DESCRIPCIÓN Sector técnico

La invención que se protege en esta Patente de invención, consiste en un método de procesamiento y almacenamiento de cultivos celulares y su equipo modular para Ia puesta en práctica del cultivo, procesos de diagnosis, experimentación y conservación de células y tejidos biológicos.

Se trata, por tanto, de un método y un equipo que permiten el control y gestión de material biológico para aplicaciones biotecnológicas en el campo de

Ia medicina ( diagnóstico molecular y pronóstico de enfermedades, terapia celular e ingeniería genética de tejidos, terapia génica y vacunas génicas, medicina regenerativa para Ia reconstrucción de tejidos y órganos), Ia farmacología (medicamentos), Ia alimentación (alimentos transgénicos, bebidas fermentadas, alimentos enriquecidos o antialérgicos, etc..) de gran utilidad en las investigaciones científicas básicas y aplicadas relativas a Ia Genómica,

Proteómica y Biología de sistemas, también llamada 'bioinformática'.

En conclusión, este método y su equipo facilitan el cultivo, la diagnosis y Ia conservación de material biológico tanto en aplicaciones científicas como industrializadas relacionadas con Ia biotecnología en cualquier sector técnico - energético, sanitario, agrícola y forestal, ganadero, alimentación, etc.. - capaz de realizar más de cuatrocientos experimentos simultáneos en cada uno de los centenares de siembras celulares disponibles.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Técnica anterior El empleo de medios de cultivos, diagnosis y conservación de material biológico es conocido y está extendido con diversas técnicas. Sin embargo, estas diversas técnicas y procedimientos varían en función de aspectos tanto técnicos como por sus aplicaciones. A tal efecto, con Ia presente invención se logra un equipo de control y gestión de material biológico más ventajoso frente a los ya conocidos por razón de sus características funcionales y operativas en orden a su carácter modular y a su versatilidad de configuraciones según las funciones de su uso.

Desde ios cultivos iniciales y rudimentales de material biológico - células y tejidos - con pipetas en placas de Petri en 1877 hasta la actualidad, se plantean distintas técnicas convencionales que vamos a analizar.

El cultivo de tejidos puede clasificarse en dos grandes categorías de técnicas: el cuiiivo de órganos y el cultivo de células. El cultivo de órganos supone el mantenimiento de pequeños fragmentos de tejido o órganos completos In vito, mientras que el cultivo celular, implica Ia propagación de células dispersas tanto en suspensión como en monocapas sobre cristal o plástico (M. Reina y Carme Auladell, "Conceptos básicos del cultivo celular" / Universidad de Barcelona).

Ei primer objetivo de! estudio celular fue lograr medios nutritivos necesarios y adecuados para el crecimiento celular. Para ello, Burrows (1910) empleó plasma de pollo, más adelante complementado con extractos embrionarios. Burrows y Carrel consiguieron cultivos de células de mamíferos, pero sin embargo, se encontraron con problemas de contaminación de los cultivos por su mera manipulación. Ei propio Carrell (1913) mediante su dispositivo denominado frasco de Carrel logró mantener cultivos de células en periodos prolongados de tiempo. Desarrollar medios de nutrientes necesarios, y condiciones asépticas adecuadas eran los principales retos en el inicio de los cultivos de tejidos.

En Ia actualidad, se pueden agrupar tres tipos de cultivos de tejidos: El cultivo de órganos, los explantes primarios, y el cultivo celular.

El cultivo de órganos, mantiene las características propias del tejido 'in vivo' pero ostenta una propagación limitada del tejido de origen, todo Io más en Ia periferia del mismo. Los explantes primarios, por el contrario, propician que el cultivo se produzca en determinadas superfices con un explanie o fragmento de tejido donde proliferan las células. Y finalmente, el cultivo celular, en que por medios enzimáticos o mecánicos - ya fuere manuales, o automatizados - se produce una disgregación celular, facilitando su propagación y manteniendo la masa celular del cultivo durante generaciones.

Ei cultivo celular destaca por Ia alta propagación de poblaciones uniformes y homogéneas, que posibilitan su caracterización, su cuantificación, su mantenimiento y Ia repetición de muestras.

En la actualidad, para desarrollar estas técnicas de cultivo, y en particular de cultivo ceiular y de tejidos, ya se conocen y son utilizados diversos procedimientos y dispositivos. Pero todos ellos presentan inconvenientes tanto operativos como funcionales, muy especialmente por su facilidad en ser contaminadas las zonas de crecimiento celular o en alterarse las condiciones ambientales de proliferación celular y de tejidos, o escasa productividad. Por Io que todas ellas suponen siempre ciertas limitaciones frente a Ia invención que se presenta. Así, son ya conocidos como dispositivos, las invenciones relativas a medios técnicos concretos. A título enunciativo, con ia finalidad del mantenimiento de cultivos celulares Ia Patente norteamericana n° 4537860 de MONSANTO COMPANY (1985) sobre un elemento estático, o de un trasportín portátil de cultivos celulares como Ia Patente europea EP0046681 de MONSANTO COMPANY (1982) donde se destaca Ia necesidad de agitación constante de los cultivos, o Ia incubadora autónoma EP0182926 de PERSONAL DIAGNOSTIC (1986).

También son conocidos medios técnicos combinados, es decir que realizan diversas funciones a Ia vez, como Ia Patente norteamericana n° 5424209 de G.KEARNEY (1995) sobre un sistema automatizado de cultivo y diagnostico, o ¡a patente española ES2162081 de AASTROM BiOSCiENCES (2001 ) sobre un equipo y procedimiento para el mantenimiento y crecimiento de células biológicas procedente de Ia patente internacional W9609770US.

Esta patente, de AASTROM BiOSCiENCES obedece a una disposición básica de medios que no permite Ia automatización ni Ia moduiaridad en ei cuitivo, diagnosis y mantenimiento del material biológico. Siendo concebida para un uso puntual sin gran industrialización.

La búsqueda de ia automatización en el control y gestión de cultivos celulares, es necesaria para incrementar el grado de eficiencia científica e industrial en sus distintos campos o sectores aplicados.

Así, Ia patente norteamericana n° 6673595 de BIOCRYSTAL ( 2004) reúne las funciones de cultivo, diagnosis, y conservación. Ahora bien, dicho concepto inventivo queda limitado por su propia configuración debido al almacenaje de los lechos de cultivo en torretas verticales, que son vulnerables a cambios de temperatura o de las condiciones ambientales en eí interior del reactor biológico, en particular, por su apilado en alturas de ios cultivos que puede provocar estados ambientales no uniformes ni homogéneos, pudiendo afectar o frustar algunos de los lechos cultivados. Además su diseño, no facilita su disposición en módulos para un proceso de gestión eficiente y el rápido análisis del estado de cultivos celulares y tejidos biológicos.

Problema técnico

Uno de (os principales obstáculos a Ia hora de aunar en una sola maquina o equipo aspectos multifuncionales - crecimiento celular y de tejidos, caracterización y conservación - reside en propiciar y mantener el estado óptimo y adecuado de las condiciones de cultivo de manera uniforme en toda Ia cámara donde se encuentran depositados para su cultivo, caracterización y conservación. Además de tratarse de una cámara cerrada, deben de generarse unas condiciones físicas, químicas y biológicas estables y controlables en medios de cultivo muy sensibles y susceptibles a variaciones, especialmente con relación a ias condiciones de humedad y de temperatura, es por ello que Ia máquia esta dotada de multitud de sensores para ei control de todas estas variables dentro de todo el bioreactor.

Muchos de los cultivos deben de realizarse y mantenerse con un movimiento de agitación constante y continuo a cierta velocidad para obtener un lecho de cultivo igualado en toda Ia superficie adherida ( piaca, plaqueta, petaca, etc.). Conseguir un control exacto de Ia agitación, deviene por tanto esencial en muchas pruebas experimentales o industriales de crecimiento de material biológico. Este sistema cumple perfectamente con ios protocolos científicos de cultivos celulares adoptados por Ia comunidad científica, en particular Ia agitación constante que se produce por un volteo.

Finalmente, para aumentar el número de cultivos celulares que favorezca ei rendimiento científico o industrial, se requiere de medios técnicos rentables y eficaces en cada cultivo, hecho que se justifica con su capacidad de trabajo y posibilidad de adición de módulos complementarios.. Solución técnica

La presente invención reúne en un mismo equipo a las funciones operativas de cultivo, caracterización, y mantenimiento, obteniendo una estabilidad y uniformidad ambiental en todo el interior del reactor biológico, una agitación controlada y constante de los lechos cultivados, y una manipulación de los lechos cultivados precisa y sencilla. También, el diseño del equipo facilita su disposición modular de una o varias piezas de cadenas de celdas de lechos de cultivos haciendo innumerable Ia cantidad de los mismos, rentabilizándolo mediante el empleo de un solo equipo técnico de control y gestión que ademas permite y facilita Ia realización de un elevado número de experimentos simultáneamente.

Todo ello contribuye a dotar unos resultados y aplicaciones de iluminación donde se incorpora Ia invención, que no se dan en los medios ya conocidos.

Efectos ventajosos

Entre las ventajas que pueden destacarse en Ia presente invención, podemos destacar:

- La disposición de ios lechos de cultivo ( placas, plaquetas o petacas compactas) donde se adhiere el cultivo agrupadas en celdas, en formato de cadenas de celdas de lechos, posibilita su almacenamiento y encaje para su cultivo en líneas de columnas paralelas de cadenas dentro de un mismo equipo de coníroi y gestión del equipo, y por tanto de innumerables cultivos. Sin ia necesidad de dotar a toda Ia habitación de una atmosfera controlada ni los posibles efectos perjudiciales producidos a los lechos por los elementos mecánicos y electrónicos de manipulación. - El diseño modular del equipo facilita tanto Ia integración alineada de columnas paralelas de cadenas de celdas de los lechos de cultivos como de medios técnicos para su cultivo, caracterización o almacenamiento por cada una de las líneas o columnas ( piezas centrifugadoras, microscopios, etc..)

- La configuración de cadenas de celdas de lechos de cultivos consigue una agitación constante de los cultivos a través de su volteo continuo dentro de un bioreactor con iguales características y parámetros ambientales - notablemente, humedad y temperatura -, que no se dan en configuraciones apiladas o de torretas.

- Esa misma configuración de cadenas de celdas de lechos de cultivos, promueve una caracterización o diagnosis de los cultivos, y una manipulación y conservación de los mismos de mínimo impacto, por tratarse de una articulación a modo de noria fija que gira verticalmente para todas sus funciones. Pudiendo asi aumentar el numero de módulos o equipos de análisis o procesos.

- El sistema de guiado incluye un dispositivo especial de amortiguación que evita que los lechos puedan sufrir movimientos indeseados ya sea en vertical, horizontal o cualquier tipo de vibración. Ello contribuye a Ia mejor estabilidad de los lechos y evita Ia posible daño o perjucio de éstos.

- La misma configuración en verticual permite atenuar o compensar los gradientes de temperatura, de forma que se consigue una homogeidad total en Ia forma que se transmite el calor hacia los lechos. Descripción de las figuras

Para una mejor comprensión de las características generales anteriormente mencionadas, se acompañan varios dibujos a Ia presente invención los cuales exponen como se específica a continuación:

Figura 1 : Vista frontal y esquemática de un equipo para el cultivo, diagnosis y conservación de células y tejidos biológicos con un bioreactor (1) , una zona de carga de lechos a utilizar y de descarga de lechos cultivados usados (2), una zona de aprovisionamiento de cultivos y reactivos (3), una zona de bombeo y centrifugación (4), y una zona de procesamiento de datos informáticos que contiene un microprocesador y de almacén de residuos (5).

Figura 2: Vista frontal y esquemática de un equipo para el cultivo, diagnosis y conservación de células y tejidos biológicos con un bioreactor (1) , una zona de carga de lechos a utilizar y de descarga de lechos cultivados usados (2), una zona de aprovisionamiento de cultivos y reactivos (3), una zona de bombeo y centrifugación (4), y una zona de procesamiento de datos informáticos que contiene un microprocesador y de almacén de residuos (5), con las compuertas abiertas.

Figura 3: Vista frontal localizada en el interior del bioreactor (1) de una columna de cadena de celdas (6) con su pie de columna (11) , cadena de eslabones o correa de celdas (10), celda (7) que puede contener uno o más lechos (12), rotor-motriz (8) , rotor de giro (9), pieza impulsora de lechos (24), y palanca impulsora de lechos (25). Figura 4: Vista frontal localizada en Ia zona de carga de lechos a utilizar y de descarga de lechos cultivados usados (2) de un lecho (12), una bandeja de entrada de lechos a utilizar (13), una guía de transporte (16), un soporte de transporte (17) que se desplaza horízontalmente según maniobra de entrada o de salida respectivamente, una bandeja de salida (14), y un hueco de apertura (15) de dicha bandeja.

Figura 5: Vista frontal de una pieza de inyección y esterilización (18) localizada en Ia parte inferior en el interior del bioreactor (1), con un lecho (12), un conducto de inyección de aire comprimido (19), un conducto de líquido inyectable (20), una cámara de pre-inyección (21), una boca del inyector (22) y un equipo de esterilización (23).

Figura 6: Vista en alzado de un conjunto localizado en Ia parte inferior en el interior del bioreactor (1),y formado por Ia pieza de inyección y esterilización (18), una celda perteneciente a Ia columna de Ia cadena de celdas, una pieza impulsora de lechos (24), una palanca impulsora de lechos (25) y una base móvil de Ia pieza impulsora de lechos (26) de desplazamiento horizontal.

Figura 7: Vista de una centrifugadora (27) localizada en Ia parte inferior en el interior del bioreactor (1).

Figura 8: Vista de un microscopio (28) localizada en Ia parte inferior en el interior del bioreactor (1),y formado por una lámpara (29), un porta-filtros (30), un porta-difusor (31), un iris (32), un ajuste de centrado (33), un condensador ( 34), el soporte porta muestras ( 35), un objetivo (36) , una cámara digital (37) y un juego de tres ejes - Y (38), X (39) y Z (40) -. Modo de realizar Ia invención

El equipo modular para el procesamiento y almacenamiento de cultivos celulares, puede ser realizado y dispuesto de Ia siguiente manera:

El equipo consta de varios espacios o zonas modulares básicos: un biorreactor (1), una zona de carga de lechos a utilizar y de descarga de lechos cultivados usados (2), una zona de aprovisionamiento de medios y reactivos (3), una zona de bombeo y centrifugación (4), y una zona de procesamiento de datos informáticos que contiene un mícroprocesador - unidad central de procesamiento (CPU) - y de almacén de residuos y desechos (5).

Dispuestos en el interior del biorreactor (1), pueden ser empleados una o varias piezas modulares, tales como columnas de cadena de celdas (6), centrifugadora (2?),y un microscopio (28) ert función a ias dimensiones del equipo, del espacio de trabajo donde se halla el equipo o de las necesidades de trabajo.

Excepto el bioreactor (1) y centrifugación (4) _r la zona de carga de lechos a utilizar y de descarga de lechos cultivados usados (2), Ia zona de aprovisionamiento de cultivos y reactivos (3), contienen compuertas que pueden ser abiertas o cerradas según las necesidades operativas.

El funcionamiento del equipo se inicia medrante ía disposición de lechos

(12)- Fíg.4 - en Ia bandeja de entrada de lechos a utilizar (IS)-Un motor u otro método de empuje impulsa el lecho a utilizar (12) colocándolo sobre el soporte de transporte (17) que se desplaza a través de una guía de transporte (16) dirigiéndose hacía ía cadena de celdas (6) localizada dentro del biorreactor (1). El interior del bioreactor (1), como cámara cerrada, se dispone -Fig.3- de una o de varias columnas de cadena de celdas (6) con su pie de columna

(11) y cadena de eslabones o correa de celdas (10).Para Ia transmisión del movimiento de la cadena o correa de celdas se puede utilizar un motor situado en uno de los rotores ya sea indistintamente en Ia parte superior o inferior de Ia cadena (8) o (9) que transmitirá el movimiento a toda Ia cadena o cualquier otro método para transmisión ya conocido; en el caso de que las celdas fueran unidas entre sí solidariamente, éstas podrían actuar como método de transmisión.

Cabe destacar Ia inclusión de un sistema de amortiguamiento de las celdas (7) que reduce Ia vibración de los lechos (12). Cada celda (7) puede contener uno o más lechos (12) tipo placa, plaqueta o petacas - a modo de ejemplo, las comerciales más usuales como Autoflask, Opticell, Petaka G2, etc.- cuyas dimensiones y apilado en ranuras de cada una de ellas variará en función del tipo de (os lechos.

El lecho vacio (12) situado en una ranura de las celdas (7) se desplazará hasta Ia posición donde se encuentre Ia pieza de inyección o extracción y esterilización (18), localizada en Ia parte inferior del interior del biorreactor (1) o cualquier lugar accesible desde ía cadena de celdas (6). Una vez el lecho (12) se sitúa frente al impulsor de lechos (24), éste a través de una palanca impulsora de lechos (25) y una base móvil de Ia pieza impulsora de lechos (26) de desplazamiento horizontal, ejecuta maniobras de entrada o salida de lechos a Ia zona de inyección de fluidos.

Mientras el lecho (12) se encuentra alojado en Ia pieza de inyección y esterilización (18), éste puede ser procesado con un determinado cultivo celular, reactivo o medio nutriente mediante Ia introducción de aire comprimido a través de una cámara de pre-inyección(21) y líquido de cultivo a través de un conducto de ííquído inyectable (20). Los líquidos o medios nutrientes inyectados se encuentran almacenados en Ia zona de aprovisionamiento de medios (3) y son dirigidos al modulo de inyección a través de las bombas peristálticas o de cualquier otro método de impulsión en Ia zona de bombeo y centrifugación (4).

Dentro de una cámara de pre-inyección (21) se realiza Ia adición y mezcla de los líquidos o medios de cultivo, que son inyectados en el lecho (12) a través de Ia boca del inyector (22). Todo ello ejecutado bajo condiciones asépticas garantizadas por un equipo de esterilización (23) de tipo electromagnético - magnetrón -, o alternativamente por medios térmicos, de radiación o cualquier otro tipo.

Una vez el vez el líquido o medio de cultivo ha sido distribuido dentro del lecho (12), éste vuelve a ser alojado en la misma posición dentro de Ia celda (7) utilizando un sistema similar ai utilizado para Ia entrada de éste en el modulo de inyección (18)

Este procedimiento se repite de forma pre-programada para ir introduciendo y procesando todas y cada unεt de las tareas en la cadena de celdas (6)

La columna de cadena de celdas (6) se encuentra así étt constante movimiento de volteo y sin ningún tipo de vibración ni perturbación, parando para ías funciones operativas de procesamiento de cultivos, y bajo condiciones ambientales asépticas, estables y uniformes dentro del bioreactor (1), ya fuere a diferentes grados de temperatura o de presión que requiriese cada cultivo procesado. Asi mismo se controfa en todo momento Ia posición de cada una de ios lechos (12) en las celdas (7) que queda almacenada en la unidad de procesamiento. Posteriormente, se procede a Ia descarga de lechos cultivados usados (2) mediante Ia sustracción de los lechos por Ia pieza impulsora de lechos (24), y su colocación en una bandeja de salida (14) a través de un soporte de transporte (17) que se desplaza a fo largo de una guía de transporte (16) hacia dicha bandeja de salida. Este procedimiento se produce mediante una palanca impulsora que va depositando los lechos en Ia bandeja de salida (14) Ia cual es accesible desde el hueco de apertura (15) donde pueden quedar a disposición del usuario.

Una de las tareas dentro de las múltiples posibles que se realizan dentro del cultivo celular es Ia centrifugación de la los lechos (12) para las separación de materias dentro de éstos

La pieza centrifugadora gira a mas de 2000 rpm durante un tiempo determinado por el usuario desde Ia programación del control de tareas. Un sistema igual que se da con el impulsor de lechos (24) al módulo de inyección (18), extrae el lecho de Ia cadena de celdas (6) y Io deja en Ia estancia previa en Ia cola de entrada ai ai módulo centrifugo. Un impulsor lineal Io introduce en el módulo de Ia centrifugadora (27).

Para Ia extracción del lecho (12), una sistema flexible empuja el lecho (12) desde el módulo de Ia centrifugadora (27) a Ia estancia previa en cola. El lecho (12) regresa a la cadena de celdas (6) por medio de una pestaña montada sobre otro impulsor lineal.

Dicho módulo de Ia centrifugadora (27) actúa como un mecanismo de aprisionamiento activado por la fuerza centrifuga debido al giro del mismo. Ademas permite ei centrifugado de uno o varios lechos de forma simultánea. Como paso intermedio entre el módulo de Ia centrifugadora (27) y Ia cadena de celdas (6) puede disponerse un buíferde almacenamiento de lechos (12) en cola de entrada y salida. Para la monitorización del cultivo distribuido en el lecho (12) se puede disponer de uno o varios módulo microscópico (28) que captura imágenes del mismo para Ia realización de cálculos y recuentos celulares, así como fotografías de alta resolución de las muestras del cultivo celular. Estos procesos y otros posibles que puedan ser realizados por el microscopio son definidos por el usuario, en función de lo que se desee monitorizar y/o calcular, pudiendo elegir así mismo Ia resolución del escaneo.

El microscopio se monta sobre tres ejes lineales - X, Y, Z - (39, 38 y 40) que se controla mediante Ia unidad central de procesamiento (5). Los posicionamientos de los ejes X e Y pueden ser consecutivos o no, pero el posicionamiento del eje Z ha de ser el último. Tras situarse sobre el lecho de cultivo (12) se toma una primera imagen en X e Y determinando el punto focal e indicando la posición de Z al objetivo, todo esto controlado mediante Ia unidad centra! de procesamiento (5). El movimiento de! eje Z ademas de actuar de enfoque dispone de un sistema informático de procesamiento de imágenes. De esta forma en cada captura se conoce el número de células muertas o vivas. El lecho (12) es extraído de Ia cadena de celdas (6) mediante un sistema igual al impulsor de lechos (24) del modulo de pre-inyección (18), y Io sitúa en una bandeja de escaneo, comprobando el código identificador del lecho (12). Una vez confirmado comienza Ia monitorización que es controlada por Ia unidad central de procesamiento - CPU -(S).

Todo el equipo esta controlado y monitorizado mediante Ia unidad centrar de procesamiento (5). Este sistema funciona utilzando una configuración servidor-cliente que permite controlar todos los parámetros del equipo (condiciones ambientales dentro del biorreactor, posición de los lechos dentro de Ia celda, tareas a llevar a cabo, tiempos, etc.) ya sea encontrándose fisicameníe delante de el equipo a través de su pantalla de control como desde cualquier otra computadora conectada a Ia red.