobin, besonders bevorzugt Leghemoglobin.

"Aktivität eines Hemproteins", bedeutet die Fähigkeit des Polypeptids Sauerstoff an die prosthetische Gruppe (hem) zu binden. Darunter werden erfindungsgemäß Eisen-Il- Komplexe des Protoporphyrins verstanden. Eine änderung der Aktivitäten eines Hemproteins in einer Zelle meint die Fähigkeit mehr oder weniger Sauerstoff in der Zelle zu binden im Vergleich zu Zellen des Wildtyps derselben Gattung und Art auf weiche die erfindunggemäßen Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Zellen etc.). Die änderung, Erhöhung oder Erniedrigung, bevorzugt Erhöhung, im Vergleich zu dem Wildtyp beträgt dabei mindestens 1 %, 2%, 5%, 10 %, bevorzugt mindestens 10 % oder mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 40 % oder 60 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70 % oder 80 %, am meisten bevorzugt um mindestens 90 %, 95 % oder mehr. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung beträgt das ATP-ADP-Verhältnis mindestens 200%, bevorzugt 300%, besonders bevorzugt mindestens 400% oder mehr bezogen auf das ATP-ADP-Verhältnis des Wildtyps.

Der Vergleich wird bevorzugt unter analogen Bedingungen durch geführt. "Analoge Bedingungen" bedeutet, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Kultur- o- der Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate, Kon- zentration etc.) zwischen den zu vergleichenden Versuchen identisch gehalten werden und die Ansätze sich allein durch die Aktivität von Hemproteinen unterscheiden.

Verändern bedeutet erfindungsgemäß eine de-novo-Einführung der Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids in eine Zelle, Gewebe , Organ, Mikroorganismus oder Pflanze oder eine Erniedrigung oder, bevorzugt, eine Erhöhung einer schon vorhande- nen Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration der Hemproteine erhöht.

Die änderung der Aktivität eines Hemproteins kann durch eine Veränderung der Struktur der Proteine es zielt werden, durch änderung der Stabilität der Hemproteine oder durch änderung der Konzentration der Hemproteine in einer Zelle.

Eine bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet daß die Aktivitäten eines Hemproteins, bevorzugt eines nichtsymbiontischen Hemoglobins oder eines Leghemoglobins erhöht wird.

Besonders bevorzugt wird die Aktivität eines Polypeptids erhöht, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß

Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurense- quenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführung erfolgt die Erhöhung der Aktivitäten des erfindungsgemäßen Hemproteins durch Expression, bevorzugt überexpression im Vergleich zum Wildtyp wie oben beschrieben, mindestens eines Nukleinsäuremoleküls umfassend mindestens ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.

„Nukleinsäuren" meint Biopolymere aus Nukleotiden, die über Phosphodiesterbindun- gen miteinander verknüpft sind (Polynukleotide, Polynukleinsäuren). Je nach dem Zuckertyp in den Nukleotiden (Ribose oder Desoxyribose), unterscheidet man zwischen den beiden Klassen der Ribonukleinsäuren (RNA) und den Desoxyribonukleinsäuren (DNA).

Die Begriffe "Protein" und Polypeptid" sind gleichbedeutend und gegenseitig austauschbar im Sinne der vorliegenden Erfindung.

In einer bevorzugen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden durch Expression eines nichtsymbiontischen Hemoglobins transformierte Zellen, bevorzugt Pflanzen hergestellt, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.

Nichtsymbiontsches Hemoglobin gehört zur Familie der Hemoglobin-Proteine, deren Funktion die reversible Sauerstoffbindung und Versorgung ist. Im Gegensatz zum Leg- hemoglobin kommt es nicht in den Wurzelknöllchen von Hülsenfrüchten (Leguminosen). Sie sind u.a. in die Detoxifizierung von Nitritoxid und in die Erkennung der Sauerstoffverfügbarkeit involviert.

In einer weiteren bevorzugten Ausfürung der vorliegenden Erfindung werden durch Ex- pression eines Leghemoglobins transformierte Zellen, bevorzugt Pflanzen hergestellt, die ein erhöhtes ATP-ADP-Verhältnis aufweisen.

Das Leghemoglobin gehört zur Familie der Hemoglobin-Proteine, deren Funktion die reversible Sauerstoffbindung und Versorgung ist. Es stammt aus Wurzelknöllchen von Hülsenfrüchten (Leguminosen) und ist eine isolierbare rote Substanz, die dem Myoglo- bin der Wirbeltiere ähnelt. Durch die reversible Bindung von O2 kann Leghemoglobin den hohen Sauerstoff-Bedarf bei der Stickstoff-Fixierung durch die Knöllchenbakterien gewährleisten. Das Apoprotein wird von den Pflanzenzellen und das hem von den Bakterien gebildet (Quelle: CD Römpp Chemie Lexikon - Version 1.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1995). Unter Expression wird in der vorliegenden Anmeldung die übertragung einer genetischen Information ausgehend von DNA oder RNA in ein Genprodukt (Polypeptid oder Protein, hier Leghemoglobin) verstanden und soll auch den Begriff der überexpression beinhalten, womit eine verstärkte Expression gemeint ist, so dass das Fremdprotein oder das natürlich vorkommende Protein verstärkt produziert werden oder einen gro- ßen Teil des gesamten Protein-Gehaltes der Wirtszelle ausmachen.

Die Expression der erfindungsgemäßen Hemproteine wird durch Transformation von Zellen erzielt.

"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen

Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus. Unter Transformation wird also die übertragung einer genetischen Information in einen Organismus, insbesondere Pflanze verstanden. Darunter sollen alle dem Fachmann bekannten Möglichkeiten zur Einschleusung der Information fallen, z. B. Mikroinjektion, Elektroporation, Teilchenbeschuss (Partikelbombardement), Agrobakterien oder Che-

mikalien vermittelte Aufnahme (z. B. Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme o- der über die Siliziumcarbonatfaser-Technik). Die genetische Information kann z. B. als DNA, RNA, Plasmid und auf sonstige Weise in die Zellen eingebracht und entweder durch Rekombination ins Wirtsgenom eingebaut, in freier Form oder unabhängig als Plasmid vorliegen.

Die Transformation kann mittels Vektoren enthaltend die obengenannten Nukleinsäu- remoleküle durchgeführt werden, bevorzugt Vektoren enthaltend Expressionskassetten welche die die oben genannten Nukleinsäure Moleküle beinhalten. Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz funkti- onell verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollelement, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsäuresequenz der Expressionskasette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulä- rer Form, extra-chromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukary- otischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressi- onskasset-ten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor mit einer der vorab beschriebenenen Spezifität und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle eingesetzt.

"Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des BESTFIT-Alignments (nach Needleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren

Gap Weight: 50 Length Weight: 3

Average Match: 10.000 Average Mismatch: -9.000

berechnet wird,

und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren

Gap Weight: 50 Length Weight: 3

Average Match: 10.000 Average Mismatch: 0.000

Anstelle des Begriff "homolog" oder "Homologie" wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff "Identität" verwendet.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden funktionelle äquivalente der SEQ ID NO: 1 , 3, 5, verwendet. Erfindungsgemäße funktionelle äquivalente der SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 werden durch Rückübersetzung einer Aminosäuresequenz abgeleitet, die eine Identität von mindestens 40%, 50%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist. Funktionelle äquivalente der SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 werden durch eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität mit der SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 von mindestens 40%, 50%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt min- destens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% o- der 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% aufweist.

"Funktionelle äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz oder Teilen einer Nukleinsäurese- quenz zu hybridisieren und befähigt sind, die Expression der Hemproteine in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.

Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekann-

ter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oligonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständi- ge Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 ⁰ C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedin- gungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 2O ⁰ C bis 65 ⁰ C, bevorzugt zwischen etwa 3O ⁰ C bis 45 ⁰ C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 3O ⁰ C bis 65 ⁰ C, bevorzugt zwischen etwa 45 ⁰ C bis 55 ⁰ C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, "Current Proto- cols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford Univer- sity Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Ap- proach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Unter einem funktionellen äquivalent versteht man weiterhin auch Nukleinsäurese- quenzen die mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz („ursprüngliche Nukleinsäure- sequenz) bis zu einem definierten Prozentsatz homolog bzw. identisch sind und die gleiche Aktivität der ursprünglichen Nukleinsäuresequenzen aufweisen, ferner insbe- sondere auch natürliche oder künstliche Mutationen dieser Nukleinsäuresequenzen. Entsprechende Definitionen finden sich an geeigneten Stellen der Beschreibung.

"Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen (=Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Sub- stitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften des Zielproteins im wesentlichen beibehalten werden.

Es werden weiterhin auch solche Nukleotidsequenzen unter den Begriffes des funktionellen äquivalentes durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389-391 ) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261 ) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.

Funktionelle äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.

Unter Nukleotidsequenz werden alle Nukleotidsequenzen verstanden, die (i) exakt den dargestellten Sequenzen entsprechen; oder (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz um- faßen, die innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes den dargestellten Sequenzen entspricht; oder (iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls (iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff "funktionsneutrale Sinnmutationen" den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.

Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Proteine zu verstehen, bei denen änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion

des Proteins zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5 ^" -oder upstream) und/oder nachfolgenden (3 ^" -oder downstream) Se- quenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Teminatoren oder Translationsverstärker.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid umfasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO

46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 um- fasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder

40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt.

Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül das für ein Polypeptid kodiert welches ein Polypeptid umfasst, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das sich in ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehreren Nukleinsäuren unterscheidet von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Sequenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurensequenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; und für ein Polypeptid mit Aktivität eines Hemproteins kodiert.

Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid Aktivität eines Hemproteins, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül das sich in ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn oder mehreren Nukleinsäuren unterscheidet von einem Nukleinsäuremolekül umfassend ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 gezeigte Se- quenz; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ

ID NO 1 ,3 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 und/oder 31 umfasst; c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 40% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 aufweist; d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein Fragment der Sequenzen gemäß SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 und/oder 40 kodiert; e) Nukleinsäuremolekül das man erhält in dem man einen Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Datenbank oder aus einer Genom-Datenbank mittels der Primer gemäß

Sequenz Nr. 41 und 42 amplifiziert f) Nukleinsäuremolekül das ein Polypeptid mit Hemprotein - Aktivität kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert; und g) Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hemprotein, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; h) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäurense- quenz gemäß der Consensus-Sequenz der Hemprotein - Sequenzen, die SEQ ID NO 46 und/oder 47, bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 44, besonders bevorzugt SEQ ID NO 43 und/oder 45 umfaßt; und für ein Polypeptid mit Aktivität eines Hemproteins kodiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor enthaltend eine Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.

Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Zelle im Sinne der Erfindung, bevorzugt ein monokotyledoner Organismus oder ein dikotyledoner Organismus mit einer erhöhten Aktivität mindestens eines Hemproteins beruhend auf der Expression einer Nukleinsäuresequenz wie oben beschrieben.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zelle hergestellt mit dem erfindunsgemäßen Verfahren.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird durch die änderung der Aktivität eines Hemproteins, neben der Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnisses, der ölgehalt in

den Zellen erhöht.

Als ölgehalt wird der Gesamt- Fettsäuregehalt in den erfindungsgemäßen Zellen bezeichnet.

"öl" umfasst im. Sinne der Erfindung neutrale und/oder polare Lipide und Mischungen derselben. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 aufgeführten zu nennen.

Tabelle 1 : Pflanzliche Lipidklassen

Neutrale Lipide meint bevorzugt Triacylglyceride. Sowohl die neutralen als auch die polaren Lipide können ein breites Spektrum an verschiedenen Fettsäuren enthalten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 2 aufgeführten Fettsäuren zu nennen.

Tabelle 2: übersicht über verschiedene Fettsäuren (Auswahl)

¹ Kettenlänge:Anzahl der Doppelbindungen ^* nicht natürlicherweise in Pflanzen vorkommend

Für weitergehende Informationen wird ebenfalls auf das Römpp Chemie Lexikon - CD Version 2.0, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1999 verwiesen.

In einer bevorzugten Variante wird dabei der Gehalt an ungesättigten Fettsäuren er- höht, insbesondere an Linolensäure.

Durch die Erhöhung des Gesamtölgehalts der erfindungsgemäßen Zelle wird der Gesamtgehalt an Proteinen jedoch nicht oder nur kaum verringert. Das heißt, der Gesamtgehalt an Fettsäuren, ausgedrückt in Masse auf Masse Trockengewicht, ist gegenüber jenem des Wildtyps signifikant erhöht. Der Gesamtgehalt an Proteinen im Vergleich zum jenem des Wildtyps, ebenfalls in Masse auf Masse Trockengewicht ausgedrückt, bleibt jedoch konstant oder wird minimal verringert. Die Verringerung ist prozentuell, bezogen auf den Wildtyp, kleiner als die Erhöhung des ölgehalts.

Die Erhöhung des ATP-ADP-Verhältnis, also die Erhöhung des Energiestatus durch Speicherung der Energie in ATP, bleibt bei Zellen die aufgrund des erfindungsgemä- ßen Verfahrens eine erhöhte Aktivität von Hemproteinen zeigen, konstant. Das heißt,

das ATP-ADP-Verhältnis der Zellen wird durch eine Veränderung der Außenbedingungen nicht beeinflußt.

Unter Außenbedingungen versteht man im Sinne der Erfindung die Kulturbedingungen für Zellen, Gewebe, Organe, Mikroorganismen oder Pflanzen. Dies können z. B. Medi- umszusammensetzung, Temperatur, Zusammensetzung der Atmosphäre oder andere, den Wildtyp beeinflussenden Faktoren sein.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung beträgt das ATP-ADP-Verhältnis der Zellen mit erfindungsgemäßen erhöhter Aktivität von Hämoproteins bei einer Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der umgebenden Atmosphäre auf 4% mindestens 200 %, 300 %, bevorzugt 400%, besonders bevorzugt mindestens 500% oder mehr bezogen auf das ATP-ADP-Verhältnis des Wildtyps.

Zusätzlich beträgt die unter diesen anaeroben Kulturbedingungen gebildete Lactamen- ge maximal 80%, bevorzugt 75%, 70%, besonders bevorzugt 65%, 60%, 55%, 50% oder weniger bezogen auf die Lactatmenge des Wildtyps. In einer weiteren Ausführung der Erfindung ist die Veränderung der Hemprotein - Aktivität, das erhöhte ATP-ADP-Verhältnis, der erhöhte ölgehalt und/oder die verringerte Latatmenge ein stabiles Merkmal der erfindungsgemäßen Zellen, welches über mehrere Generationen erhalten bleibt, bevorzugt bis zu der T2, besonders bevorzugt zur T3- Generation.

In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Zellen Pflanzenzellen, Organe, Teile von Pflanzen oder ganze Pflanzen.

"Pflanzen" im Rahmen der Erfindung meint alle dicotyledonen oder monokyledonen Pflanzen. "Pflanzen" im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe o- der ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte o- der Wurzelstöcke zu verstehen.

Eingeschlossen unter dem Begriff "Pflanzen" sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenor- gane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze" umfaßt auch einjährige und mehrjährige dicotyledone oder monokotyledone Pflanzen und schließt, beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, solche der Gattungen, Bromus, Asparagus, Pennisetum, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triti- cum, Sorghum und Saccharum ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren auf monokotyle Pflanzen, beispielsweise aus der Familie der Poaceae, besonders bevorzugt auf die Gattungen Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Seeale, Triticum, Sorghum, und Saccharum, ganz besonders bevorzugt auf Pflanzen mit landwirtschaftlicher Bedeu-tung, wie z.B. Hordeum vulgäre (Gerste), Triticum aestivum (Weizen), Triticum aestivum subsp.spelta (Dinkel), Triticale, Avena sative (Hafer), Seeale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (Hirse), Zea mays (Mais), Saccha-rum officinarum (Zuckerrohr) oder Oryza sative (Reis) angewendet.

Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern. Besonders bevorzugt aus der Familie der Gramineae sind Reis, Mais, Weizen und Gerste.

Eine transformierte Pflanze im Sinne der Erfindung ist also eine gentechnisch veränderte Pflanze.

Erfindungsgemäß eignen sich alle Pflanzen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bevorzugt werden Kartoffeln, Arabidopsis thaliana, Raps, Sojabohnen, Erdnüsse, Mais, Maniok, Purgiernuss, Yams, Reis, Sonnenblumen, Roggen, Gerste, Hopfen, Hafer, Hart und Weichweizen, Lupinen, Erbsen, Klee, Rüben, Kohl, Reben usw. wie sie z. B. aus der Verordnung über das Artenverzeichnis zum Saatgutver- kehrsgesetz (Blatt für PMZ 1986 S. 3, zuletzt geändert Blatt für PMZ 2002 S. 68) entnehmbar sind, eingesetzt.

1. Bevorzugte dikotyledone Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den diko- tylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula,

- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa

(Salat),

Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und

der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola,

Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,

Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art Glycine max (Sojabohne) sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss.

Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea ara- bica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch),

Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika,

Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch),

Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch),

- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota

(Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Seiarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer),

sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moo- se); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Erica- ceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kro- ton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Gera- niaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.

Besonders interessant ist der Einsatz von ölpflanzen, d.h. Pflanzen, die bereits natürlicherweise einen hohen ölgehalt aufweisen und/oder zu industriellen Gewinnung von ölen verwendet werden. Diese Pflanzen können einen hohen ölgehalt und/oder aber eine besondere, industriell interessante Fettsäurezusammensetzung aufweisen. Be- vorzugt sind Pflanzen, die einen Lipidanteil von mindestens 1 Gew.-% aufweisen. ölpflanzen umfassen beispielhaft: Bovago oficinalis (Borretsch); Brassica Arten wie B. campestris, B. napus, B. rapa (Senf oder Raps); Cannabis sativa (Hanf); Curthamus tinctorius (Färberdiestel); Cocos nucifera (Kokusnuss); Crambe abyssinica (Krambe); Cuphea Arten (Cuphea Arten liefern fettsäuren von mittlerer Kettenlänge insbesondere für industrielle Anwendungen); Elaeis guinensis (Afrikanische ölpalme); Ekeis oleiferu (Amerikanische ölpalme); Glycine max (Sojabohne); Gossypium hirisfum (Amerikanische Baumwolle); Gossypium barbadense (ägyptische Baumwolle); Gossypium herba- ceum (Asiatische Baumwolle Cotton ); Helianthus annus (Sonnenblume); Jatropha cur- cas (Purgiernuss oder Brechnuss); Linum usitatissimum (Lein oder Flachs); Oenethera biennis (Evening primrose); Ozea europea (Olive); Oryza sativa (Rice); Ricinus com- munis (Castor); Sesamum indicum (Sesam); Glycine max (Sojabohne); Triticum Arten (Weizen); Zea maize (Mais) sowie verschiedene Nussarten wie beispielsweise WaI- nuss oder Mandel.

Wenn es sich bei den verwendeten Pflanzen um solche zur Gattung der Leguminosen (Hülsenfrüchte) gehörenden Pflanzen handelt, so fällt unter die Erfindung die Expression von Fremdproteinen Leghemoglobinen oder in der Natur nicht-symbiontisch vorkommenden Hemoglobinen oder die Veränderung der Pflanzen derart, dass sie das natürlich vorkommende Leghemoglobin oder nicht-symbiontisches Hemoglobin übe- rexprimieren.

Höchst bevorzugt sind Kartoffeln, Arabidopsis thaliana, Raps und Soja.

Vorteilhaft ist es, wenn die vorgenannten Pflanzen ein Leghemoglobin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leghemoglobin aus den Pflanzen Lupinus luteus (LGB1_LUPLU, LGB2_LUPLU), Glycine max (LGBA_SOYBN, LGB2_SOYBN, LGB3_SOYBN), Medicago sativa (LGB1-4_MEDSA), Medicago trunculata (LGB1_MEDTR), Phaseolus vulgaris (LGB1_PHAVU, LGB2_PHAVU), Vicia faba

(LGB1_VICFA, LGB2_VICFA), Pisum sativum (LGB1_PEA, LGB2_PEA), Vigna ungui- culata (LGB1_VIGUN), Lotus japonicus (LGB_LOTJA), Psophocarpus tetragonolobus (LGB_PSOTE), Sesbania rostrata (LGB1_SESRO), Casuarina glauca (HBPA_CASGL) und Canvalaria lineata (HBP_CANLI) exprimieren. In Klammern sind die jeweiligen Swiss-Prot Datenbankeinträge vermerkt.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die vorgenannten Pflanzen ein nicht-symbiontisches Hemoglobin ausgewählt aus der Gruppe bestehen aus Hemoglobin aus den Pflanzen Arabidopsis thalina (AT_AHB2), Brassica napus (BN_AHB2), Linum usitatissimum (LU_AHB2), Glycine max (GM_AHB2), Helianthus annus (HA_AHB2), Triticum aesti- vum (TA_AHB2), Hordeum vulgäre (HV_AHB2), Oryza sativa (OS_AHB2) und Zea mays (ZM_AHB2).

Besonders vorteilhaft sind Pflanzen, die die Sequenz Nr. 1 (AT-AHB2) codierend für nicht symbiontische Hemoglobin aufweisen.

In einer bevorzugten Variante der Erfindung handelt es sich um Pflanzen, die das Hemprotein speicherorganspezifisch exprimieren.

Dies sind z. B. Zwiebeln, Knollen, Samen, Körner, Nüsse, Blätter usw. Unter Speicherorgane im Sinne der Erfindung sind auch Früchte zu verstehen. Früchte sind die Sammelbezeichnung für die den Samen als Nährgewebe umhüllenden Organe der Pflanzen. Dabei ist nicht nur an die eßbaren Früchte, insbesondere an das Obst, aber auch an Hülsenfrüchte, Getreide, Nüsse, Gewürze zu denken, sondern auch an offiziell genutzte Drogen (s. Fructus, Semen). Natürlich kann auch eine Speicherung der Speicherstoffe in der gesamten Pflanze stattfinden.

Bevorzugterweise wird das Hemprotein knollenspezifisch oder samenspezifisch expri- miert.

Als Pflanzen kommen alle zuvor genannten in Betracht. Es ist besonders bevorzugt, wenn es sich um knollenproduzierende Pflanzen, insbesondere Kartoffel-Pflanzen oder um samenproduzierende Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana oder Raps handelt.

Die gewebespezifische Expression kann z. B. durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erreicht werden. Eine solche gewebespezifische Expression ist beispielsweise bekannt aus der US 6,372,961 B1 Spalte 11 , Zeilen 44 ff.

In einer weiteren Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der o- ben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen kodierend für Polypeptide mit der Aktivität von Hemoproteinen zur Herstellung von Zelle, Gewebe, Organ, Mikroorganismus oder Pflanze mit erhöhtem ATP-ADP-Verhältnis und/oder verändertem ölgehalt, bevorzugt erhöhtem Fettsäure-Gehalt, bevorzugt erhöhtem Linolensäure-Gehalt

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Versuche beispielhaft beschrieben.

Beispiele

Allgemeine Methoden:

Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham— Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, LISA), Perkin— Eimer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlan- de), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA— Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA— Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) CoId Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0—87969—309—6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA— Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463- 5467).

Beispiel 1 : Klonierung der Gene AHB1 und AHB2 aus Arabidopsis thaliana

Zur Klonierung des Gens AHB2 wurde Gesamt-RNA aus 6 wochen alten Arabidopsis- Pflanzen extrahiert. Die Herstellung der entsprechenden cDNA erfolgte durch RT-PCR mit Hilfe der SUPERSCRIPT Il (Invitrogen).

Für die Klonierung des AHB2-Gens wurde die isolierte Arabidopsis cDNA in einer PCR-Reaktion mit den Oligonukleotidprimern AHb2f und AHb2r eingesetzt.

Sequenz Primer Ahb2f SEQU.ID.No : δ'-TTTGGTACCATGGGEGAGATTGGGTTTACAGAG-S'

Sequenz Primer Ahb2r SEQU.ID.No : δ'-TTTGGATCCTTATGACCTTTCTTGTTTCATCTCGG-S'

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 uL):

5,00 μl_ cDNA aus Arabidopsis thaliana

5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI ₂

5,00 μL 2mM dNTP

1 ,25 μL je Primer (10 pmol/uL)

0,50 μL Advantage-Polymerase

Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.

PCR-Programm:

Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C.

Das PC R-Ansätze wurden anschließend über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die amplifizierten DNA-Fragmente von AHB2 aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem .Gelpurification'Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 μL Elutionspuffer eluiert.

Anschließend wurden die DNA Fragment in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem Vektor pCR2.1-AHB2 und die Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft.

Anschließend wurden die codierenden Sequenzen für AHB2 in einen binären Pflanzen vektor, wie pBIN, hinter den samenspezifischen USP Promoter (Bäumein et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-467) kloniert. Hierfür wurde der Vektor pCR2.1- AHB2 mit den Restriktionsenzymen Kpnl und BamHI verdaut. Die resultierenden DNA- Fragmente über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die AHB codierenden Fragmente aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem .Gelpurification'Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 μL Elutionspuffer eluiert. Die eluierten DNA Fragment wurden mit dem mit den gleichen Enzymen verdauten binären Vektor über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs). Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert. Positive Klone werden mit den Primern AHb2f und AHb2r durch PCR und Sequenzierung verifiziert.

Beispiel 3: Transformation von Agrobacterium

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383- 396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al.(1984) Nucl Acids Res 13:4777-4788).

Beispiel 4: Pflanzentransformation

Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana wurde unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect, Ringbuc Zentrale Signatur: BT1 1-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0- 8493-5164-2). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und

Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Selektion der mit AHB2 transformierten Arabidopsis thaliana Pflanzen erfolgte mit Hygormycin.

Die Agrobakterium-vermittelte Transformation von Raps kann z. B. durch Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation erfolgen (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238- 242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701 ). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab.

Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285 beschriebenen Technik durchführen.

Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispielsweise einer in EP- A-O 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-O 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.

Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss,

Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser- Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook"

(1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

Beispiel 5: Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus

Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern— Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317—326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung:

Für die RNA-Hybridisierung wurde Gesamt-RNA mit Hilfe des Concert RNA Plant Reagent (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland) aus reifenden Samen extrahiert. 20 μg Gesamt-RNA oder 1 μg poly(A)+-RNA wurden mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1 ,25 % unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 x SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV- Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10 % Dextransulfat Gew.A/ol., 1 M NaCI, 1 % SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem

Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha- ³² P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte

wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 X SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 X SSC, 1 % SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.

Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden Proteins an.

Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse des Northern Blots von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis-Linien die mit dem AHB2 Konstrukt transformiert wurden sowie des

Wildtyps. Die Pflanzen der Linien 9, 10 und 11 zeigen ein starkes Detektionssignal auf dem Northern Blot . Die Pflanzen exprimieren demzufolge das AHB2 Gen in reifenden Samen. In den Samenprobe des Wildtyps konnte dagegen nur ein schwaches Signal detektiert werden, welches auf der Expression des endogenen AHB2 Gens beruhte.

Beispiel 6: Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes

Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische

Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd.

17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel IM: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 1 1 , S. 1 -27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W.,

Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2);

Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1);

"Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.:

Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.

Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).

Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, OiIy Press, Dundee, 1 19-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353).

Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-

Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP- Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.

Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.

Für die quantitative und qualtitive ölanalyse der mit den Konstrukten ADH1 und ADH2 transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde folgendes Protokoll angewendet:

Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:91 1 durchgeführt. Dazu werden 5 mg Arabidopsis Brassica Samen in 1 ,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abgewogen. Das Samenmaterial wird mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1 ; enthält Mono-C15-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiertund 20 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der überstand in ein neues Gefäß überführt und das Sediment erneut mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1) extrahiert. Die überstände wurden vereinigt und bis zu Trockene eingeengt. Die Derivatisierung der Fettsäure erfolgte durch saure Methanolyse. Hierzu wurden die extrahierten Lipide mit 0,5 M Schwefelsäure in Methanol und 2 % (v/v) Dimethoxypropan versetzt und für 60 min. bei 80°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine zweimalige Extraktion mit Petrolether gefolgt von Waschschritten mit 100 mM Natriumhydrogencarbonat und Wasser. Die so hergestellten Fettsäuremethylester wurden bis zur Trockene eingeengt und in einem definierten Volumen Petrolether aufgenommen. 2 μl_ der Fettsäuremethylester-Lösung wurden schließlich gaschromatographisch (HP 6890, Agilent Technologies) auf einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) aufgetrennt und über einen Flamenionisationsdetektor analysiert.

Die Quantifizierung des öls erfolgte durch einen Vergleich der Signalstärken der derivatisierten Fettäuren mit denen des internen Standards Mono-C15-glycerin (Sigma).

Die Bestimmung des Fettsäureprofils erfolgte durch relativen Vergleich der Signalstärken zueinander. Die Bestimmung der unsaturierungs-/saturierungs-index (USI) erfolgte wie in Gutierrez at al. ((2005) Food Chemistry 90, 341-346) beschrieben und reflektiert das Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten Fettsäuren in dem

Samenöl.

Die quantitative Proteinanalyse der mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde das Protokoll von Bradford (1976) angewendet. Rinderserumalbumin diente hierbei als Standard.

Tabelle 3: ölgehalt (Gesamtfettsäuregehalt) in reifen und reifenden (13-14 DAF) Samen transgener Arabidopsis Linien, die mit dem USP-AHB2-Konstrukt transformiert worden waren sowie in reifen und reifenden (13-14 DAF) Samen untransformierter Wildyp-Pflanzen. In reifen Samen wurde der ölgehalt über drei aufeinanderfolgende Generationen bestimmt. Die aufgeführten Werte entsprechen Mittelwerten und Stan- dardfehelern aus 6 unabhängigen Messungen. Signifikante änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse; p < 0.05) sind durch Sternchen ( ^* ) hervorgehoben.

Tabelle 3 fast beispielhaft den Verlauf der ölgahlte in reifen Samen von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis Linien über 3 Generationen zusammen, die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie den untransformierten Wildty-Pflanzen. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus 6 unabhängigen Messungen. Die Standardfehler sind ebenfalls angegeben. Signifikante änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen ( ^* ) hervorgehoben. In allen 3 Generationen konnte in den reifen Samen der transgenen

Linien eine deutliche Erhöhung im ölgehalt gezeigt werden. Der erzielte Phänotyp ist dementsprechend stabil über mehrere Generationen. Darüber hinaus konnte auch in reifenden T3 Samen während der Phase der ölspeicherung ein deutliche höhere ölgehalt in den transgenen Linien festgestellt werden (siehe Tabelle 1 ).

Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Ergbnisse für die quantitative Bestimmung der öl- und Proteingehalte in T3 Samen von 3 unabhängigen transgenen Arabidopsis Linien (9, 10, 11 ), die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie in den Samen der untransformierten Wildtyp-Pflanzen. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus 10 unabhängigen Messungen. Die Standardfehler sind ebenfalls angegeben. Signifikante änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen ( ^* ) hervorgehoben. In allen 3 transgenen Linien konnte eine signifikante Erhöhung des ölgehalts um 15 % (Linie 9), 31 % Linie (Linie 10) und 40 % (Linie 1 1). Die unterschiedlichen ölsteigerungen in den verschiedenen Linien korrelieren hierbei mit der in Abbildung 2 gezeigten Expressionsstärken. Im Gegensatz dazu hat die überexpression von AHB2 keinen Einfluss auf den ölgehalt

Abbildung 3 zeigt beispielhaft die Ergebnisse der qualitativen ölanalyse in den reifen Samen transgener Arabidopsis Linien, die mit dem Konstrukt USP-AHB2 transformiert worden waren sowie in den Samen der untransformierten Wildtyp-Pflanzen (A. Linol- säure-Gehalt, B. Linolensäure-Gehalt, C. Linolsäure/Linolensäure-Verhältnis und D. USI (Unsaturierungs / Saturierungs Index)). Die Werte entsprechen den Mittelwerten und Standardfehlern aus 10 unabhängigen Messungen. Signifikante änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen ( ^* ) hervorgehoben. Samenspezifische überexpression von AHB2 führt im Samenöl zu einer deutlichen Erhöhung von alpha-Linolensäure (C18:3) von 25 % in den Wildtyppflanze auf über 30 % in den transgenen Linien 10 und 11. Der Gehalt an Linolensäure (C18:2) Vorstufe von C18:3 ist dagegen unverändert. Dies spiegelt sich auch im Verhältnis von C18:3 zu C18:2 wieder (0,8 im Samenöl der Wildtyp-Pflanzen und >1 im Samenöl der transgenen Pflanzen. Die überexpression von AHB2 führt folglich zu eine erhöhte De- saturierung der Fettsäuren in den Samen der transgenen Linien wie auch durch den USI wiedergegeben der von 9 in den Wildtyp-Samen auf bis zu 12 in den transgenen Samen ansteigt.

Beispiel 7: Bestimmung des ATD/ADP Verhältnisses und des Milchsäuregehalts.

Um den Einfluss von unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen auf den Metabolismus in den Samen von Wildtyp und AHB2-überexprimierenden Arabidopsis-Pflanzen zu untersuchen wurden die Pflanzen im Gewächshaus (21 °C/Tag und 17 °C/Nacht, 50 % Feuchtigkeit Tag und Nacht, Photoperiode 16 h Tag / 8 h Nacht, Nachtinensität 180 μmol Photons nτ ² s ^"1 ). Für die Inkubationsexperimente mit verschiednen Konzentrationen Sauerstoff wurde Schotentragende Stängel in eine transparente Plastiktüte verpackt in der Luft mit einem Sauerstoffgehalt von 21 % bzw. 4 % (v/v) zirkulierte. Die Luftgemische der Firma Messer Griesheim GmbH (Magdeburg, Germany) enthielten 350 ppm CO2, Sauerstoffkonzentrationen wie oben angegeben und Stickstoff. Nach 2 Stunden wurden die Schoten geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Samen wurden von 13-14 Tagen alten lyophilisierten Schoten wie in Gibon et al. (2002) Plant J 30:221-235 beschrieben präpariert.

Zur Analyse der Metaboliten ATP, ADP und Milchsäure wurden Samen in einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Schwingmühle der Firma Retch (Haan, Germany) ho- mogenisiert und anschließend einer Extraktion mit Trichloressigsäure unterzogen. Die Quantifizierung der Metaboliten erfolgte anschließend wir in Gibon et al. (2002) Plant J 30: 221-235 beschrieben.

Abbildung 4 zeigt den Effekt der samenspezifischen Expression von AHB2 auf das ATP/ADP Verhältnis (A) und den Milchsäuregehalt (B) in reifenden Samen die unter normalen (21 %) Sauerstoffbedingungen oder unter hyoxischen Bedingungen (4 %) kultiviert wurden. Die Ergebnisse entsprechen Mittelwerte und Standardfehler aus 6 unabhängigen Messungen. Signifikante änderungen zum Wildtyp (basierend auf der statistischen t-test Analyse) sind durch Sternchen ( ^* ) hervorgehoben.

Die samenspezifische überexpression von AHB2 führt unter natürliche Sauerstoffkon- zentrationen in der Umgebung zu einem 2-4fach höheren ATP zu ADP Verhältnis in den Samen der transgenen Linien (4-8) als in den Wildtyp-Samen (2). Dies deutet auf eine verbesserte Energieversorgung durch die Atmungskette in den transgenen Samen auch unter den niedrigen Sauerstoffkonzentrationen innerhalb des Samens hin.

Eine Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung auf 4 % führt in den Wildtypsamen zu einer Reduktion des Energiestatus, welches sich in der Reduktion des ATP zu ADP Verhältnisses von 2 auf 0,4 wiederspiegelt. Die Absenkung des E- nergiestatus ging mit einer Akkumulation von Milchsäure in den Samen einher (20 μmol gDW" ¹ bei 21 % O2; 50 μmol gDW" ¹ ). Dies demonstriert, dass die Wildtyp-Samen fehlende Energie partiell durch energetisch ungünstigere, anaerobe Fermentation kompensieren.

Eine Absenkung der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung auf 4 % führt in den AHB2 überexprimierenden Samen ebenfalls zu einer Reduktion des Energiestatus. Allerdings beläuft sich das ATP zu ADP Verhältnis in diesen Pflanzen auf 0,8 - 2 und ist damit signifikant höher als in den Wildtyp-Samen (0,4). Dies deutet auf eine weiterhin ausreichende aerobe Energieversorgung bei einer Sauerstoffkonzentration in der Umgebung von 4 % hin. Bestätigt wird dies dadurch, dass es in den transgenen Samen nicht zu einer Steigerung der durch aerobe Fermentation gebildeten Milchsäure kommt.