ScDBN, ScLNC a ScTIP2-3

Campo da invenção:

[1] A presente invenção se insere no campo de aplicação de biotecnologia, mais especificamente na área de engenharia genética, uma vez que se refere a um método de modular a expressão gênica em plantas através do uso de regiões de nucleotídeos do genoma da cana capazes de regular a expressão gênica, também denominadas regiões promotoras ou promotores. Mais especificamente, os promotores da presente invenção são capazes de regular a expressão gênica em resposta ao déficit hídrico em folha, colmo e raízes ou preferencialmente em raízes de cana-de-aeúcar.

Estado da técnica:

[2 ] A seca é um dos principais estresses abióticos que afetam as plantas em várias áreas do. planeta, principalmente em termos de desenvolvimento e produtividade. Diferentes estágios do desenvolvimento vegetal podem ser acometidos pelo déficit hídrico levando a perdas na produtividade superiores a 70%. Atualmente, cerca de 16% de área terrestre mundial utilizada pela agricultura é afetada em alguma intensidade pelo déficit hídrico e seus efeitos tendem a ficar mais pronunciados nessas regiões, segundo previsões de mudanças climáticas.

[3] Dentre os danos mais comuns provocados pela seca destaca-se a inibição do crescimento vegetal devido a alterações nos processos de divisão e expansão celular. Além disso, o aumento da concentração de solutos na célula, associado à formação de espécies reativas de oxigénio prejudica processos enzimáticos, como. respiração celular e fotossíntese, reduzindo a assimilação de carbono. Outros efeitos da seca incluem a redução do tamanho, número e peso de grão durante a fase reprodutiva de cereais. Todos esses fatores em conjunto são responsáveis pela redução da Jbiomassa e produtividade de espécies agrícolas.

[4] As plantas utilizam uma gama de mecanismos para responder ao estresse hídrico. Para evitar o estresse, as plantas podem reduzir a perda de água através do fechamento estomático e aumento da espessura da cutícula foliar, ou então, diminuir o ciclo de vida acelerando a fase de florescimento. Além disso, as plantas desenvolveram mecanismos para sobreviver em condições de seca, como o acúmulo de moléculas osmoprotetoras, antioxidantes, e enzimas removedoras de espécies reativas de oxigénio. Nesse cenário, a elucidação dos mecanismos que controlam a capacidade de sobrevivência e crescimento vegetal durante o estresse hídrico contribui ao melhoramento genético para a produção de cultivares mais tolerantes.

[5] Recentemente, a manipulação de características do sistema radicular tem ganhado destaque como oportunidade para o melhoramento genético vegetal. 0 tamanho, diâmetro e distribuição do sistema radicular desempenham papel fundamental na manutenção das funções nutricionais da planta como um todo, inclusive em situações de estresse.

[6] Em cana-de-açúcar, o sistema radicular pode ser classificado em três tipos de acordo a função: as raízes superficiais, que captam água e nutrientes das camadas mais externas do solo.,- as raízes âncora, que ajudam no suporte da planta; e as raízes cordão, capazes de atingir às reservas de água nas camadas mais profundas no solo. Apesar de tal classificação, há certa plasticidade fenotipica dependente da condição ambiental como, por exemplo, em resposta ao déficit hidrico.

[7] Segundo a literatura, alguns cultivares de cana são capazes de reestruturar a arquitetura radicular permitindo explorar de forma mais eficiente os recursos do solo, evitando a queda de produtividade em condições de estresse hídrico. Similarmente, um estudo avaliando a distribuição de raizes em resposta a diferentes regimes de irrigação concluiu que variedades de cana submetidas a menor frequência de irrigação apresentam sistema radicular mais distribuído no solo que plantas irrigadas frequentemente.

[8] Alterações morfofisiológicas nas raízes e suas implicações no desenvolvimento e adaptação a mudanças ambientais são diretamente dependentes de cascatas de sinalização moleculares, ainda pouco compreendidas. Desta forma, o estudo de processos moleculares, celulares e fisiológicos em raízes de cana sob a condição de seca permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos de tolerância ao estresse _: , abrindo perspectivas para a obtenção de. cultivares mais tolerantes.

[9] Nesse sentido, a presente invenção propõe um método de modular a expressão de genes em plantas através do uso de promotores inéditos obtidos de genes que são induzidos em resposta ao déficit hídrico em folha, colmo e raízes ou preferencialmente em raízes de cana-de-açúcar

[10] Vale ressaltar que em cana-de-açúcar a prospecção de promotores ativos é laboriosa uma. vez que o genoma, altamente poliploide e aneuplóide, contém sequências inativas. Assim, a disponibilidade de promotores com fcssa característica tem um enorme potencial não só para estudos básicos sobre a regulação de genes associados à seca, mas também apresenta um claro apelo biotecnológico.

til] Desse modo, os promotores propostos pela presente invenção podem ser utilizados para a geração de cisgênícos de cana-de-açúcar, uma nova categoria de plantas geneticamente modificadas. A cisgenia consiste na geração de plantas contendo cassetes de expressão formados com sequências da própria espécie. Assim, o uso de tal estratégia apresenta potencial para facilitar aprovação de novos cultivares contendo tecnologias da engenharia genética, uma vez que as sequências promotoras apresentam potencial para ativar a transcrição em condições de déficit hídrico. Além disso, os promotores da presente invenção podem também ser utilizados na produção de plantas transgênicas usuais, controlando a expressão de sequências de outras espécies que não a da cana-de-açucar .

[12] No estado da técnica, ainda não há descrito promotores induzidos por déficit hídrico e cultivares comerciais contendo essa tecnologia em cana-de-açúcar.

[13] O documento BRPI0713444-4 A2 refere-se a composições de proteínas NF-YB e DNA recombinante para expressão de proteínas NF-YB que são usadas para produzir plantas transgênicas com rendimento aumentado e/ou tolerância a estresse de déficit de água aumentada. O mesmo difere da presente invenção por se tratar da proteção de plantas transgênicas superexpressando a proteína codificada pelo gene NF-YB. Em contraposição, a atual invenção tem a finalidade do uso de sequências promotoras de cana para ativação da transcrição de genes de interesse, como por exemplo., genes que podem proteger a planta contra estresses ambientais. Portanto, tratam-se de sequências diferentes, espécies filogeneticamentre distantes e finalidades distintas .

[14] O artigo "Overexpression of ShDHtJ, a dehydrin gene from Solanum habrochaites enhances tolerance to multiple abiotic stresses in tamato"

(http: //dx. doi . org/10.1016/j .plantsci .2014.12.006) descreve que a superexpressão do gene ShDHN em tomate cultivado aumentou a tolerância ao estresse frio e à seca e melhorou o crescimento das plântulas sob estresse salino e osmótico. 0 mesmo difere da invenção por se tratar da avaliação de plantas transgênicas superexpressando a proteina codificada pelo gene DHU de tomate. Em contraposição, a atual invenção tem a finalidade do uso da sequência promotora do gene DHN em cana para ativação da transcrição de genes de interesse- Tratam-se de sequências diferentes, espécies filogeneticamentre distantes e finalidades distintas.

[15] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve promotores com as características inovadoras aqui apresentadas, assim como um método para produção de planta transgênica de cana-de-açúcar com perfil de tolerância a estresses abióticos utilizando os mesmos, a fim de proporcionar uma alternativa à utilização dos promotores constitutivos (com atividade constante) .

Breve descrição da invenção:

[16] A presente invenção refere-se a um método de modulação da expressão gênica em plantas através do uso de promotores isolados de genes que têm expressão induzida em resposta ao déficit hidrico.

[17] O referido método compreende a aplicação de três sequências de nucleotideos que atuam como promotores da regulação, dos genes que codificam uma deidrina (ScDHN) , um transcrito longo não codificante {ScLNC) , e uma proteína intrínseca de tonoplasto 2-3 ^: (ScTJP2-3) , assim como o uso dos mesmos para ativaçào de genes de interesse em células de plantas transgênicas, podendo levar ao aumento da produtividade e da tolerância ao estresse abiótico, dentre outras características agronómicas desejáveis.

[18] Para confirmar a capacidade de ativar a transcrição, as sequências promotoras foram clonadas à montante do gene repórter GUS no plasraideo pORE Tl (COUTU et al., 20.07) e avaliadas através da transformação transiente em calos de cana-de-açúcar.. A presença de coloração azul nos calos bombardeados validou a utilização dos promotores pêira ativar a transcrição em células de cana-de-açúcar.

Breve descrição das figuras:

[19] Para obter total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[20] A Figura 1 representa graficamente o perfil de expressão dos genes ScDHN e ScLNC em raízes de cana-de-açúcar expostas ou não ao déficit hidrico, em que ^V A" refere-se aos níveis de expressão, para os genes ScDHN e ScLNC detectados via RNAseq em Reads per Kilobase per Million (RPKM; Leituras por Milhão de Basesj . Como padrão de intensidade dos níveis de expressão foi incluído a expressão do gene da ubiqut ina de cana ScUBI (WEI et al., 1999); e ^,X B" refere-se aos dados de expressão dos genes ScDHN e ScLNC detectados por PCR em tempo real (qPCR) .

[21] A Figura 2 A-C representa graficamente a confirmação dos perfis de expressão dos genes ScDHN, ScLNC e ScTIP2-3, com indução da expressão sob condições de déficit hídrico em três órgãos de cana (folhas, colmos e raízes) , em que "A" refere-se ao nível de expressão do gene ScDHN; "B" refere-se ao nível de expressão do gene ScLNC; e ^M C" refere- se ao nível de expressão do gene ScTIP2-3.

[22] A Figura 3 representa a identificação e abundância de prováveis elementos regulatórios de açáo eis nos promotores de cana-de-açúcar danados. 0 consenso dos motivos de DNA foi apresentado na primeira coluna. A segunda coluna representa as sequências dos motivos de referência descritos no ^v The Plant Promoter Analysis Navigator" (Chow et ai., 2015, http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/). A terceira coluna indica a família de fator de transcrição correlato. As três colunas da direita representam o numero de vezes que cada elemento é encontrado em cada uma das sequências promotoras.

[23] A Figura 4 representa os vetores utilizados na transformação transiente em cana-de-açúcar, em "ZmUbi pORE- Tl" refere-se ao controle positivo; ^v Vet.or Vazio pORE-Tl" refere-se ao controle negativo; demais siglas representam o terminador do gene NOS (NOS T) ; sequência codificante do gene NPTII (NPTII); borda direita do T-DNA do plasmídeo pORE Tl (RB) ; e borda esquerda do T-DNA do plasmídeo pORE Tl (LB) . A localização dos sítios das enzimas de restrição HindIXl, EcoRI, Sgfl e Fsei é indicada pelo nome das enzimas. A esquerda dos esquemas são apresentados os nomes das diferentes construções. A construção ZmUbi contém o promotor do gene da ubiquitina de milho, usado como controle devido sua alta atividade em cana-de-aç.úcar (LAKSHMANAN et .3. ^' /., 2005.) .

[24] A Figura 5 representa uma imagem fotográfica do ensaio de expressão transitória do gene repórter GUS em calos de cana-de-açucar, em que ^M A" refere-se aos calos transformados com ZmUbi pORE-Tl; '"B" refere-se aos calos bombardeados com vetor vazio, "C" refere-se ao DHN pORE-Tl; ^M D" refere-se ao LNC pORE-Tl; e ^ν Έ" refere-se ao TIP pORE- Tl. Foci azuis representam expressão do gene repórter GUS sob regulação dos promotores de interesse.

Descrição detalhada da invenção:

[25] A presente invenção refere-se a um método de modulação da expressão gênica em plantas através do uso de promotores provenientes de genes do genoma de cana-de-açúcar que são induzidos em resposta ao déficit hídrico empregando tecnologia de DNA recombinante.

[26] O referido método compreende as etapas de:

a) Identificação e análise de expressão de genes induzidos por estresse hídrico em plantas, preferencialmente cana-de-açucar;

b) Confirmação do perfil transcricional em diferentes órgãos (folha, colmo, e raiz) em plantas de cana-de-açúcar submetidas a condições de déficit hídrico e controle (irrigação contínua);

c) Isolamento dos promotores via reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonagem em vetores plasmidiais, como pTZ57R/T ou pGEMT-easy;

d) Análise in silico (computacional) da presença de motivos de ligação a fatores de transcrição presentes nas sequências promotoras de SEQ ID NO 1, 2 ou 3 ^;

e) Clonagem das sequências promotoras de SEQ ID NO 1, 2 ou 3 à montante do gene GUS em plasmídeo pORE Tl; e

f) Análise funcional dos promotores de SEQ ID NO 1, 2 ou 3 através de transformação transiente em células de plantas, especificamente em calos de cana~de-açúcar .

[27] Na etapa "a", os referidos "genes induzidos por estresse hidrico", ScDHN e ScLNC, são selecionados do grupo que consiste em genes que possuem expressão gênica próxima a zero na condição irrigado (menor que 30 Keads per Kilobase per Million; Leituras por Milhão de Bases) e alta atividsde transcricional quando plantas são expostas a estresse por seca (maior que 400 Reads per Kilobase per Million; Leituras por. Milhão de Bases), em raízes de eanas-de-açucar .

[28] Ainda na etapa "a", para identificação de genes é realizada uma análise transcriptômica em larga escala e determinação quantitativa da expressão em raízes através de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) com uso de pares de olígonucleotídicos específicos para os genes ScDHN e ScLNC indicados na SEQ. ID n° 4 e 5, 6 e 7, respectivamente; Adicionalmente, a seleção de candidatos para a clonagem da sequência promotora inclui a identificação do gene preferencialmente expresso em raiz, ScTIP2-3, baseado em dados de expressão disponível para espécies filogeneticamente correlatas. Na etapa ^w b", a confirmação do perfil de expressão em resposta a seca (indução gênica maior que dois, comparativamente ao controle não exposto à seca) é avaliada via análise quantitativa da expressão (RT-qPCR) em folhas, colmo e raízes de cana-de-açúcar através do uso de pares de oligonucleotideos específicos para os genes ScDHN, ScLNC e ScTIP2-3 indicados na SEQ. ID n° 4 e 5, 6 e 7, 8 e 9, respectivamente.

[29] Na etapa *c", as sequências promotoras (pScDHN, pScLNC e pScTIP2-3) foram amplificadas via PCR a partir de DNA genômico de cana-de-açúcar , como por exemplo o cultivar RB92579. Os oligonucleotidicos utilizados nessa etapa para isolamento dos promotores dos genes ScDHN, ScLNC e ScTIP2-3 são indicados pelas SEQ ID NO 10 e 11, 12 e 1.3, 14 e 15, respectivamente.

[30] Nesse sentido, a sequência promotora de SEQ ID NO:l, aqui chamada de pScDHN, refere-se à uma região de nucleotideos do genoma da cana que atua como promotora, sendo capaz de controlar a expressão do gene ScDHN, a qual apresenta 1812 pares de bases.

131 ] A sequência promotora de SEQ ID NO: 2, aqui chamada de pScLNC, refere-se á sequência de nucleotideos do genoma de cana capaz de controlar a expressão do gene ScLNC, a qual apresenta 1855 pares de bases

[32] A sequência promotora de SEQ ID NO: 3, aqui chamada de pScTIP2-3 refere-se à sequência de nucleotideos do genoma de cana capaz de controlar a expressão do gene ScTIP2-3, o qual apresenta 1565 pares de bases.

[33] Na etapa "d", as sequências genômicas isoladas são analisadas computacionalmente quanto à presença e abundância de prováveis sitios de ligação a fatores de transcrição que podem estar envolvidos na resposta a seca.

[34] Na etapa ^w e", os referidos promotores são clonados à montante do gene repórter GUS através da ligação entre extremidades nucleotidicas coesivas geradas a partir da atividade de enzimas de restrição. Desse modo, os vetores formados nessa etapa compreendem a sequência de DNA do plasmídeo binário pORE Tl modificado contendo no T-DNA uma sequência de DNA definida pelas SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 operacionalmente ligada à sequência codificante do gene Gil3, seguido do terminador NOS. Adicionalmente, os vetore-s incluem no T-DNA uma modificação no cassete de resistência a geneticina/canamicina definida pela inserção do promotor do gene ubiquitina de milho ligado, operacionalmente à região codificante do gene de resistência NPTII, seguido do terminador NOS .

[35] Na etapa "f", a atívidáde funcional das sequências promotoras é avaliada através do bombardeamento dos plasmideos em calos de cana-de-açúcar. Assim, realiza-se nessa etapa o processo de cultivo de células embriogênicas de cana-de-açúcar in vitro, a transformação transiente via biobalistica em calos e a análise histoquímica do gene GUS.

[36] Para melhor detalhamento da presente invenção, a seguir são apresentadas suas etapas experimentais.

- Seleçâo dos genes induzidos por déficit hídrico em cana -de-açúcar:

[37] Um experimento em casa de vegetação identificou o conjunto de genes induzidos na condição de déficit hídrico em raízes de cana-de-açúcar. Cultivares contrastantes para tolerância à seca, RB92579 (tolerante) e RB72454 (sensível), com três meses (fase de perfilhamento) foram submetidos à suspensão de rega em casa de vegetação. As raízes foram coletadas após dois e quatro dias nos tratamentos controle (irrigação contínua) e déficit hídrico. Após a extração de RNA e síntese de cDNA, as amostras foram enviadas para sequenciamento em aparelho Illumina Hiseq2000. As sequências produzidas foram utilizadas para montagem da novo do transcriptoma.

[38] Considerando o grupo de genes diferencialmente expressos na condição de déficit hídrico em raízes de cana- de-açúcar, os genes homólogos à Deidrina 1 (ScDHN) e RNA

Longo Não codificante (ScLNC) apresentaram alta indução da expressão pelo déficit hídrico e altos níveis de transcritos no cultivar tolerante (RB92579) e foram selecionados para clonagem da sequência promotora. A Tabela 1 apresenta os identificadores dos genes homólogos de sorgo (Sorghum bicolor) e os correspondentes no genoma de sequências expressas da cana do projeto SUCEST (Sugarcane espre^sed sequence tags) .

expressed sequ&nce tags)

[39] A expressão dos genes ScDHN e ScLNC foi induzida pelo déficit hídrico quando comparada à irrigação continua (Ρ≤Ό, 05) (Figura IA). 0 gene ScDHN apresentou a maior expressão com valores médios de aproximadamente 7.600 RPKM (Reads per Kilobase per Million; Leituras por Milhão de Bases) em plantas sob condição de déficit hidrico, nivel similar ao gene da poliubiquitina, referência de alta expressão constitutiva. O gene ScLNC também foi induzido, atingindo 453 RPKM. Em condições controle, os níveis de expressão de ambos foram próximos a zero.

[40] Essas observações foram validadas por qPCR. {quantitative Polymerase Chain Reaction, reaçâo em cadeia da polimerase quantitativa) . Os cDNAs enviados para sequenciamento foram utilizados na reaçâo de qPCF em equipamento 7500 Real-time system iApplied Biosystems) . Cada reaçâo continha 6,3 ul de SYBR Green PCR Master Mix {Applied Biosystems), 0,2 μΐ de Prlmer Forward (10 μΜ) , 0,2 μΐ de Primer Reverse (10 μΜ) , 4,3 μΐ de água, e 4 μΐ de cDNA (diluído 1:100). Os níveis de expressão foram congruentes com os dados provenientes do RNAseq (Figura 1B) . Para avaiiar expressão do gene ScDHN foi utilizado o primer forward 5'- 3' e primer reverse 5* -3' , de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente. Para avaliar a expressão do gene ScLNC foi utilizado o primer forward 5' -3' e primer reverse 5' -3', de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7, respectivamente. Os níveis, de expressão foram congruentes com os dados provenientes do RNAseq (Figura 1B) . Esses resultados demonstram que os genes selecionados são induzidos por déficit hídrico em cana-de- açúcar .

Seleção de gene raiz-específico baseado em dados disponíveis para espécie filogeneticament& correlata :

[41] Um gene com expressão raiz-específica foi identificado em trabalhos de expressão em milho e sorgo: ZmTIP2-3 (LOPES et al., 2004) e $bTIP2~3 (SHAKOOR et ai., 2014) . Considerando a hipótese que o perfil de expressão desse gene permaneça conservado durante a evolução, análises filogenéticas foram geradas visando identificar o provável gene ortólogo em cana. A Tabela 2 apresenta o identificador do gene em cana no projeto SUCEST e o respectivo homólogo em sorgo. Adicionalmente, primers foram desenhados avaliar o perfil transcricional do gene ScTIP2-3 conforme SEQ. ID 8 NO e 9.

Tabela 2 - Seleção de gene raiz especifico em cana baseado em dados disponíveis na literatura.

- Confirmação do perfil transcricional dos genes em diferentes órgãos:

[42] O perfil de expressão dos genes também foi avaliado era diferentes órgãos de eana-de-açúcar (folha +1, colmo e raízes) e em resposta ao déficit hídrico através de qPCR. Para isso, um experimento de suspensão de rega foi estabelecido em casa de vegetação com plantas de cana-de~ açúcar com 4 meses de idade (cultivar SP80-3280) . ftpós 10 dias, folha+1., colmo e raízes foram coletadas de plantas estressadas e controle (irrigação contínua) . O material vegetal coletado foi macerado e submetido a extração de RNA. Após a síntese de cDNA (kit Superscript II Reverse Transcriptase, Life Technologies), foi realizada a análise da expressão gênica dos genes selecionados através de qPCR. Os níveis de expressão relativa foram calculados utilizando o método do 2~ ^&&Ct . O gene da poliubiquitina foi utilizado como gene normalizador.

[43] 0 déficit hídrico induziu a expressão dos genes ScDHN e ScLNC em todos os órgãos vegetais (folha, colmo e raízes) . O gene ScTIP2-3 apresentou perfil de expressão somente em raízes e, adicionalmente, indução por seca em aproximadamente três vezes, comparativamente ao controle irrigado. [44] A Figura 2A-C refere-^se à confirmação dos perfis de expressão dos genes selecionados para a clonagem da sequência promotora. As plantas de cana-de-açúcar cultivar SP80-3280 em fase de perfilhamento (quatro meses) foram submetidas a suspensão de rega e tratamento controle (irrigação contínua) em casa de vegetação. Os níveis de expressão dos genes ScDHN (Figura 2A) , ScLNC (Figura 2BJ , ScTIP2-3 (Figura 2C) foram avaliadas nas amostras de folha+I, colmo e raiz das plantas submetidas ao déficit hídrico em relação às plantas irrigadas. Barras de desvio representam o erro padrão da média fn»5) . A diferença entre as médias dos tratamentos foi analisada por análise de variância (ANOVA) . Asteriscos representam diferenças significativas com p≤0, 05.

[45] Desse modo, a indução por déficit hídrico dos genes selecionados faz dos seus promotores potenciais alvos biotecnológicos para construção de cassetes alternativos a expressão ubíqua e constitutiva, pois podem permitir a expressão especificamente quando houver reduzida disponibilidade de água no solo. Assim, as sequências promotoras dos genes foram então submetidas à clonagem molecular para ensaios funcionais.

~ Isolamento dos promotores e análises in silico:

[46] As regiões promotoras dos genes ScDHN, ScLNC e ScTIP2-3 foram identificadas por BlastN no banco de dados genômicos da cana-de-açúcar disponibilizados pelo Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol {http//bce. bioetanol. cnpem.br/ctceblast/) . A região codificante foi predita em cana-de-açúcar tendo como referência o gene homólogo de maior similaridade em sorgo {Sorghum bicolor) e primers forara desenhados flanqueando a região à montante do códon de inicio da tradução. Foram utilizados para amplificação do promotor pScDHM os primers Forward 5' -3' e Reverse 5' -3' dè SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11, respectivamente. Para o promotor pScLNC foram utilizados os primers Forward 5' -3' e Reverse 5' -3' de SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13, respectivamente; e para o promotor pScTIP foram utilizados os primers Forward 5' ~3 ^r e Reverse 5' -3' de SEQ ID NO: 14 e 15, respectivamente.

[47] As sequências promotoras foram isoladas de DNA genômico do cultivar RB92579 via PCR (Polymerase Chain Reactíon, Reaçâo em Cadeia da Polimerase) . Ao mix de reação da PCR (Ix Tampão Taq Polimerase Righ Fidelity, Lite Technologies, dNTP 0,2 mM, 0,2 μΜ de Primer Forward, 0,2 μΜ de Primer Reverse, 2 U de Taq Polimerase High Fidelity, Life Technologies) foi adicionado 20 ng de DNA genômico.

[48] O programa, de amplificação consistiu em 3 etapas: (i) 94°C/ 5 minutos; tii) 94°C/30 segundos, 60°C/30 segundos, 7.2°C/2minutos (35 ve∑es) ; (iii) 72°C/10 min. Em seguida, a reação de PCR foi submetida a corrida eletroforética em gel de agarose para confirmação da amplificação. O amplicon contendo o tamanho de interesse foi cortado do gel de agarose e purificado {Wizard SV Gel -PCR clean-up system, Promega) . As sequências dos promotores ScDHN e ScTIP2-3 isoladas foram ligadas ao vetor pTZ57R/T (Life Technologies) e o promotor ScLNC ao vetor pGEM-T (Promega) . Células termocompetentes de Escherichla coli cepa DH5a foram transformadas com solução contendo ligação entre inserto e vetor. Os plasmideos. foram extraídos de colónias positivas {capazes de crescer em mexo com antibiótico ampicilina 100 mg/ml) e emriados para sequenciamento .

[49] Os tamanhos de fragmentos obtidos foram de 1812 pb para o promotor pScDHN (SEQ ID NO:l), 1855 pb para o promotor pScLNC (SEQ ID NO: 2) e 1565 pb para o promotor pScTIP2-3 (SEQ ID NO: 3). Após sequenciamento, os amplicons clonados foram alinhados, com as sequências dos contigs genõmicos utilizados como referência, confirmando o isolamento das sequências de interesse.

[50] Em seguida, análises in silíco visando á. identificação de motivos de ligação a fatores de transcrição foram realizadas empregando o programa PLANTPAN 2.0 (CHOW et al., 2015, http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/). Cinco bancos de dados foram consultados: Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa, Sorghum bicolor e Zea mays. Elementos regulatórios de ação eis presentes nos promotores com Hit Score ≥ 0,9 foram contabilizados. Dentre os elementos encontrados, destacam-se os relacionados à sinalização de déficit hídrico, representados esquematicamente na Figura 3.

[51] As letras na representação gráfica dos motivos (logos) apresentadas na Figura 3 representam os nucleotideos (A, T, C, G) e o tamanho de cada. base são proporcionais a sua frequência na posição. Os dados foram baseados em predições computacionais realizadas pelo programa PLANTPAN 2.0.

[52] Elementos regulatórios eis de ligação a fatores de transcrição das famílias bHLH, bZIP e Zinc-Finger foram os de maior abundância nos promotores avaliados. Sitios de ligação a fatores de transcrição envolvidos nas vias de sinalização hormonais também foram encontrados. Dentre eles, encontram-se os relacionados a via de etileno (EIN/.F.IL; AP2/ERF) , auxina (NAC) e ácido abscisico (AREB) .

[53] Por fim, a análise in silico dos promotores identificou diferentes combinações e abundância de motivos, principalmente prováveis sitios de ligação de fatores de transcrição envolvidos na resposta ao déficit hídrico. Esses dados indicam que os promotores isolados são provavelmente modulados pelo déficit hidrico e corroboram, em conjunto com os dados de expressão gênica, com seu uso potencial para biotecnologia .

- Construção de vetores contendo o sistema repórter GUS para transformação de células de cana-de-açúcar:

[54] Os promotores pScDHN e pScTIP 2-3 clonados no vetor pTZ57R/T e pScLNC no vetor pGEM-T foram digeridos com enzimas de restrição para inserção no plasmideo pORE Tl. Foram utilizadas enzimas de restrição que cortam sitios fianqueadores à sequência promotora: HindlII e EcoRI para o promotor ScDHtJ.; HindlII e NotI para o promotor ScTIP2-3; Sad e NotI para o promotor ScLNC. As três combinações de enzimas foram também utilizadas para digestão do plasmideo pORE Tl, gerando extremidades coesivas complementares. Em seguida, os promotores foram individualmente inseridos ί montante do gene GUS no plasmideo pORE Tl, criando um sistema para análise funcional. A construção contendo o promotor da poliubiquitina do milho fusionado ao gene GUS e o vetor sem promotor foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente, no ensaio posterior (Figura 4).

[55] Para avaliar o potencial do método da presente invenção utilizando os referidos, promotores, a. seguir são apresentados os resultados dos testes realizados. - Ensaio de expressão transiente em calos de cana-de- açúcar:

[56] A capacidade dos promotores em ativar a transcrição do repórter foi avaliada através do ensaio de expressão transitória em calos de cana-de-açúcar (Figura 5) .

[57] A produção de calos foi realizada pela empresa Pangeia Biotech (Brasil) . Antes do bombardeamento, calos embriogênicos foram dispostos em placas de Petri contendo meio osmótico (Meio MS 4, A g/L, sacarose 20%, sorbitol 72,88 g/L, manitol 72,88 g/L, Ágar 6 g/L, pH 5,8). A preparação das microparticulas de tungsténio seguiu os seguintes passos: (i) 50 mg de partículas (1,1 μΜ de diâmetro, Bio-P _¾ ad laboratories, EUA) foram adicionados a 1 ml de etanol absoluto; (ii) agitação durante 2-5 minutos; (iii) centrifugação à 13000 rpm por 10 segundos; (iv) remoção do etanol; (v) lavagem com água estéril 3. vezes; e ívi) ressuspensão em 1 ml de glicerol 50%.

[58] Em seguida, 5 μΐ de plasmideo purificado (1 ug/uD foram adicionados a 50 ul de suspensão contesndo microparticulas de tungsténio lavadas, Além disso, foram adicionados à solução 20 μL de espermidina (0,1 M, Sigma Aldrich) e 50 μΐ de CaClu (2,5 M) sob agitação. As microparticulas contendo os plasmídeos adsorvidos foram centrifugadas a 13000 rpm por 10 segundos e ressuspendidas. em 30 μΐ de etanol absoluto. O bombardeamento foi realizado em acelerador de partículas a Hélio (Bioraics, Brasil), utilizando 1000 PSI de pressão, 620 mm Hg de. vácuo e 9 cm de distância entre a salda do canhão e o material vegetal. Para cada tiro foram utilizados 5 μΐ da suspensão de plasraídeo adsorvido às microparticulas. Os calos bombardeados foram acondicionados 24 horas no escuro e, então, incubados em tampão X-Gluc (NaH ₂ PO ₄ pH 7,0 0, 1M; EDTA 10 mM; TRITON X-100 0,1%; K ₃ Fe (CN| e 1 _/ 0 mM; X-Gluc 2,0 mM) à 37°C por dois dias.

[59] Os promotores pScDHN, pScLNC e pS<iTlP2-3 apresentaram capacidade em ativar o gene repórter, confirmada pelos foci azuis em calos transformados (Figura 5C e 5D) . Dessa forma, é possível afirmar que as sequências nucleotídicas dos genes ScDHN,. ScLNC e ScTIP2-3 analisadas são sequências regulatórias ativas em cana-de-açúcar e podem ser utilizadas para expressão de sequências nucleotidicas de. interesse em plantas transgênicas.

[60] Portanto, os promotores dos genes ScDHN-, ScLNC e ScTIP2-3 da presente invenção apresentaram a capacidades de ativar a transcrição de um gene heterólogo marcador (GUS) em células vegetais. Uma vez que em cana-de-açúcar a prospecção de promotores ativos é laboriosa, os promotores identificados podem ser utilizados para a geração de cisgênicos de cana-de-açúcar, uma nova categoria de plantas geneticamente modificadas. A cisgenia consiste na geração de plantas contendo cassetes de expressão formados com sequências da própria espécie. 0 uso de tal estratégia apresenta potencial para facilitar aprovação de novos cultivares contendo tecnologias da engenharia genética. Adicionalmente, essas regiões promotoras tem o potencial de uso em outras espécies vegetais. Assim, as sequências promotoras apresentam potencial para ativar a transcrição em condições de déficit hídrico.

[61] Nesse sentido, adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso dos promotores dos genes ScDHN, ScLNC e ScTIP2~3 para aplicação de pelo menos uma das sequências (SEQ IDS NO 1, 2 e 3) para a transformação genética de células, tecidos ou órgãos. Ainda, refere-se ao uso dos mesmos para aplicação de pelo menos uma das sequências (SEQ IDS NO 1, 2 e 3) para produção de plantas transgênicas visando caracteristicas de tolerância a estresses abióticos e/ou modificação em caracteristicas agronómicas desejáveis.

[62] Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso dos vetores aqui descritos para aplicação do plasmídeo binário pORE Tl modificado contendo no T-DNA uma das sequências indicadas na SEQ ID 1, 2 ou 3 em ensaios de caracterização funcional de sequências promotoras através de transformação transiente ou estável em caria-de-açúcar ou outras monocotil.edôneas.

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