Stand der Technik Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung einer aktiven Substanz aus Blutserum, dem die Entnahme des Bluts von Menschen und Tieren, die Inkubation sowie die Absonderung der aktiven Substanz mit anschließender Konservierung zugrunde liegt. Diese Methode betrifft die Gewinnung eines Blutserums, das die Widerstandsfähigkeit des Körpers in bezug auf exogene und endogene Faktoren wie Luftdruck, Lufttemperatur, Schwerkraft, Licht etc. sowie Hunger, Durst, Schlaf-und sexuelle Bedürfnisse usw. erhöht (sh. JP 2123287, EP 0 542 303 ; RU 2096041, RU 2120301).

Das Blutserum wird hierbei von einem Spender entnommen, der zuvor in einen bestimmten funktionellen Zustand versetzt wird. Dabei wird je nach Einwirkungsgrad Blutserum mit un- terschiedlicher biologischer Aktivität gewonnen, und zwar mit miogener, somnogener, oph- talmogener, audioaktiver, thennoaktiver, diätaktiver, sexaktiver, antihypoxischer, Antialko- hol-und Antinikotinaktivität.

Ein anderes Verfahren, veröffentlicht in der EP 1 283 047, beschreibt die Behandlung von tierischem Blutserum, welches einer Gamma-Bestrahlung ausgesetzt wird mit dem Ziel, die biologische Aktivität zu erhöhen.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Weiterentwicklung dieser Methoden dar und behandelt die unterschiedlichen Verwendungen des gewonnenen Blutserums.

Gegenwärtig wird nach peptidartigen Substanzen gesucht, welche die Zellproliferation unter- schiedlicher menschlicher Gewebearten regulieren. Sowohl Stimulatoren als auch Inhibitoren der Zellteilung der normalen und pathologisch somatischen Zellen sowie Nervenzellen wer- <BR> <BR> den vielseitig erforscht [sh. Aschmarin I. P., "Neurochemie", Moskau, Verlag des Biomed.

Chem. Instituts an der Russischen Akademie der Wissenschaften, 1996].

Es wurde festgestellt, dass neben den allgemeinen Aktivierungsfunktionen der peptiden Wachstumsfaktoren-Mitosestimulation, Zelldifferenzierung und Zellwachstum unterschied- licher Arten des Normalgewebes, schneller Wundheilung-Wachstumspeptide zur Tumorbil- dung führen können [sh. Bouneres P.//Growth hormone effects on carbohydrate and Lipid metabolism. Horm. Res., 1993, Vol 40, P. 31 ; Robinson C.//Growth factors : therapeutic advances in wound healing. Ann. Med., 1993, Vol 25, P. 535 ; Diegnez C., Casanueva F.// Influence of metabolic substrates and ibesity on growth hormone secretion. Trends Endocrin.

Metab., 1995, Vol. 6, P. 55 ; Menster D., Herrmann J., Nicolson J//The role of tropic factors and autocrine/paracrine growth factors in brain meta.].

Unter anderem fördern derartige Peptide wie das parathyroide Peptid, Gastrin, Bombezin die Entwicklung von Tumorzellen sowie die Entstehung von Brust-, Knochen-und Darmkrebs [sh. Kitazawa S., Maeda S., Development of skeletal metastases//Clin. Orthop, 1995, V. 312, P. 45-50 ; Kaji et al,. Carbokyl-terminal peptices from parathyroid hormone-related protein stimulate osteoclast-like cell formation//Endocrinology, 1995, V. 136, P. 842-847].

Obwohl gewisse Peptide die normale Zellteilung begünstigen und Verhaltensstimulatoren für Mensch und Tier sind, besteht bei ihrer Verwendung die Gefahr der Bildung von Tumorzellen und der Entwicklung von Krebskrankheiten.

Frühere Untersuchungen haben ergeben, dass die Elektroschockstimulation von Tieren zur Erhöhung des Betaendorphin-Spiegels im Blut führt [sh. Litvinova S. V., et al. Action of beta- endorfin antiserum of defferent antibody tits on thermal or tail-shock pain in rats//Biomed <BR> <BR> Scie-1990. V. 1/5-P. 471-474. ]. In seinem Übersichtswerk liefert W. I. Udowitschenko zahl- reiche Daten darüber, dass der Schock beliebiger Ätiologie wie z. B. der Elektroschock so- wohl bei Menschen als auch bei Tieren die Konzentration an Betaendorphinen-, Meta-und Leuenkephalinen im Blut deutlich erhöht [sh. Udowitschenko W. I. "Das endogene opioide System beim Schock"Pathologische Physiologie und experimentelle Therapie, 1989, Nr. 6, S.

72-77].

Aus unseren Untersuchungen geht hervor, dass das nach Elektroschock entnommene tierische Serum (Substanz S1) mit endogenen Peptiden einer Molekularmasse von bis zu 10-14 kDa (sh. EP 1 283 047) angereichert ist und das Hörvermögen bei gehörlosen Tieren stimuliert [sh.

"Einfluss der Substanz S 1 auf Ratten mit gesenktem Hörvermögen"//Exper. Biol. Und Medi- zin, 2002, Nr. 1, S. 42-43].

Aufgabe der vorliegenden Erfindung Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer neuen Methode zur Ge- winnung eines biologisch aktiven Blutserums aus Hühnerblut.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Entwicklung einer Arzneimittel- form für ein neues, biologisch aktives Blutserum.

Die Erfindung geht von diversen Arzneimittelformen aus : unter anderem der peroralen, pa- renteralen, nasalen und buccalen Verabreichung sowie in Form von Suppositorien und ähnli- chen Arten.

In der Erfindung ist die Verwendung von geeigneten und physiologisch vertretbaren Medien (wie z. B. destilliertem Wasser) und Füllmitteln (z. B. Kakaobutter) vorgesehen.

Das mit Elektroschock behandelte biologisch aktive Blutserum kann sowohl selbständig als auch in Verbindung mit anderen biologisch aktiven Mitteln verwendet werden.

Ein zusätzliches Ziel der Erfindung ist eine pharmazeutische Komposition, bei der die aktive Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung als Agens auftritt. Dabei muss die pharmazeuti- sche Komposition einen aktiven Bestandteil in einer Menge aufweisen, die ausreicht, um eine günstige Wirkung auf den Organismus des Patienten auszuüben, d. h. eine effektive Menge.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Ermittlung der effektiven Dosis der aktiven Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung. Vermutlich liegt diese Dosis im Bereich 95 bis 105 mg/kg Körpergewicht des Patienten. Die konkrete Dosis soll daher vom behandelnden Arzt ausge- hend vom Zustand des Patienten, seinem Alter, seinem Gewicht und der Behandlungsart fest- gelegt werden.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Blutserums zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen. Folgende Zellen wurden verwendet : Zellen des humanen T-Zell-Lymphoms der Linie Jurkat, Zellen des hu- manen B-Zell-Lymphoms der Linie Raj, Zellen der humanen Melanomzellen der Linie Bro, Zellen des Gebärmutterhalskarzinoms der Linie HeLa, Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse der Linie MCF-7, Zellen des Osteosarkoms der Linie Mg63 und des Fibrosar- koms der Linie HT1080, Zellen des Neuroblastoms IMR-32 und des Hepatokarzinoms der Linie HepG2. Es wurde somit die Wirkung der Substanz auf die Lymphoidzellen (Jurkat und Raj), Epitheloidzellen (HeLa und MCF-7), Zellen der neuronalen Herkunft (IMR-32), Zellen des Bindegewebes (Mg63 und HT1080) sowie Mesenchymzellen (HepG2) erforscht. Als Normalzellen wurden die in vitro stimulierten Lymphozyten des peripheren menschlichen Bluts verwendet.

Kurzbeschreibung des Inhalts der Erfindung Die Behandlung von Hühnern mit Elektroschock und die Bearbeitung des Blutserums mit Gamma-Strahlen führen zu einer bedeutenden Erhöhung der biologischen Aktivität, die viele Körperfunktionen des Patienten positiv beeinflusst.

Gleichzeitig ist jedoch bekannt, dass Elektroschocks große Störungen sämtlicher lebens- wichtiger Funktionssysteme des Organismus, vor allem des zentralen Nerven-, des Herz- Kreislauf-, des Atmungssystems und des Blutkreislaufes hervorrufen. [sh. Orlow A. N., Sarkowow M. A., Butenko M. W. -Elektrotrauma, M., Medizin, 1977].

Ebenfalls wurde festgestellt, dass Blut und aus Blut hergestellte Präparate bestrahlungs- empfindlich und nicht beständig sind sowie unter Einfluss der ionisierten Strahlung deakti- viert werden. [sh.//Radiomedizin-M., Atomisdat-1972. S. 123-125 ; Gergely J., et. Al.

Studies of gamma-ray-irradiated human immunoglobulin G.//Radiosterilization of Medical Products, -1967. Vienna. -P. 115-124].

Alle diese Studien gemeinsam haben nicht die Ergebnisse gebracht, die von den Autoren der vorliegenden Erfindung erzielt wurden.

Es stellte sich heraus, dass wenn man venöses oder arterielles mit Elektroschock II.-III. Gra- des behandeltes Hühnerblut 24 Stunden lang bei niedrigen Temperaturen (circa 4-8°C) inku- biert und im Anschluss daran nach der Blutgerinnselretraktion und seiner Separation ein Se- rum gewinnt, lyophilisiert und mit ca. 20-30 (25+5) kGy bestrahlt, so erhält man ein aktives Blutserum (darauf wird in späterer Folge eingegangen).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung Nachfolgend wird die Erfindung in den bevorzugten Varianten der konkreten Ausführung eingehend geschildert. Dabei sollen die angeführten Beispiele der aktiven Substanzen und Gewinnungsverfahren, der pharmazeutischen Kompositionen und Arzneimittelformen keinen Grund zur Einschränkung der Ansprüche darstellen, sondern sie sind lediglich dazu gedacht, die Machbarkeit der Erfindung sowie die Umsetzung der genannten Zweckbestimmung (en) vorzuführen. Jeder Fachmann auf diesem Gebiet wird sich sicherlich davon überzeugen, dass für die hier angeführten Optionen der Erfindungsführung zahlreiche Modifikationen vorge- schlagen werden können, die allesamt unter die Ansprüche fallen, welche weiter unten ange- führt werden.

1. Methode zur Gewinnung vom mit Elektroschock behandeltem Hühnerblut Zur Serumgewinnung verwendet man das mit dem Elektroschock II. bis III. Grades behandelte Hühnerblut (elektrischer Strom 80-120 Volt, Frequenz 50 Hertz, Stromstärke 0,05 Ampere, Einwirkdauer : 3-4 Sek. lang im Kopfbereich). Das Blut wurde aus der arteria carotis ent- nommen und in weiterer Folge bei 4-8°C 18-24 Stunden in Polyäthylengläschen inkubiert.

Nach der vollständigen Blutgerinnselretraktion wurden die Fläschchen 20-30 Minuten lang bei 3000 U/Min. zentrifugiert, das Serum wurde von Blutgerinnseln getrennt und unter ge- wöhnlichen Verhältnissen lyophilisiert. Die Fläschchen mit dem lyophilisierten Serum wur- den auf RZ-100 M-Anlagen bei 20 bis 30 kGy, bevorzugt bei etwa 25 kGy unter Verwendung von Co60 beskahlt. Das auf diese Weise gewonnene Serum wurde bei einer Temperatur von 4- 8°C gelagert.

2.1. Beweise für die stimulierende Wirkung des mit Elektroschock behandelten Hühner- blutserums Die Versuche wurden an Ratten der Linie Wistar, und zwar Männchen mit Körpermasse 280- 300 g durchgeführt. Die Tiere wurden in 4 Gruppen zu je 10 Ratten eingeteilt.

In der ersten Gruppe wurde den Ratten 1,0 ml der physiologischen Lösung verabreicht. Den Ratten der zweiten Gruppe wurde Serum in einer Dosierung von 100+/-5, 0 mg/kg des Kör- pergewichts (Umfang 1,0 ml) verabreicht. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Ratten dekapitiert.

Den Ratten der dritten Gruppe wurde 1,0 ml der physiologischen Lösung verabreicht und den Ratten der vierten Gruppe Serum (100 +/-5, 0 mg/kg Körpergewicht) in einem Umfang von 1,0 ml. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Tiere mit einem am Schwanz befestigten Gewicht (10% des Körpergewichts der Ratte) in ein Gefäß mit Wasser (25°C) gesetzt. Nach ersten Anzeichen der Agonie wurden die Tiere aus dem Wasser herausgenommen und deka- pitiert.

Als Muster wurden Hirn, Herz, Leber (als Organe mit einer intensiven energetischen Über- lastung in Prozessen der extremen Adaptierung) sowie die Skelettmuskulatur (als Hauptträ- gerorgan) verwendet. Die Gewebsmuster jeder Ratte wurden abgewogen, mit einer isotoni- schen NaCI-Lösung abgekühlt und mit Flüssigstickstoff schnell eingefroren. Die Gesamtzeit der"Belastung"bis zum Ende der Probenentnahme betrug max. 5-6 Minuten.

In den Skelettmuskeln der Ratten wurden Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphor- säure und Adenosinmonophosphorsäure bestimmt. Nukleotide wurden mittels Ionenwech- selchromatographieverfahren auf Säulen unter Anwendung von Anionit Dowex 1 getrennt.

Die Mengenbestimmung des Adenosintriphosphorsäure-, Adenosindesophosphorsäure-und Adenosinmonophosphorsäuregehalts wurde spektrophotometrisch (Spektrophotometer Hita- chi-557) in einer 256 Nm Reichweite durchgeführt.

Das Energiepotenzial wurde nach folgender Formel berechnet : (ATP+0, 5ADF)/ (ATP+ADP+AMP).

Die Mengenbestimmung des Gehalts an zyklischer Adenosinmonophosphorsäure in Hirn, Herz und in Leber wurde mittels radioimmunologischer Analyse mit einem speziellen Gerät der Firma Amersham (Großbritannien) durchgeführt.

Die Bestimmung der markierten Adenosinmonophosphorsäure erfolgte unter Verwendung des Szintillator-Rechners GS-8.

Forschungsergebnisse Die unterschiedlichen Gehalte an Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphorsäure und Adenosinmonophosphorsäure und die Erhöhung des Enegriepotentials sind sowohl beim Vergleich der dritten Gruppe mit der Kontrollgruppe und der 2. Gruppe (p<0,05) als auch der vierten Gruppe mit der Kontrollgruppe und der zweiten Gruppe (p<0,05) sowie beim Ver- gleich der dritten und vierten Gruppe untereinander (p<0,05 Tabelle 1) offensichtlich.

Tabelle 1 : Gehalt an Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphorsäure und Adeno- sinmonophosphorsäure und das Energiepotential im Gewebe der Skelettmus- kulatur nach Elektroschock behandelten Serums Gruppe der Ratten Nukleotiden ehalt Ml Gewebe Energiepotential ATPh ADPh AMPh (Bedingter M+m M+m M+m Koeffizient) 1 (physiologische Lösung-7, 55+0, 19 0, 95+0, 12 0, 25+0, 08 0, 917+0, 080 Kontrolle) (7,28-7, 85) (0,79-1, 18) (0,14-0, 37) n=10 II (Serum) 7, 89+0, 12 1,12+0, 11 0, 14+0, 05 0, 923+0, 125 n=10 (7, 658, 02) (0,93-1, 27) (0,08-0, 25) III (physiologische Lösung + 1, 34+0, 08 3, 56+0, 17 0, 78+0, 07 0, 549+0, 140 Schwimmen) (1,19-1, 49) (3,21-3, 81) (0,65-0, 93) n=10 IV (Serum + Schwimmen) 4, 78+0, 17 2, 55+0, 11 0, 33+0, 09 0, 790+0, 095 n=10 (4,35-4, 95) (2,36-2, 72) (0,19-0, 48) Die Adenylsystemwerte im Wachzustand und 30 Minuten nach leichtem Stress aufgrund der durchgeführten Injektion (Kontrollgruppe) bestätigen, dass unter dem Serumeinfluss die Vermischung des Gehalts an Adenosintriphosphor-und Adenosindesophosphorsäure im Muskelgewebe zu den oberen Normwerten stattfindet, während sich der Adenosinmo- nophosphorsäuregehalt nach unten richtet.

Diese Ergebnisse könnten bedeuten, dass das Serum die Wachstumsprozesse der energeti- schen Reserve im Muskelgewebe vorantreibt. Die Berechnung des Energiepotentials bestätigt diese Tendenz.

Unter dem Einfluss einer extremen Schwimmbelastung in der dritten Gruppe (physiologische Lösung + Schwimmen) wurde eine Abnahme an Adenosintriphosphorsäure und eine Erhö- hung des Gehalts an Adenosindesophosphor-und Adenosinmonophosphorsäure in Bezug auf die Kontrollgruppe festgestellt.

Bei der extremen Belastung der Ratten aus der vierten Gruppe (Serum + Schwimmen) blieben die grundsätzlichen Tendenzen in Zusammenhang mit der Werteveränderung der dritten Gruppe gleich, der Anteil an Adenosintriphosphorsäure blieb jedoch deutlich höher, und bei der Berechnung des Energiepotenzials wurde eine Erhöhung der Werte in Bezug auf die Werte der dritten Gruppe um 43% (p<0,05) festgestellt.

Die Vergleichsanalyse der zyklischen Adenosintriphosphorsäure im Herz-und im Leberge- webe sowie in der Hirnsubstanz bei Ratten der ersten und zweiten Gruppe zeigte, dass unter Serumeinfluss eine Erhöhung des Gehalts der zyklischen Adenosinmonophosphorsäure in der Hirnsubstanz festzustellen ist (p<0,01), während im Herz-und Lebergewebe keine bedeuten- den Unterschiede zu den entsprechenden Daten der Kontrollgruppe (Tabelle 2) herausgefun- den werden konnten.

Tabelle 2 : Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsäure im Hirngewebe, des Her- zens und der Leber nach der Beigabe des mit Elektroschock behandelten Serums Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsäure (pM/g Gruppe der Ratten Rohgewebe) Gehirn Herz Leber M+m M+m M+m I (physiologische Lösung-3, 95+0, 58 3, 07+0, 11 2, 75+0, 18 Kontrolle) (3, 32-4, 55) (2, 98-3, 23) (2, 47-2, 99) n=10 II (Serum) 4, 58+0, 23 3, 26+0, 16 2, 98+0, 99 n=10 (4, 26-4, 85) (3, 02-3, 47) (2, 95-3, 12) III (physiologische Lösung + 0, 82+0, 13 0, 49+0, 17 1, 01+0, 07 Schwimmen) (0, 66-1, 05) (0, 32-0, 78) (0, 86-1, 14) n=10 IV Serum + Schwimmen) 1, 58+0, 13 0, 83+0, 14 1, 27+0, 08 n=10 (1, 38-1, 76) (0, 56-0, 96) (1, 14-1, 41) Unter dem Einfluss extremer Belastung wurde eine nachweisliche Senkung (<0, 05) des Ge- halts an zyklischer Adenosinmonophosphorsäure bei allen Gewebsarten der Ratten der dritten Gruppe (physiologische Lösung + Schwimmen) sowie bei Ratten der vierten Gruppe (Serum + Schwimmen) festgestellt, was jedoch unter Serumeinfluss in einem geringeren Ausmaß der Fall war. Der Anteil an Adenosinmonophosphorsäure war daher in der Hirnsubstanz um 92% höher als der entsprechende Wert der dritten Gruppe (p<0,05), im Herzgewebe um 69% und im Lebergewebe um 25,7%.

Somit ruft das mit Elektroschock behandelte Serum die Erhöhung des Energiepotenzials im Skelettmuskelgewebe der Ratte hervor, fördert die Erhöhung des Gehalts an zyklischer Ade- nosinmonophosphorsäure im Hirngewebe sowohl im Ruhezustand als auch unter extremer physischer Belastung und begünstigt nach physischem Stress der Ratten den Anstieg an zy- klischen Adenosinmonophosphorsäuren im Herz-und Lebergewebe.

2.2 Langzeitgedächtnis Methode Beim Versuch wurden 150 männliche Ratten der Linie Wistar eingesetzt. Alle Ratten wurden vorher im Rahmen des klassischen Tests"offenes Feld"geprüft, und je nach gezeigter Akti- vität wurden sie in drei Gruppen-aktive, mittlere und passive-aufgeteilt.

Zur Bildung des Situationsreflexes wurden Ratten in einem Zylinder untergebracht, der sich in einem thermostatischen, mit Wasser befüllten Gefäß befand. Der auf drei Stützen aufge- stellte Zylinder erlaubte es somit den Tieren, unter dessen unterer Kante durchzutauchen und die außerhalb des Zylinders liegende Plattform zu erreichen.

Feststellbar war eine Latenzzeit des ersten Versuchs und eine Latenzzeit der endgültigen Be- wältigung der Aufgabe der"Befreiung"aus einem geschlossenen Raum und aus dem Wasser.

Beim Bilden des Situationsreflexes wurden die Ratten in drei Gruppen aufgeteilt : -"schnelle Taucher" : jene, die bereits in der ersten Minute den Ausgang finden konnten ; -"langsame Taucher" : jene, die erst nach 2-3 Minuten begannen, den Ausgang zu su- chen ; Ratten, die die Aufgabe nicht innerhalb von 10 Minuten lösen wollten.

Die Injektion des mit Elektroschock behandelten Serums erfolgte in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht 30 Minuten vor Beginn des Versuchs in die Bauchhöhle. Den Kon- trolltieren wurde 1 ml der physiologischen Lösung verabreicht. Am nächsten Tag wurde das Reflexverhalten getestet, wonach es eine 42-tägige Pause gab.

Nach dieser Methode wurden 120 Ratten-60 Kontroll-und 60 Versuchsratten-"ausgebil- det", welche vorher in drei Gruppen-aktive, mittlere und passive-aufgeteilt wurden (zu je 20 Tieren in jeder Gruppe) ; ferner wurden diese für die Analyse in"schnelle und langsame Tau- cher"unterteilt.

Forschungsergebnisse Bei manchen Ratten fehlte der"Untertauchreflex"zur Gänze (Tabelle 3). In der Kontroll- gruppe waren es sechs der aktiven und mittleren Ratten, unter den passiven waren es 12 Tiere.

Am zweiten Tag blieb diese Zahl bei den aktiven und mittleren Ratten gleich, bei den passi- ven fiel diese auf sieben Tiere, nach 42 Tagen wollten die gleichen 11 Ratten jedoch keines- wegs erneut unter der Zylinderkante durchtauchen (eine Ratte starb während des Versuchs).

Bei den aktiven Ratten der Versuchsgruppe gab es gar keine Ratten, die am zweiten Tag da- rauf"verzichteten", die Aufgabe zu lösen. Bei den mittleren Ratten der Versuchsgruppe wa- ren es am ersten Tag drei, am zweiten Tag lösten sie dennoch die Aufgabe und behielten diese Fähigkeit auch noch nach 42 Tagen. Unter den passiven Ratten der Versuchsgruppe wollten vier Ratten die Aufgabe nicht lösen, am zweiten Tag reduzierte sich diese Zahl jedoch auf zwei und blieb auch nach 42 Tagen des Versuchs gleich.

Tabelle 3 : Anzahl der Ratten, bei denen sich kein sog. "Untertauchreflex"gebildet hat Versuchstiere 1 Tag (24 Stunden) 1 2 42 Aktive und Kontrolle 6 6 6 mittlere Raten Serum 3 0 0 Passive Raten Kontrolle 12 7 11 Serum 4 2 2 Bei den"schnellen Tauchern"führte die einmalige Seruminjektion innerhalb von 42 Ver- suchstagen zu keinen nachweislichen Veränderungen beim Aufrechterhalten des Situationsre- flexes.

Bei den"langsamen Tauchern"war eine statistisch nachweisliche Aufrechterhaltung der er- lernten Fähigkeiten, schnell den Ausweg aus einer Extremsituation zu finden, feststellbar (Tabelle 4). Dabei verkürzte sich die Zeit am zweiten Tag der Reflexbildung im Vergleich zum ersten Tag sowohl in den Kontroll-als auch in den Versuchsgruppen. In der Kontroll- gruppe war dieser Reflex 42 Tage nach der Pause zur Gänze verschwunden, während er bei den Tieren, denen eine Injektion verabreicht worden war, vollständig vorhanden war ; der Unterschied lag auch in der Zeit, die bei den Kontrollratten um das 2-3-fache (p<0, 001) aus- geprägter war.

Tabelle 4 : Einfluss des Blutserums auf die Bildung und Aufrechterhaltung situationsbe- dingter Reflexe bei « langsamen Tauchern » (Sek.) Versuchs-1 Tag (24 Stunden) tiere 2 42 LP-1 LP-2 LP-1 LP-2 LP-1 LP-2 (Latenzzeit - Periode) Kontrolle 125, 7+25 176, 7+19, 6 45, 5+9, 9 59, 0+8, 8 37, 5+30, 0 181, 5+15, 5 Aktive Serum 111, 3+39, 7 164, 8+33, 5 55, 3+15, 6 68, 4+18, 8 3, 8+29, 3 55, 7+37, 28 Gruppe Mittlere Kontrolle 144, 8+21, 8 191, 2+16, 3 49, 6+11, 2 62+14, 3 3, 8+24, 0 19, 2+9, 8 Gruppe Serum 118, 2+71, 6 178, 6+76, 8 3, 8+50, 3 77+54, 1 9, 2+28, 8 54, 6+39, 7 Passive Kontrolle 53, 3+25, 7 189, 6+12, 6 53+15, 0 66, 6+8, 0 149, 3+24, 7 196, 0+11, 1 Gruppe Serum 18, 2+71, 6 178, 6+76, 8 63, 8+50. 3 77+54, 1 39, 2+28, 8 54, 6+39, 7 Bei der Bildung und beim langfristigen Behalten von Informationen kommt den H-cholino- zeptiven Mechanismen eine bedeutende Rolle zu. 30 Tiere, denen fünf Tage lang beigebracht worden war, wie man unter einer"Glocke"durchtaucht, wurden in drei Gruppen unterteilt.

Den Tieren der ersten Gruppe (10 Ratten) wurde 30 Minuten vor dem Test Zytisin (H-choli- nozeptive-Blocker des Hirns) in Form einer physiologischen Lösung in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht in die Bauchhöhle injiziert.

Den Tieren der zweiten Gruppe (10 Ratten) wurde ein mit Elektroschock behandeltes Serum in einer Dosis von 100 mg/kg und 30 Minuten später eine Zytisin-Lösung in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht.

Der dritten Tiergruppe (Kontrolle-10 Ratten) wurde eine physiologische Lösung in einer Dosis von 1 ml injiziert.

Das komplexe Verhalten der Tiere wurde nach der oben angeführten Methode 48 Stunden nach der Injektion der erwähnten Substanzen getestet. Die Biotestierung zeigte 48 Stunden, nachdem die Wirkung von Zytisin bemerkbar war, eine deutliche Verlangsamung der"Plucht- reaktion"aus einem geschlossenen Raum, und zwar um das Dreifache im Vergleich zu den Kontrolltieren.

Die vorläufige Verabreichung des Serums bis zur Zytisin-Injektion hob nicht nur die Wirkung dieses Blockers auf, sondern rief auch einen Reaktionsanstieg beim"Flüchten"um 20% im Vergleich zur Kontrollgruppe hervor, und die allgemeine Wirksamkeit der Substanz übertraf die Wirkung des Blockers um das 5-fache (Tabelle 5).

Tabelle 5 : Latenzzeit der situationsbedingten Reaktion bei Ratten in Zusammenhang mit von Zytisin und mit Elektroschock behandeltem Serum (Sek) Zeitparameter Kontrolle Beigabe von Zytisin Beigabe von Serum+ Zytisin (dritte Gruppe) (erste Gruppe) (zweite Gruppe) Nach 48 St. 13, 33+0, 58 40, 0+14 8, 3+5, 5 <0,05 > 0,05 <0, 05 Auf Grund der erzielten Ergebnisse wurde festgestellt, dass die H-Hirncholinorezeptoren bei der Wiederherstellung der"Fluchtreaktion"im Zusammenhang mit dem Modellieren eines komplexen Verhaltens der Tiere eine Rolle spielen und dass das mit Elektroschock behandelte Serum der Entwicklung einer gebremsten"Lernwirkung"vorbeugt.

Das mit Elektroschock behandelte Blutserum fördert daher die Bildung des Langzeitgedächt- nisses, und zwar vor allem bei Tieren mit einer verlangsamten"Fluchtreaktion"aus einem geschlossenen Raum und aus Wasser. Ferner spielt es beim Aufrechterhalten des Langzeitge- dächtnisses über die H-cholinozeptiven Hirnmechanismen eine große Rolle.

2.3. Epilepsie Methode Nach heutigem Stand bewirkt Kampfer in toxischen Dosierungen die Hyperaktivierung der beweglichen Bereiche des Zentralnervensystems, was sich wiederum in der Entwicklung toni- scher Krämpfe wiederspiegelt. Aus diesem Grund wird Kampfer neben Korazol zur Genera- tion von Krämpfen verwendet. Abhängig von der Dosis des verabreichten Präparates werden mit Hilfe von Kampfer sämtliche typische Komponente eines kleinen und großen epilepti- schen Anfalls hervorgerufen.

Bei unserem Versuch wurde der Einfluss eines mit Elektroschock behandelten Serums auf die epileptische Aktivität untersucht, welche durch Injizieren von Kampfer in die Bauchhölle von Ratten hervorgerufen wird.

Beim Versuch wurden 40 männliche Ratten der Linie Wistar mit einem Gewicht von 190-210 g verwendet. Die Kampferöllösung (20%) wurde in die Bachhölle in einer Dosis von 0,25 ; 0,5 Erscheinungsformen der Krampfaktivität : die Latenzzeit der Krampfaktivität wird erhöht, die konischen Krämpfe verlaufen schwächer und ohne Verlust der gewöhnlichen Bewegungsfä- higkeit. Außerdem bewahrt das mit Elektroschock behandelte Serum die Tieren beim Model- lieren von schweren Epilepsieformen vor dem Tod (alle Tiere bleiben nach Verabreichung von 0,5 ml der 20%-Kampferlösung am Leben).

2.4. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Blutserums auf die Zellproliferation des Menschen Das erfindungsgemäße Blutserum stellt ein lyophilisiertes, mit Elektroschock II.-III. Grades <BR> <BR> behandeltes Hühnerblutserum dar [Beresnjewa W. I., "Elektrotrauma, Elektroverbrennung und die Behandlung", M., 1964, S. 87]. Zwei Arten davon wurden bei den Tests verwendet : die erste-aufgelöst in Wasser in einer Konzentration von 100 mg/ml (Versuchsfraktion 1), die zweite-nach dreiminütigem Zentrifugieren der Suspension bei 10000 x g (drei Minuten lang) (Versuchsfraktion 2).

Zellgewinnung Die Zellen der Jurkat-und Raji-Linie sowie Lymphozyten des menschlichen peripheren Bluts wurden in Kunststoffplatten (Nunc oder Falcon) im 1640-RPMI-Medium (Sigma) durch Zu- gabe des 10%-Rinderfetalserums (Gibco), 100 Einheiten/ml Penizillin und 100 ßg/ml Strep- tomyzin bei einer Raumtemperatur von 37°C in einem CO2-Inkubator mit 5% C02-Gehalt und bei 95% Feuchtigkeit kultiviert. Zellen der Linien Bro, HeLa, MCF-7, Mg63, HT1080, IMR-32 sowie HepG2 wurden ebenfalls kultiviert, jedoch im DMEM-Medium (Sigma).

Isolierung der mononuklearen Leukozyten (ML) nach der Boyum-Methode [Boym A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.//Scand J. Lab.

Clin. Invest. -1968.-21-Suppl. 97. -P. 9-18] In je zwei konische 50 ml Probiergläser (Falcon) wird eine 15 ml Phykoll-Pak-Lösung einge- füllt, worauf anschließend je 25 ml in einem Phosphatsalzpuffer (PSP) zweifach verdünntes Blut aufgetragen wird. Daraufhin werden die Probiergläser in einem Baket-Rotor bei 400 x g und 20°C 30 Minuten geschleudert. Die obere Phase, die Plasma enthält, kommt nicht zur Anwendung.

Die monoklearen Leukozyten (ML), die sich an der Trennlinie zwischen Plasma und Trenn- medium ringförmig konzentrieren, werden im Zentrifugenreagenzglas gesammelt, vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, in der Folge zweifach mit PSP gewaschen, wobei die Lösung bei 250 x g 10 Minuten geschleudert und im Kulturmedium aufgelöst wird. Diese Fraktion enthält 10-30% Monozyten und 80-90% Lymphozyten, die im Folgenden als Lymphozyten bezeich- net werden. Ein Teil der Lymphozyten wurde für die Erforschung der mitogenen Aktivität des Testpräparats verwendet und ein anderer zur Proliferation stimuliert, indem der Zelllösung Phytohemaglutinin in Konzentration 20 mkg/ml hinzugefügt wurde.

Evaluierung der Biosyntheseintensität Desoxyribonucleinsäure (DNS) in Zellen Die Evaluierung der Biosyntheseintensität DNS wurde durchgeführt, nachdem der säureun- löslichen Zellfraktion 3H-Thymidin hinzugefügt worden war. Zu diesem Zweck wurden Lym- phozyten in 96-Well-Platten in 200 1 Medium zu je 200-800tausend Medium in jedem Well im Vollmedium mit unterschiedlicher Konzentration der Testsubstanz kultiviert. 3H-Thymidin (Ki/Well, 40 mKi/mMol) wurde 2 Stunden vor Inkubationsschluss zugegeben. Für die Ra- diometrie wurden die Zellen mit Hilfe einer automatischen Vorrichtung für die Zellsammlung auf Filter gesammelt, die säurelöslichen Produkte mit 5% TH-Essigsäure (H20) gewaschen und ihre Radioaktivität mit Szintillometer gemessen. Die Biosyntheseintensität DNS wird in Imp./Min. gemessen.

Die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit nach Inkubation mit unterschiedlichen Präparaten mittels MTT-Test [Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellur growth and survaval : application to proliferation and cytotoxicity assays.//J. Immunol. Meth., 1983,65, 55-63] Zur Durchführung des Tests wurden die Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt (Haftzellen, wenn sie etwa eine halbe Fläche der Nährplatte ausfüllen), in das Nährmedium gesetzt, in der Gorjaew-Kammer) gezählt und anschließend in einem Nährme- dium mit einer Konzentration von 50-100tausend in 1 Mio. aufgelöst. Die Zelllösung wurde nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen zu je 100 gl in die 96- Wellplatten eingefügt. Für die Zählung der vitalen Zellen wurden nach Beendigung der Inku- bation in diverse 96-Wellenpaltten in sämtliche Wellen je 50 ul MTT-Lösung im Nährme- dium (3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 Diphenyl Tetrazolium Bromid) zugefügt. Für die Her- stellung einer MTT-Lösung wird 1 ml MTT-Ausgangslösung mit 4 ml Nährmedium ver- mischt. Die Zubereitung der MTT-Endlösung erfolgt durch die Auflösung dieser Substanz in einer Phosphatsalzlösung (PSL, 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 7.4, mit einem 0,15 M NaCI-Gehalt) mit einer Konzentration von 5 mg MTT/ml PSL und weitere Filtrierung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 um (die Lagerung erfolgt bei einer Tem- peratur von +4°C bis zu einem Monat). Nach dem Zufügen der MTT-Lösung werden die Platten unter den gleichen Bedingungen für weitere 4 Stunden in den Inkubator gestellt. Wei- ters wird durch das Absaugen mit der Pumpe das Nährmedium entfernt, in jedes Well werden je 150 nl Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Auflösung von gebildeten blauen Formazankristallen zugegeben und die optische Dichte der Lösung in jedem Well auf einem Mehrkanalspektro- fotomer für Mikroplatten bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen (Labsystem). Die Er- gebnisse der Lebensfähigkeit der Zellen je nach Konzentration der Substanz werden in Pro- zenten des Überlebens der Kontrollzellen dargestellt. Die Daten wurden mit dem Computer- programm"Origin"verarbeitet.

Ergebnisse und Diskussion Die Ergebnisse sind auf den Abbildungen 1-8 dargestellt. Daraus ergibt sich Folgendes : die hochkonzentrierte Substanz S 1 (2,5-20 mg/ml) hat auf alle Zellen eine hemmende Wirkung, die Reaktion der Zellen verschiedener Gewebearten auf diese Substanz ist jedoch unter- schiedlich. Die IC50-Dosis (Konzentration der Substanz, die zur 50% Hemmung der Zellen führt) variiert bei unterschiedlichen Zelllinien von 2,2 (Jurkat) bis >20 mg/ml (Mg63) für die Ausgangssubstanz (Index 1) von 3,6 (Lymphozyten des peripheren Bluts) bis > 20 mg/ml (Mg 63 und HeLa) für die lösliche Fraktion der Substanz (Index 2). Bei sämtlichen Zelllinien lag die Toxizität der Ausgangssubstanz über jener der löslichen Substanz. Hier wäre jedoch zu erwähnen, dass für einzelne Linien die Toxizität dieser Formen fast gleich war (Mg63, Raji, Lymphozyten des peripheren Bluts), und für andere (Jurkat, MCG-7, IMR-32) wie- derum gab es nach IC50 2-3-fach große Unterschiede. Die Gegenüberstellung der Empfind- lichkeit der Zellen der Testsubstanz im Vergleich zum herkömmlichen Krebspräparat"Doxo- rubizin"finden Sie in der Tabelle 7.

Tabelle 7 : Empfindlichkeit der getesteten Zelllinien auf das Präparat"Doxorubizin" Zelllinie IC50, hM* Jurkat 100 Raji 20 Bro B-19 ** HeLa 400 MCF-7 150 Mg63-* * HT1080-** IMR-32 4 HepG2 100 Lymphozyten des peripheren Bluts 40 Anmerkung : *-hM = 0, 58 hg/ml * *-die Empfindlichkeit auf das Präparat"Doxorubizyn"wurde nicht getestet.

Ferner wurde beobachtet, dass in einem bestimmten Konzentrationsbereich (von 0,3 bis 3 mg/ml) je nach Zellinie und Substanzform das Mittel auf bestimmte Zellen stimulierend wirkt. Eine stimulierende Wirkung wurde auch in Bezug auf die Jerkat-, Raji-, Bro-, Mg63-, HT1068-und HepG2-Zellen festgestellt. Die stimulierende Wirkung war unerheblich (10-20- 40%), jedoch bei beiden Substanzformen vorhanden. Bei den Zellen der Linie HeLa, MCF-7, JMR-32 und Lymphozyten des peripheren Bluts war keine stimulierende Wirkung nachzu- weisen. Die stimulierende Wirkung der Ausgangssubstanz in einer Lösungsform war in einer viel niedrigeren Konzentration als in seiner löslichen Fraktion. Möglicherweise liegt der Grund für die zu beobachtende Stimulation nicht im eigentlichen Stimulieren der Prolifera- tion, sondern in der verstärkten Atmung der Zellen, was ebenfalls bei der Methode zur Beur- teilung der Lebensfähigkeit der Zellen festzustellen ist. Die letzte Frage bedarf einer genau- eren Untersuchung.

Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen verschiedener Substanzen mit den immunkom- petenten Zellen werden in der Regel zwei Fragen erörtert : 1. Ob die Testsubstanz über eine mitogene Aktivität verfügt, d. h. über eine Fähigkeit, die Lymphozytenproliferation zu stimulieren (in diesem Fall ihre Mengenerhöhung, was üblicherweise nach der Verstärkung der Biosynthese der DNS-Lymphozyten, die nach dem Bestand von 3H-Thymidin beurteilt, festgestellt wird).

2. Ob die Testsubstanz auf Lymphozyten eine toxische Wirkung ausübt (wird meistens beurteilt nach der Hemmung der Lymphozytenproliferation, die durch Mitogene mit 3H- Thymidin-Gehalt oder mit Hilfe vitaler Farbstoffe des Typs MTT vorher stimuliert wurden).

Ferner ist zu erwähnen, dass die nicht aktivierten Lymphozyten in der Kultur nicht proliferie- ren und dass deren Zahl unter Einwirkung von Mitogenen bei ansteigender Mitogenkon- zentration steigt. Dies drückt sich im Anstieg der markierten DNS aus.

Der Wirkungsgrad der Mitogene auf Lymphozyten wird je nach Dosis in einer s. g."glocken- förmigen"Kurve dargestellt (Abb. 9). Abschnitt (1) spiegelt jene Reichweite der Mitogen- konzentration wieder, bei der die ansteigende Wirkung (die Biosyntheseintensität DNS) im Verhältnis zur Mitogenkonzentration steht. Der zweite Kurvenabschnitt (2) zeigt den flach verlaufenden Abschnitt wieder und beinhaltet die Reichweite der Mitogenkonzentration, nämlich wann die höchste Wirkung bereits erreicht wurde, das Ansteigen der Mitogenkon- zentration nicht durch Veränderung des erreichten Proliferationsniveau gekennzeichnet und keine zytotoxische Wirkung zu beobachten ist. Abschnitt (3) zeigt jenen Bereich der Mito- genkonzentration, in dem dieser bereits eine toxische Wirkung hat.

Die Beurteilung der mitogenen Aktivität der Substanz wurde in zwei Versuchen durchgeführt : 1. Gegenstand der Untersuchung war die Wirkung der Substanz auf die nicht aktivierten Lymphozyten des menschlichen peripheren Bluts. Dabei wurde die Abhängigkeit der proliferativen Aktivität (der Wirksamkeit) von der Dosis der Substanz getestet.

2. Gegenstand der durchgeführten Tests war die Wirkung der Substanz auf die Biosyntheseintensität DNS der mittels Phytohämaglytinyl aktivierten Lymphozyten (FHA 20 llg/ml) in der zweiten Phase.

Beim Untersuchen der Substanz wurde keine mitogene Aktivität festgestellt, d. h., dass im getesteten Bereich der Substanzkonzentration (0.1-100. 0 mg/ml) keine Stimulation der Bio- syntheseintensität Desoxyribonucleinsäure der Lymphozyten des peripheren Bluts erkennbar war (Abbildung 10).

Unabhängig von der Substanzdosis hat sich die Anzahl der Lymphozyten des peripheren Bluts nicht wesentlich verändert. Beim Untersuchen der Wirksamkeit der Substanz auf die mit Mitogen FHA 20 ukg/ml aktivierten Lymphozyten wurde die Hemmung der aktivierten Lymphozyten festgestellt.

In Rahmen der durchgeführten Tests wurde somit festgestellt, dass in einer Konzentration von über 0,3 mg/ml die Substanz die Biosyntheseintensität Desoxyribonucleinsäure der stimulier- ten Lymphozyten inhibieren kann (Abb. 11), obwohl die Frage über den Realisierungsmecha- nismus dieser Wirkung noch offen bleibt. Die Untersuchung der zytostatischen und der eige- nen zytotoxischen Wirkung ist daher von Bedeutung.

Um festzustellen, wie die erhaltenen Daten beim Menschen zu werten sind, sollte man wissen, wie die Substanzkonzentration in den einzelnen Organen oder im Gewebe nach der Durchfüh- rung bestimmter Tierversuche aussieht. In diesem Zusammenhang ist es daher wichtig zu untersuchen, in welcher unterschiedlicher Konzentration die Substanz die Biosyntheseinten- sität DNS in Organen beeinflusst, die die Lymphopoese bestimmen, und zwar im Knochen- mark, in der Milz und im Thymus der Maus.

Abgesehen von Lymphozyten wurde ebenfalls die zytotoxische Aktivität der Substanz unter- sucht, indem den Zellen das Karzinom der Milchdrüse der Linie MCF-7, die sich im Zustand einer monomolekularen Schicht befinden, hinzugefügt wurde. Auf Grund einer Kontaktbrem- sung der Zellen wurde keine Proliferation festgestellt. Bei einem'solchen Modell kann man die toxische Wirkung der Substanz feststellen, d. h. diese von der zytostatischen Wirksamkeit trennen. Bei der Verwendung dieses Modells hat man festgestellt, dass die Substanz über eine eigene zytotoxische Wirkung bei einer Konzentration von über 2,5 mg/ml verfügt, unabhän- gig davon, ob die nichtlösliche Fraktion entfernt wurde oder nicht. Die Abhängigkeit von der Dosis ist jedoch sehr schwach ersichtlich. Zu erwähnen ist, dass bei der Inkubation mit den proliferierten Zellen die toxische Wirkung bedeutend schwächer ist, was möglicherweise da- mit in Zusammenhang steht, dass eine Wirkung innerhalb von 24 Stunden registriert wurde und nicht nach 72 Stunden, wie dies bei den proliferierten Zellen der Fall ist (eine längere Zellinkubation im Zustand einer monomolekularen Schicht kann zum Tod der Kontrollzellen führen).

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Testsubstanz nicht nur über eine zytostatische Wirkung, sondern auch über eigene zytotoxische Akitivität verfügt. Die zytotoxische Aktivi- tät war jedoch wesentlich geringer als die gesamte zytotoxische und zytostatische Aktivität, obwohl diese bei gleicher Konzentration beobachtet wurden.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die aus tierischem Blut mit Elektroschock II.-III. Grades gewonnene Substanz S l in der Dosierung 0,1-1, 1 mg/ml eine um 10-40% höhere Proliferation der menschlichen Zellen der Linien Jurkat, Raji, Bro, Mg63, HT1068 und HegL2 hervorruft als jene der Kontrollgruppe. In Bezug auf die Zellen der Linien Hela, MCF-7, JMR-32 und Lymphozyten des peripheren Bluts bewirkt die in höherer Dosierung verwendete Substanz (2,5-20 mg/ml) eine feststellbare Hemmung der Proliferation sämtli- cher von uns untersuchten Krebszellen des Menschen. Die Sensibilität der Zellen gegenüber der Substanz S 1 liegt deutlich höher als gegenüber dem bekannten tumorbekämpfenden Prä- parat Doxorubizin. Bezugnehmend auf den Einschluss von 3H-Thymidin in die Biosynthese DNS hat die Substanz sowohl eine zytostatische als auch zytotoxische Wirkung.