本发明属于植物保护和细胞生物学领域， 尤其涉及一种观测融合蛋白长距 离转运至水稻叶芽的方法。 背景扶术

病原细菌是通过 III型分泌系统转运效应子， 其转运机制研究得较为清楚。 但对于丝状真菌来说，尽管诸如吸器等专化的 侵染结构参与了效应蛋白的转运， 但其效应蛋白是如何被转运进入寄主细胞仍然 未知。 卵菌效应蛋白都具有一个保守的基序即 RXLR, 该基序位于信号肽下游并且 参与效应蛋白在寄主细胞内的转运。 许多研究表明， RXLR基序在卵菌效应蛋白 转运 寄主细胞中起作用。 绿色荧光蛋白 （green f luorescence protein, GFP )作为基因标记已经完 全应用于微观定位和数量性状的测定， 利用原核表达技术构建效应蛋白基因与 GFP基因融合的原核表达载体， 通过化学方法诱导融合蛋白表达， 利用融合蛋 白处理水稻根尖， 将融合蛋白处理过根尖的水稻植株的叶芽进行 冷冻切片， 用 荧光染料对切片进行染色，共聚焦显微镜观测 效应蛋白在水稻植株体内的转运。 稻瘟病菌效应蛋白能在水稻根组织内的转运已 有报道， 但目前还没有关于稻瘟 病菌蛋白在水稻植株体内转运， 即从水稻根尖转运至叶芽的报道。 发明内容 本发明实施例的目的在于提供一种观测融合蛋 白长距离转运至水稻叶芽的 方法， 旨在解决现有技术不能快速、 简便、 准确的观测融合蛋白是如何长距离 转运至水稻叶芽的问题。

本发明实施例提供了一种观测融合蛋白长距离 转运至水稻叶芽的方法， 该 方法采用 GFP融合蛋白处理水稻根尖，处理过根尖的水稻 植株叶芽进行冷冻切 片， 切片后 PI荧光染料进行染色， 共聚焦显微镜直接观测 GFP融合蛋白从水 稻根尖转运至叶芽。

进一步、 该方法的具体步骤是：

步骤一、 5.0mg/ml的 GFP融合蛋白处理种子发芽至 14天的水稻幼嫩植株 的根尖 0.5cm处 24h， 灭菌水漂洗 4h, 叶芽进行冷冻切片， PI对切片进行染色， 共聚焦显微镜直接观测 GFP融合蛋白在水稻植林内的转运；

步骤二、 将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于 4°C离心机离心收集菌体， 用新鲜配制的緩冲液悬浮菌体；

步骤三、 在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清 。 进一步、其特征在于，緩沖液为 20mM Tris-HCl， pH7.4; 200mM NaCl; ImM EDTA; ΙΟιηΜ β-巯基乙醇。

进一步、 荧光染色的具体方法为：

( 1 )将切片放入固定液抽气 10min， 室温固定 1 hr;

( 2 ) 固定完毕后用 PEMT洗三次， 每次 10 min;

( 3 ) 37°C条件下酶解 lhr; 酶解后 PEM沖洗三次，每次 10 min;

( 4 )用 0.1M PBS ( pH7.2 )溶液配制 NaBH4, 浓度为 lmg/ml, 用配制好 的 img/ml的 NaBil4处理水稻 >尖 20min;

( 5 ) 室温用 50mM Gly封闭 30min;

( 6 )力。一抗， 4°C过夜， 冲洗一抗： PBS冲洗三次，每次 10 min; 加二抗 ( 1 :600 ) ，37°C、 闭光条件下， 3 hr; 沖洗二抗： PBS冲洗三次，每次 10 min; 加 上抗荧光淬灭剂后， 封片。

本发明实施例提供的观测融合蛋白长距离转运 至水稻叶芽的方法的有益效 果在于： 1、 方法简便、 准确、 快速。

2、利用 GFP融合蛋白处理水稻根尖 0.5cm处，叶芽被冷冻切片后 PI染色， 共聚焦显微镜观测 GFP融合蛋白从水稻根尖转运至叶芽， 能直接定性地了解 GFP融合蛋白在水稻植株内的长距离转运情况。

3、 GFP融合蛋白直接处理水稻根尖 0.5cm处， 共聚焦显微镜观测 GFP融 合蛋白转运至叶芽可为进一步开展效应蛋白能 引起水稻系统防御反应提供非常 强有力的证据。

4、荧光染色法处理切片，有效避免了切片易� �到残留叶绿素的干扰的问题。 附图说明

图 1是本发明实施例提供的观测融合蛋白长距离� �运至水稻叶芽的方法流 程图。 具体实施方式

为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明， 并不用于限定本发明。

图 1示出了本发明提供的观测融合蛋白长距离转� �至水稻叶芽的方法流 程。 为了便于说明， 仅仅示出了与本发明相关的部分。 本发明实施例提供了一种观测融合蛋白长距离 转运至水稻叶芽的方法， 该 方法采用 GFP融合蛋白处理水稻根尖，处理过根尖的水稻 植株叶芽进行冷冻切 片， 切片后 PI荧光染料进行染色， 共聚焦显微镜直接观测 GFP融合蛋白从水 稻才艮尖转运至叶芽。

作为本发明实施例的一优化方案， 该方法的具体步骤是：

步骤一、 5.0mg/ml的 GFP融合蛋白处理种子发芽至 14天的水稻幼嫩植株 的根尖 0.5cm处 24h， 灭菌水漂洗 4h, 叶芽进行冷冻切片， PI对切片进行染色， 共聚焦显微镜直接观测 GFP融合蛋白在水稻植株内的转运；

步骤二、 将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于 4°C离心机离心收集菌体， 用新鲜配制的緩冲液悬浮菌体；

步骤三、 在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清 。 作为本发明实施例的一优化方案，緩沖液为 20mM Tris-HCl, pH7.4; 200mM NaCl; ImMEDTA; ΙΟπιΜβ-巯基乙醇。

作为本发明实施例的一优化方案， 荧光染色的具体方法为：

(1)、 将切片 ^ 固定液抽气 10min， 室温固定 1 hr;

(2) 、 固定完毕后用 PEMT洗三次， 每次 lOmin;

( 3 ) 、 37°C条件下酶解 lhr; 酶解后 PEM冲洗三次，每次 10 min;

(4) 、 用 0.1MPBS (pH7.2)溶液配制 NaBH4， 浓度为 lmg/ml, 用配制 好的 lmg/ml的 NaBH4处理水稻才艮尖 20min;

(5) 、 室温用 50mMGly封闭 30min;

(6) 、 加一抗， 4°C过夜， 冲洗一抗： PBS冲洗三次,每次 10 min; 加二抗 ( 1:600)，37°C、 闭光条件下， 3 hr; 沖洗二抗： PBS沖洗三次，每次 10 min; 加 上抗荧光淬灭剂后， 封片。

作为本发明实施例的一优化方案， 方法

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原 理作进一步描述。

实施例 1、

5. Omg/ml的 GFP融合蛋白处理种子发芽至 14天的水稻幼嫩植株的根尖 0.5cm处 24h， 灭菌水漂洗 4h， 叶芽进行冷冻切片， PI对切片进行染色， 共聚 焦显微镜直接观测 GFP融合蛋白在水稻植株内的转运。

将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物于 4°C离心机离心收集菌体， 用新鲜配 制的緩冲液 (20mM Tris-HCl, pH7.4; 200mM NaCl; lmM EDTA; lOm β -巯基 乙醇） 悬浮菌体。 在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清 。 处理是将该 基因的原核表达产物纯化后按照 5. Omg/ml (含 25mMMES) 的浓度处理种子发芽 至 14天的丽江新团黑谷幼嫩植株的根尖 0. 5cm处 24h， 灭菌水漂洗 4 h， 叶芽 进行冷冻切片， PI对切片染色， 共聚焦显微镜观测 GFP融合蛋白在水稻植株内 的转运。 共聚焦显微镜观测到 GFP融合蛋白已经从水稻根尖转运到叶芽。

实施例 2、 切片荧光染色

将水稻切片放入固定液 (4%多聚甲酪 0.1% 戊二醛)抽气 lOmin,室温固定 1 hr。 固定完毕后用 PEMT(0.05% Triton x-100)洗三次， 每次 10 min。 37°C条件下 酶解 lhr PEM配制 1% 果胶酶，1.5% 纤维素酶， 0.4M甘露醇。 酶解后 PEM冲 洗三次，每次 10 min。 用 lmg/ml NaBH4 (PBS配制） 处理 20min。 室温用 50mM Gly封闭 30min。 加一抗（ β-tubulin—抗 1:800， AtMAP18—抗 1 :100 ) , 4°C过 夜冲洗一抗： PBS冲洗三次，每次 10 min。 加二抗（ 1 :600 ) ,37V、 闭光条件下， 3 hr。 沖洗二抗： PBS沖洗三次，每次 10 min。 加上抗荧光淬灭剂后， 封片。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明 的保护范围之内。