Procedimiento para Ia obtención de péptidos bicíclicos

La presente invención trata de síntesis orgánica en fase sólida, particularmente de síntesis de péptidos bicíclicos.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

Los péptidos bicíclicos, tanto los aislados de fuentes naturales como los obtenidos sintéticamente, son compuestos que presentan interesantes actividades biológicas. La naturaleza del puente que forma el biciclo es diversa, y puede incluir un puente disulfuro, un tioéter, o una lactama.

Un ejemplo de péptidos bicíclicos es Ia familia de péptidos antibióticos antitumorales aislados de organismos marinos, que incluye Ia tiocoralina (cf. Romero, F.; Espliego, F.; Pérez Baz, J.; García de Quesada, T.; Grávalos, D.; De Ia Calle, F.; Fernandez-Puentes, J. L. J. Antibiotics 1997, 50, 734-737), el BE-22179, el triostin A, y el equinomicin. Este grupo de péptidos presenta una estructura compleja que contiene: a) un eje Ca; b) una estructura bicíclica formada por dos cadenas peptídicas antiparaleias; c) un enlace éster o tioéster en Ia parte terminal de Ia cadena peptídica; d) un puente disulfuro o un puente análogo en Ia mitad de las cadenas peptídicas; e) un cromóforo intercalador en Ia parte λ/-terminal; f) Ia presencia de varios λ/-metil aminoácidos; y g) aminoácidos no naturales de configuración D. Las estructuras de estos péptidos son:

Triostin A Equinomicin

Por tanto, Ia estructura general de esta familia de compuestos es:

Un ejemplo de grupo heterocíclico es el ácido 3-hidroxiquinolino-2-carboxílico (Hqa) y sus derivados (fórmula siguiente), los cuales forman Ia parte heterocíclica de Ia tiocoralina y de otros depsipéptidos naturales con interesantes actividades biológicas, como el SW-163C, SW-163E, y el sandramicin. Además, este cromóforo heterocíclico juega un papel muy importante en las propiedades enlazantes del DNA con estos compuestos. La síntesis de este heterociclo ha estado optimizada (cf. Riego. E., Bayo, N., Cuevas, C, Albericio, F., M. álvarez, Tetrahedron 61 , 1407-1411, 2005).

donde Ri es H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo formado por un grupo alquilo, un grupo arilo y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo; donde R ₂ es H o un grupo funcional carbonilo enlazado a una cadena alquílica formando un éster, con un grupo tiol, hidroxilo o amino al final de Ia cadena.

Aunque los procedimientos estándar para síntesis en fase sólida se pueden aplicar con éxito para acceder a un gran numero de péptidos, Ia síntesis de péptidos bicíclicos es todavía muy difícil y muy dependiente de Ia secuencia. Esto es debido a Ia presencia de reacciones secundarias asociadas con Ia elongación de Ia cadena peptídico; en particular, a circunstancias como:

- formación de dicetopiperazina de los dos residuos consecutivos posteriores al grupo functional éster o tioéster;

- dificultad en completar Ia formación del enlace éster; y

- alta labilidad de los enlaces éster o tioéster a las condiciones básicas.

Estas limitaciones son especialmente dramáticas por ejemplo en el caso de Ia tiocoralina y oxatiocoralina debido a Ia rápida formación de dicetopiperazinas de las dos consecutivas NMe-cisteinas. En este contexto, se han establecido nuevas vías para minimizar Ia formación de dicetopiperazinas.

Los péptidos bicíclicos como los representados arriba presentan una interesante actividad biológica, por lo que es interesante proporcionar nuevas rutas sintéticas para acceder a ellos.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención proporciona un procedimiento para Ia obtención de un dímero intermolecular por puente disulfuro en fase sólida a partir de precursores lineales. En una realización particular, el puente disulfuro es escindido del soporte sólido y biciclado en solución para obtener compuestos con Ia estructura de Ia fórmula adjunta, donde AA1 , AA2, AA3, AA4, AA1', AA2', AA3', y AA4' son independientemente α-aminoácidos de configuración L o D, si aplica, proteinogénicos o no proteinogénicos, y donde por Io menos dos son cisternas o /V-alquil cisteinas, formando un puente disulfuro; donde Ri, R ₂ , y R ₃ son cada uno independientemente H o un grupo orgánico seleccionado de un grupo que consiste de un grupo alquilo, un grupo arilo, un grupo aralquilo, y sus derivados sustituidos con un grupo hidroxilo, un grupo mercapto, un grupo amino, un grupo guanidino, un grupo halógeno; donde R ₄ es independientemente H o un grupo alquilo; donde arilo (Aryl) es independientemente un grupo aromático/arilo, un grupo alquilo, o un grupo heterocíclico: el término grupo aromático o grupo arilo significando un grupo aromático mono- o policíclico hidrocarbonado, un mono- , bi-, or policiclo adecuado; y el término grupo heterocíclico significando un anillo cerrado hidrocarbonado en el cual uno o mas átomos del anillo es un elemento que no es carbono, un mono-, bi- o policiclo adecuado.

AA1 ¹ AA2 ¹ AA3' AA4 ¹

En una realización preferida, el soporte sólido es una resina ácido-lábil como Ia resina p-alcoxibenzilo Wang o Ia resina cloruro de 2-clorotritilo. Aún más preferida es Ia realización en Ia que para formar el _. precursor lineal, se usan los siguientes grupos protectores: Fmoc (fluorenilmethiloxicarbonil), Alloc (alliloxicarbonil), Tritilo (trifenilmetilo), pNZ (4-nitrobenziloxicarbonilo), Boc (f-butiloxicarbonilo), TBDMS (f-butildimetilsililo) o Trac (2,2,2- tricloroetoxicarbonilo). En todos los casos, el grupo arilo puede ser introducido en fase sólida o en solución.

En particular, Ia invención supone Ia preparación de un dímero ¡ntermolecular por puente disulfuro de tetrapéptidos a partir de un tetrapéptido lineal, que permite restringir Ia flexibilidad de Ia cadena minimizando Ia formación de dicetopiperazinas.

La invención está especialmente dirigida a Ia preparación de péptidos bicíclicos. Con este fin, Ia invención implica Ia preparación de un tetrapéptido lineal por síntesis en fase sólida, que puede contener un grupo éster o tioéster, y Ia subsiguiente formación de un dímero por puente disulfuro intermolecular en fase sólida. En este aspecto de Ia invención, las partes heterocíclicas pueden estar ya formando parte del dímero, o reemplazadas temporalmente por un grupo protector adecuado. El proceso involucra Ia escisión del dímero del soporte sólido y Ia simultánea doble ciclación para

formar el biciclo. El heterociclo también se puede introducir en este punto, en el caso que no estuviera formando parte del dímero.

Los compuestos de esta invención tienen actividad biológica, como por ejemplo actividad antitumoral.

El procedimiento de esta invención se puede llevar a cabo a partir de reactivos de partida de una manera rápida y enantio- y estereocontrolada, aprovechando las ventajas de Ia metodología sintética de fase sólida, donde una molécula en construcción se une a un soporte insoluble durante todas las operaciones sintéticas. Por Io tanto, los excesos de reactivos y los productos secundarios solubles pueden ser eliminados lavando Ia resina-molécula con disolventes adecuados. Por Io tanto, se pueden utilizar grandes excesos de reactivos solubles para completar Ia reacción en un periodo corto de tiempo, evitando racemización (si aplica) y otras reacciones secundarias. El método también permite su automatización.

Los aspectos preferibles del procedimiento sintético de Ia presente invención están representados mejor en el esquema adjunto, el cual esta dirigido a Ia formación de los compuestos objetivo

Como se muestra en el esquema, el procedimiento preferible para Ia formación sintética de péptidos bicíclicos está basado en un enfoque de fase sólida, véase por ejemplo, Lloyd-Williams, P., et al. Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins. CRC Press, Boca Ratón (FL), 1997. El procedimiento comprende las siguientes características generales:

(a) anclaje del primer aminoácido protegido en un soporte sólido (p. ej., poliestireno, polietileno injertado sobre poliestireno, y similares) conteniendo un espaciador bifuncional o enlazador ácido-lábil (p. ej., clorotritilo, polialcoxibenzilo, y similares); los preferidos son Ia resina Wahg y Ia resina Barios [cloruro de clorotritilo (CTC)], Ia cual reduce al mínimo Ia formación de dicetopiperazinas (DKP ¹ S) y permite Ia escisión de péptidos protegidos en condiciones acidas muy suaves;

(b) esquema de protección basado en una combinación de varios grupos protectores: fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)/aliloxicarbonilo (Alloc) / p-nitrobenziloxicarbonilo (pNZ), tert-butiloxicarbonilo (Boc), f-butildimetilsililo (TBDMS), y 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Trac).

(c) el uso del grupo acetamidometilo (Acm), que es un grupo protector ortogonal a los grupos protectores de los grupos aminos descritos anteriormente, para enmascarar el grupo tiol de Ia Cys durante Ia elongación de péptido y facilitar Ia formación directa del puente disulfuro;

(d) Ia formación del puente disulfuro en fase sólida, Io cual facilita Ia eliminación del exceso de l ₂ únicamente por filtración y lavados, formando el dímero abierto;

(e) el empleo de un arsenal de agentes acoplantes desde los mas reactivos, aquellos basados en HOAT (1-hidroxi-7-azabenzotriazol) a los más suaves basados en HOSU (λ/-hidroxisucc¡nimida) para mejorar los rendimientos de acoplamiento, evitar reacciones secundarias, así como sobreacilaciones.

Además, el procedimiento del esquema comprende los pasos secuenciales de:

(a) Ia incorporación del primer aminoácido (AA2) sobre Ia resina Wang o Ia resina Barios formando un enlace éster, teniendo el grupo funcional Damino temporalmente protegido con el grupo Fmoc;

(b) Ia introducción del aminoácido siguiente (AA1) utilizando una estrategia Fmoc y HATU (hexafluorofosfato de λ/-[(dimetilamino)-1H-1 ,2,3-triazolo[4,5- b]piridin-1 -ilmetilen]-λ/-metilmetanaminio)/HOAt (1 -hidroxi-7- azabenzotriazol)/DIEA (/V,λ/-diisopropiletilamina) para asegurar un acoplamiento completo, el teniendo Ia funcionalidad Damino temporalmente protegido con el grupo Fmoc; y el grupo funcional de Ia cadena lateral temporalmente protegido con el grupo TBDMS (íerí-butildimetilsililo) o Trt (tritilo) cuando se utilizan Cys o Ser, o con un grupo Alloc cuando se utiliza Dap (diaminopropiónico);

(c) el cambio del grupo protector del grupo funcional α-amino de Fmoc a pNZ.

(d) elongación de Ia cadena peptídica a través de Ia cadena lateral de Ia Serina, Cisteina o Diaminopropiónico (Dap) utilizando ácido trifluoroacético en presencia de TIS (triisopropilsilano) [TFA-TIS-CH ₂ CI ₂ (2:5:93)] para eliminar el grupo tritilo (Serina o Cisteina) y Pd(PPh ₃ VPhSiH ₃ para eliminar el grupo Alloc (Dap). Se utilizó HATU/HOAt/DIEA en DMF para realizar el enlace amida y DIPCDI (λ/,λ/'-diisopropilcarbodiimida)/DMAP [4-{N,N- dimetilam¡no)p¡rid¡na] en el caso de realizar el enlace éster o tioéster (AA4). Alternativamente, también se puede utilizar MSNT [1-(Mesitileno-2-sulfonil)-3- nitro-1 H-1 ,2,4-triazol] /NMI (λ/-metilmidazol)/DIEA para formar el enlace éster.

(e) introducción del aminoácido siguiente (AA3) usando HATU/HOAt/DIEA como sistema de acoplamiento para asegurar un acoplamiento completo.

alternativamente algunos λ/-metil aminoácidos se pueden introducir mediante el método de /V-metilación de aminoácidos en fase sólida por el método Fukuyama (cf. Miller, S. C; Scanlan, T. S., J. Am. Chem. Soc, 1998, 120, 2690-2691 ; Yang, L.; Chiu, K., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 7307-7310) utilizando o-nitrosulfonilo como protección temporal del grupo funcional α-amino;

(f) eliminación del grupo pNZ e introducción del ácido 3-hidroxiquináldico usando PyBOP (hexafluorofosfato de (benzotriazol-i-iloxi)-tris- (pirrolidino)fosfonio)/ HOAt/DIEA como sistema de acoplamiento;

(g) formación del dímero por puente disulfuro intermolecular mediante tratamiento con b y eliminación del reactivo por filtración y lavados;

(h) tratamiento con ácido trifluoroacético [(TFA-CH ₂ CI ₂ (1 :4) con resina Wang y TFA-CH ₂ Cb (1 :99) con Ia resina Barios] para obtener el péptido dimerizado;

(i) Ia formación del biciclo usando PyAOP [hexafluorofosfato de (7- azabenzotriazol-i-iloxi)-tris(pirrolidino) fosfonio]/DIEA o PyBOP/HOAt/DIEA para asegurar una delación completa y evitar Ia guanidilación que puede ocurrir cuando se utilizan HATU u otros reactivos basados en aminio/uronio;

(j) alternativamente, Ia introducción del heterociclo se puede realizar también después de Ia formación del biciclo, mediante tratamiento con DIPCDI y HOSU, en DCM.

Alternativamente, Ia síntesis del péptido se puede iniciar en otro punto de Ia cadena que no sea AA2.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

EJEMPLOS

Métodos generales:

Derivados de aminoácidos protegidos, PyBOP ₁ PyOAP ₁ fueron obtenidos de Applied Biosystems (Framingham, MA), Bachem (Bubendorf, Switzerland), Albatross (Montreal, Canadá), y NovaBiochem (Láufelfingen, Switzerland). La resina Barios se obtuvo de Rohm and Haas (Philadelphia, USA) o de Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany). DIEA, DIPCDI, piperidina, TFA, amoníaco, ¡odometano, cloroformiato de alilo, cloroformiato de p-nitrobenzilo, y el acido quináldico fueron obtenidos de Aldrich (Milwaukee, Wl), y EDCηCI y HOAt eran de Luxembourg Industries (TeI Aviv, Israel). DMF ₁ CHaCI ₂ , Acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), Dioxano, Et ₂ O, TBME (f-butil metil éter) y EtOAc (acetato de etilo) fueron obtenidos de SDS (Peypin, France). El ácido (R)(-)-thiazolidino-4-carboxílico, trifluorometanosulfónico, N- hidroximetilacetamida y /V-hidroxisuccinimida fueron obtenidos de Fluka (Buchs, Switzerland). Todos los reactivos comerciales y disolventes se usaron tal como se recibieron con Ia excepción de Ia DMF y el CH ₂ CI ₂ , los cuales fueron desgasificados con nitrógeno para eliminar contaminantes volátiles (DMF) y guardados sobre tamiz molecular de 4á (Merck, Darmstadt, Germany), y THF que fue destilado de sodio/benzofenona.

Las reacciones en solución se realizaron en balones con fondo redondo. Los extractos de disolventes orgánicos fueron secados sobre MgSO ₄ anhidro, y seguidamente se evaporó el disolvente bajo presión reducida a temperaturas por debajo de 40 °C.

Las síntesis en fase sólida fueron realizadas en jeringas de polipropileno (2, 5 mL) provistas de un disco poroso de polipropileno. Los disolventes y los reactivos solubles fueron eliminados por succión. La eliminación del grupo Fmoc se realizó con piperidina-DMF (1 :4, v/v) (1 x 1 min, 2 x 5 min). Los lavados entre desprotecciones, acoplamientos, y desprotecciones finales se realizaron con DMF (5 x 1 min) y CH ₂ CI2 (5 x 1 min) usando 5 mL disolvente.g- ¹ resina para cada lavado. Las transformaciones de Ia síntesis de los péptidos y los lavados se realizaron a 25 °C.

Las columnas de HPLC (columna de fase reversa Symmetry® C18, 5.0 Dm x 4.6 mm x 150 mm) fueron obtenidas de Waters (Ireland). El HPLC analítico se realizó en un instrumento Waters que comprende un módulo de separación (Waters 2695), inyector automático, detector de fotodiodo array (Waters 996), y controlador del sistema (Millenium ³² login). La detección de UV se realizó a 215 o 220 nm, y se realizaron gradientes lineales de CH3CN (+0.036% TFA) en H2O (+0.045% TFA), a 1.0 mL-min ^"1 de flujo en 15 min.

Los análisis de MALDI-TOF y ES(+)-MS de muestras de péptido fueron realizadas en un Applied Biosystems VoyagerDE RP, utilizando matriz ACH, y en un espectrómetro Waters Micromass ZQ spectrometer y en un Agilent Ion Trap 1100 Serie LC/MSDTrap. Espectroscopia ¹ H NMR (400 MHz) y ¹³ C NMR (100 MHz) se realizó en un Varían Mercury 400. Los desplazamientos químicos (δ) son expresados en partes por millón relativos al cloruro de tetrametilsililo. Las constantes de acoplamiento son expresadas en Hertz.

Ejemplo 1 : Boc-NMe-Cvs(Me)-OH

En un balón de fondo redondo, NaH al 60% en aceite mineral (2.01 g, 51 mmol) fue disuelto en THF anhidro (20 mL). A continuación, se añadió Boc- Cys(Me)-OH (4.0 g, 17 mmol) disuelto en THF (20 mL) y Ia reacción se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. Se añadió ¡odometano (2.1 mL, 34 mmol) gota a gota y Ia reacción se dejó en agitación durante 14 h a 4 °C. Se añadió MeOH

lentamente para eliminar el exceso de hidruro y a continuación se añadió H ₂ O, y Ia mezcla se llevo a pH 8 mediante Ia adición de NaOH, y el THF residual fue eliminado por evaporación. La fase acuosa fue extraída con TBME (3 x 20 ml_) y acidificada a pH 2 con HCI 4N. Boc-NMe-Cys(Me)-OH fue extraída con EtOAc (3 x 20 mL) y secada (MgSO ₄ ). El producto objetivo (3.6 g, 85% rendimiento) fue obtenido como un aceite incoloro. Alternativamente, Boc-NMe-Cys(Me)-OH se puede obtener a partir de HCI-H-NMe-Cys-OH. HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del acido (R)(-)-tiazolidin-4-carboxylico de acuerdo con Liu, J-F.; Tang, X-X.; Jiang, B. (cf. Synthesis 2002, 1499-1501), fue disuelto en H ₂ O-THF (1 :1) (170 mL) y Ia mezcla fue enfriada a 4 °C. Se añadieron iodometano (2.07 mL, 33.3 mmol) disuelto en THF (68 mL) y NaHCO ₃ (5.3 g, 71.4 mmol) en H ₂ O (68 mL) secuencialmente sobre Ia solución de aminoácido. Después de que Ia adición fuera completa, Ia mezcla se agitó a 25 °C durante 4 h, punto en el cual el test de Ellman fue negativo. La solución fue acidificada hasta pH 5 y el disolvente se eliminó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en 2% Na ₂ CO ₃ acuoso dioxano (1 :1) (80 mL) y Ia solución se enfrió a 4 °C. Sobre Ia solución de aminoácido se anadió (Boc) ₂ O (6.2 g, 35.7 mmol) disuelto en dioxano (8 mL), y el pH se ajustó a 8.5-9.5 añadiendo 10% Na ₂ CO ₃ acuoso. La mezcla se agitó a 4 °C durante 2 h y a 25 °C durante 2 días, manteniendo el pH a 8.5- 9.5. El dioxano se eliminó y Ia solución acuosa se lavó con TBME (3 x 50 mL). La fase acuosa se acidificó con HCI 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) y fue purificado por HPLC preparativo (gradiente lineal de 15 a 50% ACN en 30 min, 40 mL/min). Obtenido: 1.15 g, 19.4% rendimiento. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 7.18 (br s, 1H), 4.74 (dd, 1H), 3.05 (d, 1 H), 2.88 (d, 1 H), 2.84 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.46 (s, 9H). ¹³ C NMR δ 175.2, 156.5, 80.7, 58.0, 33.2, 32.1 , 28.6, 15.6. ESMS: m/z caled para C ₁₀ H ₁₉ NO ₄ S, 249.10; encontrada, 250.3 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 2: Alloc-NMe-Cvs(Me)-OH

En un balón de fondo redondo de 500 mL, Boc-NMe-Cys(Me)-OH (3.0 g, 12.0 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH ₂ CI ₂ (1 :1 ). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na ₂ CO ₃ (50 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (1.5 mL, 14.4 mmol) en dioxano (50 mL), y el pH se

mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na ₂ CO ₃ acuoso _. Se siguió el curso de Ia reacción mediante TLC [EtOAcH ₂ óAcOH2-propanol (2:1 :1 :1)]. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 50 ml_) y después se acidificó a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml_), (2.5 g, 89.6% rendimiento). ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 5.95 (m, 1 H), 5.34 (dd, 1 H), 5.22 (dd, 1 H), 4.81 (m, 1 H), 4.62 (d, 2H), 3.10 (dd, 1 H), 2.95 (s, 3H) ₁ 2.90 (dd, 1 H), 2.13 (s, 3H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ) δ 174.8, 157.2, 136.8, 117.9, 67.1 , 66.9, 58.8, 33.1 , 32.0, 17.9. ESMS: m/z caled para C ₉ H ₁₅ NO ₄ S, 233.07; encontrada, 234.3 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 3: Boc-NMe-Cvs(Acm)-OH

HCI-H-NMe-Cys-OH (4.1 g, 23.8 mmol), obtenido del ácido (R)(-)-tiazolidin-4- carboxílico de acuerdo con Liu, J-F.; Tang, X-X.; Jiang, B. (Synthesis 2002, 14991501 ), se disolvió en H ₂ O (12.3 mL) y Ia solución se purgó con Ar, y entonces λ/-hidrox¡met¡lacetamida (3.54 g, 39.7 mmol) se añadió a Ia solución y Ia mezcla se enfrió a 4 °C bajo Ar. Se añadió una solución de TFA en acido trifluorometanosulfónico (95:5) (41 mL) a Ia solución de aminoácido. La mezcla se agitó a 25 °C durante 16 h hasta que el test de Ellman dio negativo. El producto se disolvió en 2% Na ₂ CO ₃ acuoso ^" dioxano (1 :1 ) (80 mL) y Ia solución se enfrió a 4 °C. Sobre Ia solución de aminoácido se anadió (Boc) ₂ O (6.2 g, 35.7 mmol) disuelto en dioxano (8 mL), y el pH se ajustó a 8.5-9.5 añadiendo 10% Na ₂ CO ₃ acuoso. La mezcla se agitó a 4 °C durante 2 h y a 25 °C durante 3 días, manteniendo el pH a 8.5-9.5. El dioxano se eliminó y Ia solución acuosa se lavó con TBME (3 x 50 mL). La fase acuosa se acidificó con HCI 4N hasta pH 2 y el producto se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). El disolvente se eliminó bajo presión reducida para dar 1.23 g, 16.9% rendimiento global). ¹ H NMR (CDCI ₃ ): δ 6.72 (br s, 1 H), 4.92 (m, 1 H), 4.56 (m, 1 H), 4.21 (m, 1 H), 3.21 (m, 1 H), 2.89 & 2.82 (m, 4H), 2.05 (m, 3H), 1.50 (s, 9H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ): δ 172.6, 159.1 , 153.5, 80.9, 59.3, 40.6, 32.3, 31.4, 28.3, 22.9. ESMS: m/z caled para C ₁₂ H ₂₂ N ₂ O ₅ S, 306.12; encontrada, 306.67 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 4: Alloc-NMe-Cvs(Acm)-OH

En un balón de fondo redondo de 250 ml_, Boc-NMe-Cys(Acm)-OH (0.74 g, 2.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFáCH2CI2 (1:1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na ₂ C0 ₃ (20 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en dioxano (20 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na ₂ Cθ ₃ acuoso _. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 25 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL). Obtenido: 0.61 g, 87% rendimiento. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 10.25 (br s, 1H), 7.34 (br s, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.34 (dm, 1 H), 5.25 (dm, 1 H), 4.94 & 4.84 (m, 1 H), 4.65 (m, 2H), 4.58 (dd, 1 H), 4.24 (dd, 1 H), 3.25 (dd, 1 H ₁ 2.92 (m, 4H), 2.11 (s, 3H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ) δ 174.0, 159.8, 158.2, 132.1 , 118.2, 67.5, 59.1 , 42.1 , 31.7, 30.9, 22.4. ESMS: m/z caled para C ₁₁ Hi ₈ N ₂ O ₅ S, 290.09; encontrada, 291.07 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 5: Alloc-Cvs(Me)-OH

En un balón de fondo redondo de 250 mL, Boc-Cys(Me)-OH (0.56 g, 2.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFáCH ₂ CI2 (1 :1 ). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na ₂ CO ₃ (30 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.3 mL, 2.9 mmol) en dioxano (30 mL), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na ₂ CO ₃ acuoso _. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL). Obtenido: 0.51 g, 97% rendimiento. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 5.93 (m, 1 H), 5.34 (dd, 1 H), 5.26 (dd, 1 H), 4.62 (d, 2H), 3.0 (m, 1 H), 2.15 (s, 3H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ) δ 175.0. 156.2, 132.6, 118.8, 67.2, 53.2, 38.3, 18.2.ESMS: m/z caled para C ₈ H ₁₃ NO ₄ S, 219.06; encontrada, 219.75 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 6: Alloc-Cvs(Acm)-QH

En un balón de fondo redondo de 250 mL, Boc-Cys(Acm)-OH (1.0 g, 3.4 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFACH ₂ CI ₂ (1 :1). La mezcla se

evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na ₂ C0 ₃ (30 ml_). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo (0.43 mL, 4.1 mmol) en dioxano (30 ml_), y el pH se mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na ₂ CO ₃ acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 mL) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL). Obtenido: 0.89 g, 95% rendimiento. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 5.89 (m, 1 H), 5.18 (dd, 1 H), 5.12 (dd, 1 H), 4.62 (d, 2H), 4.42 (dd, 1 H), 4.25 (dd, 1 H), 3.10 (dd, 1 H), 2.98 (dd, 1H), 2.05 (s, 3H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ) δ 173.1 , 173.0. 156.9, 132.6, 118.3, 66.2, 54.1 ,

42.4, 34.4, 23.0. ESMS: m/z caled para Ci ₀ H ₁₆ N ₂ O ₅ S, 276.08; encontrada, 277.69 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 7: Boc-D-Ser(TBDMS)-OH

Boc-D-Ser-OH (1.0 g, 5.35 mmol) se disolvió en DMF (10 mL) y se enfrió a 0 °C en un baño de hielo. A continuación se añadieron TBDMSCI (1.04 g, 6.96 mmol) y imidazol (1.10 g, 16.0 mmol), y Ia reacción se mantuvo a 0 °C durante 1 h y después se llevó a 25 °C y se agitó durante 14 h más. A continuación se añadió HCI 1N (25 mL), y el producto se extrajo con Et ₂ O (3 x 25 mL). Las fases orgánicas se combinaron y secaron (MgSO4), y el producto se purificó por cromatografía en columna [(CH ₂ CI ₂ EtOAc (2:1 )] para obtener 0.99 g (64% rendimiento) del producto objetivo como un sólido blanco. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ = 5.45 (br s, 1 H), 4.11 (m, 1 H), 3.85 (m, 1 H), 1.46 (s, 9H),

0.92 (s, 6H), 0.88 (s, 9H). ¹³ C NMR (CDCi ₃ ) δ = 175.2, 156.4, 80.5, 63.6, 55.4,

28.5, 25.9, 18.4, -3.4, -5.6. ESMS: m/z caled para Ci ₅ H ₃₁ NO ₅ Si, 319.18; encontrada, 319.74 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 8: Alloc-GIv-OH

En un balón de fondo redondo de 250 mL, H-GIy-OH (1.0 g, 13.3 mmol) se hizo reaccionar durante 1 h con TFA-CH ₂ CI ₂ (1 :1). La mezcla se evaporó a sequedad y se realizaron coevaporaciones con dioxano con el fin de eliminar el exceso de TFA. El sólido se disolvió en una solución acuosa al 30% de Na ₂ CO ₃ (50 mL). A continuación, se añadió gota a gota una solución de cloroformiato de alilo. (1.7 mL, 16.0 mmol) en dioxano (50 mL), y el pH se

mantuvo a 8-9 mediante Ia adición de 10% Na ₂ CO ₃ acuoso. Una vez completada Ia reacción, Ia fase acuosa se lavó con TBME (3 x 30 ml_) y fue entonces acidificada a pH 2 mediante Ia adición de HCI 4N, y el producto objetivo se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) para dar 2.0 g (95% rendimiento) de un aceite incoloro. ¹ H NMR (CDCI ₃ ) δ 5.91 (m, 1 H), 5.36 (dd, 1 H), 5.24 (dd, 1 H), 4.63 (d, 2H), 4.07 (s, 2H). ¹³ C NMR (CDCI ₃ ) δ 174.28, 156.57, 132.62, 118.27, 67.28, 66.25, 66.37, 43.29. ESMS: m/z caled para C ₆ H ₉ NO ₄ , 159.05; encontrada, 160.30 [M + H] ⁺ .

Ejemplo 9: {fHαa-D-Ser(& ¹ )-Glv-Cvs(& ² )-Cvs(Me)& ³ πHqa-D-Ser(& ³ VGIv- Cvs(& ² )-Cvs(Me^& ¹ 1)

En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ -DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1:4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). La funcionalización (0.90 mmol/g) se calculó midiendo Ia absorbancia a 290 nm de Ia solución de desprotección del Fmoc. A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de TFA-TIS-CH ₂ CI ₂ (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg, 0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH ₂ CI ₂ (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh ₃ ) ₄ (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH ₃ (55.4

mg, 0.45 mmol) disuelto en CH ₂ Cb durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y después se introdujo Boc-Cys(Acm)-OH (65.5 mg, 0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μl_, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₃ H ₃₂ N ₆ OnS ₂ , 632.16; encontrada, 632.16 [M + H] ⁺ . Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI ₂ 4.6 M, HCI 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido 3-hidroxiquináldico (12.7 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con

PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μl_, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue olivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₅ H ₃₂ N ₆ O ₉ S ₂ 624.17; encontrada, 624.58 [M + H] ⁺ . La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I ₂ (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH ₂ CI ₂ (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H ₂ O, Ia mezcla fue evaporada con N ₂ , y liofiiizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₄ H ₅₂ N ₁₀ Oi ₆ S ₄ 1104.24; encontrada, 1105.22 [M + H] ⁺ . El producto liofilizado se disolvió en CH ₂ CI ₂ y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH ₂ CI ₂ (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₄ H ₄₈ N ₁₀ Oi ₄ S ₄ 1068.22; encontrada, 1069.86 [M + H] ⁺ . MALDI-TOF: m/z caled para C ₄₄ H ₄₈ Ni ₀ Oi ₄ S ₄ 1068.22; encontrada, 1069.30 [M + H] ⁺ .

Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ. Eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI ₂ (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH ₂ CI ₂ a 25 °C durante 2 días.

Ejemplo 10: Qxathiocoraline: {[Hqa-D-Ser(& ¹ )-GIy-(Me)Cys(& ² )- (Me)Cvs(Me)& ³ ][Hqa-D-Ser(& ³ )-Glv-(Me)Cvs(& ² )-(Me)Cvs(Me)& ¹ ]}

En una jeringa de polipropileno de 3 ml_ provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ DMF (9:1 ). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 ml_) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH ₂ Cl ₂ (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH ₂ CI ₂ (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-NMe-Cys(Me)-OH (104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH ₂ CI ₂ (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPt^) ₄ (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH ₃ (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y Boc-NMe-Cys(Acm)-OH (68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₅ H ₃₆ N ₆ O _{1 1} S ₂ 660.19; encontrada, 662.02 [M + H] ⁺ . Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI ₂ 4.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido 3-hidroxiquináldico (12.7 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con

PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μl_, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue olivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₇ H ₃₆ N ₆ O ₉ S ₂ 652.20; encontrada, 653.62 [M + H] ⁺ . La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I ₂ (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min). El peptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH ₂ CI ₂ (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H ₂ O, Ia mezcla fue evaporada con N ₂ , y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₈ H _6O Ni ₀ Oi ₆ S ₄ 1160.31 ; encontrada, 1161.84 [M + H] ⁺ . El producto liofilizado se disolvió en CH ₂ CI ₂ y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMF-CH ₂ CI ₂ (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia delación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₈ H ₅₆ N ₁₀ Oi ₄ S ₄ 1124.29; encontrada, 1125.35 [M + H] ⁺ . MALDI-TOF: m/z caled para C ₄₈ H ₅₆ Ni ₀ Oi ₄ S ₄ 1124.29; encontrada, 1125.9957 [M + H] ⁺ .

Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI ₂ (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH ₂ CI ₂ a 25 °C durante 2 días.

Ejemplo 11 : frQac-D-Ser(& ¹ )-Glv-Cvs(& ² )-Cys(Me)& ³ 1[Qac-D-Ser(& ³ )-Glv- Cvs(& ² )-Cvs(Me)& ¹ p

En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ -DMF (9:1). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La

resina Fmoc-G Iy-O-Wa ng fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH ₂ CI ₂ (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-Cys(Me)-OH (98.5 mg, 0.45 mmol) por reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMFCH ₂ CI ₂ (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh ₃ ) ₄ (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH ₃ (55.4 mg, 0.45 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH ₂ Cb (3 x 1 min). El proceso se repitió tres veces y después se introdujo Boc-Cys(Acm)-OH (65.5 mg, 0.225 mmol) con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₃ H ₃₂ N ₆ OnS ₂ , 632.16; encontrada, 632.16 [M + H] ⁺ . después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI ₂ 4.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido quináldico (11.6 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μL, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue clivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₅ H ₃₂ N ₆ O ₈ S ₂ , 608.17; encontrada, 608.94 [M + H] ⁺ . La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I ₂ (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min). El péptido dimerizado fue entonces escindido de Ia resina mediante tratamiento con TFA-CH ₂ CI ₂ (1:4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H ₂ O, Ia mezcla fue evaporada con N ₂ , y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₄ H ₅₂ N ₁₀ Oi ₄ S ₄ , 1072.25; encontrada, 1073.52 [M + H] ⁺ . El

producto liofilizado se disolvió en CH ₂ CI ₂ y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH ₂ CI ₂ (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia ciclación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₄ H ₄₈ N ₁₀ O ₁₂ S ₄ , 1036.23; encontrada, 1037.64 [M + H] ⁺ . MALDI-TOF: m/z caled para C ₄₄ H ₄₈ Ni ₀ Oi ₂ S ₄ , 1036.23; encontrada, 1038.06 [M + H] ⁺ .

Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI ₂ (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1 ), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH ₂ CI ₂ a 25 °C durante 2 días.

Ejemplo 12: (rQac-D-Ser(& ¹ )-Glv-(Me)Cvs(& ² )-(Me)Cvs(Me)& ³ irQac-D- Ser(& ³ )-Glv-(Me)Cvs(& ² HMe)Cvs(Me)& ¹ 1}

En una jeringa de polipropileno de 3 mL provista de un disco poroso de polietileno, se colocó resina Wang (50 mg, 0.93 mmol/g). La resina se lavó después con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y se añadió Fmoc-Gly-OH (110 mg, 0.37 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ DMF (9:1 ). A continuación, DIPCDI (57.6 μL, 0.37 mmol) y DMAP (4.5 mg, 0.04 mmol) en DMF (0.2 mL) fueron secuencialmente añadidos y Ia mezcla se dejó reaccionar durante 14 h. La resina Fmoc-Gly-O-Wang fue sometida a los siguientes lavados/tratamientos: filtración, CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), DMF (3 x 1 min), piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min). A continuación, se introdujo Fmoc-D-Ser(Trt)-OH (76.8 mg, 0.135 mmol) mediante HATU (51.3 mg, 0.135 mmol) como agente acoplante en DMF en presencia de DIEA (45.9 μL, 0.27 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h y después de filtrarla el ensayo Kaiser indicó Ia finalización de Ia reacción de acoplamiento. La peptidil resina fue después lavada con DMF (3 x 1 min), CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), y tratada con piperidina-DMF (1 :4) (1 x 1 min, 2 x 5 min) para eliminar el grupo Fmoc. Con el fin de introducir el grupo pNZ, Ia resina fue tratada con cloroformiato de p-nitrobenzilo (29.1 μL, 0.135 mmol) y

DIEA (229 μL, 1.35 mmol) durante 45 min. La desprotección del grupo tritilo se realizó con lavados de con TFA-TIS-CH ₂ CI ₂ (2:2.5:95.5) hasta que se consiguió un filtrado incoloro. La peptidil resina fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min) y se introdujo Alloc-NMe-Cys(Me)-OH (104.8 mg, 0.45 mmol) mediante reacción con DIPCDI (69.7 μL, 0.45 mmol) y DMAP (5.5 mg, 0.045 mmol) en DMF-CH ₂ CI ₂ (1 :9) durante 14 h a 25 °C. A continuación, para eliminar el grupo Alloc, Ia peptidil resina fue tratada con Pd(PPh ₃ ) ₄ (5.2 mg, 4.5 μmol) y PhSiH ₃ (55.4 μL, 0.45 mmol) disuelto en CH ₂ CI ₂ durante 15 min bajo Ar, y fue después lavada con CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min). Boc-NMe-Cys(Acm)- OH (68.8 mg, 0.225 mmol) se introdujo con HATU (85.6 mg, 0.225 mmol), HOAt (30.7 mg, 0.225 mmol), y DIEA (37.5 μL, 0.22 mmol) como sistema de acoplamiento. El acoplamiento se repitió una vez. Una alícuota de Ia resina se clivó y se analizó por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₅ H ₃₆ N ₆ OnS ₂ , 660.19; encontrada, 662.02 [M + H] ⁺ . Después de lavar Ia resina con DMF (3 x 1 min) y CH ₂ CI ₂ (3 x 1 min), el grupo pNZ se eliminó por tratamiento con SnCI ₂ 4.6 M, HC1 1.6 mM en DMF (2 x 30 min) y el ácido quináldico (11.6 mg, 0.067 mmol) se introdujo por reacción con PyBOP (34.9 mg, 0.067 mmol), HOAt (9.1 mg, 0.067 mmol), y DIEA (34.4 μL, 0.20 mmol) en DMF. Una alícuota de Ia resina fue clivada y analizada por HPLC-ESMS: m/z caled para C ₂₇ H ₃₆ N ₆ O ₈ S ₂ , 636.20; found, 637.98 [M + H] ⁺ . La formación del puente disulfuro intermolecular se obtuvo por tratamiento con I ₂ (57 mg, 0.225 mmol, 0.06 M) en DMF (2 x 10 min). La resina fue repetidamente lavada con CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min), DMF (10 x 1 min), y CH ₂ CI ₂ (10 x 1 min). El peptido dimerizado fue entonces clivado de Ia resina mediante tratamiento con TFACH ₂ CI ₂ (1 :4) (2 x 30 min), y después de Ia adición de H ₂ O, Ia mezcla fue evaporada con N ₂ , y liofilizada. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₈ H ₆₀ Ni ₀ O ₁₄ S ₄ , 1128.32; found, 1129.86 [M + H] ⁺ . El producto liofilizado se disolvió en CH ₂ CI ₂ y se añadió a una solución de HOAt (49 mg, 0.36 mmol) en DMFCH ₂ CI ₂ (1 :9), y Ia mezcla se agitó durante 30 min. Adición de PyBOP (187 mg, 0.36 mmol) y DIEA (90 μL) para ajustar a pH 8.0 permitió el comienzo de Ia delación, que fue agitada durante 4 h. El disolvente se evaporó y el péptido bicíclico fue entonces purificado por HPLC semipreparativo. HPLC-ESMS: m/z caled para C ₄₈ H ₅₆ Ni ₀ O ₁₂ S ₄ , 1092.30; found, 1093.16 [M + H] ⁺ .

Alternativamente, el dímero se puede también obtener antes de sacar el grupo protector pNZ. La escisión del dímero de Ia resina, evaporación, liofilización, y ciclación bajo las condiciones descritas anteriormente

proporciona el biciclo protegido con el grupo pNZ-. La eliminación del grupo protector pNZ se lleva a cabo por tratamiento con SnCI ₂ (1.5 equiv), HC1 1.6 mM en EtOAc-DMF (9:1), y el ácido 3-hidroxiquináldico (3 equiv) se introdujo mediante reacción con EDC-HCI (3 equiv), y HOSu (3 equiv), en CH ₂ CI ₂ a 25 °C durante 2 días.